NO317148B1 - Nye svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, vaksiner, fremgangsmate for fremstilling derav og terapeutisk middel - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet nye sikre, svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammer fremskaffet ved å isolere Pseudomonas aeruginosa i ren tilstand ifølge Fisher-Devlin immunotype og derpå gjentatte ganger å renske den isolerte stamme spesielt CFCPA 10142, KCCM-10029) CFCPA 20215 (KCCM 10030), CFCPA 30720 (KCCM 10031), CFCPA 40057 (KCCM 10032), CFCPA 50243 (KCCM 10033), CFCPA 60534 (KCCM 10034 og CFCPA 70018 (KCCM. 10035) stammer. I tillegg er det beskrevet vaksiner for immunisering mot Pseudomonas aeragmosa-infeksjon som innbefatter celleveggsproteiner med molekylvekt i området fra 10.000 til 100.000, fremskaffet fra de svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammer, et terapeutisk middel for behandling av Pseudomonas aeruginosa-infeksjon inneholdende immunoglobulin(er) indusert av celleveggsproteiner i et. forsøksdyr, og fremgangsmåter for deres fremstilling. Celleveggsproteinkomponenten av den svekkede stamme er ikke-patogen og sikker og oppviser utmerket antistoffdannelse og er anvendelig for fremstilling av en vaksine og terapeutisk middel. Celleveggsproteinene oppviser en utmerket kryss-beskyttende kapasitet for forskjellige Pseudomonas aeruginosa-stammer, samt en overlegen antistoffinduserende egenskap.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, en ikke-patogen profylaktisk vaksine og et terapeutisk middel for en Pseudomonas aeruginosa infeksjon, samt en fremgangsmåte for fremstilling derav. Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse nye svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, som blir fremskaffet ved å isolere Pseudomonas aeruginosa i en ren tilstand i henhold til Fisher-Devlin immunotype, og derpå gjentatt å renske opp den isolerte stamme ved sekvensielle passasjer gjennom mus, en profylaktisk vaksine fremstilt fra, og terapeutiske immunoglobuliner indusert fra celleveggsproteiner separert fra den svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammen, samt en fremgangsmåte for fremstilling derav.

Beskrivelse av tidligere teknikk

Pseudomonas aeruginosa er en bevegelig gram-negativ stav, omkring 0,5 umx 1,5 - 3,0 um, med et enkelt flagellum og opptrer utstrakt i jord, vann, kloakk og tarm hos mennes-ker (Mol. Microbiol. 4, 1069-1075, 1990). Pseudomonas aeruginosa er en patogen stamme som forårsaker inveterate infeksjoner, så som septicemia, generell infeksjon, kro-nisk luftveisinfeksjon, cystisk fibrose av bukspyttkjer-telen, osv. Septicemia forårsaket av Pseudomonas aeruginosa er en sykdom som stammer enten fra invasjonen av mikroorganismer i seg selv, eller utskillelsen av dets toksiske bestanddeler i blodet hos pasienter som har senket motstandsdyktighet grunnet kirurgisk behandling, oppskjæring, trauma og lignende. Tilstedeværelsen av tok-sinet forårsaker sjokk med høy feber, redusert blodtrykk, og andre symptomer som til syvende og sist kan føre til døden. Videre har, siden Pseudomonas aeruginosa har blitt påvist i urinveisinfeksjoner, interesse for Pseudomonas aeruginos i stor grad økt. Følgelig vil utvikling av et medisinsk middel være i stand til effektivt å forhindre eller behandle inveterate suppurative sykdommer, så som septicemia og urinveisinfeksjoner forårsaket av Pseudomonas aeruginosa, og dette er i stor grad ønsket. Pseudomonas aeruginosastammer er imidlertid resistente mot de fleste antibiotiske substanser, og et effektivt forebyggende eller terapeutisk middel for Pseudomonas aeruginoas-infeksjoner har ikke blitt utviklet fram til i dag. Virulensen av Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner har således økt over tid.

Pseudomonas aeruginosastammer kan bli klassifisert på forskjellige måter. Ett slikt klassifiseringssystem klassifi-serer stammene i sju (7) typer i henhold til Fisher immunotype. Et annet system er basert på o-antigengruppen som foreslått av Terada. Enda et annet system er The International Antigenic Typing Scheme (IATS) klassifiseringssystem. I betraktning av klassifiseringssystemer er de Pseudomonas aeruginosa-stammene som oftest opptrer hos Pseudomonas aeruginosa-infiserte pasienter: 5/2a, 2c, 3, 7/3a, 3c, l/4a, 4b, 6/5a, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /li og 3, 7/3d, 3e typer i henhold til Fisher immunotype/o-serotype med 3, 7, 2 og 1 typer idet Fisher immunotype (tilsvarende 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a og 4b som O-serotype) hovedsaklig er til stede.

En behandlingsmetode for Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner nøytraliserer Pseudomonas aeruginosa-toksinene med antitoksiner. Antitoksinet er imidlertid et terapeutisk middel som kun er gunstig hos pasienter som allerede lider av septicemia, og har ingen profylaktisk effekt. Videre er antitioksinet som for tiden er tilgjengelig, meget dyrt, og dets bruk er begrenset. I tillegg er den mest signifi-kante ulempen som følger med bruken av antitoksinet den relativt lave kureringsgraden og de medfølgende alvorlige bieffektene.

En metode som er under studium for å unngå ulempene assosiert med antitoksinet, benytter et felles antigen for forebygging og behandling av Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner. Metoder under studium for å fremskaffe det felles antigenet kan generelt bli klassifisert i to grupper. Den første angår en metode for å bruke et felles antigen separert og renset fra Pseudomonas aeruginosastammer som har forskjellige immunotyper som et profylaktisk vaksineantigen mot Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner (Japan, J. Exp. Med. 45, 335-359, 1975). Den andre metoden angår bruken av felles antigen masseprodusert ved å anvende en genetisk manipuleringsteknikk hvor et gen som koder for det ønskede antigen blir isolert og satt inn i en egnet vektor for å fremskaffe en rekombinant vektor, og derpå blir den passende vertsorganismen transformert med den resulterende rekombinante vektor og inkubert for å uttrykke det ønskede antigenet.

Selv om utvikling av en profylaktisk vaksine som bruker et felles antigen teoretisk er en meget effektiv metode, indikerer for tiden utviklingen av studier som angår denne metoden at denne metoden har mange problemer som forblir uløste. Hovedulempene er at det felles antigenet ikke kan forhindre alle typer Pseudomonas aeruginosa å ha forskjellige immunotyper, og dets effektivitet er følgelig meget liten. Slik liten effektivitet antyder at tilstedeværelsen av et annet ukjent hovedantigen, i tillegg til det felles antigen, kan fremskaffe en effektiv profylaktisk effekt.

En annen metode for å behandle Pseudomonas aeruginosa-infeksjon er tilføringen av antibiotika eller kjemoterapeu-tiske midler som har bred-spektrumselektivitet for Pseudomonas aeruginosa-stammen. Siden det fins mange Pseudomonas aeruginosastammer og de generelt har en meget høy grad av medikamentresistens, har imidlertid mange pasienter bukket under for Pseudomonas aeruginosastammer som ikke effektivt kan bli behandlet med antibiotika.

I tillegg har en metode som bruker terapeutisk immunoglobulin blitt utviklet. Imidlertid oppviser slik immunoglobulin ingen eller liten terapeutisk effekt på alle Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner, og har således kun blitt brukt for meget begrensede typer Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner. Dette skyldes i hovedsak at immunoglobulinet blir fremstilt i henhold til en metode for å fremstille et polyklonalt antistoff hos en viss mikroorganisme, og kan følgelig ikke vanligvis virke på de mange Pseudomonas aeruginosa-stammene.

Forsøk har blitt foretatt for å utvikle et billig terapeutisk middel med monoklonale museantistoff (J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985) eller humane monoklonale antistoff (FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990) mot Pseudomonas aeruginosa. Her kan cellelinjer bli valgt ut for å danne de mest effektive nøytraliserende antistoffene fra en cellebank med cellefunksjonsteknikker, og deretter kan en cellelinje bli brukt som utgangsmateriale for å danne det ønskede antistoff i en industriell skala. Denne metoden sikter imidlertid mot behandlingen av Pseudomonas aeruginosa-infeksjon via antistoffproduksjon, men ikke mot profylaktiske vaksiner. I tillegg har denne metoden den fordel at siden alle infeksjoner blir forårsaket av forskjellige Pseudomonas aeruginosastammer med forskjellige serologiske og immunologiske typer, kan ikke alle bli behandlet med kun én type monoklonalt antistoff. Dvs. monoklonal antistoffterapi kan ikke bli effektivt utnyttet til å behandle alle de Pseudomonas aeruginosa-infiserte pasientene.

For å utvide effektiv behandling med denne metoden har samtidig tilførsel av flere typer antistoff på basis av deres undersøkte kryss-reaktivitet blitt utviklet. Her blir blod samlet opp fra Pseudomonas aeruginosa-infiserte pasienter og undersøkt for å identifisere den serologiske og/eller immunologiske type av de infiserende Pseudomonas aeruginosa-stammene. Deretter blir monoklonale antistoff som er egnet for den identifiserte type, tilført pasien-ten. Denne metoden krever imidlertid meget tid, og er føl-gelig utilgjengelig for pasienter hvis tilstand nødven-diggjør umiddelbar behandling.

I tidligere teknikk har bruken av celleveggsproteiner separert fra Pseudomonas aeruginosastammer som et antigen for en vaksine, blitt foreslått {se Vaccine, vol. 7, "Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine", 1989). Imidlertid benytter den foreslåtte metoden i den ovenfor nevnte referanse fire typer generelle Pseudomonas aeruginosastammer, dvs. NN 170041, NN 170015, NN 868 og NN 170046, som ikke er svekket, og følgelig er et problem med hensyn til toksisiteten av Pseudomonas aeruginosa-stammene i seg selv til stede. Videre, siden celler, ved fremstilling av en pro-teinkomponentvaksine fra slike Pseudomonas aeruginosastammer, kan bli ødelagt, kan de frigjøre inn i mediet frem-mede nukleinsyrer og toksiske høymolekylvektssubstanser, lipopolysakkarider (LPS), som er til stede i cytoplasma. Disse substansene blir deretter inkorporert i den resulterende vaksinen som urenheter, noe som øker forsiktigheten som er nødvendig ved tilførsel av vaksinen og begrenser muligens dens bruk.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Nærværende oppfinnere har således utført forskning for å finne et middel som er i stand til effektivt å indusere antistoff mot Pseudomonas aeruginosa, og som har god immu-nogen {dvs. antigen) aktivitet med ekstrem lav risiko grunnet de iboende toksisiteter hos Pseudomonas aeruginosa- stammene i seg selv. Som et resultat bekreftet nærværende oppfinnere at når Pseudomonas aeruginosastammer isolert fra Pseudomonas aeruginosa-infiserte pasienter blir klassifisert i sju (7) arter basert på deres immunotyper og derpå blir hver rene stamme svekket ved å passere organismen flere ganger gjennom en egnet animalsk vert, kan nye sikre og svekkede Pseudomonas aeruginosastammer bli fremskaffet. Disse stammene har celleveggsproteiner som ikke bare er anvendelige for fremstilling av en vaksine for profylakse mot Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner, men som også kan bli benyttet som en antistoffinduser for å danne immunoglobuliner for Pseudomonas aruginosa-infeksjon hos dyret. De resulterende immunoglobulinene oppviser overlegen terapeutisk effekt på forskjellige Pseudomonas aeruginosa-infeksjoner innbefattende alvorlige tilfeller i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Følgelig er det et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en ny og sikker svekket Pseudomonas aeruginosa-stamme som har celleveggsproteiner som oppviser antigenisitet uten toksisiteten hos Pseudomonas aeruginosa-stammen i seg selv.

Det er et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en vaksine for å indusere en immunrespons for å forhindre påfølgende sykdom forårsaket av Pseudomonas aeruginosa hos en pasient som mottar vaksinen.

Det er et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte for å fremstille vaksinen.

Det er et annet mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe et terapeutisk middel for behandling av Pseudomonas aeruginosa-infeksjon som omfatter minst ett immunoglobulin for Pseudomonas aeruginosastammer.

Det er et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for å fremstille immunoglobulinet.

Det foregående har skissert enkelte av de viktigere mål for foreliggende oppfinnelse. Disse målene bør bli betrak-tet som kun illustratoriske for enkelte av de viktigere trekk og anvendelser av oppfinnelsen. Mange andre gunstige resultater kan bli fremskaffet ved å anvende den beskrevne oppfinnelse på en annen måte, eller ved å modifisere oppfinnelsen innen omfanget av beskrivelsen. Følgelig kan andre mål og en grundigere forståelse av oppfinnelsen bli oppnådd ved å referere til oppsummeringen av oppfinnelsen, og den detaljerte beskrivelsen som beskriver den foretrukne utførelsesform i tillegg til omfanget av oppfinnelsen definert av kravene tatt i sammenheng med de medføl-gende tegninger.

Oppsummering av oppfinnelsen

En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse angår nye, sikre og effektive svekkede Pseudomonas aeruginosastammer som har celleveggsproteiner som gir antigenisitet uten toksisiteten av Pseudomonas aeruginosa-stammen i seg selv. Foreliggende oppfinnelse angår spesielt sikre svekkede Pseudomonas aeruginosastammer som blir fremskaffet ved å isolere Pseudomonas aeruginosastammer fra pasienter infisert med Pseudomonas aeruginosa, klassifisere de isolerte mikroorganismestammer i sju (7) typer arter i henhold til Fisher-Devlin Immunotypen, velge ut en enkel representativ stamme for hver immunotype, rense den utvalgte stamme via gjentatte injeksjons/isolasjons/re-injeksjonstrinn i for-søksdyr, og velge ut den mest svekkede stamme for hver av sju (7) typer Pseudomonas aeruginosastammer. De aktuelle svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammer fremgår av krav 1's karakteriserende del.

En ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er rettet mot en ny ikke-patogen vaksine, samt fremgangsmåten for fremstilling av vaksinen for profylakse mot Pseudomonas aeruginosa-infeksjon. Vaksinen blir fremstilt ved å adskille celleveggsproteiner i en i hovedsak ren tilstand fra hver av sju (7) typer sikre svekkede Pseudomonas aeruginosastammer som beskrevet nedenfor og ytterligere rense de atskilte celleveggsproteiner, og deretter fortrinnsvis slå sammen de rensede celleveggsproteinene avledet fra minst 3 typer av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer. Fortrinnsvis blir ekvivalente mengder av celleveggsproteiner fra hver av de 3 typer benyttet ved fremstilling av vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse. En slik ikke-patogen vaksine fremgår av krav 3 og 4.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et terapeutisk middel for Pseudomonas aeruginosa-infeksjon som angitt i krav 6 og som inneholder minst ett immunoglobulin dannet ved å dyrke minst én sikker svekket Pseudomonas aeruginosa-stamme, adskille celleveggsproteinet, rense det atskilte celleveggsproteinet, og deretter inji-sere det rene celleveggsproteinet som en antistoffinduser i forsøksdyr for å indusere immunoglobulinet.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser resultatet av SDS-PAGE på rensede celleveggsproteiner adskilt fra svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse,- og Fig. 2 er en kurve som representerer vektendringen hos hann-mus, i hvilke celleveggsproteinet av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse er injisert intravenøst.

Beste måte å utføre oppfinnelsen

Fisher-Devlin Immunotyper av Pseudomonas aeruginosa blir klassifisert i sju typer, type 1 til type 7. I foreliggende oppfinnelse blir Pseudomonas aeruginosastammer som har Fisher immunotyper 1-7, valgt ut som stammer for svekkelse på basis av det faktum at de blir påvist i blodet hos hoveddelen, dvs. 90 til 95 % eller mer av Pseudomonas aeruginosa-infiserte pasienter. Spesielt blant de sju (7) typene av Pseudomonas aeruginosa er type 1 og type 3 de hyppigst påviste stammene hos Pseudomonas aeruginosa-infiserte pasienter. Beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse kan imidlertid bli brukt mot enhver av stammene av Pseudomonas aeruginosa for å fremskaffe beskyttelse eller behandling.

Sikre svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse kan bli fremskaffet ved å isolere hver av de sju typene Pseudomonas aeruginosastammer i ren tilstand fra blodet hos pasienter som er bestemt til å ha Pseudomonas aeruginosa-infeksjon, og derpå svekke de isolerte stammene ved gjentatte opprenskningsprosedyrer. De sikre svekkede Pseudomonas aeruginosastammer således fremskaffet er alle sju (7) typer og betegnet henholdsvis CFCPA 10142 (Fisher type 1), CFCPA 20215 (Fisher type 2), CFCPA 30720 (Fisher type 3), CFCPA 40057 (Fisher type 4), CFCPA 50243 (Fisher type 5), CFCPA 60534 (Fisher type 6), og CFCPA 70018 (Fisher type 7). Her er CFCPA en forkor-telse for "Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa", som er laget hos Cheil Food and Chemicals Inc. hvor oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse er ansatt, og navnet av gjeldende stamme, Pseudomonas aeruginosa.

De svekkede Pseudomonas aeruginosastammer fremskaffet ved gjentatte renskningsprosedyrer som beskrevet ovenfor har fenotyper og mikrobiologiske egenskaper som i hovedsak er identiske med dem hos tilsvarende opphavsstammer, men viser nye egenskaper som er nyttige ved fremstilling av et vaksineantigen for profylakse mot Pseudomonas aeruginosa-infeksjon istedenfor enhver patogenisitet som er til stede i opphavsstammene før svekkelse. Følgelig blir de svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse ansett som nye mikroorganismestammer. Ut fra dette ble disse stammene deponert ved The Korean Culture Center of Microorganisms i The Korean Federation of Culture Collections, heretter KCCM, som en internasjonal deponeringsmyndighet under Budapest Konvensjonen 12. mai 1993 under tilgangsnummeret KCCM 10029 for CFCPA 10142, KCCM 10030 for CFCPA 20215, KCCM 10031 for CFCPA 30720, KCCM 10032 for CFCPA 40057, KCCM 10033 for CFCPA 50243, KCCM 10034 for CFCPA 60534 og KCCM 10035 for CFCPA 70018.

Renseprosedyrene for å danne de svekkede Pseudomonas aeruginosastammer blir gjentatte ganger utført generelt inntil stammene viser de ønskede LD50-verdier. Selv om antall opprenskningsprosedyrer eller trinn varierer avhengig av dyk-tighetsnivået hos arbeideren, toksisiteten av opphavsstam-men og lignende, blir opprenskningstrinnet fortrinnsvis utført 3 til 7 ganger, f .eks. inntil LD50 av Pseudomonas aeruginosa er minst 2 x IO<7> celler. LD50-nivået av nye svekkede Pseudomonas aeruginosastammer således fremskaffet i henhold til foreliggende oppfinnelse hos mus er fortrinnsvis 2,0 x IO<7> celler eller mer.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en vaksine for immunisering mot Pseudomonas aeruginosa-infeksjon og som

blir fremstilt ved å adskille celleveggsproteiner i en ren tilstand fra hver av de nye svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse som fremskaffet ovenfor, og deretter ytterligere rense de atskilte celleveggsproteiner, og slå sammen de rensede celleveggsproteiner således fremskaffet i et vist blandeforhold, fortrinnsvis i like mengder av celleveggsproteinene fra hver av de ønskede Pseudomonas aeruginosastammer for hvilke immunisering er ønsket. Det vil si mengden som brukes for hver stamme er den som er tilstrekkelig til å indusere immunisering mot denne stamme hos en spesiell vertstype.

I tillegg gir foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av vaksiner for immunisering mot Pseudomonas aeruginosa, særpreget ved at de svekkede Pseudomonas aeruginosastammer blir inkubert i fermentorer under opprettholdelse av optimale vektbetingelser for å fremskaffe en Pseudomonas aeruginosa-stammemasse. Den fremskaffede mikroorganismemassen blir behandlet i henhold til en serie fremgangsmåter som inkluderer ekstraksjon av celleveggsproteiner ved behandling med organisk oppløsningsmiddel, fraksjonering basert på molekylvekter, ultrasentrifugering for å fremskaffe de ønskede celleveggsproteiner. De fremskaffede celleveggsproteinene avledet fra de sju {7} typene svekkede Pseudomonas aeruginosastammer blir slått sammen med hverandre i en passende sammensetning ved et ønsket forhold, fortrinnsvis i like mengder. Fremgangsmåten for fremstilling av vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse som beskrevet ovenfor kan bli oppsummert som følger.

Heretter vil vaksineblandingene ifølge foreliggende oppfinnelse bli mer spesielt forklart under henvisning til fremstillingsmetoden derav.

For å fremstille vaksiner for profylakse mot Pseudomonas aeruginosa i henhold til foreliggende oppfinnelse blir i det første trinn sju typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, henholdsvis CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 og CFCPA 70018 inkubert i en fermentor av passende størrelse. Som dyrkningsmedium for dette formål er tryptisk soyamedium, eller fortrinnsvis et spesialmedium som beskrevet nedenfor egnet for inkubering av Pseudomonas aeruginosa som beskrevet ovenfor.

Det spesielle medium innbefatter glykose (3Og/l), pepton (I5g/1), MgS04 (0,5g/l), CaC03 (5g/l), KHaPO< (lg/1), FeS04 (5mg/l), CuS04 (5mg/l), og ZnS04 (5mg/l). Dette spesielle medium er utelukkende utformet av nærværende oppfinnere for dyrkning av Pseudomonas aeruginosastammer. Når Pseudomonas aeruginosastammer blir dyrket i det spesielle medium, er utbyttet av bakteriemassen minst 30 % høyere enn den bakterielle massen dyrket på tryptisk soyamedium på basis av vekten av tørr bakteriemasse. Følgelig er bruken av et slik spesielt medium en foretrukket utførel-sesform.

I et slikt bakterielt masseinkuberingstrinn er de optimale dyrkningsbetingelser: temperatur 37°C, aereringsgrad 1 wm {volum/volum, minutt) og utsåingsvolum 5 % v/v av dyrk-ningsmediumoppløsningen, og inkuberingen blir utført under en omrøringshastighet på 100 omdr./min. i opprinnelig 2 timer og deretter 600 omdr./min. i 10 til 20 timer, fortrinnsvis i 12 til 16 timer.

Ved avslutning av inkubering blir i det andre trinn de utfelte bakterieceller adskilt fra dyrkningsoppløsningen ved hjelp av sentrifugering eller lignende. De atskilte bakterieceller blir behandlet i det tredje trinn med et organisk oppløsningsmiddel for å inaktivere mikroorganismene og på samme tid å fjerne cellevegglipidkomponenter. I det tredje trinn er det organiske oppløsningsmiddel fortrinnsvis valgt fra gruppen omfattende aceton, kloroform, etanol, butanol, etc, hvor aceton er den mest foretrukne.

Derpå omfatter det fjerde trinn gjentatt ekstraksjon av celleveggproteiner, dvs. 5 til 6 ekstraksjoner med cellene i seg selv ikke blir ødelagt, slik at deres celleinnhold er tapt. For dette formål blir mikroorganismeceller holdt i en oppløsning, slik som fosfatbufferoppløsning, trisbuf-feroppløsning og lignende, fortrinnsvis i fosfatbufferopp-løsningen, og blir behandlet med en blander eller homogenisator for å ekstrahere celleveggproteinene. Ekstraksjonen ble fortrinnsvis utført under omrøring ved 100 - 2000 omdr./min. ved 4°C. I tillegg bør i det fjerde trinn spesielle forholdsregler bli tatt for å hindre øde-leggelsen av cellene, slik at de ønskede celleveggproteiner kan bli holdt atskilt fra de toksiske proteiner tilstede i cytoplasma. Således, under ekstraksjonsprose-dyren er det nødvendig å kontinuerlig bestemme hvorvidt cellene blir ødelagt eller ikke ved å bestemme tilstedeværelsen av laktatdehydrogenase eller heksokinase som et cytoplasmisk markørenzym.

Deretter blir celleveggproteinene av de svekkede Pseudomonas aeruginosastammer fremskaffet i en supernatant i henhold til den ovennevnte fremgangsmåte fraksjonert ved å utsette dem for de første og andre ultrafiltreringene for å fremskaffe bare proteiner som har molekylvekter mellom 10.000 og 100.000. I dette trinn er det meget viktig at en molekylvekt av de resulterende celleveggproteiner blir innenfor området 10,000 til 100.000. Grunnen er at molekyl-vekten av celleveggproteiner mindre enn 10.000 ikke gir den ønskede profylaktiske virkning som bestemt med dyreforsøk, mens en molekylvekt som er høyere enn 100.000 kan forårsake toksiske effekter grunnet tilstedeværelsen av høymoleky1vektlipopolysakkarid (LPS).

De separerte celleveggsproteiner fra hver av de syv typer svekkede Pseudomonas aeruginosa med molekylvekt vekt mellom 10.000 og 100.000 blir hver ytterligere renset ved ultrasentrifugering for å fjerne alle mulige mindre lipopolysakkarider som kan være til stede. Derpå blir et trinn for å fjerne alle bakterielle substanser utført for endelig å fremskaffe celleveggproteinene av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer som er ikke-patogene og som har tilstrekkelig renhet for bruk som en vaksine for profylakse mot Pseudomonas aeroginosainfeksjon.

Celleveggproteinene som ble fremstilt fra de syv typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer forenes deretter i et visst forhold for å danne vaksinen. Når frekvensen av opptreden av sykdom av de opprinnelige Pseudomonas aeruginosastammer før svekkelse blir tatt i betraktning bør kombinasjonen av celleveggsproteiner bli foretatt ved å blande celleveggproteiner fremskaffet fra minst tre (3) typer, mer foretrukket fire (4) typer eller mer og mest foretrukket alle de syv (7) typer Pseudomonas aeruginosa-stammer. Selv om blandingsforholdet varierer med typene av Pseudomonas aeruginosastammer fra hvilke celleveggsproteinene kan bli slått sammen erholdes, blir celleveggsproteinene fortrinnsvis blandet i et forhold på like mengder.

F.eks. er de foretrukne vaksinesammensetninger i henhold

til foreliggende oppfinnelse de som inneholder celleveggsproteiner fremskaffet fra CFCPA 10142; CFCPA 20215; CFCPA 3072 0 og CFCPA 60534 i et blandingsforhold på 1:1:1,5:0,5; 1:1:1:1 eller 0,5:1,5:1,5:0,5 eller en vaksine som inneholder alle celleveggsproteiner erholdt fra CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057; CFCPA 50243; CFCPA 60534 og CFCPA 70018 i et blandingsforhold av i hovedsak like mengder. Den minste mengde celleveggspro-teinblanding fra hver av stammene Pseudomonas aeruginosa til stede i vaksinen, er den minimale mengde som er tilstrekkelig til å indusere immunisering i den påtenkte vert/pasient.

Hvis ønsket, kan vaksinen for profylakse mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatte, i tillegg til celleveggsproteinkomponentene fremstilt som ovenfor, farmasøytisk akseptable eksipienter, f.eks. kalsiumhydroksid, kalsiumfosfat, ISCOM (immu-nostimulerende kompleks, SAF-1 (Syntex Adjuvant Formulation-1), SAFm (modifisert Syntex Adjuvant Formulation) og liknende eksipienter kjent for fagmannen.

For anvendelse som en profylaktisk vaksine mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon, varierer dosen som skal tilføres med kjønn, alder, vekt, helsetilstand, etc, hos individene som kan være eksponert for Pseudomonas aeruginosa, men er generelt 0,5 til 2,5 mg av blandingen av celleveggsprotein fra hver av de svekkede stammer. Denne mengde blir generelt erholdt fra en bakteriemasse med tørrevekt 0,1 g - 0,5 g (tilsvarende våtvekt 0,5 til 2,5 g). Den foretrukne tilføringsrute er ved intramuskulær injeksjon.

Ifølge et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse kan celleveggsproteinet fremskaffet i ren tilstand fra den svekkede Pseudomonas aeruginosastamme i foreliggende oppfinnelse også brukes som en antistoffindusator for å indusere immunoglobulin til forsøksdyr. Følgelig gir foreliggende oppfinnelse et terapeutisk middel for å behandle en Pseudomonas aeruginosainfeksjon som inneholder et immunoglobulin fremstilt ved injeksjon av celleveggsproteinet i ren tilstand fremskaffet ved separasjon og opprenskning som nevnt ovenfor i et forsøksdyr for å indusere dannelse av et immunoglobulin mot Pseudomonas aeruginosa.

Spesielt er det separerte og rensede celleveggsprotein fremskaffet i henhold til foreliggende fremgangsmåte som spesielt illustrert ovenfor fra svekkede Pseudomonas aeruginosastammer ifølge foreliggende oppfinnelse et antigen benyttet til å inokulere forsøksdyr, slik som sauer, kaniner, etc for å indusere dannelsen av det relaterte antistoff. Blodet blir samlet opp fra forsøksdyrene og derpå blir serumet atskilt. Det atskilte serum behandles på kjent måte for å oppnå det ønskede immunoglobulin i renset tilstand. For dette formål kan separasjonen og opprensk-ningen av immunoglobulin fra det atskilte serum bli utført i henhold til velkjente metoder innenfor det relevante tekniske [se Practical Immunology, 3. utg. (1989), 292-294], f.eks. ved å blande det atskilte serum med destillert vann, tilsette blandingen til DEAE-cellulose (die-tylaminoetylcellulose) for å tillate immunoglobulinet å bli absorbert, fjerne supernatanten og derpå vaske den immunoglobulinabsorberte DEAE-cellulose flere ganger med fosfatbufferoppløsning for å fremskaffe det rensede immunoglobulin.

Immunoglobulinet som benyttes ved den terapeutiske behandling for å behandle Pseudomonas aeruginosainfeksjonen, blir fremskaffet ved å immunisere et forsøksdyr med en blanding inneholdende celleveggsproteiner separert fra forskjellige svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i et visst forhold. For dette formål kan et kombinert immunoglobulin fremskaffes ved å immunisere forsøksdyret med en blanding omfattende hver av celleveggsproteinene fremskaffet fra hver av de syv (7) typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i et visst forhold, fortrinnsvis i et forhold på like mengder bli brukt. Imidlertid, når kryss-reaktiviteten fra hver av immunoglobulinene blir vurdert, gir immunoglobulinene fremskaffet ved å immunisere et for-søksdyr med en blanding bestående av celleveggsproteiner atskilt fra hver av de 4 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer som følger: CFCPA 10142, CFCPA 2 0215, CFCPA 30720 og CFCPA 60534 og i et forhold på 1:1:1:1 vesentlig terapeutisk effekt på infeksjoner forårsaket av alle Pseudomonas aeruginosastammer som har Fisher-typer 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7. Dette er det foretrukne kombinerte immu-noglobulinterapeutiske middel for å behandle en sykdom forårsaket av Pseudomonas aeruginosa.

Immunoglobulinet for Pseudomonas aeruginosa i henhold til foreliggende oppfinnelse kan bli formulert til farmasøyti-ske blandinger i en frysetørket form eller en flytende form og, om nødvendig, ytterligere inneholde farmasøytisk aksepterbare bæremidler og lignende. De farmasøytisk akseptable bærestoffer som kan anvendes innbefatter fortrinnsvis for eksempel mannitol, laktose, sakkarose, humant albumin, etc. i tilfellet med frysetørkede preparater og fysiologisk saltvann, vann for injeksjon, fosfat-bufferoppløsning, aluminiumhydroksid i tilfellet med flytende preparater.

Doseringen av immunoglobulin varierer avhengig av alder, kroppsvekt, kjønn og generell helsetilstand hos individet, alvorligheten av Pseudomonas aeruginosainfeksjonen og komponentene av det kombinerte immunoglobulin som blir til-ført. Immunoglobulinet blir generelt tilført i en mengde på 0,1 mg til 1000 mg, fortrinnsvis l mg til 100 mg. pr. dag, pr. kg kroppsvekt til en voksen via intravenøs rute.

Foreliggende oppfinnelse vil bli mer spesielt illustrert av de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1:

Isolering av Pseudomonas aeruginosastamme fra Pseudomonas aeruginosainfiserte pasienter, samt identifisering derav.

Fra hver av 260 forskjellige blodprøver tatt fra Pseudomonas aeruginosainfiserte pasienter, ble omkring 1 til 5 ml porsjoner aseptisk samlet opp og tillatt å stå i én time ved romtemperatur. Etter at blodet var lagret over natten i et kjøleskap ved 4°C ble det sentrifugert med 1500 x g (g:gravitasjon) i 10 minutter ved 4°C for å fjerne faste bestanddeler og fremskaffe et supernatant serum. Serumet som ble fremskaffet ovenfor ble fortynnet med fosfat-bufferoppløsning (NaH2P04 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCl 8,766 g pr. liter) i et forhold på 1:10 (serum til oppløsning) og deretter spredt på en tryptisk soyamedium-kulturplate ved å tilsette 1,0 til 1,5 % agar, som var fremstilt tidligere. Kulturplaten ble inkubert i 12 timer eller mer, i en inkubator holdt ved en konstant temperatur på 37°C under aerobe betingelser. Kulturene således fremskaffet ble overført til ferske kulturplater og deretter ble de ønskede mikroorganismer isolert i ren tilstand ved hjelp av en kjent mikroorganismeren isoleringsmetode [se Thomas D. Brock and Michael T. Madigan, Bilogy of Miroorganisms (1988), 5. utg. s. 32-33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey].

For de isolerte Pseudomonas aeruginosastammer har deres serologiske og immunologiske karakteristika allerede blitt beskrevet (se, Bergey's Manual) og deres identifikasjon kan bli bestemt under anvendelse av et kommersielt ana-lysesett i henhold til analysemetoden beskrevet i J. Gen. Microbiol, 130, 631-644, 1984. Hver Pseudomonoas aerugin-osast amme ble inokulert i et forsøksrør inneholdende 5 ml tryptisk soyamedium og derpå inkubert ved 37°C under aerobe betingelser for å justere konsentrasjonen av bakteriell masse til å bli hold ved en absorbans på tilnærmet 2,0 eller mer under synlig lys på 650 nm.

En porsjon på 1 ml ble tatt aseptisk fra denne kulturopp-løsning og sentrifugert med 6000 x g ved 4°C i 10 minutter. Supernatantkulturoppløsningen ble fjernet og den utfelte mikroorganisme ble suspendert ved å tilsette samme mengde sterilisert saltvann. 15 ul av hvert forsøksserum inneholdt i settet og kontrollserum (normal kaninserum) ble tilsatt til hver brønn av en 96-brønners mikroplate og ble blandet med 15 pl mikroorganismesuspensjon fremskaffet ovenfor for å bestemme hvorvidt agglutineringen inntreffer innen 10 til 30 minutter. I dette forsøk, siden mikroor-ganismestammen i en brønn med positiv agglutinering har en serotype som er identisk med den til serumet tilsatt dette, kunne identifiseringen av de isolerte mikroorganismer lett bli oppnådd.

EKSEMPEL 2:

Utvelgelse av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer fra hver av de isolerte Pseudomonas aeruginosastammer.

For å svekke Pseudomonas aeruginosastammer for å fremskaffe sikre mikroorganismer for bruk ved fremstillingen av en vaksine, ble én stamme for hver av Pseudomonas aeru-ginosastammene som har forskjellige immunotyper valgt ut og derpå svekket ved gjentatte opprenskninger.

I denne prosedyre ble kontrollen for en toksisk Pseudomonas aeruginosastamme GN 11189 (Episome Institute, Japan) valgt som viser en dødelighetsgrad på 100 % etter 3 dager etter intravenøs (eller intraperitoneal) injeksjon på 2,0 x 10s celler GN 11189 i ICR hannmus som veier 20 til 25 g.

Hver stamme av de ovenfor utvalgte Pseudomonas aeruginosa-stammer som har en forskjellig immunotype ble dyrket i tryptisk flytende soyamedium under de samme betingelser som i eksempel 1 og derpå sentrifugert med 600 x g ved 4°C i 10 minutter. Det erholdte cellepresipitat ble suspendert i 10 ml fysiologisk saltvann, sentrifugert igjen under de samme betingelser som ovenfor og derpå fortynnet med ferskt fysiologisk saltvann for å justere celleinnholdet til 5 x 10s, 5 x IO<6>, 5 x 10<7> og 5 x IO<8> celler pr. ml. Hver cellefortynning ble administrert til én gruppe bestående av 10 ICR mus via den intravenøse (eller intraperitoneale) rute. Til kontrollgruppen ble GN 11189 stammen tilført i en mengde på 2,0 x 10<*> celler pr. kontrolldyr. Ved det punkt hvor dødeligheten innen 3 dager i kontrollgruppen er 100 % ble Pseudomonas aeruginosastammer isolert aseptisk fra ICR mus/mus som overlevde ved den høyeste cellekon-sentrasjon. De isolerte Pseudomonas aeruginosastammer ble igjen spredt på tryptisk soya-agarplatemedium. Etter mik-roorganisk ren isoleringsmetoden som nevnt ovenfor ble hver mikroorganismestamme isolert i ren tilstand. ;Alle syv (7) typer av de første svekkede mikroorganismer ble gjentatt passert gjennom ICR mus omkring 3 til 7 ganger i henhold til metoden beskrevet ovenfor inntil den ønskede LD50 på minst 2,0 x 107 celler ble oppnådd for hver mikroorganismestamme. Sikkerhetsverdien for hver endelig svekkede Pseudomonas aeruginosastamme som er uttrykt som LD50 er opplistet i den følgende tabell 2. ;Alle de syv (7) typer mikroorganismer som nevnt ovenfor oppviste LDS0-verdi på minst 2,0 x IO<7> celler. Følgelig kunne det bli funnet at de svekkede mikroorganismer ble valgt ut. ;EKSEMPEL 3 ;Identifisering av svekkede Pseudomonas aruginosastammer ;Sterilisert cetrimid (10 % w/v) ble tilsatt til et flytende næringsmedium (pH 7,2-7,4) som ble fremstilt ved dampsterilisering i en autoklave ved 121°C i 15 minutter til en endelig konsentrasjon på 0,3 % (v/v). En 10 ml porsjon av det således fremskaffede medium ble tatt aseptisk og deretter innført i et forsøksrør, til hvilket én dråpe av hver svekkede Pseudomonas aeruginosastamme isolert i ren tilstand i henhold til eksempel 2 foran, ble inokulert og derpå utsatt for utsåingsdyrking ved 30 til 37°C i 12 til 16 timer. ;Fra forsøksrøret hvor veksten av mikroorganisme inntreffer, ble 0,5 ml av kulturoppløsningen tatt, spredt på en plate av cetrimid-agar-medium som Pseudomonas aeruginosa-isoleringsmedium og derpå ble platen inkubert. Kolonien som først ble identifisert som Pseudomonas aeruginosa ved pigmentdannelse ble overført og inkubert på et Pseudomonas aeruginosa-agar-medium for påvisning av fluorescin (Prote-ose pepton nr. 3 (oksoid) 2 %, glycerol (dobbelt-destillert) 1%, KjHP04 (vannfri) 0,15%, MgS04.7H20 0,15%, Agar 1,5% (w/v), pH 7,2) og deretter et Pseudomonas aeruginosa-agar-medium for påvisning av pyocyanin (Pepton (Difco) 2%, glycerol (dobbeltdestillert) 1%, K2S04 (vannfri 1%, MgCl2 (vannfri) 0,14%%, agar 1,5 (w/v), pH 7,2) og deretter igjen undersøkt for morfologisk test, næringsmiddelkrav og oksydasetest for å bestemme tilstedeværelsen av Pseudomonas aeruginosa-stammen. Typene av de utvalgte Pseudomonas aeruginosastammer ble bestemt i henhold til IATS klassifiseringssystem ved å bruke et Pseudomonas aeruginosa anti-gensett (fremstilt av Difco Laboratories, Detroit, Michi-gan, USA) og deretter klassifisert av Fisher immunoseroty-per. Resultatene derav er beskrevet i den følgende tabell 3. ;EKSEMPEL 4 ;Fysiologiske karakteristika av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer ;(1) Hver av de syv typer Pseudomonas aeruginosastammer svekket i henhold til eksempel 2, med veksthastigheter avhengig av forskjellige pH-verdier ble bestemt. Hver mikro-organismes tamme ble inokulert i 50 ml tryptisk soyamedium med en pH-verdi på 7,2, og derpå preinkubert ved 37°C i 12 til 16 timer under aerobe betingelser med en omrøringshas-tighet på 200 omdr./min. Hver preinkuberte bakterielle massestamme ble inokulert i 500 ml av hver av ferskt tryptisk soyamedim med pH 3,0, pH 5,0, pH 7,0 og pH 9,0 i den endelige konsentrasjon på 1% (v/v) og derpå inkubert i fermentorer ved 37°C under de samme betingelser som ovenfor. Under denne periode ble en prøve fremskaffet fra hvert kulturmedium ved et intervall på 2 timer og derpå ble konsentrasjonen av bakteriell masse bestemt ved å måle absorbansen av prøven ved 600 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Resultatene derav er beskrevet i den følgende tabell 4. ;Som det kan sees fra tabell 4, vokste de svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse ikke under svært sure betingelser, f.eks. ved pH 3,0, men viste i det vesentlige identiske eller lignende veksthastigheter under mediumbetingelser ved pH 5,0 til pH 9,0. Følgelig kan, i foreliggende oppfinnelse, alle 7 typer mikroorganismer vokse meget godt innenfor et bredt pH-område. (2) I henhold til samme metode som under (1) ovenfor, ble veksthastighetene for Pseudomonas aeruginosastammer bestemt i henhold til temperaturvariasjoner. Hver av de 7 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer ble inokulert i 50 ml tryptisk soyamedium ved en pH-verdi på 7,0 og deretter preinkubert i 12 til 16 timer ved 3 7°C under aerobe betingelser med en omrøringshastighet på 200 omr./min.. Hver av de pre-inkuberte stammer ble inokulert i 500 ml tryptisk soyamedium ved en pH-verdi på 7,0 og deretter inkubert i fermentorer, som ble holdt ved forskjellige temperaturer på 25°C, 30°C, 37°C og 42°C, under de samme betingelser som ovenfor. I løpet av denne periode ble veksthastigheten i hver fermentor bestemt ved å måle absorbansen av kulturoppløsningen ved 600 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Resultatene er beskrevet i tabell 5. Slik det kan observeres fra tabell 5, viste alle 7 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer den beste vekst ved 37°C og viste også god vekst ved 30°C, 25°C. Imidlertid ved 42°C viste hver av de syv typer Pseudomonas aeruginosastammer en relativt sen veksthastighet i forhold til veksthastigheten ved de andre temperaturer. (3) Det følgende forsøk var å bestemme effekten av karbonkilde på veksthastighet av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer. Hver av de 7 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer ble inokulert i 50 ml tryptisk soyamedium ved en pH-verdi på 7,0 og deretter ved 37°C i 12 til 16 timer under aerobe betingelser med en omrøringshastig-het på 200 omdr./min. Kulturmediet ble så sentrifugert med 6000 x g ved 4°C i 10 minutter under aseptiske betingelser for å innhøste den bakterielle masse som derpå ble resuspendert i 10 ml fysiologisk saltvann. Hver 50 ul av mikro-organismesuspensjonene fremskaffet ovenfor ble henholdsvis inokulert til 5 ml av M9 medium (Na2HP04 7H20 12,8 g, KH,P04 3 g, NaCl 0,5 g, NH4C1 1 g) som inneholder forskjellige karbonkilder (som observert nedenfor og deretter inkubert i 12 timer. Derpå ble for hver kulturoppløsning graden av mikroorganismevekst bestemt ved å måle absorbansen ved 600 nm. ;Vekstkarakteristika for svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammer, avhengig av karbonkilder, oppviste et mønster som i hovedsak var likt vekstkarakteristikaene til generelle Pseudomonas aeruginosastammer, avhengig av karbonkilder {se Bergey's Manual). Det bør imidlertid bli bemerket at selv om Pseudomonas aeruginosa har blitt rapportert til generelt ikke å bruke mannose, oppviste svekket Pseudomonas aeruginosa i henhold til foreliggende oppfinnelse noe vekst i det mannoseinneholdende medium. ;Som det kan observeres fra det ovennevnte kan svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse bli inkubert i et konvensjonelt medium inneholdende en karbonkilde, nitrogenkilde, uorganiske forbindelser, aminosyrer, vitaminer og andre næringsstof-fer under aerobe betingelser ved utvalgt temperatur, pH, osv. for å fremskaffe en bakteriell masse. Celleveggsproteiner fra den resulterende bakterielle massen blir brukt for fremstilling av Pseudomonas aeruginosavaksiner. ;Som karbonkilde for inkubering av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer kan forskjellige karbohydrater, så som glykose, mannitol, fruktose, osv., forskjellige organiske syrer, så som eddiksyre, druesyre, melkesyre, og lignende, bli brukt. For nitrogenkilden kan forskjellige organiske og uorganiske ammoniumsalter, pepton, gjærekstrakter, kaseinhydrolysater og andre nitrogeninneholdende substanser bli brukt. Som uorganiske forbindelser kan magnesium-sulfat, kalsiumkarbonat, jernsulfat, kobbersulfat, zink-sulfat og kaliumhydrogenfosfat og kaliumdihydrogenfosfat og lignende, bli brukt. Inkuberingen blir fortrinnsvis ut-ført ved 25 til 37°C under aerobe betingelser, f.eks. ved hjelp av en platekultur eller av en flytende kultur, så som ristekultur eller aerering spinnerkultur. PH-verdien av mediet blir fortrinnsvis opprettholdt ved pH 5 til 9 under inkuberingsperioden. Fortrinnsvis blir den bakterielle massen, fremskaffet ved sentrifugering av kulturopp-løsningen inkubert i 12 til 16 timer, brukt som utgangsmateriale for fremstilling av vaksiner som beskrevet nedenfor. ;Eksempel 5: ;Inkubering av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer ;(I) I en 5 1 fermentor ble den bakterielle massen av Pseudomonas aeruginosa, fremskaffet i henhold til eksempel 2, inkubert for masseproduksj on som følger. 2,5 1 av medium-oppløsningen, fremskaffet ved å oppløse 3 0 g tryptisk soyamedium per l 1 destillert vann, ble justert til pH 7,2, sterilisert og deretter innført i 5 1 fermentoren. InkuberingsbetingeIsene var: inkuberingstemperatur var 37°C; aereringshastighet var 1 wm,- inokuleringsmengde var 5 % (v/v) av svekket Pseudomonas aeruginosa bakteriell masse fremskaffet fra eksempel 2 for kulturoppløsning; og omrøringshastigheten ble holdt ved 100 omdr./min. i de første 2 timer, og deretter ble inkuberingen fortsatt i 12 til 16 timer ved en fast omrøringshastighet på 600 omdr./min. Selv om mengden av fremskaffet bakteriell masse var noe forskjellig avhengig av type Pseudomonas aeruginosastamme, var det gjennomsnittlige utbyttet omtrent 8g (tørr vekt) bakteriell masse per liter kulturoppløsning. (2) Hver av de sju typer svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammer ble inkubert under samme inkuberingsbetingelser som i ovenfor (l), bortsett fra at det spesielle medium for å dyrke Pseudomonas aeruginosa som består av glykose (30g/l), pepton (15g/l), MgS04 (0,5g/l), CaC03 (5g/l), KH2P04 (lg/l), FeS04 (5 mg/l), CuSO, (5 mg/l) og ZnS04 (5 mg/l) blir brukt som medium. Med dette spesielle mediet ble omkring 10,4 g til 10,5 g (tørr vekt) av bakteriell masse for hver mikroorganismestamme fremskaffet. Således kan bruken av dette spesielle medium gi et utbytte av bakteriemasse som er minst 30% (basert på tørr vekt) høyere enn det i tryptisk soyamedium. ;Eksempel 6: ;Delvis opprenskning av celleveggsproteiner fra svekkede Pseudomonas aeruginosastammer ;For å fremstille vaksiner mot Pseudomonas aeruginosa ble celleveggsproteiner fra hver av de sju typer svekkede ;Pseudomonas aeruginosastammer delvis renset. Nedenfor blir type 3-stammen, dvs. CFCPA 30720 (KCCM 10031) brukt som et typisk eksempel. De andre svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammene kan imidlertid også bli utsatt for samme metode som den følgende opprenskningsmetode for å fremskaffe de delvis rensede celleveggproteinene. ;2,5 1 av det spesielle medium som brukt i eksempel 4 (2) ovenfor ble innført i en 5 1 fermentor, og deretter inkubert i 12 til 16 timer under opprettholdelse av samme inkuberingsbetingelser som ovenfor. Ved avslutning av inkuberingen ble 2,5 1 av kulturoppløsningen sentrifugert ;med 6.000 x g ved 4°C i 20 minutter for å fjerne supernatanten. De utfelte cellene ble resuspendert i en fosfat-bufferoppløsning {Na2HP04 1,15 g, KC1 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCl 8,766 g, per liter, pH 7,2) ved 4°C, igjen sentrifugert, og deretter vasket med samme fosfatbufferoppløsning. Til 130 g av cellene således fremskaffet, ble det tilsatt 3 volumdeler (omkring 390 ml) aceton med hensyn til det opprinnelige våtcellevolum, og blandingen ble tillatt å stå ved 4°C i 12 timer eller mer. Acetonet ble fjernet fra den utfelte cellen, og 2 volumdeler (omkring 260 ml) av ferskt aceton med hensyn til de opprinnelige våtcellevolum ble igjen tilsatt til residuet. Den resulterende blandingen ble omrørt i 5 til 10 minutter, og deretter sentrifugert med 8.000 x g ved 4°C i 20 minutter. Supernat ant acetonet ble fjernet, og til residuet ble samme volum aceton tilsatt. Blandingen ble omrørt og sentrifugert i henhold til samme metode beskrevet ovenfor for å fjerne supernatanten. De utfelte cellene ble tørket på en plate ved romtemperatur for å fjerne aceton. De tørkede mikroorganismene ble resuspendert ved å tilsette 250 ml av samme fos-fatbufferoppløsning som ovenfor, slik at den endelige konsentrasjonen kunne bli justert til 10% (v/v). Den resulterende blandingen ble behandlet med en homogenisator ved en hastighet på 500 til 1.500 omdr./min. i 10 minutter under opprettholdelse av en temperatur på 4°C for å ekstrahere celleveggsproteiner. Den fremskaffede suspensjonen ble sentrifugert med 8.000 til 10.000 x g i 30 minutter for å fremskaffe supernatanten. De utfelte cellene ble atskilt, igjen suspendert ved å tilsette samme volum fosfatbuffer-oppløsning, og deretter utsatt for en andre ekstraksjon under samme betingelser som ovennevnte første ekstraksjon for å fremskaffe supernatanten. ;Ved å bruke samme betingelser som første ekstraksjonsme-tode ble celleveggsproteiner gjentatt ekstrahert 5 til 6 ganger, mens det utøvdes forsiktighet for ikke å ødelegge (lysere) noen av cellene. Destruksjonen av cellene kan bli bestemt ved å måle et spesifikt protein som en cytoplasmisk markørsubstans, dvs. laktatdehydrogenase eller heksokinase. De ekstraherte supernatantene hvorav hver blir undersøkt for å sikre at celleveggsproteiner blir ekstrahert uten inkorporering av cytoplasmiske proteiner, laktatdehydrogenase og heksokinas, blir samlet opp, omrørt, og så til slutt resentrifugert med 10.000 x g ved 4°C i 30 minutter for å fremskaffe en klar supernatant. Proteinopp-løsningen således fremskaffet besto kun av i hovedsak rene celleveggsproteiner, og ble justert med proteinmengde-bestemmende assay slik at proteinkonsentrasjonen blir holdt ved et nivå på 1 mg/ml til 2 mg/ml. Ytterligere ble renheten av proteinoppløsningen bestemt ved hjelp av 10 til 15% konsentrasjonsgradientelektroforese. Som et resultat kunne det bli funnet at de ønskede celleveggsproteiner med en molekylvekt i området fra 10.000 til 100.000 var til stede (se fig. 1). ;Eksempel 7: ;Ren opprenskning av grovproteiner ;Den følgende fremgangsmåte ble utført slik at grovcelle-veggsproteinoppløsningen i en konsentrasjon på 1 til 2 mg/ml ville bli renset for å inneholde kun de effektive komponentene. 2 til 2,5 1 grovcelleveggsproteinoppløsning ble først un-derkastet en molekylvekt 100.000 "cut-off" membranfiltre-ring i Pellicon Cassette systemet for å fjerne proteinmolekyler som har molekylvekt over 100.000. I henhold til denne fremgangsmåten ble proteiner som har molekylvekt under 100.000 gjenvunnet som filtrat, og proteiner som har molekylvekt større enn 100.000 ble kontinuerlig sirkulert til å bli atskilt fra de små molekyler som har molekylvekt under 100.000. ;Som et resultat ble proteinoppløsningen konsentrert med 10 til 20 % av det opprinnelige volum, og ble påfølgende vasket med 20 til 25 1 (ti ganger mengden av det opprinnelige volum av proteinoppløsning) av sterilisert fosfatbuf-feroppløsning {Na2HPO« 1,15 g, KC1 0,2 g, KHaP04 0,2 g, NaCl 8,766 g, per liter) for å gjenvinne 90% eller mer av proteinene som har molekylvekt under 100.000. Proteinene som har molekylvekt under 100.000 atskilte, idet filtratet ble påført, et molekylvekt 10.000 "cut-off" membranfilter i samme system, for å fjerne proteiner som har molekylvekt mindre enn 10.000 og andre urenheter, og på samme tid kon-sentrere proteinene som har molekylvekt på 10.000 til 100.000 til en konsentrasjon på 1 mg/ml. ;Til slutt ble supernatanten ultrasentrifugert for å fjerne lipopolysakkarid (LPS) og celleveggsrelaterte fragmenter som muligens er til stede i supernatanten fremskaffet ovenfor i spormengder. Ultrasentrifugering utføres med 180.000 x g til 200.000 x g i 3 timer ved 4°C. Etter fjerning av presipitatene ble den fremskaffede supernatanten sterilisert ved filtrering gjennom 0,2um filter for å fremskaffe 250 til 260 mg proteinblanding for bruk i vaksiner for profylakse mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon. ;Eksempel 8:;Opprenskning av celleveggsproteiner fra svekkede Pseudomonas aeruginosastammer med foreskjellige immunotyper. ;De gjenværende seks typer svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammene i henhold til foreliggende oppfinnelse, dvs. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 og CFCPA 70018 ble behandlet i henhold til sammen metode som den for mikroorganismeinkuberingen og opprensk-ningen for å fremstille vaksineblanding for CFCPA 3 0720 Pseudomonas aeruginosastamme, som beskrevet i eksempel 5, eksempel 6 og eksempel 7. De endelige Pseudomonas aeruginosa-vaksineblandinger således fremskaffet viste samme brede mønster av CFCPA 30720 vaksineblanding i 10 til 15 konsentrasjonsgradient SDS-PAGE. I tillegg kunne det bli bestemt, som et resultat av sammenligning med standard molekylvektsmarkør, at alle proteiner inneholdt i vaksineblandingene har en molekylvekt i området fra 10.000 til 100.000 (fig. 1). ;Eksempel 9: ;Kryssbeskyttende kapasitetsforsøk med kombinerte anti-gener . Celleveggsproteinene, avledet fra hver svekkede Pseudomonas aeruginosa-stamme etter separasjons- og opprensknings-trinnene i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 7 og 8, ble intraperitonealt tilført i en mengde på 0,2 mg/kg til 6 ukers gamle ICR hann-mus som veide 23 til 25 g for å immunisere dyret. Hver gruppe besto av 10 til 15 forsøksdyr. En uke fra immuniseringen ble blod tatt fra 2 til 3 mus per gruppe for ELISA (enzymtilknyttet immuno-sorbentassay). For de gjenværende ICR mus ble Pseudomonas aeruginosa-villtypestamme, tilsvarende den respektive immunotype, injisert i en mengde på 10 til 50 ganger den opprinnelige LD50-verdi for hver mikroorganismestamme opplistet i tabell 2 i eksempel 2. Den beskyttende effektiviteten mot hver Pseudomonas aeruginosstamme ble kontinuerlig undersøkt i en uke. Som et resultat viste alle for-søksgruppene en beskyttende effekt mot de tilsvarende Pseudomonas aeruginosastammer, og ELISA'ene til alt det oppsamlede blodet oppviste også gode positive verdier, noe som betyr en forbedring i de immunologiske responser. ;I foreliggende oppfinnelse ble, for fremstilling av vaksiner som er i stand til å oppvise felles beskyttende effekt mot infeksjoner forårsaket av enhver type Pseudomonas aeruginosastammer, fire typer av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer (tre typer Pseudomonas aeruginosastammer som oftest blir påvist i menneskelige infeksjoner, og en type Pseudomonas aeruginosastamme som er vanskelig å over-vinne om den blir kontaktet, dvs. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 og CFCPA 60534) behandlet for å fremskaffe celleveggsproteiner som ble kombinert i et forhold på ekvivalente mengder, og ble derfor undersøkt for kryss-beskyttende kapasitet mot hver immunotype av Pseudomonas aeruginosastammer. ;Celleveggsproteiner separert fra de fire typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, som angitt ovenfor, ble slått sammen i et forhold på ekvivalente mengder (1:1:1:1) basert på vekt. De kombinerte celleveggsproteinene ble tilført intraperitonealt til ICR hann-mus for å immunisere forsøksdyrene. Kontrollgruppen ble gitt 0,3 ml av fosfat-buf feroppløsning (Na2HP04 1,15 g, KC1 0,2 g, KH2P04 0 , 2 g, NaCl 8,766 g, per liter). Etter en uke fra immuniseringen ble hver av forsøksgruppene immunisert med Pseudomonas aeruginosavaksine, og kontrollgruppen immunisert med fos-fatbuf feroppløsning, gitt intraperitonealt Pseudomonas aeruginosa i fem (5) forskjellige konsentrasjoner fortynnet i en serie på 10 ganger fra 1 x IO<8> celler til 1 x 10<* >celler, og etter en uke ble overlevelsestallet av forsøks-dyrene talt opp for å regne ut effektivitetsindeksen (EI). Resultatene derav er opplistet i tabell 7 nedenfor, hvor effektivitetsindeksen er definert som en verdi LDS0 i for-søksgruppen delt på LDS0 i kontrollgruppen. Som det kan observeres fra tabell 7 har en vaksine bestående av celleveggsproteiner, fremskaffet fra 4 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, dvs. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 og CFCPA 60534, en EI-verdi på 3,0 til 18 eller mer mot hver immunotype av Pseudomonas aeruginosa-stammer. Følgelig når det blir tatt i betraktning at vaksiner som har en EI-verdi på minst 2 er ansett som å ha god immunologisk effekt, kan det bli observert at vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse viser god beskyttende effekt mot infeksjoner forårsaket av enhver type av 7 typer Pseudomonas aeruginosastammer.

I henhold til fremgangsmåten som nevnt ovenfor, bortsett fra at blandingen av celleveggsproteiner som ble fremstilt var avledet fra 3 typer svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammer CFCPA 10142, CFCPA 30720 og CFCPA 20215 {gruppe I), og blandingen av celleveggsproteiner fremstilt fra alle 7 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer (gruppe II) hvor alle celleveggsproteiner er til stede i et forhold på ekvivalente mengder blir brukt istedenfor blandingen av 4 typer proteiner, ble den kryssbeskyttende kapasitet av disse 2 typer vaksiner mot infeksjon av hver Pseudomonas aeruginosa undersøkt. Resultatene derav er beskrevet i tabell 8.

Som det kan observeres fra ovennevnte forsøksresultater, siden den blandede proteinkomponentvaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse består av celleveggsproteiner fremstilt fra minst tre (3) forskjellige typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer som viser forskjellige immunotyper fra hverandre, viser denne vaksinen utmerket beskyttende effekt mot enhver immunotype av Pseudomonas aeruginosa sammenlignet med kun én type av felles antigen. Det vil si selv om effektivitetsindeksen av vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse varierer med type og antall utvalgte mikroorganismer fra svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, blandingsforhold av celleveggsproteiner avledet fra disse, immunologisk tidstabell og metode, osv. kan det bli bekreftet at vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse er effektiv mot alle Pseudomonas aeruginosa-stammer som for tiden opptrer hos sykehus og pasienter.

Eksempel 10:

Toksikologisk forsøk for celleveggsproteiner.

For å fremstille en komponentvaksine for profylakse mot infeksjon forårsaket av Pseudomonas aeruginosa, bør sikkerheten av celleveggsproteinene i seg selv som skal bli brukt som komponentvaksine, så vel som sikkerheten av mikroorganismestammene i seg selv som beskrevet i eksempel 2, bli sikret. I dette eksempelet ble celleveggsproteiner delvis renset og deretter undersøkt for sin sikkerhet i et forsøksdyr, dvs. mus. Spesielt ble hver av de svekkede

mikroorganismene inkubert med tryptisk soyamedium som kulturmedium i en 5 1 fermentor, og deretter behandlet i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene 5, 6 og 7. Superaatantene fra celleveggsproteinene, ekstrahert fra

svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, ble samlet opp sammen, igjen sentrifugert med 10.000 x g ved 4°C i 30 minutter for å fjerne finpartikler som muligens var til stede i oppløsning. De resulterende celleveggsproteiner ble filtrert gjennom et Amicon membranfilter for å fremskaffe en blanding av celleveggsproteiner som har molekylvekt i området fra 10.000 til 100.000, som ble konsentrert til en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml, og derpå sterilisert med et 0,2 um filter for å fremskaffe en proteinkilde for toksikologisk testing.

I det toksikologiske forsøket var de benyttede forsøksdy-rene ICR hannmus som veide fra 20 til 22 g. Til denne for-søksgruppen ble proteinkilden injisert intravenøst i en mengde på 20 mg/kg og 100 mg/kg. Kontrollgruppen ble gitt fysiologisk saltvann i en mengde på 25 ml/kg. Som det kan observeres fra tabell 9 og den vedlagte fig. 2 oppviste forsøksgruppen en lett inhibering med hensyn til vekt-økning på første dag etter tilførsel, men viste på og etter andre dag etter tilførsel en normal vekst og ingen spesielle symptomer. I tillegg selv på og etter 7'ende dag ble ingen spesielle endringer eller symptomer i noe organ funnet.

Eksempel 11;

Bestemmelse av antigenisitet av celleveggsproteiner

Celleveggsproteiner, fremskaffet ved partiell opprenskning av svekkede Pseudomonas aeruginosastammer på samme måte som i eksempel 10, ble brukt som et antigen, og ble injisert intravenøst til ICR mus i en mengde på 0,1 mg/kg eller 0,2 mg/kg for å immunisere forsøksdyrene. En uke etter immunisering ble en viss mengde blod tatt fra hver mus av gruppen av mus, serumet ble atskilt fra det oppsamlede blodet, og dannelsen av antistoffet ble bestemt i samsvar med ELISA-metoden {J. Clin. Microbiol. 15, 1054-1058, 1982) .

Først ble 100 ul antigen fremstilt i eksempel 10 som var justert til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml i en beleggsbuf-fer (0,05 M karbonatbufferoppløsning bestående av NaHC03 2,85 g, Na2C03 1,70 g, H20 1, pH 9,6) tilsatt til hver brønn av en 96-brønners mikroplate, og deretter omsatt enten ved romtemperatur i 2 timer, eller ved 4°C i 12 til 14 timer, for at proteinet skulle feste seg til platen.

Etter fjerning av den vandige oppløsningen ble 200 pl av 1% bovinserumalbumin (BSA) tilsatt til hver brønn i platen, og deretter omsatt ved romtemperatur i en time for å blokkere den gjenværende del i brønnene ikke bundet protein .

I dette forsøket ble serum fra en ikke-immunisert mus brukt som et antistoff for kontrollgruppen. Ved avslutning av reaksjonen ble platen vasket igjen 5 til 6 ganger med en fosfatbufferoppløsning (pH 7,0-7,2), og 100 pl av et andre antistoff, dvs. kanin-antimus Ig-peroksydasekonju-gat, ble tilsatt til hver brønn og tillatt å reagere ved normal temperatur i en time.

Deretter ble platen kraftig vasket 7 ganger eller mer med samme fosfatbuffervaskeoppløsning (pH 7,0-7,2). Som et substrat ble 50 pl ortofenylendiamindihydroklorid, justert til en konsentrasjon på 0,3 til 0,4 mg/ml i sitratfosfat-buf f er oppløsning (0,1 M sitratfosfatbuffer, pH 5,0), tilsatt til hver brønn av platen og reagert i 20 minutter ved fravær av lys. Deretter ble 50 ul lN-svovelsyre henholdsvis tilsatt for å stoppe reaksjonen i hver brønn. Deretter ble absorbansen, ved 490 nm for hver reaksjonsoppløsning, målt ved hjelp av et spektrofotometer.

Som det kan observeres fra tabell 10 resulterer i hver forsøksgruppe tilføringen av 0,1 eller 0,2 mg/kg antigen i immunitet som er 2 til 5 ganger høyere enn den hos kontrollgruppen .

Eksempel 12:

Dannelse av immunoglobulin for Pseudomonas aeruginosa

Proteinoppløsningen fremskaffet fra eksempel 7 ble tilført kaniner for å danne det tilsvarende immunoglobulin. Selv om celleveggsproteinet som var fremskaffet fra svekket Pseudomonas aeruginosa-stamme CFCPA 30720 ble brukt som et typisk eksempel, kan samme metode bli anvendt for de andre svekkede Pseudomonas aeruginosa-stammene.

0,5 til 1 ml (inneholdende 100 til 200 ug celleveggsprotein) av celleveggsproteinoppløsningen, fremskaffet fra CFCPA 3 0720 stammen i eksempel 7, ble brukt for å inokulere albinokaniner tre ganger ved intervaller på 7 dager. Deretter ble blod tatt ved jevne intervaller fra hver av kaninene, og serum ble atskilt. 100 ml av det atskilte kaninserumet ble blandet med 300 ml destillert vann, og blandingen ble tilsatt til 500 g (våt vekt) DEAE-cellulose ved 4°C. Den resulterende blandingen ble grundig ristet i en time ved 4°C, tillatt å stå, og deretter ble superna-

tanten atskilt og fjernet. Det gjenværende residuet ble vasket tre ganger med hver 200 ml 0,01 M fosfatbufferopp-løsning (Na2HP04 1,15 g, KH2P04 0 , 2 g, KCl 0,2 g, NaCl 8,766 g, per liter, pH 8,0) for å fremskaffe 600 mg immunoglobulin IgG med renhet på 96 % eller mer.

EKSEMPEL 13

Terapeutisk effekt av immunoglobulin på Pseudomonas aeruginosainfeksj on.

For immunoglobuliner mot Pseudomonas aeruginosastammer fremskaffet i eksempel 12 ovenfor, ble deres terapeutiske effekter på Pseudomonas aeruginosainfeksjon undersøkt på følgende måte. Heretter ble 10 mus brukt i hver gruppe.

1,0 - 3,0 x IO<6> celler fra hver av de patogene Pseudomonas aeruginosastammer av Fisher immunotyper 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 ble injisert intraperitonealt i hver mus for å forårsake Pseudomonas aeruginosainfeksjon. Innen 2 til 6 timer etter injeksjonen ble det rensede immunoglobulin for hver stamme injisert intravenøst til hver mus i en mengde på 0,1 til 2 mg pr. mus for å undersøke den terapeutiske effekt derav.

I kontrollgruppen ble 0,5 ml fysiologisk saltvann for injeksjon injisert intravenøst i stedet for immunoglobulin. I dette forsøk var immunoglobulinene som ble brukt CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 og CFCPA 60534, eller en blanding av disse 4 typer av immunoglobuliner i forhold på ekvivalente mengder.

Som et resultat oppviste kontrollgruppen som mottok kun fysiologisk saltvann en dødelighetsgrad på 50 eller mer innen 48 timer og 100 % etter 72 timer. Forsøksgruppen som mottok det tilsvarende immunoglobulin oppviste imidlertid en overlevelsesgrad på 80 % eller mer etter 72 timer. Føl-gelig kunne det påvises at immunoglobulinet er effektivt for behandlingen av infeksjon forårsaket av patogene Pseudomonas aeruginosastammer som har den tilsvarende Fisher immunotype. Imidlertid hadde intet enkelt immunoglobulin stor effekt på en infeksjon forårsaket av patogene Pseudomonas aeruginosastammer som har Fisher immunotyper 4 og 5.

På den annen side viste musegruppen som mottok kombinasjonen av alle 4 typer immunoglobuliner i forholdet 1:1:1:1

etter vekt overlegen terapeutisk effekt selv på Fisher 4 og 5 typer av Pseudomonas aeruginosastammer grunnet sin kryss-reaktivitet. Følgelig kan den kombinerte immunoglo-bulinsammensetning i henhold til foreliggende oppfinnelse bli brukt som et terapeutisk middel som er effektivt mot infeksjon forårsaket av Pseudomonas aeruginosastammer med alle Fisher-immunotyper. Resultatene av dette forsøk er oppsummert i tabell 11 og 12.

EKSEMPEL 14

Terapeutisk effekt av de kombinerte immunoglobuliner på Pseudomonas aeruginosa-infeksj on.

4 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer valgt fra eksempel 13, dvs. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 og CFCPA 60534 ble inkubert og ekstrahert i henhold til samme fremgangsmåte som eksempel 5, 6 og 7 for å fremskaffe den kombinerte blanding av celleveggsproteiner som deretter ble inokulert tre ganger ved intervaller på én uke i en mengde på 1,5 til 2 mg i geiter ifølge den samme fremgangsmåte som eksempel 13 for å fremskaffe de kombinerte Pseudomonas aeruginosa immunoglobuliner i stor mengde som ble renset i henhold til kjente metoder {se Practical Immunology, 3. utg. (1989), s. 292-294.

For å bestemme den immunologiske beskyttende effekt og terapeutiske effekt av det rensede og sammenslåtte immunoglobulin fremskaffet ovenfor på patogene Pseudomonas aeruginosa Fisher immuotyper, Petogene Pseudomonas aeruginosa-stammer med hver immunotype inokulert i en musegruppe (seks grupper : 20 mus pr. gruppe) hvori den kombinerte immunoglobulinblanding på forhånd var injisert tre ganger og en annen musegruppe (seks grupper; 10 mus pr. gruppe som ikke mottok noen immunoglobulinblanding i en mengde på 1,0 til 3,0 x 10<6> celler pr. mus for å observere den immunologiske beskyttende effekt av det kombinerte immunoglobulin. I tillegg ble en annen musegruppe (seks grupper: 10 mus pr. gruppe) patogene Pseudomonas stammer først inokulert og etter 2 til 6 timer ble den kombinerte immunoglo-bulinsammensetning erholdt ovenfor injisert intravenøst i en mengde på 0,1 til 5 mg pr. mus som veide ca. 20 til 25 g for å observere den terapeutiske effekt av immunoglobu-linblandingen i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Som et resultat derav kunne det bli vist at den kombinerte immunoglobulinblanding i henhold til foreliggende oppfinnelse oppviser en immunologisk beskyttende effekt på 80% eller mer, og en terapeutisk effekt på 75% eller mere (bestemt som overlevelsesgraden (%) etter 7 dager), mens alle i kontrollgruppene hadde dødd innen 3 dager.

Følgelig kan det bli bestemt at den kombinerte immunoglobulinblanding ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli brukt som et nyttig medisinsk middel som viser både utmerket terapeutisk effekt og immunologiske beskyttende effekt.

EKSEMPEL 15

Formulering av immunoglobuliner

Kombinasjonen av celleveggsproteiner som ble erholdt ved inkubering og ekstraksjon av 4 typer svekkede Pseudomonas aeruginosastammer utvalgt i eksempel 13, dvs. CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 og CFCPA 60534 i henhold til samme metode som i eksemplene 5, 6 og 7 ble tilført hann-geiter på samme måte som eksempel 14 for å erholde det kombinerte Pseudomonas aeruginosa-immunoglobulin som ble separert og renset, og derpå formulert ved å bruke forskjellige farmasøytisk akseptable bæremidler slik at 1 til 100 mg antistoffimmmunoglobulin kan ble tilført pr. kg. kroppsvekt. Det formulerte immunoglobulin ble administrert til mus infisert med Pseudomonas aeruginosa for å bestemme effektiviteten av immunoglobulinet avhengig av typene bæremidler brukt for immunoglobulinet. Som et resultat av dette, i tilfellet med flytende formuleringer oppviser immunoglobulinpreparatet med fysiologisk saltvann for injeksjon eller fosfatbufferoppløsning som et bæremiddel en høy effektivitet og i tilfellet med frysetørkede formuleringer gir bruken av mannitol, sakkarose eller laktose som et bæremiddel høy effektivitet av immunoglobulinpreparatet. På den annen side senker i en frysetørket formulering anvendelsen av human albumin sammen med Pseudomonas aeruginosa immunoglobulin i henhold til foreliggende oppfinnelse effektiviteten av immunoglobulin og i tilfellet med flytende formuleringer viser bruken av aluminiumhydroksid som et farmasøytisk bæremiddel lav effektivitet. Resultatene er oppsummert i tabell 13.

EKSEMPEL 16

Effektivitet for den formulerte immunoglobulinblanding

Det formulerte immunoglobulin med en fosfatbufferopp-løsning som vist for å gi den høye effektivitet fra for-søksresultatet i eksempel 15 ble undersøkt for å bestemme effektivitet som et profylaktisk og terapeutisk middel for en sekundær kuntan infeksjon i sår, brannskader, trauma og lignende. En mus mottok en brannskade i henhold til brann-skadeforsøksprosedyren [se, J. Infect. Dis. 131, 688-691,

1975]. Det flytende preparat inneholdende 0,5 til 1 mg av

kombinert Pseudomonas aeruginosa immunoglobulin pr. 1 ml fosfatbufferoppløsning ble formulert til en spray som deretter ble påført brannskadedelen hos musen i forsøks-gruppen for å bestemme effekten derav i sammenligning med den til kontrollgruppen som ikke hadde noen behandling med immunoglobulinsprayen. Som et resultat av dette forsøks viste musegruppen behandlet med immunoglobulin-fosfat-buf feroppløsningsprayen bemerkelsesverdig høyere overlevelsesgrad enn den ikke-behandlede gruppe. Følgelig kan det påvises at det Pseudomonas aeruginosa-immunoglobulin-inneholdende preparat i henhold til foreliggende oppfinnelse oppviser en overlegen beskyttende effekt og en overlegen terapeutisk effekt på Pseudomonas aeruginosa-infeksjon. Resultatene av dette forsøk er beskrevet i den følgende tabell 14.

Som beskrevet ovenfor er hver svekkede Pseudomonas aeruginosastamme i henhold til foreliggende oppfinnelse i hovedsak sikker i forhold til villtype eller patogene arter. I tillegg, siden celleveggsproteinene derav oppviser en utmerket sikkerhet og kryssbeskyttende egenskap og også en overlegen nøytraliserende antistoffdannelseskapasitet, kan celleveggsproteinene bli brukt ikke bare som en vaksine for profylakse mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon, mens også som en antistoffinduser i forsøksdyr for å danne immunoglobulin som kan bli brukt som et terapeutisk middel mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon. Følgelig kan det bli observert at svekkede Pseudomonas aeruginosastammer i henhold til foreliggende oppfinnelse er meget anvendelige mikroorganismer for å fremstille en profylaktisk vaksine og et terapeutisk middel mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon.

Claims (7)

1. Svekket Pseudomonas aeruginosa-stamme, karakterisert ved at den har en LDS0 på minst 2,0 x IO<7> celler i mus og som blir fremskaffet ved å isolere Pseudomonas aeruginosa i ren tilstand i henhold til immunotype fra pasienter infisert med Pseudomonas aeruginosa, og utsette den isolerte stammen for gjentatt opprenskning for å svekke stammen, idet Pseudomonas aeruginosa- stammene er er valgt fra slike stammer som har til-gangsnummer ved Korean Federation of Culture Colection KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215), KCCM 10031 (CFCPA 30720), KCCM 10032 (CFCPA 40057), KCCM 10033 (CFCPA 50243), KCCM 10034 (CFCPA 60534) og KCCM 10035 (CFCPA 70018) .

2. Anvendelse av minst én Pseudomonas aeruginosastamme valgt fra gruppen omfattende de Pseudomonas aeruginosa-stammer som er angitt i krav 1, ved fremstilling av en vaksine mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon.

3. Ikke-patogen vaksine egnet til å indusere en immunrespons forårsaket av Pseudomonas aeruginosa, karakterisert ved at den omfatter en blanding av celleveggproteiner med en molekylvekt på 10.000 til 100.000 og som er avledet fra minst én svekket Pseudomonas aeruginosastamme ifølge krav 1, samt eventuelt minst en farmasøytisk akseptabel eksipient, for å indusere en immunrespons for å forhindre påfølgende sykdom forårsaket av Pseudomonas aeruginosa.

4. Vaksine ifølge krav 3, karakterisert ved at celleveggproteinene fra hver av de svekkede Pseudomonas aeruginosastammer er til stede i like mengder.

5. Fremgangmåte ved fremstilling av en ikke-patogen vaksine for immunisering mot Pseudomonas aeruginosainfeksjon, karakterisert ved at den omfatter: a) å inkubere hver rene Pseudomonas aeruginosa valgt fra CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 og CFCPA 70018 i et første dyrkningsmedium, b) å svekke hver rene inkuberte stamme ved gjentatte in-jeksjoner i forsøksdyr og velge ut den mest svekkede stamme for hver Pseudomonas aeruginosastamme som er svekket, c) å inkubere hver svekkede Pseudomonas aeruginosastamme i et andre dyrkningsmedium, d) å adskille den svekkede Pseudomonas aeruginosa-stamme fra dyrkningsmediet, e) å behandle den atskilte Pseudomonas-aeruginosastamme med et organisk oppløsningsmiddel for å inaktivere og fjerne celleveggkomponentene, f) å ekstrahere celleveggproteinet fra den behandlede Pseudomonas aeruginosa-stamme mens samtidig å bestemme hvorvidt cellene er Pseudomonas aeruginosa blir ødelagt ved å undersøke tilstedeværelsen av laktatdehydrogenase eller heksokinase som et cytoplasmatisk markørenzym, g) å utsette det ekstraherte celleveggprotein for ultra-filtrering for å velge ut kun de celleveggproteiner som har en molekylvekt i området fra 10.000 til 100.000, h) å ultrasentrifugere celleveggproteinet for ytterligere å fjerne at pipopolysakkarid og alle bakterielle substanser, i) å gjenvinne de utvalgte celleveggproteiner i ren tilstand, og j) å f reinstille en vaksine ved å bruke de utvalgte celleveggproteiner som en antigen substans for å indusere immunisering.

6. Terapeutisk middel for behandling av Pseudomonas aeru-ginosainf eks jon hos en pasient som oppviser slik infeksjon, karakterisert ved at middelet omfatter minst ett immunoglobulin som er spesifikt mot minst en Pseudomonas aeruginosastamme, hvor nevnte immunoglobulin blir indusert ved infeksjon i en passende vertsorganisme av celleveggproteiner avledet fra minst én svekket Pseudomonas aeruginosa-stamme valgt blant de stammer som er angitt i krav 1, i en mengde som er tilstrekkelig til å indusere en immunrespons hos nevnte vertsorganisme for å fremskaffe dannelsen av nevnte immunoglobulin for i det minste å minke de skadelige effekter av sykdommen forårsaket av Pseudomonas aeruginosa, hvor det terapeutiske middel eventuelt foreligger i frysetørket form, og hvor det terapeutiske middel eventuelt ytterligere kan inneholde minst et egnet farmasøytisk akseptabelt bæremiddel valgt fra gruppen omfattende mannitol, laktose, sakkarose og humant albumin og eventuelt ytterligere et egnet farma-søytisk akseptabelt bæremiddel.

7. Terapeutisk middel ifølge krav 6, karakterisert ved at det omfatter minst et immunoglobulin mot hver av Pseudomonas aeruginosastam-mene tilsvarende Fisher immunotypene 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7, fortrinnsvis immunoglobuliner mot enhver av fire av disse stammer, og mest foretrukket mot enhver av tre av disse stammer.