KR960014620B1

KR960014620B1 - 신규한 약독화 녹농균 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신

Info

Publication number: KR960014620B1
Application number: KR1019930010273A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 박완제; 문우상; 유왕돈; 유리안; 노갑수; 이남중; 김제학; 김달현; 김영지; 이동억; 하석훈; 조양제; 홍선표
Original assignee: 이종기; 제일제당주식회사
Priority date: 1993-06-07
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 1996-10-19
Also published as: ZA943887B; KR950000865A

Abstract

내용 없음.

Description

신규한 약독화 녹농균 균주 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신

제1도는 본 발명에 따른 약독화 녹농균주로부터 분리, 정제된 세포벽 단백질의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 것이다.

제2도는 본 발명에 따른 약독화 녹농균주의 세포벽 단백질을 정맥 투여한 후의 수컷 생쥐에서의 체중변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 신규한 약독화 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주 및 이러한 약독화 녹농균을 모주로 하여 세포벽 단백질만을 순수하게 분리 정제하고 배합하여 형성되는 녹농균 예방 백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 길이가 1.5 내지 3.0m이고, 폭이 0.5m 정도인 간균으로서 1개의 편모를 갖고 있고 운동성이 있는 그람 음성균이며 토양, 물, 하수 및 사람의 장관에 널리 분포되어 있다.[Mol. Microbiol. 4, 1069-1075, 1990]. 이러한 녹농균은 패혈증, 전신감염, 만성기도감염증, 췌낭포성 섬유증등의 난치성 감염을 일으키는 병원성 균이다. 특히 녹농균에 의해 야기되는 패혈증은 수술, 열상 및 외상등에 의해 저항력이 저하된 환자의 혈액중에 미생물 그 자체가 침입하거나 그의 독성 구성성분이 분비됨으로써 유발되는 질병으로 고열, 혈압저하 등의 쇼크를 일으켜 결국 사망에까지 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 더구나 최근에는 녹농균이 요도감염증에서도 검출되어 더욱 주목을 받게 되었다. 따라서, 녹농균에 의해 야기되는 패혈증, 요도감염증 등의 난치성 화농성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제의 개발이 절실이 요구되어 왔다. 그러나, 녹농균은 일부의 항생제를 제외한 상용 항생물질에 대해 내성을 갖고 있을 뿐만 아니라 현재까지도 좋은 효과를 갖는 예방 및 치료제가 개발되어 있지 않은 상태이므로 녹농균 감염으로 인한 치사율이 갈수록 높아지고 있다.

현재까지 개발되어 실용화된 녹농균 감염증에 대한 유일한 치료법은 녹농균에 대한 항독소를 만들어 독소를 중화시키는 방법이다. 그러나, 항독소는 이미 패혈증이 진행된 환자에게만 사용할 수 있는 치료제이며, 예방적인 기능은 없을 뿐만 아니라 가격도 상당히 고가이므로 일반 환자에게 범용적으로 사용할 수는 없다는 단점을 지니고 있다. 또한, 가장 커다란 결점은 이 항독소의 투여를 통해서 치료될 수 있는 완치율이 비교적 낮으며, 부작용 또한 크다는 점이다.

따라서, 최근에는 이러한 항독소 이용방법의 단점을 해소시키는 한가지 방법으로 공통항원을 이용하는 방법이 적극적으로 연구되고 있다. 현재, 녹농균 감염증의 예방 또는 치료를 목적으로 이루어지고 있는 공통항원에 대한 연구는 크게 두가지 분야로 분류할 수 있다. 그중 하나는 서로 다른 면역형태를 가진 녹농균들로부터 공통항원을 분리 정제하여 녹농균 감염증에 대한 예방 백신용 항원으로 사용하는 방법[Japan, J.Exp. Med. 45, 355-359, 1975]이며, 다른 한가지 방법은 최근에 급속도로 발전되고 있는 유전공학적 방법에 의해 이 항원을 암호화하고 있는 유전자를 꺼내서 적절한 벡터에 재조합시켜 형질발현시킨 후, 공통항원을 대량 생산하여 항원으로 사용하려는 시도이다. 공통항원을 사용한 예방 백신의 개발은 매우 효과적인 접근방법이기는 하지만, 연구가 진행됨에 따라 최근에 이르러는 이러한 접근방법에 해결해야 할 문제가 많은 것으로 지적되고 있다. 그중 가장 결정적인 단점은 공통항원 한가지만으로 여러가지 면역형태를 가진 녹농균을 모두 예방할 수 없기 때문에 효과가 지극히 낮다는 점이다. 이러한 낮은 효과는 현재까지 밝혀진 공통항원 이외에도 어떤 미지의 주요 항원이 같은 존재하여야만 효과적인 예방이 가능할 것이라는 점을 시사하는 것이다.

또 다른 방법으로는 세포융합 기술을 이용하여 녹농균에 대한 마우스 모노클로날 항체[J.Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985] 또는 인간 모노클로날 항체[FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990]를 생산하고, 각 항체중에서 녹농균을 가장 잘 중화시킬 수 있는 항체생산 세포주를 선별하여 이것을 생산 균주로 이용한 대량 생산을 통해 저가의 치료제를 개발하려 하는 시도가 있다. 그러나 이 방법 역시 항체 생산을 통한 녹농균 감염증의 치료에만 목적이 있는 것이지 예방 백신으로 사용하는 것은 아니며, 또한 한 종류의 모노클로날 항체에 의해서만은 현재까지 혈청학적, 면역학적으로 알려진 수십여종의 녹농균에 의한 감염증을 모두 치료할 수는 없기 때문에 감염된 환자 모두를 효과적으로 치료할 수 없다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 서로간의 교차반응성(cross-reactivity)을 조사하여 몇가지의 항체를 동시에 투여하는 방법과 녹농균 감염 환자의 혈액을 채취하여 녹농균의 혈청학적 또는 면역학적 형태를 규명하여 여기에 맞는 모노클로날 항체를 투여하는 방법이 제시되기도 하였으나, 이것 역시 시간이 많이 소요되기 때문에 시간을 다투는 환자의 치료법으로는 부적절하다.

선형기술에는 또한 녹농균주로부터 세포 단백질을 분리하여 항원 백신으로 사용하는 방법이 제안되었다[참조 : Vaccine, Vol. 7, Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine 1989]. 그러나, 이 문헌에 제시된 방법에서는 약독화시키지 않은 NN 170041, NN 170015, NN 868 및 NN 170046의 4종의 일반 균주를 사용하였기 때문에 균주 자체의 독성이 문제가 될 뿐 아니라, 이러한 균주로부터 단백질 성분 백신을 제조하는 과정에서도 세포의 파쇄가 일어나 세포질내에 존재하는 이종의 핵산 또는 유독성 고분자 물질인 리포폴리사카라이드(LPS) 등의 불순물이 백신 성분내에 혼재하게 되므로 사용시 상당히 주의를 기울여야 하는 단점이 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 녹농균 자체의 고유한 독성의 위험은 없으면서 인체에 투여시에 효과적으로 녹농균에 대한 항체의 형성을 유발함으로써 우수한 면역원성(즉, 항원성) 작용을 나타낼 수 있는 수단을 찾기위해 광범위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 녹농균-감염 환자로부터 분리된 녹농균을 면역형태에 따라 7종으로 구분하여 이들을 각각 반복 순화시킴으로써 약독화시키면, 그의 세포벽 단백질이 녹농균 감염 예방용 백신의 제조에 유용한 신규의 안전한 약독화 녹농균주가 수득됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 녹농균 자체의 독성은 없으면서 그의 세포벽 단백질이 항원성만을 나타내도록 약독화시킨 신규의 안전한 녹농균주, 특히 녹농균에 감염된 환자로부터 녹농균주를 분리하여, 이를 분리된 미생물을 피셔-데블린 면역형태(Fisher-Devlin Immunotype)에 따라 7종의 형태로 구분한 후, 이중 대표적인 미생물들을 면역형태별로 1주씩 선택하여 이들을 각각 실험동물에 반복적으로 주입하여 순화시켜 7가지 균주 각각에 대해 가장 약독화된 균주를 선별하여 얻어지는 안전한 약독화 녹농주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 바와같은 약독화된 안전한 7종의 녹농균주 각각으로부터 세포벽 단백질을 순수하게 분리 및 정제하여, 이들중 적어도 3종 이상의 균주로부터 유래한 세포벽 단백질을 일정 비율로 혼합하여 구성되는 녹농균 감염 예방용 백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

녹농균의 피셔-데블린 면역형태는 타입 1부터 7까지의 7종으로 구분되는데 본 발명에서는 이들 7종의 녹농균이 90 내지 95% 이상 거의 대부분의 녹농균 감염 환자의 혈액으로부터 검출된다는 사실에 기초하여 이들 균주를 약독화 대상 균주로 선택하였다. 특히 이들 7종의 녹농균주중에서 타입 1과 타입 3의 균주가 녹농균 감염 환자에게서 가장 빈번하게 검출되는 형태이다.

본 발명에 따르는 안전한 약독화 농농균주는 녹농균에 감염된 것으로 판정된 환자의 혈액으로부터 면역형태에 따른 7종 각각의 녹농균주를 순수하게 분리하여 반복적인 순화과정을 통해 약독화시킴으로써 수득된다. 이렇게 하여 수득되는 안전한 약독화 녹농균주는 각각 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 및 CFCPA 70018로 명명한다.

이러한 바복적 순화과정에 의해 수득되는 약독화 녹농균주는 형태학적이나 균학적 성질 등의 여러면에서 약독화시키기 전의 모균주와 거의 동일하나, 모균주가 가지고 있던 병원성은 나타내지 않으면서 오히려 녹농균 감염에 대한 예방을 위한 백신 항원으로 이용될 수 있는 새로운 성질을 나타내므로 신규한 균주인 것으로 분류된다. 따라서 이들 균주는 각각 1993년 5월 12일자로 국제 기탁기관인 한국종균협회부설 한국 미생물 보존센터에 기탁되어 CFCPA 10142는 KCCM 10029, CFCPA 20215는 KCCM 10030, CFCPA 30720는 KCCM 10031, CFCPA 40057은 KCCM 10032, CFCPA 50243은 KCCM 10033, CFCPA 60534는 KCCM 10034 또한 CFCPA 70018은 KCCM 10035의 가탁번호를 부여받았다.

이와같이 약독화 녹농균주를 수득하는 순환과정은 일반적으로 균주가 일반적으로 목적하는 LD50치를 나타낼때까지 반복 수행하는데, 그 반복횟수는 조작하는 기술자나 모균주의 독성상태 등에 따라 다르지만 바람직하게는 3 내지 7회 반복 수행한다. 이렇게 하여 수득되는 본 발명에 따르는 신규한 약독화 녹농균주의 LD₅₀치는 바람직하게는 2.0×10⁷이상이 된다.

또한, 본 발명에서는 상기에서 수득한 신규의 약독화 녹농균 가각각으로부터 세포벽 단백질을 순수하게 분리정제하여 일정 비율로 혼합하여 제조되는 녹농균 감염 예방을 위한 항원 백신이 제공된다.

본 발명에 따르면 또한, 약독화된 녹농균을 다양한 크기의 발효조에서 최적 생장조건을 유지한 상태로 배양하여 다량의 균체를 수득하고, 이어서 수득한 균체를 각각 유기 용매처리 및 추출, 분자량 크기에 따른 분리, 초원심분리 등의 일련의 과정에 따라 처리함으로써 세포벽 단백질을 수득하고, 이들을 일정 비율로 배합하여 통상의 백신제의 제조방법에 따라 처리함을 특징으로 하는 녹농균 예방 백신제의 제조방법이 제공된다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따르는 백신제의 제조방법은 다음과 같이 개략적으로 나타낼 수 있다.

이하에서는 본 발명의 백신 조성물을 그의 제조방법과 관련하여 더욱 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 녹농균 예방 백신제의 제조방법에서는 우선 제1단계에서 약독화된 7종의 녹농균주, 즉 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 및 CFCPA 70018 균주의 각각을 적절한 크기의 배양기내에서 배양한다. 이때 배지로는 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)를 사용하거나, 특히는 상기와 같은 녹농균주의 배양에 적합하도록 구성된 특수 배지를 사용한다.

이 특수 배지는 글루코즈(30g/), 펩톤(15g/), MgSO₄(0.5g/), (CaCO₃(5g/), KH2PO4(1g/), FeSO₄(5mg/), CuSO₄(5mg/) 및 ZnSO₄(5mg/)로 구성된다. 이 특수배지는 녹농균주의 배양에 적합하도록 본 발명자들에 의해 특별히 고안된 것으로 신규한 것이다. 따라서, 이 특수배지도 본 발명의 범주내에 포함된다. 이들 녹농균주를 특수 배지에서 배양하면 트립틱 소이 브로스 배지에서 배양하였을 때에 비해 건조 균체의 중량을 기준하여 적어도 30% 이상 높은 건조균체를 수득할 수 있으므로 특수 배지를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

이러한 균체 배양단계에서 최적 배양조건은 온도 37℃, 통기량 1vvm(volume/volume ㆍminute), 접종량은 배양 배지액의 5v/v%로 하는 것이며, 초기 2시간은 교반속도를 100rpm으로 하고, 그후에는 600rpm으로 하여 10 내지 20시간, 바람직하게는 12 내지 16시간 동안 배양한다.

배양이 완료되면, 제2단계로 배양액으로부터 침전된 세포를 원심분리 등의 방법에 의해 분리한다. 분리한 세포를 제3단계에서는 유기용매로 처리하여 미생물을 불활성화시키는 동시에 세포벽 지질 성분을 제거한다. 이때 유기용매로 바람직하게는 아세톤, 클로로포름, 에탄올, 부탄을 등이 사용되며, 가장 바람직하게는 아세톤이 사용된다.

계속해서, 제4단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 하면서 5 내지 6회 반복해서 세포벽 단백질을 추출한다. 이를 위해서는 미생물 세포를 인산염 환충액, 트리스 완충액 등의 용매, 바람직하게는 인산염 완충액중에서 정치시키거나 믹서(mixer) 또는 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 추출한다. 추출과정은 4℃에서 100 내지 2000rpm으로 교반하여 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 제4단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 주의하여야 하며, 이는 목적하는 세포벽 단백질에 세포질내의 유독성 단백질이 흔입되는 것을 방지하기 위해서이다. 따라서, 추출과정중에 세포질내 표지효소인 락테이트 데하이드로게나제 또는 헥소키나제를 측정 함으로써 세포의 파쇄여부를 계속 확인하는 것이 필요하다.

이렇게 하여 상등액으로 수득되는 약독화 녹농균주의 세포벽 단백질은 1차 및 2차 한외여과하여 분자량이 10,000 내지 100,000 범위의 단백질만이 수득되도록 분획화시킨다. 이때 세포벽 단백질의 분자량 범위가 10,000 내지 100,000이 되도록 하는 것은 매우 중요한데, 이는 분자량이 10,000 미만이면 동물실험에 의해 밝혀진 것으로 목적하는 항원 백신으로서의 예방 효과가 없고, 분자량이 100,000 보다 큰 범위에서는 고분자량의 리포폴리사카라이드(LPS)의 존재로 인해 독성이 야기될 수 있기 때문이다.

분리된 분자량 범위 10,000 내지 100,000의 세포벽 단백질 분획은 다시 초원심분리(ultracentrifuge)하여 잔존할 수 있는 미량의 리포폴리사카라이드를 제거한 후에 밀리포어 필터등을 사용하여 제균시켜 최종적으로 녹농균 감염 예방 백신용의 약독화 녹농균 세포벽 단백질을 수득한다.

이렇게 하여 수득된 약독화 녹농균주로부터의 세포벽 단백질은 일정 비율로 흔합하여 백신으로 사용한다. 이들의 흔합시에는 각 균주의 검출 빈도를 고려하여 적어도 3종의 균주로부터 수득된 세포벽 단백질, 특히 바람직하게는 4종 이상, 가장 바람직하게는 7종 모두의 균주로부터 수득된 세포벽 단백질을 혼합하여 사용한다. 혼합비율은 대상이 되는 녹농균주의 종류에 따라 상이하지만 일반적으로 각 세포벽 단백질 성분을 동량 비율로 혼합시키는 것이 바람직하다.

예를들어 본 발명에 따르는 바람직한 백신 조성물은 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534로부터 수득된 세포벽 단백질을 1 : 1 : 1.5 : ,1 : 1 : 1 : 1 또는 0.5 : 1.5 : 1.5 : 0.5의 비율로함유하거나, CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 및 CFCPA 70018로부터 수득된 세포벽 단백질을 모두 거의 동일한 비율로 함유하는 것이다.

본 발명에 따르는 녹농균 감염 예방 백신에는 상기에서 수득된 세포벽 단백질 성분 이외에도 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를들면 수산화칼슘, 인산칼슘, ISCOM(immunostimulating complex).

SAF-1(Syntex Adjuvant Formulation-1) 또는 SAFm(modifiede Syntex Adjuvant Formulation)등을 함유시킬 수 있다.

녹농균 감염 예방 백신으로 사용시에 사용용량은 녹농균의 감염이 우려되는 투여 대상의 성별, 연령, 체중, 건강상태 등에 따라 달라지지만, 일반적으로는 균체의 건조중량 0.1 내지 0.5g(습윤중량 0.5 내지 2.5g에 해당)으로부터 수득되는 세포벽 단백질을 투여하며, 이 양은 일반적으로 0.5 내지 2.5mg이다. 투여경로는 바람직하게는 근육내 투여한다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예1

녹농균 감염 환자로부터 녹농균의 분리 및 동정

녹농균 감염증 환자들로부터 채혈된 서로 상이한 260종의 혈액을 각각 약 1 내지 5ml씩 무균적으로 분양받아 실온에서 1시간 정도 방치한 후, 4℃의 냉장고에서 밤새 보관한 다음 4℃에서 1500g으로 10분간 원심분리하여 고형물을 제거하고 상등액으로 혈청을 수득하였다.

미리 준비된 1.0 내지 1.5% 아가(agar)를 첨가한 트립틱 소이 브로스 배양 평판에 상기에서 얻어진 혈청을 인산염 완충용약(l당 Na₂HPO₄1.15g, KCI 0.2g, KH₂PO₄0,2g, NaCI 8.766g)으로 1:10의 비로 희석하여 각각을 도말한 후, 37℃로 유지되는 호기성 즈건의 배양기에서 12시간 이상 배양하였다. 이렇게 하여 수득된 배양물을 새로운 배양 평판에 옮겨서 공지의 미생물 순수 분리방법[참조 : Biology of Microorgan-isms]을 사용하여 미생물을 순수한 형태로 분리하였다.

분리된 녹농균들의 혈청학적, 면역학적 분류는 이미 알려져 있으며(참조 : Bergey's Manual), 시판되고 있는 분석키트를 이용하여 다음과 같은 분석 방법으로 동정한다[J. Gen. Microbiol. 130, 631-644,1984].

트립틱 소이 브로스 5ml를 시험관에 넣고 각각의 균을 접종한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건하에서 배양하여 650nm에서의 흡광도가 대략 2.0 이상이 유지되도록 균체농도를 조절하였다. 이 배양액 1ml를 무균적으로 분취하여 4℃에서 6000g으로 10분간 원심분리한 후, 상층의 배양액을 제거하고 침전된 미생물에 동량의 멸균 식염수를 가하여 현탁시켰다. 준비된 96-웰 마이크로플레이트에 시험혈청 및 대조혈청(정상 토끼혈청) 15l씩을 각각 가한 후, 각 혈청에 상기에서 수득된 미생물 현탁액 15μl씩을 가하여 혼합시키고 10내지 30분 사이에 응집반응(agglutination)이 일어나는지 여부를 관찰하였다. 여기에서 양성의 응집반응이 일어나는 웰의 균주는 거기에 첨가한 혈청과 일치되는 혈청학적 형태(Serotype)를 가지는 것이므로 쉽게 구별할 수 있다.

실시예2

분리된 각 녹농균으로부터 약독화된 미생물의 선별

녹농균을 백신 제조에 사용될 수 있는 안전한 미생물로 약독화시키기 위해서 다른 면역형태를 가진 대표적인 미생물을 각각 1주씩 선택하여, 이 미생물을 가지고 반복적인 순화를 통해서 약독화시켰다. 이때 대조군으로 사용되는 독성 녹농균은 GN 11189(일본의 Episome Inntitute로부터 구입)를 선택하였으며, GN 11189은 2.0×10⁶세포를 체중 20 내지 25g의 수컷 ICR 생쥐에 정맥(또는 복강)을 통해서 주입하게 되면 3일 이내에 100%의 치사율을 나타낸다.

상기에서 선택된 면역형태가 다른 각 1주씩의 녹농균을 각각 트립틱 소이 브로스내에서 실시예 1에서와 동일한 조건하에 액체 배양한 후, 4℃에서6000g으로 10분간 원심분리한다. 수득된 세포 침전물을 생리식염수 10mldp 현탁시켜 상기와 동일한 조건으로 재원심분리한 후, 신선한 생리식염수로 ml당 5×10⁵, 5×10⁶, 5×10⁷, 5×10⁸세포가 되도록 적절히 희석하여 각각의 세포들을 한 그룹당 10마리씩의 생쥐에게 정맥(또는 복강을 통해) 투여하였다. 이때 대조군에게는 GN 11189 균주 2.0×10⁶세포만을 투여하였으며, 3일 이내 모두100% 치사율을 보이는 시점에서 가장 높은 균체 농도에서 생존한 ICR 생쥐로부터 녹농균을 다시 무균적으로 분리하였다. 분리한 녹농균을 다시 트립틱 소이 아가 평판 배지에 도말하여 상기에 연급한 미생물 순수 분리방법을 사용하여 각각의 미생물을 순수하게 분리하였다.

상기와 같이 생쥐를 통해 1차로 약독화시킨 미생물을 재차 상기와 동일한 방법으로 3 내지 7회 반복 투여하여 목적하는 LD₅₀이 최소 2.0×10⁷세포 이상이 될 때까지 선택된 7균주 모두를 반복해서 처리하였다. 각각의 안전하게 약독화된 최종 미생물의 LD₅₀으로 표시한 안전성 측정치는 표 2에서 나타내었다.

₇

주 : ＋ 성장, －성장하지 못함.

표 4에서 보는 바와 같이, 7종의 약도화된 녹농균은 모두 37℃에서 가장 좋은 성장을 나타내고 있으며 그다음이 30℃, 25℃ 순으로 나타나고 있다. 그러나 42℃에서는 7종의 녹농균 모두가 다른 온도에 비해서 비교적 느린 성장을 나타났다.

(3) 하기의 실험은 약독화된 녹농균의 탄소원에 따른 성장속도를 측정하기 위한 것이다. 7종의 약독화 녹농균주를 각각 pH 7.0으로 조정된 트립틱 소이 브로스 50ml에 접종하고 37℃에서 200rpm으로 유지되는 호기성 조건하에서 12 내지 16시간 동안 배양한 후, 무균상태하에 4℃에서 6000g으로 10분간 원심분리하여 미생물을 수확한 다음 10ml의 생리식염수에 현탁시켰다. 각각 서로 다른 탄소원을 함유하는 M9 배지(Na₂HPO₄7H₂O 12.8g, KH₂PO₄3g, NaCI 0,5g NHCI lg) 5ml에 상기에서 수득한 미생물 현탁액 50l씩을 가하여 12시간 동안 배양한 후, 각각의 배양액에 대해 600nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 성장여부를 조사하였다.

₃ ₂ ₄ ₄ ₄ ₄ ₃ ₄ ₂ ₄ ₂ ₄ ₂ ₄ ⁵⁰ ₂ ₄ ₂ ₄ ⁸ ⁴ ⁵⁰ ⁵⁰

상기에서와 동일한 방법에 따라 백신으로써 4종의 단백질 혼합물 대신에, 3종의 약독화 녹농균주인 CFCPA 10142, CFCPA 30720 및 CFCPA 20215로부터 유래하는 세포벽 단백질이 동량비로 구성된 혼합물(그룹 I) 또는 7종 전부의 약독화 녹농균주로부터 유래한 세포벽 단백질의 혼합물(그룹 H)을 사용하여 각 녹농균주의 감염에 대한 이들 2종의 백신의 교차방어능력을 측정하였다. 그 결과는 다음 표 7에서 보는 바와같다.

실시예 10

세포벽 단백질의 항원성 측정

실시예 9에서와 동일하게 약독화 녹농균주로부터 부분정제하여 수득한 세포벽 단백질을 항원으로 사용하여 실험동물인 ICR 생쥐에게 0.1mg/kg 또는 0.2mg/kg의 용량으로 정맥주사하여 면역시키고, 면역시킨지 1주일후에 각 그룹의 쥐로부터 일정량의 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 항체생성 여부를 ELISA 방법을 사용하여 아래와 같이 측정하였다[J.Clin. Microbiol. 15, 1054-1058, 1982].

우선, 코팅 버퍼(0.05M 탄산염 완충액, pH 9.6)내에서 0.1mg/ml의 농도로 조성된 항원을 96-마이크로플레이트의 각 웰에 100ml씩 가하여 실온에서 2시간 또는 4℃에서 12 내지 14시간 반응시켜 플레이트에 단백질을 부착시킨 다음 수용액을 제거하고, 여기에 1% 우혈청알부민(BSA) 200ml를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 단백질-비결합 부분을 차단시켰다. 이때 대조군의 항체로는 면역시키지 않은 생쥐의 혈청을 사용하였다. 반응 종료후, 다시 인산염 완충액으로 5 내지 6회 세척하고, 생쥐의 항체에 대한 토끼의 항체에 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체(Rabbit-anti mouse 1g- Peroxidase Conjugate) 100ml를 가하여 상온에서 1시간동안 반응시킨 후, 동일한 인산염 완충 세척액으로 7회 이상 격렬하게 세척하였다. 여기에 기질로서 시트레이트-포스페이트 완충액(0.1M Citrate -Phosphate buffer, pH 5.0)에 오르토-페닐렌디아민 디하이드로 클로라이드를 0.3 내지 0.4mg/ml의 농도로 조정하여 50l씩 첨가하고, 20분간 차광하에 반응시킨 후, 1N- 황산 50ml씩을 가하여 반응을 정지시켰다. 그후, 각 반응용액을 분광 광도계를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 표 9에서 보는 바와같이, 시험군의 경우 0.1 또는 0.2mg/kg의 항원투여에 의해 대조군에 비해 2 내지 5배 정도의 면역가를 나타내주고 있음을 알수 있다. 상기에서 보는 바와같이, 본 발명에서 약독화된 각 녹농균주들은 독성면에서 상당히 안전한 미생물이면서 동시에 세포벽 단백질의 안전성 및 항체 생성능이 우수하고, 또한 각종 녹농균에 대해서도 우수한 교차방어능력을 나타내므로 녹농균 예방 성분 백신 제조를 위한 미생물로서 매우 우수함을 알 수 있다.

Claims

균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 10142(KCCM 10029)인 안전한 약독화 녹농균주.
균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 20215(KCCM 10030)인 안전한 약독화 녹농균주.
균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 30720(KCCM 10031)인 안전한 약독화 녹농균주.
균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 40057(KCCM 10032)인 안전한 약독화 녹농균주.
균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 50243(KCCM 10033)인 안전한 약독화 녹농균주.
균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 60534(KCCM 10034)인 안전한 약독화 녹농균주.
균주명이 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) CFCPA 70018(KCCM 10035)인 안전한 약독화 녹농균주.
제1항 내지 7항중의 어느 하나에 따른 안전한 약독화 녹농균주로부터 순수하게 분리, 정제하여 수득한 세포벽 단백질을 함유함을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
제8항에 있어서, 약독화 녹농균주가 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 및 CFCPA 70018중에서 선택된 적어도 3종의 균주임을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
제9항에 있어서, 선택된 약독화 녹농균주가 CFCPA 10142, CFCPA 20215 및 CFCPA 30720의 3종의 균주임을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
제9항에 있어서, 선택된 약독화 녹농균주가 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534의 4종의 균주임을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
제9항에 있어서, 선택된 약독화 녹농균주가 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 및 CFCPA 70018의 7종의 균주임을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
제8항 내지 12항중의 어느 하나에 있어서, 각각의 선택된 약독화 녹농균주로부터 수득한 세포벽 단백질을 동량비로 혼합하여 사용하는 녹농균 감염 예방 백신.
제8항에 있어서, 세포벽 단백질 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 녹농균 감염 예방 백신.
a) 제1항 내지 7항중의 어느 하나에 따른 안전한 약독화 녹농균주를 최적 성장조건하에서 배양하여 수득한 균체를 유기 용매로 처리하여 미생물을 불활성화시키는 동시에 세포벽의 지질성분을 제거하고, b) 수득한 균체로부터 세포벽 단백질을 추출한 후, c) 수득된 세포벽 단백질을 한외여과하여 분자량이 10,000 내지 100,000 범위인 단백질 성분만을 분리하고, d) 이 단백질 성분을 초원심분리시켜 목적하는 세포벽 단백질만을 순수하게 분리시킴을 특징으로 하여, 녹농균 감염 예방 백신을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 단계 a)에서 배양에 사용된 배지가 트립틱 소이 브로스임을 특징으로 하여 녹농균 감염 예방 백신을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 단계 a)에서 배양에 사용된 배지가 ℓ당 글루코즈 30g, 펩톤 15g, MgSO₄0.5g, CaCO₃5g, KH₂PO₄1g, FeSO₄5mg, CuSO₄5mg 및 ZnSO₄5mg으로 구성된 특수 배지임을 특징으로 하여 녹농균 감염 예방 백신을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 단계 a)에서 사용된 유기 용매가 아세톤, 클로로포름, 에탄올 또는 부탄올임을 특징으로 하여 녹농균 감염 예방 백신을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 단계 b)에서 추출용 용매가 인산염 완충액 또는 트리스 완충액임을 특징으로 하여 녹농균 감염 예방 백신을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 단계 b)에서 세포벽 단백질을 정지시켜 추출하거나, 믹서 또는 균질화기를 사용하여 추출함을 특징으로 하여 녹농균 감염 예방 백신을 제조하는 방법.
1ℓ당 글루코즈 30g, 펩톤 15g, MgSO₄0.5g, CaCO3 5g, KH₂PO₄1g, FeSO|₄5mg, CuSO₄5mg 및 ZnSO₄5mg을 함유함을 특징으로 하는, 제1항 내지 7항중의 어느 하나에 따르는 약독화 녹농균주의 배양용 배지.