NL9420005A - Nieuwe verzwakte stammen van Pseudomonas aeruginosa. - Google Patents
Nieuwe verzwakte stammen van Pseudomonas aeruginosa. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9420005A NL9420005A NL9420005A NL9420005A NL9420005A NL 9420005 A NL9420005 A NL 9420005A NL 9420005 A NL9420005 A NL 9420005A NL 9420005 A NL9420005 A NL 9420005A NL 9420005 A NL9420005 A NL 9420005A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- pseudomonas aeruginosa
- cfcpa
- strain
- collection
- ofculture
- Prior art date
Links
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims description 272
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 119
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 118
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 98
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 76
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 208000032536 Pseudomonas Infections Diseases 0.000 claims description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 21
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 17
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 13
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 13
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 8
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 7
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 4
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims description 4
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 3
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000013475 authorization Methods 0.000 claims 32
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 claims 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 claims 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 104
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 39
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 9
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 9
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 208000034693 Laceration Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N ketorolac tromethamine Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N pyocyanin Chemical compound CN1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CC=CC2=O YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 108700027479 Syntex adjuvant formulation Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 229960002798 cetrimide Drugs 0.000 description 1
- 239000001982 cetrimide agar Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- WIVXEZIMDUGYRW-UHFFFAOYSA-L copper(i) sulfate Chemical compound [Cu+].[Cu+].[O-]S([O-])(=O)=O WIVXEZIMDUGYRW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910001867 inorganic solvent Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003049 inorganic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical class CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- XULSCZPZVQIMFM-IPZQJPLYSA-N odevixibat Chemical class C12=CC(SC)=C(OCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC)C(O)=O)C=3C=CC(O)=CC=3)C=C2S(=O)(=O)NC(CCCC)(CCCC)CN1C1=CC=CC=C1 XULSCZPZVQIMFM-IPZQJPLYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
NIEUWE VERZWAKTE STAMMEN VAN PSEUDOMONAS AERUGINOSA
ACHTERGROND VAN DE UITVINDINGGebied van de uitvinding
De onderhavige aanvrage betreft nieuwe verzwaktestammen van Pseudomonas aeruginosa, een profylactisch vaccinen een geneesmiddel tegen infekties door Pseudomonas aerugi¬nosa, alsmede een werkwijze voor het bereiden daarvan. Meerin het bijzonder betreft de onderhavige uitvinding nieuweverzwakte stammen van Pseudomonas aeruginosa, die doorisolering van Pseudomonas aeruginosa in zuivere toestand aande hand van het Fisher-Devlin immunotype gevolgd door her¬haalde zuivering van de geïsoleerde stam door achtereenvol¬gende passages door muizen zijn verkregen, een profylaktischvaccin en therapeutische immunoglobulinen die resp. zijnbereid uit en opgewekt door celwandproteïnen welke uit deverzwakte stam van Pseudomonas aeruginosa zijn afgescheiden,en een werkwijze voor het bereiden daarvan.
Beschrijving van de stand der techniek
Pseudomonas aeruginosa bestaat uit beweeglijkegramnegatieve staafjes, ca. Ο,Βμπι x 1,5-3,0 μπι, met eenenkel flagellum en komt wijd verspreid voor in de grond, inwater, in rioolwater en in de menselijke darm (Mol. Microbi¬ol. 4, 1069-1075, 1990). Pseudomonas aeruginosa is eenpathogene stam, die de oorzaak vormt van hardnekkige infek¬ties zoals bloedvergiftiging, algemene infekties, chronischeinfekties van het ademhalingsstelsel, cystische pancreasfi-brose en dergelijke. De door Pseudomonas aeruginosa veroor¬zaakte bloedvergiftiging is een ziekte die ofwel door inva¬sie van het micro-organisme zelf of anders door afscheidingvan giftige bestanddelen daarvan in het bloed van patiëntenmet een verminderde weerstand als gevolg van chirurgischeingrepen, laceratie, verwondingen en dergelijke wordt ver¬ oorzaakt. De aanwezigheid van het toxine veroorzaakt "shock"met hoge koorts, verlaagde bloeddruk en andere symptomen,die uiteindelijk tot de dood kunnen leiden. Aangezien Pseu¬domonas aeruginosa ook in infekties van de urinewegen isaangetroffen, is de belangstelling voor Pseudomonas aerugi¬nosa sterk toegenomen. Er bestaat dan' ook een dringendebehoefte aan het ontwikkelen van medicijnen waarmee hardnek¬kige etteringbevorderende ziekten zoals bloedvergiftiging eninfekties van de urinewegen, welke door Pseudomonas aerugi¬nosa worden veroorzaakt, effektief kunnen worden verhinderdof behandeld. De stammen van Pseudomonas aeruginosa zijnechter resistent voor de meeste antibiotica terwijl eendoeltreffend preventief of therapeutisch middel tegen infek¬ties van Pseudomonas aeruginosa tot nu toe niet is ontwik¬keld. De virulentie van infekties door Pseudomonas aerugino¬sa is daarom met de tijd sterker geworden.
De stammen van Pseudomonas aeruginosa kunnen opdiverse wijzen worden geklassificeerd. Bij één van dieklassificatiesystemen worden de stammen aan de hand van hetimmunotype volgens Fisher in zeven (7) typen ingedeeld. Eenander systeem, voorgesteld door Terada is op de O-antigeen-groep gebaseerd. Nog een ander systeem is het klassificatie-systeem van het International Antigenic Typing Scheme (I-ATS). Met het oog op deze klassificatiesystemen zijn destammen van Pseudomonas aeruginosa die het meest frequentbij door Pseudomonas aeruginosa geïnfekteerde patiëntenvoorkomen: de typen 5/2a, 2c, 3, 7/3a, 3c, l/4a, 4b, 6/5a,5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /11 en 3,7/3d, 3evolgens het Fisher immunotype/0-serotype, waarbij de typen3, 7, 2 en l van het Fisher immunotype (overeenkomend met detypen 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a en 4b van het 0-seroty-pe) in hoofdzaak aanwezig zijn.
Bij een behandelingsmethode voor infekties metPseudomonas aeruginosa worden de toxinen van Pseudomonasaeruginosa met antitoxinen geneutraliseerd. Het antitoxineis echter een geneesmiddel dat alleen goed werkt bij pati¬ënten die reeds bloedvergiftiging hebben, en vertoont geenprofylaktisch effekt. Verder is het tegenwoordig verkrijgba- re antitoxine uiterst kostbaar en is zijn toepassing be¬perkt. Het belangrijkste nadeel dat met het gebruik van hetantitoxine gepaard gaat, wordt echter gevormd door de be¬trekkelijk geringe genezingsgraad en door de bijkomendeernstige neveneffekten.
Een methode in onderzoek voor het vermijden van denadelen die aan het gebruik van het antitoxine zijn verbon¬den, maakt gebruik van een gemeenschappelijk antigeen voorhet verhinderen en de behandeling van Pseudomonas aerugino-sa-infekties. De in onderzoek zijnde methoden voor hetverkrijgen van het gemeenschappelijke antigeen kunnen in hetalgemeen in twee groepen worden ingedeeld. De eerste methodebetreft het gebruik van een gemeenschappelijk antigeen datuit stammen van Pseudomonas aeruginosa met verschillendeimmunotypen is afgescheiden en gezuiverd, als profylaktischvaccin-antigeen tegen Pseudomonas aeruginosa-infekties(Japan, J. Exp. Med. 45, 355-359, 1975). De tweede methodebetreft het gebruik van een gemeenschappelijke antigeenmas-sa, verkregen door gebruik van een genetische manipulatieme-thode, waarbij een voor het gewenste antigeen coderend genwordt geïsoleerd en in een geschikte vector wordt ingebouwdter verkrijging van een recombinante vector, waarna degeschikte gastheer met de verkregen recombinant-vector wordtgetransformeerd en ter expressie van het gewenste antigeenwordt geïncubeerd.
Ofschoon de ontwikkeling van een profylaktischvaccin met behulp van een gemeenschappelijk antigeen intheorie een zeer doeltreffende methode is, wijst de standvan het onderzoek naar deze methode er momenteel op dat dezemethode nog vele onopgeloste problemen vertoont. Het belang¬rijkste nadeel is dat met het gemeenschappelijke antigeenniet alle infekties met Pseudomonas aeruginosa van verschil¬lende immunotypen kunnen worden verhinderd, zodat zijndoeltreffendheid betrekkelijk laag is. Een dergelijke gerin¬ge doeltreffendheid wijst erop dat naast de aanwezigheid vanhet gemeenschappelijke antigeen nog een ander onbekendantigeen nodig kan zijn om een effektief profylaktischeffekt te bereiken.
Een andere methode voor het behandelen van Pseu¬domonas aeruginosa-infekties berust op de toediening vanantibiotica of chemotherapeutische middelen met een breedspectrum-selectiviteit voor de Pseudomonas aeruginosa-stam-i men. Aangezien er echter vele stammen van Pseudomonas aeru¬ginosa zijn en zij doorgaans een grote resistentie tegengeneesmiddelen vertonen, worden vele patiënten het slachtof¬fer van Pseudomonas aeruginosa-stammen die door antibioticaniet effektief kunnen worden behandeld. Daarnaast is eeni methode ontwikkeld die gebruik maakt van een therapeutischimmunoglobuline. Een dergelijk immunoglobuline heeft echtergeen of weinig therapeutisch effekt tegen alle Pseudomonasaeruginosa-infekties en wordt daarom alleen voor een beperktaantal typen van Pseudomonas aeruginosa-infekties gebruikt,i Dit komt in hoofdzaak doordat het immunoglobuline is bereidmet een methode, waarbij polyklonale antilichamen tegen eenbepaald micro-organisme worden opgewekt, zodat het nietgemeenschappelijk tegen de vele Pseudomonas aeruginosa-stammen kan werken.
) Er zijn reeds pogingen gedaan om een goedkoop geneesmiddel te ontwikkelen uit monoklonale muize-antilicha-men (J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985) of monoklonalemenselijke antilichamen (FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990) tegen Pseudomonas aeruginosa. Bij deze methodei kunnen cellijnen uit een celbank, die met een celfusietech-niek zijn gevormd, worden geselecteerd op het vermogen om demeest doeltreffende neutraliserende antilichamen te vormen,waarna een cellijn als uitgangsmateriaal voor het producerenvan het gewenste antilichaam op industriële schaal kan) worden gebruikt. Deze methode is echter op de behandelingvan Pseudomonas aeruginosa-infekties via de produktie vanantilichamen gericht en niet op het gebruik van profylakti-sche vaccins. Bovendien is een nadeel van deze methode dat,aangezien alle infekties door verschillende Pseudomonasi aeruginosa-stammen van uiteenlopend serologisch en immunolo¬gisch type worden veroorzaakt, zij niet alle met slechts ééntype monoklonaal antilichaam kunnen worden behandeld. Datwil zeggen, de therapie met monoklonale antilichamen kan niet effektief worden gebruikt om alle door Pseudomonasaeruginosa geïnfekteerde patiënten te behandelen.
Teneinde een effektieve behandeling met dezemethode uit te breiden is een gelijktijdige toediening vandiverse soorten antilichamen op basis van hun onderzochtekruisreaktiviteit voorgesteld. Bij deze methode wordt bloeduit met Pseudomonas aeruginosa geïnfekteerde patiëntenverzameld en dan onderzocht ter identificatie van het sero-logische en/of immunologische type van de infekterendePseudomonas aeruginosa-stammen. Vervolgens worden monoklona-le antilichamen, die voor het gevonden type geschikt zijn,aan de patiënt toegediend. Deze methode vereist echter veeltijd en is daarom ongeschikt voor patiënten wier toestandeen onmiddellijke behandeling nodig maakt.
In de stand der techniek is reeds het gebruik vancelwandproteïnen, afgescheiden uit Pseudomonas aeruginosa-stammen, als antigeen voor een vaccin voorgesteld (zieVaccine, Vol. 7, "Experimental studies on de protectiveefficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine", 1989). De indit document voorgestelde methode gebruikt echter viersoorten van algemene Pseudomonas aeruginosa-stammen, name¬lijk NN 170041, NN 170015, NN 868 en NN 170046, die nietverzwakt zijn. Dit levert een probleem in verband met degiftigheid van de Pseudomonas aeruginosa-stammen zelf.
Verder kunnen bij het bereiden van een proteïnehoudendvaccin uit dergelijke Pseudomonas aeruginosa-stammen cellenworden opengebroken die in het medium vreemde nucleïnezurenen giftige hoogmoleculaire stoffen zoals in het cytoplasmaaanwezige lipopolysacchariden (LPS) afgeven. Deze stoffenworden dan als verontreiniging in het verkregen vaccinopgenomen, waardoor een grotere zorg bij het toedienen vanhet vaccin is vereist en de toepassing zo mogelijk wordtbeperkt.
BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinders hebben intensief gezochtnaar een middel waarmee antilichamen tegen Pseudomonasaeruginosa effektief kunnen worden opgewekt en dat een goede immunogene (met name antigene) werking vertoont met eenuiterst gering risico voor een inherente giftigheid afkom¬stig van Pseudomonas aeruginosa-stammen zelf. Als resultaatdaarvan hebben de uitvinders gevonden dat nieuwe, veilige enverzwakte stammen van Pseudomonas aeruginosa kunnen wordenverkregen door stammen van Pseudomas aeruginosa, die uit metPseudomas aeruginosa geinfekteerde patiënten zijn geïso¬leerd, op basis van hun immunotype in zeven (7) soorten inte delen en vervolgens elke zuivere stam te verzwakken doorhet organisme vele malen door een geschikte dierlijke gast¬heer te voeren. Deze stammen hebben celwandproteinen dieniet alleen nuttig zijn voor het bereiden van een vaccinvoor profylaxe tegen Pseudomonas aeruginosa-infekties, maarook kunnen worden gebruikt als opwekkers van antilichamenvoor het verkrijgen van immunoglobulinen tegen Pseudomonasaeruginosa-infekties in het dierlijke lichaam. De verkregenimmunoglobulinen hebben in overeenstemming met de uitvindingeen uitstekend therapeutisch effekt op diverse Pseudomonasaeruginosa-infekties, waaronder ook ernstige gevallen.
Het is derhalve een oogmerk van de uitvinding omeen nieuwe en veilige verzwakte Pseudomonas aeruginosastamte leveren waarvan de celwandproteinen een antigene werkingvertonen, zonder dat de giftigheid van de Pseudomonas aeru¬ginosa- stam zelf optreedt.
Een ander doel van de uitvinding is het leverenvan een vaccin voor het opwekken van een immuunrespons terverhindering van het later optreden van een door Pseudomonasaeruginosa veroorzaakte ziekte, bij een patiënt die hetvaccin ontvangt. Een volgend doel van de uitvinding is hetleveren van een werkwijze voor het bereiden van het vaccin.
Nog een doel van de uitvinding is het leveren vaneen geneesmiddel voor het behandelen van Pseudomonas aerugi¬nosa- inf ekties, welk geneesmiddel tenminste één immunoglobu-line tegen de Pseudomonas aeruginosa-stam bevat.
Een volgend doel van de uitvinding is het ver¬schaffen van een werkwijze voor het bereiden van het immuno-globuline.
In het voorgaande zijn enkele van de meest perti¬nente doeleinden van de onderhavige uitvinding genoemd. Dezedoeleinden dienen te worden opgevat als illustratief voorenkele van de meest pertinente kenmerken en toepassingen vande uitvinding. Vele andere gunstige resultaten kunnen wordenverkregen door de genoemde uitvinding'op een andere maniertoe te passen of de uitvinding binnen het kader van deopenbaring te wijzigen. Zo kunnen andere doeleinden en eenbeter begrip van de uitvinding worden verkregen aan de handvan de samenvatting van de uitvinding, de gedetailleerdebeschrijving met een beschrijving van de voorkeursuitvoerin¬gen, en verder de door de conclusies bepaalde inhoud van deuitvinding, in samenhang met de bijgaande tekeningen.
SAMENVATTING VAN DE UITVINDING
Eén uitvoeringsvorm van de uitvinding betreftnieuwe, veilige en doeltreffende verzwakte Pseudomonasaeruginosa-stammen waarvan de celwandproteïnen een antigenewerking hebben, zonder de giftigheid van de Pseudomonasaeruginosa-stam zelf. Meer specifiek betreft de onderhavigeuitvinding veilige, verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammendie verkregen worden door het isoleren van Pseudomonasaeruginosa-stammen uit patiënten die met Pseudomonas aerugi¬nosa zijn geïnfekteerd, het indelen van de geïsoleerdemicro-organisme-stammen in zeven (7) typen of soorten aan dehand van het immuuntype volgens Fisher-Devlin, het selecte¬ren van een enkele representatieve stam voor elk immuuntype,het zuiveren van de geselecteerde stam via herhaalde stappenvan injektie/isolering/herinjektie in proefdieren en hetselecteren van de meest verzwakte stam, voor elk van dezeven (7) typen van Pseudomonas aeruginosa-stammen.
Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavigeuitvinding is gericht op een nieuw vaccin en op de werkwijzevoor het bereiden van het vaccin voor profylaxe tegen infek-tie door Pseudomonas aeruginosa. Het vaccin wordt bereiddoor celwandproteïnen in nagenoeg zuivere toestand uit elkder zeven (7) typen van veilige verzwakte Pseudomonas aeru¬ginosa-stammen af te scheiden zoals hieronder beschreven en de afgescheiden celwandproteïnen verder te zuiveren envervolgens bij voorkeur de gezuiverde celwandproteïnenafkomstig uit ten minste drie typen van verzwakte Pseudom¬onas aeruginosa-stammen met elkaar te combineren. Bij voor¬keur worden equivalente hoeveelheden celwandproteïnen uitelk der drie typen gebruikt voor het bereiden van het vaccinvolgens de onderhavige uitvinding.
Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavigeuitvinding is een geneesmiddel tegen infektie door Pseudom¬onas aeruginosa, dat tenminste één immunoglobuline bevat,verkregen door het kweken van tenminste één veilige verzwak¬te Pseudomonas aeruginosa-stam, het afscheiden van celwand¬proteïnen daaruit, het zuiveren van het afgescheiden cel-wandproteïne en het injekteren van het zuivere celwandprote-ïne als antilichaam-opwekker in proefdieren ter opwekkingvan het immunoglobuline, alsmede een werkwijze voor hetbereiden van het geneesmiddel.
De meer pertinente en belangrijke kenmerken van deonderhavige uitvinding zijn hierboven zodanig aangeduid datde hierna volgende gedetailleerde beschrijving van de uit¬vinding beter zal worden begrepen en dat de onderhavigebijdrage tot de techniek volledig zal worden geapprecieerd.Bijkomende kenmerken van de hierna te beschrijving uitvin¬ding zijn vermeld in de conclusies van de uitvinding. Des¬kundigen zullen opmerken dat het hier gegeven concept en despecifieke uitvoeringsvormen daarvan gemakkelijk als basiskunnen worden gebruikt voor het wijzigen of het ontwerpenvan andere structuren voor het uitvoeren van dezelfde doel¬einden van de onderhavige uitvinding. Verder zullen deskun¬digen zich realiseren dat zulke gelijkwaardige constructiesniet afwijken van de geest en de omvang van de uitvindingzoals in de conclusies beschreven.
KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN
Voor een goed begrip van de aard en de doeleindenvan de uitvinding wordt verwezen naar de volgende gedetai-leerde beschrijving, in samenhang met de bijgaande tekenin¬gen, waarin: fig. 1 het resultaat toont van SDS-PAGE van gezui¬verde celwandproteinen die uit verzwakte Pseudomonas aerugi¬nosa- stammen volgens de onderhavige uitvinding zijn afge¬scheiden; en fig. 2 een grafiek is, die de gewichtsveranderingbij mannelijke muizen aangeeft, waarin de celwandproteinenvan verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens deonderhavige uitvinding intraveneus zijn geinjekteerd.
BESTE WIJZE VAN UITVOERING VAN DE UITVINDING
De immuuntypen volgens Fisher-Devlin van Pseudom¬onas aeruginosa worden in zeven typen ingedeeld, type 1 tottype 7. Bij de onderhavige uitvinding worden Pseudomonasaeruginosa-stammen met de immuuntypen 1-7 volgens Fisher alsstammen voor de verzwakking geselecteerd, op grond van hetfeit dat zij in het bloed van het merendeel (90-95% of meer)van de met Pseudomonas aeruginosa geïnfekteerde patiëntenworden aangetroffen. Onder de zeven (7) typen van Pseudom¬onas aeruginosa zijn het type 1 en het type 3 de meestfrequent aangetroffen stammen in de met Pseudomonas aerugi¬nosa geïnfecteerde patiënt. De leer van de onderhavigeuitvinding kan echter tegen elk van de stammen van Pseudom¬onas aeruginosa worden gebruikt om bescherming of behande¬ling te verschaffen.
Veilige verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammenvolgens de onderhavige uitvinding kunnen worden verkregendoor elk van de zeven typen van Pseudomonas aeruginosa-stammen in zuivere toestand uit het bloed van patiënten teisoleren die als dragers van een Pseudomonas aeruginosa-infektie zijn aangewezen en vervolgens de geïsoleerde stam¬men met herhaalde zuiveringsmethoden te verzwakken. De zoverkregen veilige verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammenomvatten alle zeven (7) typen en worden resp. aangeduid metCFCPA 10142 (Fisher-type 1), CFCPA 20215 (Fisher-type 2), CFCPA 30720 (Fisher-type 3), CFCPA 40057 (Fisher-type 4), CFCPA 50243 (Fisher-type 5), CFCPA 60534 (Fisher-type 6), en CFCPA 70018 (Fisher-type 7). Hierbij is CFCPA een afkorting van "Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa", welke term is samengesteld uit Cheil Food and Chemicals Inc.,waarin de uitvinders van de onderhavige uitvinding werkzaamzijn, en de naam van de betreffende stam, Pseudomonas aeru¬ginosa .
De verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, diedoor de bovenbeschreven herhaalde zuiveringsmethoden wordenverkregen, hebben nagenoeg dezelfde fenotypen en microbiolo¬gische eigenschappen als de overeenkomstige ouderstammenmaar vertonen daarnaast nieuwe eigenschappen die nuttig zijni bij het bereiden van een vaccin-antigeen voor profylaxetegen een Pseudomonas aeruginosa-infektie, in plaats van depathogene eigenschappen die in de ouderstammen voorafgaandaan de verzwakking aanwezig zijn. Als gevolg daarvan kunnende Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderhavigeuitvinding als nieuwe stammen van een micro-organisme wordenbeschouwd. Daarom zijn deze stammen om 12 mei 1993 bij hetKorean Culture Centre of Microorganisms in the Korean Fede¬ration of Culture Collections, (hierna KCCM), fungerend alsinternationale depositaris onder het verdrag van Boedapest,gedeponeerd, en wel onder de toelatingsnuramers: KCCM 10029 voor CFCPA 10142, KCCM 10030 voor CFCPA 20215, KCCM 10031 voor CFCPA 30720, KCCM 10032 voor CFCPA 40057, KCCM 10033 voor CFCPA 50243, KCCM 10034 voor CFCPA 60534 en KCCM 10035 voor CFCPA 70018.
De zuiveringsmethoden voor het leveren van deverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen worden herhaaldemalen uitgevoerd totdat de stammen in het algemeen de ge¬wenste waarden voor LD50 vertonen. Ofschoon het aantalzuiveringsprocedures of -stappen in afhankelijkheid van devaardigheid van de technicus, de giftigheid van de ouder¬stammen en dergelijke kan variëren, wordt de zuiveringsstapbij voorkeur 3 tot 7 maal uitgevoerd, bijv. totdat de LD50van Pseudomonas aeruginosa ten minste 2xl07 cellen bedraagt.De LD50-waarde in muizen van de zo volgens de uitvindingverkregen nieuwe verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammenbedraagt bij voorkeur 2,0xl07 cellen of meer.
De onderhavige uitvinding levert ook een vaccinvoor immunisatie tegen Pseudomonas aeruginosa-infekties, welk vaccin wordt bereid door celwandproteinen in zuiveretoestand af te scheiden uit elk van de nieuwe verzwaktePseudomonas aeruginosa-stammen volgens de uitvinding, zoalshierboven verkregen, en de afgescheiden celwandproteinen danverder te zuiveren, en door de zo verkregen gezuiverdecelwandproteinen in een bepaalde mengverhouding met elkaarte combineren, bij voorkeur in equivalente hoeveelheden vande celwandproteinen uit elk van de gewenste Pseudomonasaeruginosa-stammen waartegen immunisatie wordt beoogd. Datwil zeggen de voor elke stam gebruikte hoeveelheid is diewelke voldoende is om immunisatie tegen die stam in eenbepaald gastheertype te verkrijgen.
Bovendien levert de onderhavige uitvinding eenwerkwijze voor het bereiden van vaccins voor immunisatietegen Pseudomonas aeruginosa, welke gekenmerkt is doordatverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in fermentatietoe-stellen onder handhaving van optimale groeicondities wordengeïncubeerd ter verkrijging van een massa uit Pseudomonasaeruginosa-stammen. De verkregen massa van micro-organismenwordt behandeld volgens een reeks procedures, waaronderextractie van celwandproteinen door behandeling met eenorganisch oplosmiddel, fraktionering naar molecuulgewicht enultracentrifugering ter verkrijging van de gewenste celwand¬proteinen. De verkregen celwandproteinen, die uit de zeven(7) typen van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen zijnafgeleid, worden in een geschikte constitutie en een gewens¬te verhouding, bij voorkeur in equivalenten hoeveelheden,met elkaar gecombineerd.
De werkwijze voor het bereiden van vaccins volgensde onderhavige uitvinding, zoals hierboven beschreven, kanals volgt worden samengevat.
Tabel 1. Procedures voor afscheiding en zuivering van cel-wandproteïnen uit verzwakte Pseudomonas aerugino¬sa- stammen en voor het bereiden van vaccins.
Hierna zullen de vaccins van de onderhavige uit¬vinding meer specifiek worden beschreven aan de hand van debereidingswijze daarvan.
Terwille van het bereiden van vaccins voor profy-laxe tegen Pseudomonas aeruginosa volgens de onderhavigeuitvinding worden in de eerste stap zeven typen van verzwak¬te Pseudomonas aeruginosa-stammen, namelijk CFCPA 10142,CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA60534 en CFCPA 70018 elk geïncubeerd in een fermentatietoe-stel van geschikte afmetingen. Als kweekmedium voor dit doel blijkt trypsine-soyabouillon, maar bij voorkeur een speciaalmedium zoals hieronder beschreven, geschikt te zijn voor hetincuberen van Pseudomonas aeruginosa zoals hierboven be¬schreven.
Het speciale medium bevat glucose (30 g/1), pepton(15 g/1), MgS04 (0,5 g/1), CaC03 (5 gA) , KH2P04 (1 g/1) ,
FeS04 (5 mg/1) , CuS04 (5 mg/1) en ZnS04 (5 mg/1) . Dit specia¬le medium is door de onderhavige uitvinders speciaal ontwor¬pen voor het kweken van Pseudomonas aeruginosa-stammen en isnieuw. Dit speciale medium valt dan ook onder de omvang vande onderhavige uitvinding. Worden Pseudomonas aeruginosa-stammen in dit speciale medium gekweekt, dan is de opbrengstaan bacteriemassa tenminste 30% hoger, betrokken op hetgewicht van de droge bacteriemassa, dan dat van een bacte¬riemassa die in trypsine-soyabouillon is gekweekt. Hetgebruik van een dergelijk speciaal medium vormt dan ook eenvoorkeursuitvoering.
Bij de incubatiestap voor de bacteriemassa zijn deoptimale kweekomstandigheden: temperatuur 37°C, beluchtings-graad 1 wm (volume/volume.minuut) en inzaaivolume 5% v/vvan de kweekmediumoplossing. De incubatie wordt uitgevoerdmet een roersnelheid van 100/min voor de eerste 2 uren envan 600/min tijdens 10-20 uren, bij voorkeur tijdens 12 tot16 uren.
Bij voltooiing van de incubatie worden de neerge¬slagen bacteriecellen in de tweede trap door middel vancentrifugeren of dergelijke van de kweekoplossing geschei¬den. De afgescheiden bacteriecellen worden in de derde trapmet een organisch oplosmiddel behandeld ter inaktivering vande micro-organismen en tegelijkertijd ter verwijdering vande lipidecomponenten uit de celwanden. Het organische oplos¬middel voor de derde trap wordt bij voorkeur gekozen uit degroep van aceton, chloroform, ethanol, butanol etc, waarbijaceton de meeste voorkeur geniet.
De latere vierde trap omvat een herhaalde extrac¬tie van celwandproteïnen, namelijk 5-6 extracties, waarbijde cellen zelf niet worden opengebroken en hun celinhoudniet verloren gaat. Tot dit doel worden de cellen van het micro-organisme in een oplossing zoals een fosfaatbufferop-lossing, een trisbufferoplossing en dergelijke (bij voorkeurin de fosfaatbufferoplossing) gehouden en wordt een mengerof een homogenisator gebruikt om de celwandproteïnen te5 extraheren. De extractie wordt bij voorkeur uitgevoerd doorroeren bij 100/min tot 2000/min en bij 4°C. Daarnaast dienenin de vierde trap speciale voorzorgen te worden genomen omopenbreken van de cellen te voorkomen zodat de gewenstecelwandproteïnen gescheiden kunnen worden gehouden van de3 giftige proteïnen uit het cytoplasma. Tijdens de extractie-procedure is het dan ook noodzakelijk om continu te bepalenof de cellen al dan niet opengebroken worden, en wel doorbepaling van de aanwezigheid van lactaatdehydrogenase ofhexokinase als een cytoplasmatisch merkerenzym.
3 Daarna worden de celwandproteïnen van de verzwakte
Pseudomonas aeruginosa-stammen, die met bovengenoemde proce¬dures in een bovendrijvende vloeistof worden verkregen,gefraktioneerd door ze aan een eerste en een tweede ultra¬filtratie te onderwerpen, teneinde alleen de proteïnen met3 molgewichten tussen 10.000 en 100.000 te verkrijgen. Bijdeze trap is het belangrijk dat het molecuulgewicht van deverkregen celwandproteïnen binnen het gebied van 10.000 tot100.000 ligt. De reden is dat celwandproteïnen met eenmolecuulgewicht kleiner dan 10.000 niet het gewenste profyl-5 aktische effekt geven, zoals door dierproeven bepaald,terwijl een molgewicht boven 100.000 giftige effekten kanopleveren door de aanwezigheid van hoogmoleculair lipopolys-accharide (LPS).
De afgescheiden celwandproteïnen uit elk van de3 zeven typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa, die een mole¬cuulgewicht tussen 10.000 en 100.000 hebben, worden elk voorzich verder door ultracentrifugering gezuiverd teneinde elkekleine hoeveelheid lipopolysaccharide die nog aanwezig kanzijn, te verwijderen. Daarna wordt een trap voor het verwij-5 deren van bacteriële stoffen uitgevoerd teneinde tenslottede celwandproteïnen van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen te verkrijgen die niet-pathogeen zijn en die vol- doende zuiver zijn voor toepassing als vaccin ter profylaxetegen Pseudomonas aeruginosa-infekties.
De uit de zeven typen verzwakte Pseudomonas aeru¬ginosa- stammen verkregen celwandproteïnen worden dan in eenbepaalde verhouding met elkaar gecombineerd ter formuleringvan het vaccin. Als men de frequentie' van het optreden vanziekten door de aanvankelijke Pseudomonas aeruginosa-stammenvoorafgaand aan de verzwakking in aanmerking neemt, diénende celwandproteïnen zodanig te worden gecombineerd dat decelwandproteïnen verkregen uit tenminste drie (3) typen,meer bij voorkeur vier (4) typen of meer, met elkaar wordenvermengd, waarbij de meeste voorkeur uitgaat naar vermengingvan alle zeven (7) typen van de Pseudomonas aeruginosa-stammen. Ofschoon de mengverhouding varieert met het typevan de Pseudomonas aeruginosa-stammen waaruit de te combine¬ren celwandproteïnen afkomstig zijn, worden de celwandprote¬ïnen bij voorkeur in een verhouding van equivalente hoeveel¬heden met elkaar vermengd.
De vaccins volgens de onderhavige uitvinding diede voorkeur genieten zijn bijv. die welke celwandproteïnenafkomstig uit CPCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA60534 in een mengverhouding van 1:1:1,5:0,5/ 1:1:1:1 of0,5:1,5:1,5:0,5 bevatten of een vaccin dat alle celwandpro¬teïnen afkomstig uit CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720,CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 en CFCPA 70018 in eenmengverhouding van nagenoeg gelijke hoeveelheden bevat. Dekleinste hoeveelheid celwandproteïnen uit elk van de stammenvan Pseudomonas aeruginosa, die in het vaccin aanwezig is,is gelijk aan de minimumhoeveelheid welke voldoende is voori het opwekken van immunisatie in de gewenste gastheer/pati¬ent .
Desgewenst kan het vaccin voor profylaxe tegenPseudomonas aeruginosa-infekties volgens de onderhavigeuitvinding naast de op bovenstaande wijze verkregen celwand¬proteïnen nog farmaceutisch aanvaardbare excipiëntia bevat¬ten, zoals bijv. calciumhydroxide, calciumfosfaat, ISCOM(immunostimulerend complex), SAF-1 (Syntex Adjuvant Formula- tion-1), SAFm (gemodificeerd Syntex Adjuvant Formulation) ensoortgelijke excipientia die aan de deskundige bekend zijn.
Bij gebruik als profylactisch vaccin tegen infek-ties van Pseudomonas aeruginosa varieert de toe te dienendosering met het geslacht, de leeftijd, het gewicht, degezondheidstoestand en dergelijke van de personen die metPseudomonas aeruginosa kunnen zijn besmet, maar deze dose¬ring bedraagt in het algemeen 0,5 tot 2,5 mg van het mengselvan celwandproteinen uit elk van de verzwakte stammen. Dezehoeveelheid wordt in het algemeen verkregen uit een bacte-riemassa van 0,1 g tot 0,5 g droog gewicht (overeenkomendmet 0,5 tot 2,5 g nat gewicht). De toediening geschiedt bijvoorkeur door intramusculaire injektie.
Volgens een ander aspekt van de onderhavige uit-: vinding kunnen de celwandproteinen die in zuivere toestanduit de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen van deonderhavige uitvinding zijn verkregen, ook als opwekker vanantilichamen worden gebruikt teneinde immunoglobulinen inproefdieren op te wekken. Daarom verschaft de onderhavigeI uitvinding een geneesmiddel voor het behandelen van eenPseudomonas aeruginosa-infektie, welk geneesmiddel eenimmunoglobuline bevat, dat gevormd is door celwandproteinenin zuivere toestand, verkregen door afscheiding en zuiveringop bovenstaande wijze, in een proefdier te injekteren ten-i einde de produktie van een immunoglobuline tegen Pseudomonasaeruginosa op te wekken.
Meer in het bijzonder vormen de afgescheiden engezuiverde celwandproteinen, die met de bovenbeschrevenprocedures uit de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen) van de onderhavige uitvinding zijn verkregen, een antigeendat gebruikt kan worden om proefdieren zoals schapen, konij¬nen en dergelijke daarmee te enten teneinde de vorming vanhet betreffende antilichaam op te wekken. Het bloed van deproefdieren wordt verzameld, waarna het serum daaruit wordt) afgescheiden. Het afgescheiden serum wordt op bekende wijzeopgewerkt ter verkrijging van het gewenste immunoglobulinein gezuiverde toestand. Tot dit doel kan de afscheiden enzuivering van immunoglobuline uit het afgescheiden serum geschieden volgens een methode die in het betreffende tech¬nische gebied algemeen bekend is (zie Practical Immunology,3de editie (1989), 292-294), bijv. door het afgescheidenserum met gedestilleerd water te vermengen, het mengsel ter3 absorptie van immunoglobuline aan DEAE-cellulose (diethyla-minoethyl-cellulose) toe te voegen, de bovendrijvende vloei¬stof te verwijderen, en dan het DEAE-cellulose met hetgeabsorbeerde immunoglobuline vele malen met een fosfaatbuf-feroplossing te wassen ter verkrijging van het gezuiverde) immunoglobuline.
Het in het geneesmiddel voor het behandelen vanPseudomonas aeruginosa-infekties gebruikte immunoglobulinewordt verkregen door een proefdier te immuniseren met eenmengsel, dat celwandproteïnen afkomstig van diverse verzwak-5 te Pseudomonas aeruginosa-stammen in een bepaalde verhoudingbevat. Tot dit doel kan een gecombineerd immunoglobulineworden gebruikt, dat verkregen is door het proefdier teimmuniseren met een mengsel, bestaande uit elk van de cel¬wandproteïnen afkomstig van elk van de zeven (7) typen) verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in een bepaaldeverhouding, bij voorkeur in een verhouding van equivalentehoeveelheden. Houdt men echter rekening met de kruisreakti-viteit van elk van de immunoglobulinen, dan zullen de immu-noglobulinen, die verkregen zijn door een proefdier te5 immuniseren met een mengsel, bestaande uit celwandproteïnenafkomstig van elk van de vier volgende typen van verzwaktePseudomonas aeruginosa-stammen: CFCPA 10142, CFCPA 20215,CFCPA 30720 en CFCPA 60534 in een verhouding van 1:1:1:1,een aanzienlijk therapeutisch effekt leveren bij infekties) die door alle Pseudomonas aeruginosa-stammen van de typen 1,2, 3, 4, 5, 6 en 7 volgens Fisher worden veroorzaakt. Dit ishet voorkeursgeneesmiddel uit gecombineerde immunoglobulinenvoor het behandelen van een door Pseudomonas aeruginosaveroorzaakte ziekte.
3 Het immunoglobuline tegen Pseudomonas aeruginosa volgens de onderhavige uitvinding kan worden verwerkt totfarmaceutische preparaten in gelyofiliseerde vorm of invloeibare vorm en kan daarnaast desnoods farmaceutisch aanvaardbare dragers, bijv. stabilisatoren, conserverings¬middelen, isotonische middelen en dergelijke bevatten. Defarmaceutisch aanvaardbare dragers die kunnen worden ge¬bruikt, omvatten bij voorkeur bijv. mannitol, lactose,saccharose, menselijk albumine en dergelijke in het gevalvan gelyofiliseerde preparaten en een fysiologische zoutop¬lossing, water voor injektie, een fosfaatbufferoplossing,aluminiumhydroxide etc. in het geval van vloeibare prepara¬ten.
De dosering van het immunoglobuline varieert inafhankelijkheid van de leeftijd, het lichaamsgewicht, hetgeslacht en de algemene gezondheidstoestand van de persoon,de ernst van de Pseudomonas aeruginosa-infektie en de be¬standdelen van het.gecombineerde immunoglobuline dat wordttoegediend. Het immunoglobuline wordt doorgaans in eenhoeveelheid van 0,1 mg tot 1000 mg, bij voorkeur 1 mg tot100 mg, per dag per kg. lichaamsgewicht aan een volwassenetoegediend via de intraveneuze weg.
De onderhavige uitvinding zal meer specifiekworden geïllustreerd door de volgende voorbeelden, maar magop geen enkele wijze tot deze voorbeelden worden beperkt.
Voorbeeld l: Isolering van een Pseudomonas aeruginosa-stam uit met Pseudomonas aeruginosa geïnfekteerdepatiënten en identificatie daarvan
Dit elk van 260 verschillende bloedmonsters,genomen van met Pseudomonas aeruginosa geïnfekteerde pati¬ënten, werd een evenredig deel van ca. 1 tot 5 ml aseptischaf genomen. Dit bloed mocht 1 uur bij kamertemperatuur blij¬ven staan. Nadat het bloed 's nachts in een koelkast op 4°Cwas bewaard, werd het 10 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met1500 x g (g = versnelling van de zwaartekracht) ter verwij¬dering van de vaste stoffen en ter 7verkrijging van eenbovendrijvend serum. Het zo verkregen serum werd met eenfosfaatbufferoplossing (NaH2P04 1,15 g, KC1 0,2 g, KH2P04 0,2g, NaCl 8,766 g per liter) in een verhouding van 1:10 (serumtot oplossing) verdund en dan verspreid over een voorafgemaakte kweekplaat met trypsine soyabouillon onder toevoe¬ ging van 1,0 tot 1,5% agar. De kweekplaat werd 12 uren ofmeer geïncubeerd in een incubator die onder aerobe conditiesop een constante temperatuur van 37°C werd gehouden. De zoverkregen kweken werden overgevoerd naar verse kweekplaten,waarna de gewenste micro-organismen in zuivere toestand metbehulp van een bekende zuivere isoleringsmethode voor micro-organismen werden geïsoleerd (zie Thomas D. Broek en Micha-sel T. Madigan, Biology of Microorganisms (1988), 5e editie,pp 32-33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey).
De serologische en immunologische kenmerken van degeïsoleerde Pseudomonas aeruginosa-stammen zijn reeds gepu¬bliceerd (zie het handboek van Bergey), zodat hun identifi¬catie kan geschieden met een analyse "kit" uit de handelvolgens de in J. Gen. Microbiology, 130, 631-644, 1984beschreven analytische methode. Elke Pseudomonas aeruginosa-stam werd geënt in een proefbuis die 5 ml trypsine-soya-bouillon bevatte en daarna bij 37°C onder aerobe omstandig¬heden geïncubeerd teneinde de concentratie van de bacteri-enmassa zodanig in te stellen dat een absorbantie van ca.
2,0 of meer onder zichtbaar licht van 650 nm behouden bleef.
Uit deze kweekoplossing werd een evenredig deelvan 1 mm aseptisch afgenomen en 10 minuten bij 4°C gecentri¬fugeerd met 6000 x g. De bovendrijvende kweekvloeistof werdverwijderd waarna het neergeslagen micro-organisme werdgesuspendeerd door toevoeging van een zelfde hoeveelheidgesteriliseerde fysiologische zoutoplossing. In elke holtevan een microplaat met 96 holtes werd 15 μΐ testserum uit de"kit" en 15 μΐ controleserum (normaal konijneserum) gebrachtwaarna dit werd vermengd met 15 μΐ van de bovenverkregen' suspensie van microorganisme en waarna werd nagegaan ofbinnen 10-30 minuten agglutinatie optrad. Aangezien de stamvan het microorganisme bij dit onderzoek in een holte metpositieve agglutinatie van het zelfde serotype is als datvan het toegevoegde serum, kon de identificatie van degeïsoleerde microorganismen gemakkelijk worden verricht.
Voorbeeld 2: Selectie van verzwakte Pseudomonas aerugino¬ sa- stammen uit elk van de geïsoleerde Pseu¬domonas aeruginosa-stammen
Terwille van het verzwakken van Pseudomonas aeru-ginosa-stammen ter verkrijging van veilige microorganismenvoor toepassing bij het bereiden van een vaccin, werd voorelk van de Pseudomonas aeruginosa-stammen met een apartimmuuntype één stam geselecteerd en dan via herhaalde zuive-i ringen verzwakt.
Bij deze procedure werd als controle een giftigePseudomonas aeruginosa-stam GN 11189 (Episome Institute,Japan) gekozen, welke een sterfte van 100% binnen 3 dagenveroorzaakt na intraveneuze (of intraperitoneale) injektie! van 2,0 x 10* cellen van GN 11189 in een mannelijke ICR-muismet een gewicht van 20-25 g.
Elk van de geselecteerde Pseudomonas aeruginosa-stammen met verschillend immuuntype werd onder dezelfdecondities als in voorbeeld 1 in vloeibare trypsine-soya-f bouillon gekweekt en daarna 10 minuten bij 4°C gecentrifu¬geerd bij 6000 x g. Het verkregen celprecipitaat werd in 10ml fysiologische zoutoplossing gesuspendeerd, opnieuw gecen¬trifugeerd onder dezelfde condities als eerder en dan ver¬dund met een verse fysiologische zoutoplossing teneinde heti celgehalte op 5 x 10s, 5 x 106, 5 x 107 en 5 x 108 cellen perml in te stellen. Elke celverdunning werd langs intraveneuze(of intraperitoneale) weg toegediend aan een groep van 10ICR-muizen. Aan de controlegroep werd de stam GN 11189toegediend in een hoeveelheid van 2,0 x 106 cellen peri proefdier. Op het punt waar de sterfte binnen drie dagen inde controlegroep 100% was werden Pseudomonas aeruginosa-stammen aseptisch geïsoleerd uit ICR-muizen die bij dehoogste celconcentratie overleefden. De geïsoleerde Pseudom¬onas aeruginosa-stammen werden opnieuw verspreid over eeni plaatmedium van trypsine-soya en agar. Na de bovenstaandeisoleringsmethode van het microorganisme werd elke stam vanhet microorganisme in zuivere toestand geïsoleerd.
Alle zeven (7) soorten van de eerste verzwaktemicroorganismen werden herhaaldelijk (ca. 3-7 maal) met debeschreven methode door ICR-muizen gevoerd totdat voor elkestam van het microorganisme de gewenste LDS0 van tenminste 2.0 x 107 cellen was bereikt. De veiligheidswaarde voor elketenslotte verkregen verzwakte stam van Pseudomonas aerugino¬sa, uitgedrukt in de waarde van LDS0, is in de volgendetabel 2 weergegeven.
Tabel 2. Veiligheidswaarden van geselecteerde verzwakte
Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderha¬vige uitvinding
Alle zeven (7) soorten microorganismen, zoalshierboven genoemd, vertoonden een LDS0 waarde van tenminste 2.0 x 107 cellen. Hieruit blijkt dat verzwakte microorganis¬men waren geselecteerd.
Voorbeeld 3: Identificatie van verzwakte Pseudomonas aeru¬ ginosa- stam.
Aan een vloeibaar voedingsmedium (pH 7,2-7,4), datbereid was door 15 minuten steriliseren met stoom in eenautoclaaf bij 121°C, werd gesteriliseerd 10% (gew/vol)cetrimide toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,3%(vol/vol). Uit het zo verkregen medium werd aseptisch eenevenredig deel van 10 ml afgenomen en in een proefbuisgebracht, waarna dit werd geënt met 1 druppel van elkeverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam, die volgens voorbeeld2 in zuivere toestand was geïsoleerd. De stam werd 12-16uren bij 30-37°C in zaaicultuur gekweekt. Uit de proefbuis,waarin de groei van het microorganisme plaatsvindt, werd 0,5ml kweekoplossing genomen en over een plaat van cetrimide-agar-medium als isolatiemedium voor Pseudomonas aeruginosaverspreid, waarna de plaat werd geïncubeerd. De kolonie, diereeds door pigmentvorming als Pseudomonas aeruginosa konworden geïdentificeerd, werd overgebracht naar en geïncu¬beerd op een Pseudomonas aeruginosa-agar-medium voor hetaantonen van fluoresceïne (Proteose pepton nr. 3 (oxoïde),2%, Glycerol (dubbel gedestilleerd) 1%, K2HP04 (watervrij)0,15%, MgS04.7H2 0,15%, Agar 1,5% (gew./vol), pH 7,2) envervolgens naar en op een Pseudomonas aeruginosa-agar-mediumvoor het aantonen van pyocyanine (Pepton (Difco) 2%, Glyce¬rol (dubbel gedestilleerd) 1%, K2S04 (watervrij) 1%, MgCl2(watervrij) 0,14%, Agar 1,5% (gew/vol), pH 7,2). Vervolgenswerd het opnieuw beoordeeld met een morfologische proef, eenproef naar voedingsbehoefte en een oxidatietest teneinde deaanwezigheid van de Pseudomonas aeruginosa-stam te bepalen.De typen van de geselecteerde Pseudomonas aeruginosa-stammenwerden volgens het IATS-klassificatiesysteem bepaald ondergebruikmaking van een antigeenkit voor Pseudomonas aerugino¬sa (gemaakt door Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA)waarna zij werden geklassificeerd volgens de immuno-seroty-pen van Fisher. De resultaten daarvan zijn in de volgendetabel 3 weergegeven.
Tabel 3. Criteria voor selectie van Pseudomonas aeruginosa-stammen, alsmede hun serotype en beschermingsge-bied.
Voorbeeld 4: Fysiologische eigenschappen van verzwakte
Pseudomonas aeruginosa-stammen (1) Bij elk van de zeven soorten Pseudomonasaeruginosa-stammen, die volgens voorbeeld 2 waren verzwakt,werd de groeisnelheid in afhankelijkheid van verschillendepH-waarden bepaald. Elke stam van het microorganisme werdgeënt in 50 ml trypsine-soyabouillon met een pH-waarde van7,2 en daarna 12-16 uren bij 37°C onder aerobe omstandighe- den met een roersnelheid van 200/min gepreincubeerd. Elkegepreincubeerde bacteriemassa werd tot een eindconcentratievan 1% (vol/vol) geënt in 500 ml verse trypsine-soyabouillonmet een pH van 3,0, een pH van 5,0, een pH van 7,0 en een pHvan 9,0, en daarna in fermentatietoestellen bij 37°C onderdezelfde omstandigheden als hierboven geïncubeerd. Tijdensdeze periode werd van elk kweekmedium met intervallen van 2uren een monster genomen waarna de concentratie aan bacte¬riemassa werd bepaald door de absorbantie van het monsteri bij 600 nm met behulp van een spectrofotometer te meten. Deresultaten zijn weergegeven in de volgende tabel 4.
Tabel 4. Groeisnelheden van microorganisme in afhankelijk¬heid van de pH-waarde i
: Opmerking: + groei, - geen groei
Zoals blijkt uit tabel 4 vertoonden de verzwaktePseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderhavige uit¬vinding geen groei onder sterk zure omstandigheden, bijv.i bij pH 3,0, maar hadden zij nagenoeg gelijke of soortgelijkegroeisnelheden in media met een pH van 5,0 tot 9,0. Daaromkunnen bij de onderhavige uitvinding alle zeven soortenmieroorganismen zich goed binnen een breed pH-gebied wordengekweekt.
(2) Met dezelfde methode als in het bovenstaandeonderdeel (1) werd de groeisnelheid van Pseudomonas aerugi-nosa-stammen bij wisselende temperatuur bepaald. Elk van dezeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen werdi geënt in 50 ml trypsine-soyabouillon bij een pH-waarde van 7,0 en daarna 12-16 uren bij 37°C onder aerobe omstandighe¬den en een roersnelheid van 200/min gepreincubeerd. Elk vande gepreincubeerde stammen werd geënt in 500 ml trypsine-soyabouillon met een pH van 7,0 en daarna in fermentatietoe-) stellen onder dezelfde omstandigheden als hierboven geïncu-beerd, waarbij de toestellen op temperaturen van 25°C, 30°C,37°C en 42°C werden gehouden. Tijdens deze periode werd degroeisnelheid in elk fermentatietoestel bepaald door deabsorbantie van de kweekoplossing bij 600 nm met behulp vani een spectrofotometer te meten. De resultaten zijn weergege¬ven in tabel 5.
Tabel 5. Groeisnelheden van microorganisme bij wisselendetemperatuur.
)
upmerjcmg: + groei, - geen groei ) Zoals blijkt uit tabel 5 vertoonden alle zeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen de bestegroei bij 37°C en verder een goede groei bij 30°C en 25°C.Bij 42°C vertoonde elk van de zeven soorten Pseudomonas aeruginosa-stammen echter een relatief langzame groei,vergeleken met de groeisnelheid bij andere temperaturen.
(3) Het volgende experiment werd gedaan ter bepa¬ling van het effekt van een koolstofbron op de groeisnelheid> van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen. Elk van dezeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen werdgeënt in 50 ml trypsine-soyabouillon bij een pH van 7,0 endaarna 12-16 uren bij 37°C onder aerobe omstandigheden eneen roersnelheid van 200/min geïncubeerd. Het kweekmedium) werd vervolgens 10 minuten bij 4°C onder aseptische omstan¬digheden gecentrifugeerd met 6000 x g, waarna de bacterie-massa werd gewonnen en gehersuspendeerd in 10 ml fysiologi¬sche zoutoplossing. Van de zo verkregen suspensies vanmicroorganisme werd telkens 50 μΐ geënt in 5 ml M9-medium5 (Na2HP04.7H20 12,8g, KH2P04 3g, NaCl 0,5g, NH4C1 lg) datuiteenlopende koolstofbronnen bevatte (zie hieronder) endaarna 12 uren geïncubeerd. Voor elke kweekoplossing werdvervolgens de mate van groei van het microorganisme bepaalddoor meting van de absorbantie bij 600 nm.
)
Tabel 6. Groei-eigenschappen van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in afhankelijkheid van de kool¬stof bron.
Opmerking: + groei, - geen groei
De groei van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen op diverse koolstofbronnen vertoonde een patroon datnagenoeg gelijk was aan dat van de groei van algemene Pseu¬domonas aeruginosa-stammen op diverse koolstofbronnen (ziehet handboek van Bergey). Opgemerkt wordt echter dat hoewelgerapporteerd is dat Pseudomonas aeruginosa in het algemeengeen mannose gebruikt, de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderhavige uitvinding wel enige groei ineen mannose-houdend medium vertoonden.
Zoals blijkt uit het bovenstaande, kunnen deverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderha¬vige uitvinding ter verkrijging van een bacteriemassa onderaerobe condities bij geselecteerde temperatuur, pH en derge¬lijke in een gebruikelijk medium met een koolstofbron, eenstikstofbron, anorganische verbindingen, aminozuren, vitami¬nen en andere voedingsstoffen worden geïncubeerd. De cel-wandproteïnen uit de verkregen bacteriemassa worden gebruiktvoor het bereiden van Pseudomonas aeruginosa-vaccins.
Als koolstofbron voor het incuberen van de ver¬zwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen kunnen diverse koolhy¬draten zoals glucose, mannitol, fructose etc., diverseorganische zuren, zoals azijnzuur, pyrodruivenzuur, melkzuuren dergelijke worden gebruikt. Voor de stikstofbron kunnendiverse organische en anorganische ammoniumzouten, pepton,gistextracten, caseïne, hydrolisaten en andere stikstofhou¬dende stoffen worden gebruikt. Als anorganische verbindingenkunnen magnesiumsulfaat, calciumcarbonaat, ferrosulfaat,cuprosulfaat, zinksulfaat en kaliumwaterstoffosfaat enkaliumdiswaterstoffosfaat en dergelijke worden gebruikt. Deincubatie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 25-37°C onderaerobe omstandigheden, bijv. door middel van een plaatcul-tuur of een vloeibare cultuur zoals een schudcultuur of eenbeluchtings-spinnercultuur. De pH-waarde van het mediumwordt tijdens de incubatieperiode bij voorkeur op een waardevan 5-9 gehandhaafd. Bij voorkeur wordt de bacteriemassa,die door centrifugeren van de 12-16 uren geïncubeerde kweek-oplossing wordt verkregen, als uitgangsmateriaal voor hetbereiden van vaccins gebruikt, zoals hierna beschreven.
Voorbeeld 5: Incubatie van verzwakte Pseudomonas aerugino¬ sa- stammen.
(l) De volgens voorbeeld 2 verkregen bacteriemassavan Pseudomonas aeruginosa werd terwille van de massaleproduktie in een fermentatievat van 5 1 als volgt geïncu¬beerd. 2,5 1 van een medium, verkregen door tryptine-soya-bouillon in gedestilleerd water op te lossen (30 g op 1 1)werd op pH 7,2 gebracht, gesteriliseerd en daarna in het vat van 5 1 gebracht. De incubatieomstandigheden waren: incuba-tietemperatuur 37°C; beluchtingsgraad 1 wm; entingshoeveel-heid 5% (vol/vol) bacteriemassa van verzwakte Pseudomonasaeruginosa verkregen uit voorbeeld 2, betrokken op kweekop-lossing; roersnelheid 100/min voor de eerste 2 uren endaarna een vaste roersnelheid van 600'/min voor de volgende12-16 uren. Ofschoon de verkregen hoeveelheden bacteriemassaenigszins verschilden, afhankelijk van het type van dePseudomonas aeruginosa-stam, was de gemiddelde opbrengst ca.8 g (droog gewicht) bacteriemassa per liter kweekvloeistof.
(2) Elk van de zeven typen verzwakte Pseudomonasaeruginosa-stammen werd onder dezelfde incubatieomstandighe¬den als in het bovenstaande onderdeel (1) geïncubeerd, metals verschil dat als medium een speciaal medium voor hetkweken van Pseudomonas aeruginosa werd gebruikt, dat bestonduit glucose (30 g/1), pepton (15 g/1), MgS04 (0,5 g/1) ,
CaC03 (5g/l) , KH2P04 (lg/1) , FeS04 (5mg/l) , CuS04 (5mg/l) enZnS04 (5mg/l) . Met dit speciale medium werd ca. 10,4 g tot10,5 g (droog gewicht) bacteriemassa voor elke stam van hetmicroorganisme verkregen. Door het gebruik van dit specialemedium kan derhalve een opbrengst aan bacteriemassa wordenverkregen die tenminste 30% groter is (betrokken op drooggewicht) dan die in een trypsine-soyabouillon.
Voorbeeld 6: Partiële zuivering van celwandproteïnen uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen
Voor het bereiden van vaccins tegen Pseudomonasaeruginosa, werden de celwandproteïnen uit elk van de zevensoorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen partieeli gezuiverd. Hierna wordt de stam van type 3, namelijk CFCPA30720 (KCCM 10031) als typerend voorbeeld gebruikt. Deandere verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen kunnenechter aan dezelfde methode als de navolgende zuiveringsme-thode worden onderworpen ter verkrijging van partieel gezui¬verde celwandproteïnen.
2,5 1 van het speciale medium, zoals gebruikt inhet bovenstaande voorbeeld 4(2), werd in een fermentatievatvan 5 1 gebracht en daarna 12-16 uren onder handhaving van dezelfde incubatieomstandigheden als hierboven geïncubeerd.Na voltooiing van de incubatie werd 2,5 1 van de kweekoplos-sing 20 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 6000 x g terverwijdering van de bovendrijvende vloeistof. De neergesla¬gen cellen werden gehersuspendeerd in een fosfaatbufferop-lossing (Na2HP04 1,15 g, KC1 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCl 8,766g, per liter, pH 7,2) bij 4°C, dan opnieuw gecentrifugeerden gewassen met dezelfde fosfaatbufferoplossing. Aan 130 gvan de zo verkregen cellen werden 3 volumina (ca. 390 ml)aceton betrokken op het oorspronkelijke natte cel volumetoegevoegd waarna het mengsel 12 uren of langer bij 4°Cmocht blijven staan. Nadat het aceton van de neergeslagencellen was verwijderd werden opnieuw twee volumina (ca. 260ml) verse aceton, betrokken op het oorspronkelijke nattecelvolume, aan het residu toegevoegd. Het verkregen mengselwerd 5-10 minuten geroerd en daarna 20 minuten gecentrifu¬geerd met 8000 x g. De bovendrijvende aceton werd verwijderdwaarna een zelfde volume aceton aan het residu werd toege¬voegd. Het mengsel werd op dezelfde wijze als hierbovenbeschreven doorgeroerd en gecentrifugeerd ter verwijderingvan de bovendrijvende vloeistof. De neergeslagen cellenwerden bij kamertemperatuur op een plaat gedroogd ter ver¬wijdering van de aceton. De gedroogde microorganismen werdengehersuspendeerd door toevoeging van 250 ml van dezelfdefosfaatbufferoplossing als hierboven, zodat de eindconcen-tratie kon worden ingesteld op 10% (vol/vol). Het verkregenmengsel werd 10 minuten bij een draaisnelheid van 500-1500/min onder handhaving van een temperatuur van 4°C in eenhomogenisator behandeld ter extractie van de celwandprote-inen. De verkregen suspensie werd 30 minuten gecentrifugeerdbij 8000 x g tot 10.000 x g ter verkrijging van de boven¬drijvende vloeistof. De neergeslagen cellen werden afge¬scheiden, opnieuw gesuspendeerd door toevoeging van eenzelfde volume fosfaatbufferoplossing en daarna onderworpenaan een tweede extractie onder dezelfde omstandigheden alsde eerste extractie ter verkrijging van de bovendrijvendevloeistof.
Door gebruikmaking van dezelfde omstandigheden alsbij de eerste extractie werden de celwandproteinen herhaal¬delijk (5-6 maal) geëxtraheerd, waarbij gezorgd werd datgeen van de cellen openbrak (lysis vertoonde). Het openbre¬ken van de cellen kan worden bepaald door een speciaalproteïne als cytoplastische merkstof te meten, namelijklactaatdehydrogenase of hexokinase. De geëxtraheerde boven¬drijvende vloeistoffen, die elk waren getest om te zorgendat de celwandproteinen zonder meenemen van cytoplastischeproteïnen (lactaatdehydrogenase en hexokinase) waren ge¬ëxtraheerd, werden gezameld, doorgeroerd en tenslotte op¬nieuw 30 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 10.000 x g terverkrijging van een heldere vloeistof. De zo verkregenproteïne-oplossing bestond enkel uit nagenoeg zuivere cel¬wandproteinen en werd met een kwantitatieve proteïnetestingesteld op een proteïneconcentratie op het niveau van 1mg/ml tot 2 mg/ml. Verder werd de zuiverheid van de prote-ineoplossing bepaald met behulp van elektroforese met eenconcentratiegradiënt van 10-15%. Als resultaat kon wordenaangetoond dat de gewenste celwandproteinen met een molge-wicht tussen 10.000 en 100.000 aanwezig waren (zie fig. 1).
Voorbeeld 7: Verdere zuivering van ruwe proteïnen.
De volgende methode werd uitgevoerd ter zuiveringvan de ruwe oplossing van celwandproteinen met een concen¬tratie van 1-2 mg/ml, teneinde te zorgen dat alleen dedoeltreffende bestanddelen aanwezig waren.
2-2,5 1 van de ruwe oplossing van celwandproteinenwerd eerst gefiltreerd door een membraanfilter uit hetPellicon Cassette System met maximale doorlaat van molge-wicht 100.000, teneinde de proteïnemoleculen met een molge-wicht boven 100.000 te verwijderen. Bij dit proces werden deproteïnen met een molgewicht beneden 100.000 als filtraatverkregen en werden de proteïnen met een molgewicht boven100.000 continu rondgevoerd ter scheiding van de kleinemoleculen met een molgewicht beneden 100.000.
Als gevolg hiervan werd de proteïneoplossing tot10-20% van het oorspronkelijke volume geconcentreerd. Ver¬ volgens werd zij gewassen met 20-25 1 (tien maal het oor¬spronkelijke volume van de proteïneoplossing) aan gesterili¬seerde fosfaatbufferoplossing (Na2HP04 1,15 g KC1 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCl 8,766 g/1) teneinde 90% of meer derproteïnen met molgewicht beneden 100.000 terug te winnen. Deproteïnen met molgewicht beneden 100.000, die als filtraatwerden verkregen, werden over een membraanfilter van het¬zelfde systeem met een minimale doorgang van molgewicht10.000 gevoerd teneinde proteïnen met een molgewicht kleiner| dan 10.000 en andere onzuiverheden te verwijderen en tege¬lijkertijd de proteïnen met molgewicht 10.000 tot 100.000 teconcentreren tot een waarde van 1 mg/ml.
Tenslotte werd de bovendrijvende vloeistof aanultracentrifugering onderworpen ter verwijdering van lypopo-lysacchariden (LPS) en celwandverwante fragmenten, die in debovenverkregen vloeistof mogelijk in sporenhoeveelhedenaanwezig zijn. Het ultracentrifugeren werd 3 uren bij 4°Cuitgevoerd met 180.000 x g tot 200.000 x g. Na verwijderingvan de neerslagen werd de verkregen vloeistof gesteriliseerdi door filtratie door een filter van 0,2 μπι, zodat 250 tot 260mg proteïnepreparaat werd verkregen dat in vaccins voorprofylaxe tegen Pseudomonas aeruginosa-infekties kon wordengebruikt.
i Voorbeeld 8; Zuivering van celwandproteïnen uit verzwakte
Pseudomonas aeruginosa-stammen met verschil¬lende immuuntypes.
De overblijvende zes soorten verzwakte Pseudomonasaeruginosa-stammen volgens de onderhavige uitvinding, datI wil zeggen de Stammen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 40057,CFCPA 50243, CFCPA 60534 en CFCPA 70018 werden behandeld metdezelfde methode voor incubatie van het microorganisme enzuivering als in voorbeeld 5, voorbeeld 6 en voorbeeld 7 isbeschreven voor het bereiden van een vaccin uit de Pseudom-i onas aeruginosa-stam CFCPA 30720. De zo verkregen vaccinpre-paraten uit Pseudomonas aeruginosa vertoonden hetzelfdebandpatroon als het vaccinpreparaat uit CFCPA 30720 bij SDS-PAGE met een concentratiegradiënt van 10-15%. Bovendien kon bij vergelijking met een merkstof van standaard molecuulge-wicht worden vastgesteld dat alle proteïnen in de vaccinpre-paraten een molgewicht tussen 10.000 en 100.000 hadden (fig.1) .
Voorbeeld 9; Test op kruisbeschermend vermogen met gecom¬bineerde antigenen
De celwandproteïnen, afkomstig van elke verzwaktePseudomonas aeruginosa-stam na de afscheidings- en zuive-) ringstrappen volgens de methoden van de voorbeelden 7 en 8werden in een hoeveelheid van 0,2 mg/kg intraperitoneaaltoegediend aan mannelijke ICR-muizen van 6 weken oud met eengewicht van 23-25 kg teneinde de dieren te immuniseren. Elkegroep bestond uit 10-15 proefdieren. Eén week na de immuni-5 satie werd van 2 tot 3 muizen per groep bloed afgenomen terwille van een ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Bijde overblijvende ICR-muizen werd een "wilde" Pseudomonasaeruginosa-stam, die met het betreffende immuuntype overeen¬kwam, geinjekteerd in een hoeveelheid van 10-50 maal de) oorspronkelijke ldeo-waarde voor elke in tabel 2 van voor¬beeld 2 genoemde stam van het microorganisme. De doeltref¬fendheid van de bescherming tegen elke Pseudomonas aerugino-sa-stam werd gedurende één week continu nagegaan. Als gevolgdaarvan bleken alle testgroepen een beschermend effekt tegen5 de overeenkomstige Pseudomonas aeruginosa-stammen te hebbenen gaven de ELISA-proeven bij al het verzamelde bloed ookgoede positieve waarden, hetgeen een verbetering in immuno¬logische respons betekent.
Voor het bereiden van vaccins volgens de onderha¬ll vige uitvinding, die in staat zijn om een gemeenschappelijkbeschermend effekt te geven tegen infekties die door eenwillekeurig type van Pseudomonas aeruginosa-stammen wordenveroorzaakt, werden vier typen verzwakte Pseudomonas aerugi¬nosa- stammen (drie typen Pseudomonas aeruginosa-stammen die5 het meest frequent bij infekties van het menselijk lichaamworden gevonden en één type Pseudomonas aeruginosa-stam diebij aantreffen moeilijk te bedwingen is, namelijk CFCPA10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534) behandeld ter verkrijging van celwandproteïnen, die daarna in equiva¬lente hoeveelheden werden gecombineerd en vervolgens werdenonderzocht op hun vermogen tot kruisbescherming tegen elkimmunotype van de Pseudomonas aeruginosa-stammen.
Celwandproteïnen, afkomstig van de bovengenoemdevier typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, werdenin equivalente hoeveelheden (1:1:1:1), betrokken op hetgewicht, met elkaar gecombineerd. De gecombineerde celwand¬proteïnen werden intraperitoneaal toegediend aan mannelijkeICR-muizen ter immunisering van de proefdieren. De controle¬groep kreeg 0,3 ml fosfaatbufferoplossing (Na2HP04 l,15g, KC1 0,2g, KH2P04 0,2g, NaCl 8,766g per liter) toegediend. Naéén week, gerekend vanaf de immunisatie, werd aan elk van demet Pseudomonas aeruginosa-vaccin geïmmuniseerde testgroepenen aan de met fosfaatbufferoplossing geïmmuniseerde contro¬legroep intraperitoneaal Pseudomonas aeruginosa toegediendin vijf (5) verschillende concentraties die een reeks vantelkens 10-voudige verdunning vormen, gaande vanaf 1 x 108cellen tot 1 x 104 cellen. Na één week werd het aantaloverlevende testdieren geteld ter berekening van de effi¬ciëntie- index (EI). De resultaten zijn weergegeven in deonderstaande tabel 7, waarin de efficiëntie-index is gedefi¬nieerd als de waarde van LD50 in de testgroep, gedeeld doorde waarde van LD50 in de controlegroep. Zoals blijkt uitfig. 7 heeft een vaccin, bestaande uit de celwandproteïnenafkomstig van vier soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-Stammen, namelijk CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 enCFCPA 60534, een EI-waarden van 3,0 tot 18 of meer tegen elkimmunotype van de Pseudomonas aeruginosa-stammen. In aanmer¬king nemens dat vaccins met een EI-waarde van tenminste tweeals vaccins met een goed immunologische effekt worden be¬schouwd, volgt hieruit dat het vaccin volgens de onderhavigeuitvinding een goed beschermend effekt heeft tegen infektiesdie door elk willekeurig type van de zeven soorten Pseudom¬onas aeruginosa-stammen worden veroorzaakt.
Tabel 7. Test naar kruisbeschermend vermogen van Pseudom¬onas aeruginosa-vaccin, bereid uit vier (4) ver¬schillende soorten verzwakte Pseudomonas aerugino-sa-stammen, tegen elk type van het micro-organisme )
Door herhaling van de bovenstaande methode met alsverschil dat in plaats van het mengsel van vier soortenproteïnen nu een mengsel van celwandproteinen afkomstig uitdrie typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen namelijk) CFCPA 10142, CFCPA 30720 en CFCPA 20215 (groep I) of eenmengsel van celwandproteinen afkomstig uit alle zeven typenverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen (groep II) werdgebruikt, waarbij alle celwandproteinen in equivalentehoeveelheid ten opzichte van elkaar aanwezig waren, werd heti kruisbeschermend vermogen van deze twee soorten vaccinstegen infektie door elke soort Pseudomonas aeruginosa onder¬zocht. De resultaten daarvan zijn vermeld in tabel 8.
Tabel 8. Test op kruisbeschermend vermogen van vaccinsi afkomstig van drie typen (groep I) of zeven typen (groep II) verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam¬men, tegen elk type van het microorganisme.
Uit de bovenstaande experimentele resultaten kanworden afgeleid dat, aangezien het vaccin volgens de uitvin¬ding met gemengde proteinebestanddelen uit celwandproteïnenbestaat die van tenminste drie (3) verschillende soortenverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen met onderlingverschillende immunotypen afkomstig zijn, dit vaccin eenuitstekend beschermend effekt tegen elk soort immuuntype vanPseudomonas aeruginosa vertoont, in tegenstelling totslechts een enkel soort gemeenschappelijk antigeen. Hoewelde efficiëntieindex van het vaccin volgens de uitvindingvarieert met het soort en het aantal geselecteerde microor-ganismen uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, demengverhouding van de daaruit afgeleide celwandproteïnen,het immunologische schema en de methode, etc., wordt zodoen¬de bevestigd dat het vaccin van de onderhavige uitvindingdoeltreffend werkt tegen alle Pseudomonas aeruginosa-stammendie momenteel in ziekenhuizen en bij patiënten optreden.
Voorbeeld 10: Toxicologische test op celwandproteïnen.
Ter bereiding van een deelvaccin voor profylaxetegen infekties die door Pseudomonas aeruginosa worden veroorzaakt, dient men zeker te zijn van de veiligheid vande celwandproteinen zelf, die als deelvaccin worden gebruikten ook van de veiligheid van de stammen van het microorga-nisme zelf zoals beschreven in voorbeeld 2. In dit voorbeeld5 werden celwandproteinen partieel gezuiverd en daarna onder¬zocht op hun veiligheid in een proefdier, bijv. een muis. Inhet bijzonder werd elk van de verzwakte microorganismen ineen fermentatietoestel van 5 liter geïncubeerd met trypsine-soyabouillon als kweekmedium en dan verder behandeld op de) wijze van de voorbeelden 5, 6 en 7. De bovendrijvende vloei¬stoffen van celwandproteinen, geëxtraheerd uit verzwaktePseudomonas aeruginosa-stammen, werden samengevoegd enopnieuw 30 minuten gecentrifugeerd bij 4°C met 10.000 x gter verwijdering van fijne deeltjes die mogelijk in oplos-5 sing aanwezig waren. De resulterende celwandproteinen werdendoor een membraanfilter van Amicon gefiltreerd ter verkrij¬ging van een mengsel van celwandproteinen met molecuulge-wichten tussen 10.000 en 100.000, welk mengsel tot eenproteïneconcentratie van 1 mg/ml werd geconcentreerd en) daarna met een filter van 0,2 μχα. werd gesteriliseerd terverkrijging van een proteinebron voor toxicologische proe¬ven.
Bij de toxicologische proef bestonden de gebruikteproefdieren uit mannelijke ICR-muizen met een gewicht van5 20-22 gram. De proteinebron werd intraveneus bij de test¬groep geinjekteerd in een hoeveelheid van 20 mg/kg en van100 mg/kg. De controlegroep kreeg een fysiologische zoutop¬lossing in een hoeveelheid van 25 ml/kg toegediend. Zoalsblijkt uit tabel 9 en de bijgevoegde figuur 2, vertoonde de) testgroep een lichte remming van de gewichtstoename op deeerste dag na de toediening, terwijl deze groep op de tweededag na toediening en later een normale groei en geen specia¬le symptomen vertoonde. Bovendien kon zelfs op en na dezevende dag geen specifieke wijziging of symptomen in enigj orgaan worden gevonden.
Tabel 9. Acute toxicologische test voor celwandproteinenafkomstig van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen.
Voorbeeld 11 Bepaling van de antigene werking van celwand¬proteinen
Celwandproteinen, verkregen door partiële zuive¬ring van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen op dezelf¬de wijze als in voorbeeld 10, werden als antigeen gebruikten werden in een hoeveelheid van 0,1 mg/kg of 0,2 mg/kgintraveneus in ICR-muizen geinjekteerd teneinde de proefdie¬ren te immuniseren. Eén week na de immunisatie werd eenbepaalde hoeveelheid bloed bij elke muis van de groep muizenafgenomen, waarna het serum uit het verzamelde bloed werdafgescheiden en de vorming van antilichamen met behulp vaneen ELISA-methode werd bepaald (J. Clin. Microbiol. 15,1054-1058, 1982).
Eerst werd 100 μΐ van het in voorbeeld 10 verkre¬gen antigeen, dat op een concentratie van 0,1 mg/ml in eenbekledingsbuffer was ingesteld, (0,05 M carbonaatbufferop-lossing bestaande uit NaHC03 2,85 g, Na2C03 l,70g, H20 l, pH9,6) in elke holte van een microplaat met 96 holtes gebrachten daar 2 uren op kamertemperatuur of 12-14 uren op 4°Cgehouden teneinde het proteïne aan de plaat te laten hech¬ten.
Na het verwijderen van de waterige oplossing werdaan elke holte van de plaat 200 μΐ 1% runderserumalbumine(BSA) toegevoegd, dat 1 uur bij kamertemperatuur in reaktiewerd gebracht, teneinde het overblijvende deel in de holtes,dat niet aan proteïne was gebonden, te blokkeren.
Bij deze test werd het serum van niet-geimmuni¬seerde muizen als antilichaam voor de controlegroep ge¬bruikt. Bij voltooiing van de reaktie werd de plaat opnieuw5-6 malen gewassen met een fosfaatbufferoplossing (pH 7,0tot 7,2) en werd 100 μΐ van een tweede antilichaam, namelijkkonijn-antimuis-lG-peroxidaseconjugaat, aan elke holtetoegevoegd en 1 uur bij normale temperatuur daarmee inreaktie gebracht.
Daarna werd de pl’aat 7 malen of meer met dezelfdefosfaatbufferoplossing (pH 7,0 tot 7,2) krachtig gewassen.Als substraat werd 50 μΐ orthofenyleendiamine-dihydrochlori-de, ingesteld op een concentratie van 0,3 tot 0,4 mg/ml ineen citraat-fosfaatbufferoplossing (0,1 M citraat-fosfaat-buffer, pH 5,0) aan elke holte van de plaat toegevoegd en 20minuten bij uitsluiting van licht in reaktie gebracht.
Daarna werd telkens 50 μΐ IN zwavelzuur toegevoegd teneindede reaktie in elke holte te stoppen. Voor elke reaktieoplos-sing werd vervolgens de absorbantie bij 490 nm met behulpvan een spectrofotometer gemeten.
Tabel 10 Vorming van antilichamen tegen celwandprotelnenvan elk microorganisme (490 nm).
Zoals uit tabel 10 blijkt, resulteert de toedie¬ning van 0,1 of 0,2 mg/kg aan antigeen en de testgroep ineen immuniteit die 2 tot 5 maal hoger is dan in de controle¬groep .
Voorbeeld 12: Produktie van immunoglobuline tegen Pseudom¬ onas aeruginosa.
I De in voorbeeld 7 verkregen proteïneoplossing werd aan konijnen toegediend ter produktie van het overeenkomsti¬ge immunoglobuline. Ofschoon de celwandprotelnen afkomstigvan de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam CPCPA 30720 alstyperend voorbeeld werd gebruikt, kan dezelfde methode: worden toegepast op de andere verzwakte Pseudomonas aerugi-nosa-stammen.
0,5 tot 1 ml van de in voorbeeld 7 uit de stamCFCPA 30720 verkregen oplossing van celwandprotelnen, (met100-200 μg celwandprotelnen daarin) werd gebruikt om albino-) konijnen 3 malen met tussenpozen van 7 dagen te enten.
Daarna werd bij één der konijnen met regelmatige tussenpozenbloed afgenomen, waaruit het serum werd afgescheiden. 100 mlvan het afgescheiden konijneserum werd vermengd met 300 mlgedestilleerd water, waarna het mengsel bij 4°C werd toege-i voegd aan 500 g (nat gewicht) DEAE-cellulose. Het verkregenmengsel werd 1 uur bij 4°C krachtig doorgeschud, waarna het mocht blijven staan en waarna de bovendrijvende vloeistofwerd afgescheiden en verwijderd. Het overblijvende residuwerd drie maal gewassen met telkens 200 ml 0,01 M fosfaat-bufferoplossing (Na2HP04 1,15 g, KH2P04 0,2 g, KC1 0,2 g,
NaCl 8,766 g per liter, pH 8,0) waardoor 600 mg immunoglobu-line IgG met een zuiverheid van 96% of meer werd verkregen.
Voorbeeld 13: Therapeutische effekt van het immunoglobuline op een Pseudomonas aeruginosa-infektie.
Bij de in voorbeeld 12 verkregen immunoglobulinentegen Pseudomonas aeruginosa-stammen werd het therapeutischeffekt op een infektie door Pseudomonas aeruginosa op devolgende wijze bepaald. Hierbij werden 10 muizen in elkegroep gebruikt.
Elk van de pathogene Pseudomonas aeruginosa-stam¬men met de immuuntypen 1,2,3,4,5,6 en 7 volgens Fisherwerden in hoeveelheden van 1,0-3,0 x 106 intraperitoneaalbij elke muis geinjekteerd ter opwekking van een Pseudomonasaeruginosa-infektie. Binnen 2-6 uren na de injektie werd hetgezuiverde immunoglobuline tegen elke stam intraveneus bijelke muis geinjekteerd in een hoeveelheid van 0,1-2 mg permuis en werd het therapeutische effekt daarvan nagegaan.
In de controlegroep werd in plaats van immunoglo¬buline 0,5 ml fysiologische zoutoplossing (voor injektie-doeleinden) intraveneus geinjekteerd. Bij deze proef warende gebruikte immunoglobulinen: CFCPA 10142, CFCPA 20215,CFCPA 30720 en CFCPA 60534., of een mengsel van deze viersoorten immunoglobulinen in equivalente hoeveelheden tenopzichte van elkaar.
Als gevolg hiervan vertoonde de controlegroep, diealleen een fysiologische zoutoplossing had ontvangen, eensterfte van 50% of meer binnen 48 uren en 100% na 72 urenterwijl de testgroep, die het overeenkomstige immunoglobuli¬ne ontving, een overlevingspercentage van 80% of meer na 72uren vertoonde. Hieruit kan worden afgeleid dat het immuno¬globuline werkzaam is bij de behandeling van infekties, diedoor pathogene Pseudomonas aeruginosa-stammen met het over¬eenkomstige immunotype volgens Fisher worden veroorzaakt.
Geen enkel immunoglobuline had daarentegen veel effekt tegeneen infektie, veroorzaakt door pathogene Pseudomonas aerugi¬nosa- stammen met immuuntypen 4 en 5 volgens Fisher.
Anderzijds vertoonde de groep muizen, die eeni combinatie van vier soorten immunoglobulinen in een ge¬wichtsverhouding 1:1:1:1 hadden ontvangen, dankzij de kruis-reaktiviteit daarvan een uitstekend therapeutisch effekt,zelfs op de typen 4 en 5 volgens de Fisher van Pseudomonasaeruginosa-stammen. Het gecombineerde immunoglobulineprepa-) raat volgens de onderhavige uitvinding kan dan ook alsdoeltreffend geneesmiddel worden gebruikt tegen infektiesdie door Pseudomonas aeruginosa-stammen van alle immuuntypesvolgens Fisher worden veroorzaakt. De resultaten van dezeproef zijn samengevat in de tabellen 11 en 12.
Tabel 11. Immunologisch beschermend effekt bij gebruik vanimmunoglobulinen individueel of in combinatie.
>
Tabel 12. Onderlinge relatie van de immunologische bescher¬ming door immunoglobuline tegen Pseudomonas aeru¬ginosa- stammen
Voorbeeld 14: Therapeutisch effekt van de gecombineerde immunoglobulinen op een infektie door Pseu¬domonas aeruginosa.
Vier soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen die in voorbeeld 13 waren geselecteerd, dat wilzeggen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534,werden op dezelfde wijze als in de voorbeelden 5, 6 en 7geïncubeerd en geëxtraheerd ter verkrijging van een gecombi¬neerd preparaat van celwandproteinen, dat vervolgens opdezelfde wijze als in voorbeeld 13 drie malen met tussenpo¬zen van 1 week en in hoeveelheden van 1,5 tot 2 mg bij een geit werd geënt ter verkrijging van de gecombineerde Pseu¬domonas aeruginosa-immunoglobulinen in grote hoeveelheid.Deze hoeveelheid werd met een bekende methode gezuiverd (ziePractical Immunology, 3de editie (1989), pag. 292-294).
Ter bepaling van het immunologisch beschermendeffekt en het therapeutische effekt van de op bovenstaandewijze verkregen gezuiverde en gecombineerde immunoglobulinenten opzichte van pathogene Pseudomonas aeruginosa-stammenvan diverse immuuntypes volgens Fisher, werden Pseudomonas1 aeruginosa-stammen van elk immuuntype in een hoeveelheid van1,0 tot 3,0 x 10* cellen per muis geënt op een groep muizen(zes groepen, 20 muizen per groep) die vooraf drie maal eeninjektie met het gecombineerde immunoglobulinepreparaathadden gekregen, en op een andere groep muizen (zes groepen:10 muizen per groep) die geen immunoglobulinepreparaathadden ontvangen, teneinde het immunologisch beschermendeeffekt van het gecombineerde immunoglobuline waar te nemen.Daarnaast werd een andere groep muizen (zes groepen, 10muizen per groep) eerst geënt met een pathogene Pseudomonas1 aeruginosa-stam, waarna deze groep na 2 tot 6 uren eenintraveneuze injektie met het op bovenstaande wijze verkre¬gen gecombineerde immunoglobulinepreparaat in een hoeveel¬heid van 0,1 tot 5 g per muis van 20 tot 25 g kregen, terwaarneming van het therapeutisch effekt van het immunoglobu¬linepreparaat volgens de onderhavige uitvinding.
Als gevolg daarvan kon worden aangetoond dat hetgecombineerde immunoglobulinepreparaat volgens de uitvindingeen immunologisch beschermend effekt van 80% of meer en eentherapeutisch effekt van 75% of meer vertoont (bepaald alsi overlevingsgraad (%) na zeven dagen) terwijl de muizen vanalle controlegroepen binnen drie dagen stierven.
Zodoende kan worden vastgesteld dat het gecombi¬neerde immunoglobulinepreparaat volgens de uitvinding bruik¬baar is als nuttig geneesmiddel, dat zowel een uitstekendI therapeutisch effekt als een immunologisch beschermendeffekt vertoont.
Voorbeeld 15: Formulering van de immunoglobulinen
De combinatie van celwandproteinen, verkregen doorincubatie en extractie van vier soorten verzwakte Pseudom¬onas aeruginosa-stammen uit voorbeeld 13, namelijk CFCPA10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534 op dezelfdewijze als in de voorbeelden 5, 6 en 7, werd op de wijze vanvoorbeeld 14 aan een mannelijke geit toegediend ter verkrij¬ging van het gecombineerde Pseudomonas aeruginosa-immunoglo-buline. Dit werd afgescheiden en gezuiverd en daarna ondergebruikmaking van diverse farmaceutisch aanvaardbare dragersgeformuleerd, zodanig dat 1-100 mg antilichaam-immunoglobu-line per kg lichaamsgewicht kan worden toegediend. Hetgeformuleerde immunoglobuline werd toegediend aan muizen,die met Pseudomonas aeruginosa waren geinfekteerd, teneindede doeltreffendheid van het immunoglobuline in afhankelijk¬heid van de soort drager voor het immunoglobuline te bepa¬len. Als resultaat hiervan bleek dat in het geval van eenvloeibare formulering het immunoglobulinepreparaat met eenfysiologische zoutoplossing voor injektie of een fosfaatbuf-feroplossing als drager een hoge doeltreffendheid heeft endat in het geval van een gelyofiliseerde formulering eenhoge doeltreffendheid van het immunoglobulinepreparaat kanworden geleverd door het gebruik van mannitol, saccharose oflactose als drager. Anderzijds wordt in een gelyofiliseerdeformulering de doeltreffendheid van het immunoglobuline doorhet gebruik van menselijk albumine naast het Pseudomonasaeruginosa-immunoglobuline volgens de uitvinding verlaagd enwordt een geringe doeltreffendheid bereikt in het geval vaneen vloeibare formulering door het gebruik van aluminiumhy-droxide als farmaceutische drager. De testresultaten zijnverzameld in tabel 13.
Tabel 13. Doeltreffendheid van Pseudomonas aeruginosa-immu-noglobuline in afhankelijkheid van de farmaceuti¬sche drager.
i i
Voorbeeld 16: Doeltreffendheid van het geformuleerde immu- noglobulinepreparaat.
Het geformuleerde immunoglobuline met een fosfaat-bufferoplossing, dat volgens het testresultaat van voorbeeldi 15 een hoge doeltreffendheid levert, werd gebruikt terbepaling van zijn doeltreffendheid als profylactisch entherapeutisch middel voor een secondaire huidinfektie bij laceraties, verbrandingen, verwondingen en dergelijke. Bijeen muis werd een brandplek veroorzaakt volgens de brand-testprocedure (zie J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975). Hetvloeibare preparaat met 0,5-1 mg gecombineerd Pseudomonasaeruginosa-immunoglobuline per ml fosfaatbufferoplossingwerd tot een spoeivloeistof omgezet, die vervolgens op debrandplek van de muis in de testgroep werd gesproeid terbepaling van het effekt daarvan in vergelijking met heteffekt bij de controlegroep, die geen behandeling met deimmunoglobulinespray ontving. Bij dit experiment bleek datde met de opgesproeide immunoglobuline-fosfaatbuffer-oplos-sing besproeide groep muizen een aanmerkelijk hogere overle-vingsgraad dan de niet-behandelde groep vertoonde. Hieruitvolgt dat het preparaat volgens de uitvinding met Pseudom¬onas aeruginosa-immunoglobuline een uitstekend beschermendeffekt en een uitstekend therapeutisch effekt op infektiesmet Pseudomonas aeruginosa uitoefent. De resultaten van ditexperiment zijn weergegeven in de volgende tabel 14.
Tabel 14. Resultaat van brandtest
Zoals hierboven beschreven is elke verzwaktePseudomonas aeruginosa-stam volgens de onderhavige uitvin¬ding in hoge mate veilig, vergeleken met de wilde of patho-gene soorten. Aangezien verder de celwandproteïnen daarvani een uitstekende veiligheid, een uitstekend kruisbeschermendvermogen en ook een uitstekend vermogen tot het vormen vanneutraliserende antilichamen hebben, kunnen de celwandprote¬ïnen niet alleen worden gebruikt als vaccin voor profylaxetegen Pseudomonas aeruginosa-infekties, maar ook als een) opwekker van antilichamen bij proefdieren teneinde immuno-globulinen te leveren die als therapeutisch middel voorinfecties met Pseudomonas aeruginosa kunnen worden gebruikt.Zo blijkt dat de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammenvolgens de uitvinding zeer nuttige microorganismen zijn voori het bereiden van een profylactisch vaccin en een therapeu¬tisch middel tegen Pseudomonas aeruginosa-infekties.
Claims (38)
1. Verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam met eenLD., van tenminste 2,0 x 107 cellen in muizen, welke stamwordt verkregen door Pseudomonas aeruginosa in zuiveretoestand naar het immuuntype te isoleren uit patiënten diemet Pseudomonas aeruginosa zijn geïnfekteerd en de geïso¬leerde stam aan herhaalde zuiveringen te onderwerpen terverzwakking van de stam. Het CFCPA-nummer wordt toegevoegd maar is wellichtniet noodzakelijk. De voorbereider wenst wellicht dat detypes volgens Fisher in de conclusies worden opgenomen.
2. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) bijde Korean Federation of Culture Collection.
3. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) bijde Korean Federation of Culture Collection.
4. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) bijde Korean Federation of Culture Collection.
5. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10032 (CFCPA 40057} bijde Korean Federation of Culture Collection.
6. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) vande Korean Federation of Culture Collection.
7. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10034 (CFCPA 60534) vande Korean Federation of Culture Collection.
8. De Pseudomonas aeruginosa-stam volgens conclu¬sie 1, met het toelatingsnummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) vande Korean Federation of Culture Collection.
9. Toepassing van tenminste één Pseudomonas aeru¬ginosa- stam, gekozen uit de groep van: de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10032 (CFCPA 40057) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10034 (CFCPA 60534) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) van de Korean Federation ofCulture Collection, voor het bereiden van een vaccin voor immunisatietegen Pseudomonas aeruginosa-infekties.
10. Werkwijze voor het immuniseren tegen een doorPseudomonas aeruginosa veroorzaakte ziekte door bij eenpersoon die aan een dergelijke immunisatie behoefte heefteen niet-pathogeen antigeen te injekteren, bestaande uitcelwandproteinen afkomstig uit tenminste één verzwakte niet-pathogene Pseudomonas aeruginosa-stam die gekozen is uit degroep van: de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-3 nummer KCCM 10032 (CFCPA 40057) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) van de Korean Federation ofCulture Collection, ) de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings- nummer KCCM 10034 (CFCPA 60534) van de Korean Federation ofCulture Collection, en de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) van de Korean Federation of5 Culture Collection, in een voldoende hoeveelheid om in die persoon eenimmuunrespons op te wekken ter verhindering van een lateredoor Pseudomonas aeruginosa veroorzaakte ziekte.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij de uit) een verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam afgeleide celwand- proteïnen een molecuulgewichtsgebied van 10.000-100.000hebben.
12. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij decelwandproteïnen door intramusculaire injektie worden toege- 3 diend.
13. Een niet-pathogeen vaccin voor het opwekkenvan een immuunrespons tegen een door Pseudomonas aeruginosa-veroorzaakte ziekte, omvattende een mengsel van celwandpro-teinen afkomstig van tenminste één verzwakte Pseudomonas D aeruginosa-stam gekozen uit de groep van: de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-5 nummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-i nummer KCCM 10032 (CFCPA 40057) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) van de Korean Federation ofCulture Collection, I de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings- nummer KCCM 10034 (CFCPA 60534) van de Korean Federation ofCulture Collection, en de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) van de Korean Federation ofi Culture Collection, ter opwekking van een immuunrespons ter verhinde¬ring van een later door Pseudomonas aeruginosa veroorzaakteziekte.
14. Vaccin volgens conclusie 13, waarbij de ver- i zwakte Pseudomonas aeruginosa-stam tenminste drie (3) stam¬men omvat, gekozen uit de groep van: CFCPA 10142, CFCPA20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 enCFCPA 70018.
15. Vaccin volgens conclusie 14, waarbij de ver-i zwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen bestaan uit: CFCPA 10142, CFCPA 20215 en CFCPA 30720.
16. Vaccin volgens conclusie 14, waarbij de ver¬zwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen zijn gekozen uit degroep van: CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA i 60534.
17. Vaccin volgens conclusie 14, waarbij de ver¬zwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen bestaan uit zeventypen van de stammen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720,CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 en CFCPA 70018.
18. Vaccin volgens één der conclusies 13-17, waarbij de celwandproteïnen van elk van de aanwezige ver¬zwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in equivalente hoe¬veelheden aanwezig zijn.
19. Vaccin volgens conclusie 13, dat verder farma¬ceutisch aanvaardbare excipiëntia omvat.
20. Werkwijze voor het bereiden van een niet-pathogeen vaccin voor immunisatie tegen Pseudomonas aerugi- S nosa-infekties, omvattende: a) het winnen van Pseudomonas aeruginosa uitpatiënten die met Pseudomonas aeruginosa zijn geïnfekteerd, b) het selecteren en isoleren van tenminste éénsoort van Pseudomonas aeruginosa in zuivere toestand; ) c) het incuberen van elke zuivere Pseudomonas aeruginosa in een eerste kweekmedium, d) het verzwakken van elke zuivere geïncubeerdestam door herhaalde injekties in proefdieren en het selecte¬ren van de meeste verzwakte stam voor elke Pseudomonas 5 aeruginosa-stam die op deze wijze verzwakt is, e) het incuberen van elke verzwakte Pseudomonasaeruginosa-stam in een tweede kweekmedium, f) het afscheiden van de verzwakte Pseudomonasaeruginosa uit het kweekmedium, ) g) het behandelen van de afgescheiden Pseudomonas aeruginosa met een organisch oplosmiddel ter inaktivering enverwijdering van de lipide bestanddelen uit de celwanden, h) het extraheren van de celwandproteïnen uit debehandelde Pseudomonas aeruginosa onder gelijktijdige bepa- 5 ling van het al dan niet openbreken van de cellen van Pseu¬domonas aeruginosa door vaststellen van de aanwezigheid vanlactaatdehydrogenase of hexokinase als een cytoplasmatischmerkerenzym, i) het onderwerpen van de geëxtraheerde celwand- ) proteïnen aan ultrafiltratie ter selectering van alleen diecelwandproteïnen die een molecuulgewicht tussen 10.000 en100.000 hebben, j) het ultracentrifugeren van de celwandproteïnenter verdere verwijdering van lipopolysacchariden en bacte- 5 riële stoffen, k) het winnen van de geselecteerde celwandprote-inen in zuivere toestand, en 1. het bereiden van een vaccin onder gebruikmakingvan de geselecteerde celwandproteïnen als antigene stof teropwekking van immunisatie.
21. Werkwijze volgens conclusie 20, waarin deextractie wordt verricht door de behandelde Pseudomonasaeruginosa-cellen in een bufferoplossing te brengen.
22. Werkwijze volgens conclusie 21, waarbij debufferoplossing wordt gekozen uit de groep van een fosfaat-bufferoplossing en een trisbufferoplossing.
23. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij deextractie van de celwandproteïnen wordt verricht door debacteriemassa te laten staan of door op de behandelde Pseu¬domonas aeruginosa-cellen in te werken met een menger of eenhomogenisator.
24. Werkwijze volgens conclusie 23, waarbij demenger bij 4°C en 100/min tot 2000/min wordt bedreven.
25. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij deextractie 5-6 malen wordt verricht.
26. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij hetorganische oplosmiddel wordt gekozen uit de groep van ace-ton, chloroform, ethanol, butanol terwijl het organischeoplosmiddel bij voorkeur aceton is.
27. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij degeïsoleerde Pseudomonas aeruginosa-stammen omvatten: CFCPA I 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243,CFCPA 60534 en CFCPA 70018.
28. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij hettweede kweekmedium wordt gekozen uit de groep van trypsine-soyabouillon en een kweekmedium dat glucose (30 g/1), pepton 1 (15 g/1), MgS04 (0,5 g/1), CaC03 (5g/l), KH2P04 (lg/1), FeS04(5mg/l), CuS04 (5mg/l) en ZnS04 (5mg/l) bevat.
29. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij deomstandigheden voor de incubatie van de verzwakte Pseudom¬onas aeruginosa-stammen zijn: een temperatuur van 37°C, een i beluchtingsgraad van 1 wm (volume/volume .minuut) en eeninzaaivolume van 5% vol/vol betrokken op de kweekmediumop-lossing, waarbij de incubatie wordt uitgevoerd bij eenroersnelheid van 100/min voor de eerste 2 uren en daarna 600/min voor de volgende 10-20 uren, bij voorkeur 12 tot 16uren.
30. Incubatiemedium voor het incuberen van eenverzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam gekozen uit de groepvan·. de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10032 (CFCPA 40057) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10034 (CFCPA 60534) van de Korean Federation ofCulture Collection, en de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) van de Korean Federation ofCulture Collection, welk medium 30 g glucose, 15 g pepton, 0,5 gMgS04, 5 g CaC03, lg KH2P04, 5 mg FeS04, 5 mg CuS04 en 5 mgZnS04 per liter bevat.
31. Therapeutisch middel voor het behandelen vanPseudomonas aeruginosa-infekties bij een patiënt die dezeinfekties vertoont, welk middel ten minste één immunoglobu-line bevat dat specifiek tegen ten minste één Pseudomonasaeruginosa-stam werkt, waarbij het immunoglobuline wordtopgewekt door injektie in een geschikte gastheer van cel-wandproteïnen, afkomstig van ten minste één verzwakte Pseu¬domonas aeruginosa-stam die gekozen is uit de groep van: de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10029 (CFCPA 10142) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10030 (CFCPA 20215) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10031 (CFCPA 30720) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10032 (CFCPA 40057) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10033 (CFCPA 50243) van de Korean Federation ofCulture Collection, de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nutnmer KCCM 10034 (CFCPA 60534) van de Korean Federation ofCulture Collection, en de Pseudomonas aeruginosa-stam met het toelatings-nummer KCCM 10035 (CFCPA 70018) van de Korean Federation ofCulture Collection, in een hoeveelheid die voldoende is om in degastheer een immuunrespons op te wekken ter initiëring vande produktie van het immunoglobuline tegen Pseudomonasaeruginosa en tenminste ter vermindering van de ongewensteeffekten van de door Pseudomonas aeruginosa veroorzaakteziekte.
32. Therapeutisch middel volgens conclusie 31, dateen immunoglobuline tegen elk van de Pseudomonas aeruginosa-stammen bevat die overeenkomen met de immuuntypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7 volgens Fisher.
33. Therapeutisch middel volgens conclusie 31, datimmunoglobulinen bevat tegen vier van de Pseudomonas aerugi¬nosa- stammen gekozen uit stammen met de immuuntypen l, 2, 3,4, 5, 6 en 7 volgens Fisher.
34. Therapeutisch middel volgens conclusie 31, datimmunoglobulinen bevat tegen drie van de Pseudomonas aerugi- nosa-stammen, gekozen uit de stammen die overeenkomen met deimmuuntypen 1, 2, 3, 4, 5, 6, en 7 volgens Pisher.
35. Therapeutisch middel volgens conclusie 31 ingelyofiliseerde vorm.
) 36. Therapeutisch middel volgens conclusie 35 dat verder een geschikte farmaceutisch aanvaardbare dragerbevat, gekozen uit de groep van mannitol, lactose, saccharo¬se en menselijk albumine.
37. Therapeutisch middel volgens conclusie 31 in ) vloeibare vorm, dat verder geschikte farmaceutisch aanvaard¬bare dragers bevat.
38. Therapeutisch middel volgens conclusie 31,bereid in een farmaceutische doseringsvorm als injektie-vloeistof, tablet, capsule, oogdruppels, spoeivloeistof of i zalf.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019930010281A KR970001710B1 (ko) | 1993-06-07 | 1993-06-07 | 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 |
| KR1019930010273A KR960014620B1 (ko) | 1993-06-07 | 1993-06-07 | 신규한 약독화 녹농균 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 |
| KR930010281 | 1993-06-07 | ||
| KR930010273 | 1993-06-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9420005A true NL9420005A (nl) | 1995-06-01 |
| NL194910B NL194910B (nl) | 2003-03-03 |
| NL194910C NL194910C (nl) | 2003-07-04 |
Family
ID=26629705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9420005A NL194910C (nl) | 1993-06-07 | 1994-06-02 | Verzwakte stam van Pseudomonas aeruginosa, alsmede een vaccin en een geneesmiddel tegen Pseudomonas aeruginosa-infecties, en een werkwijze ter bereiding van het vaccin. |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0702564B1 (nl) |
| JP (1) | JP2911603B2 (nl) |
| CN (1) | CN1112356A (nl) |
| AT (1) | AT408445B (nl) |
| AU (1) | AU676575B2 (nl) |
| CA (1) | CA2141871C (nl) |
| CH (1) | CH687233A5 (nl) |
| DE (3) | DE4493997C2 (nl) |
| ES (1) | ES2074968B1 (nl) |
| GB (1) | GB2285925B (nl) |
| NL (1) | NL194910C (nl) |
| NO (1) | NO317148B1 (nl) |
| RU (1) | RU2155226C2 (nl) |
| SE (1) | SE507114C2 (nl) |
| TW (1) | TW403655B (nl) |
| WO (1) | WO1994028928A1 (nl) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1086588C (zh) * | 1995-12-07 | 2002-06-26 | 余国华 | 假单胞菌活性蛋白及其生产方法 |
| CN1328371C (zh) * | 2005-09-01 | 2007-07-25 | 北京未名凯拓农业生物技术有限公司 | 一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用 |
| CN102534029A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 上海中优医药高科技有限公司 | MRSA中QacB基因的检测引物及其检测方法 |
| CN102534027A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 上海中优医药高科技有限公司 | MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物及其检测方法 |
| IT201600091033A1 (it) * | 2016-09-08 | 2018-03-08 | Bioimmunizer Sagl | Ceppi di batteri probiotici appartenenti al genere Bifidobacterium e loro estratti di cellule probiotiche (ECP) aventi proprietà immunostimolanti. |
| CN109401992B (zh) * | 2017-08-18 | 2021-07-23 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌及其应用 |
| CN110724647B (zh) * | 2018-07-17 | 2022-11-04 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株具有免疫保护作用的铜绿假单胞菌及其应用 |
| US20220378902A1 (en) * | 2019-08-22 | 2022-12-01 | Sichuan University | Bacterial membrane vesicles, and separation and preparation system and method therefor |
| CN114763544A (zh) * | 2021-01-15 | 2022-07-19 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种铜绿假单胞菌高产蛋白菌株的生物诱变方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3987164A (en) * | 1970-10-20 | 1976-10-19 | Yuzuru Homma | Method for prevention of pseudomonas aeruginosa infections |
| US3928565A (en) * | 1971-10-19 | 1975-12-23 | Yuzuru Homma | Pharmaceutical preparation of pseudomonas aeruginosa bacterial component possessing anti-tumor and anti-infection properties |
| JPS5612435B1 (nl) * | 1971-03-29 | 1981-03-20 | ||
| DE3829616C2 (de) * | 1988-09-01 | 1996-08-29 | Behringwerke Ag | Lipoprotein I (OMPI) von Pseudomonas aeruginosa |
-
1994
- 1994-06-02 DE DE4493997A patent/DE4493997C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 AU AU68571/94A patent/AU676575B2/en not_active Ceased
- 1994-06-02 CA CA002141871A patent/CA2141871C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 CN CN94190491A patent/CN1112356A/zh active Pending
- 1994-06-02 EP EP94917176A patent/EP0702564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-02 CH CH00454/95A patent/CH687233A5/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 AT AT0900694A patent/AT408445B/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 ES ES09550003A patent/ES2074968B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 JP JP7501593A patent/JP2911603B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 RU RU95113158/13A patent/RU2155226C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 NL NL9420005A patent/NL194910C/nl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 GB GB9502373A patent/GB2285925B/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 WO PCT/KR1994/000062 patent/WO1994028928A1/en active IP Right Grant
- 1994-06-02 DE DE4447677A patent/DE4447677C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 DE DE4493997T patent/DE4493997T1/de active Pending
- 1994-06-04 TW TW083105105A patent/TW403655B/zh not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-02-06 NO NO19950421A patent/NO317148B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-02-06 SE SE9500418A patent/SE507114C2/sv not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9502373D0 (en) | 1995-03-29 |
| NL194910B (nl) | 2003-03-03 |
| WO1994028928A1 (en) | 1994-12-22 |
| JP2911603B2 (ja) | 1999-06-23 |
| GB2285925A (en) | 1995-08-02 |
| DE4447677C2 (de) | 1998-07-23 |
| ES2074968B1 (es) | 1996-05-01 |
| AT408445B (de) | 2001-11-26 |
| NO950421D0 (no) | 1995-02-06 |
| CH687233A5 (de) | 1996-10-31 |
| CN1112356A (zh) | 1995-11-22 |
| SE9500418D0 (sv) | 1995-02-06 |
| NO950421L (no) | 1995-04-07 |
| ATA900694A (de) | 2001-04-15 |
| EP0702564B1 (en) | 2000-03-01 |
| CA2141871A1 (en) | 1994-12-22 |
| NL194910C (nl) | 2003-07-04 |
| SE507114C2 (sv) | 1998-03-30 |
| TW403655B (en) | 2000-09-01 |
| JPH09501826A (ja) | 1997-02-25 |
| DE4493997C2 (de) | 1997-07-17 |
| AU676575B2 (en) | 1997-03-13 |
| GB2285925B (en) | 1997-04-09 |
| NO317148B1 (no) | 2004-08-30 |
| EP0702564A1 (en) | 1996-03-27 |
| AU6857194A (en) | 1995-01-03 |
| DE4493997T1 (de) | 1995-10-05 |
| RU2155226C2 (ru) | 2000-08-27 |
| CA2141871C (en) | 1999-05-11 |
| SE9500418L (sv) | 1995-04-07 |
| ES2074968A1 (es) | 1995-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Middlebrook et al. | Botulinum toxins | |
| US6391315B1 (en) | Vaccine for inhibiting and preventing induced staphylococcus infection, isolated antigens used therein, and isolated antibodies induced thereby | |
| NL9420005A (nl) | Nieuwe verzwakte stammen van Pseudomonas aeruginosa. | |
| Sartono et al. | Three bacteriocin peptides from a lactic acid bacterium Weissella confusa MBF8-1 with spermicidal activity | |
| CN1089478A (zh) | 治疗剂及其用途 | |
| Iyer et al. | Detection of virulence associated genes, haemolysin and protease amongst Vibrio cholerae isolated in Malaysia | |
| KR100649286B1 (ko) | 감독화톡신을 포함하는 백신제제 | |
| US5861163A (en) | Process for preparing a vaccine against pseudomonas aeruginosa using attenuated strains | |
| Yanamura et al. | Active immunity to the microbacterium multiforme psittacosis in the mouse | |
| KR970001710B1 (ko) | 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 | |
| KR970001704B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 20215를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR960014620B1 (ko) | 신규한 약독화 녹농균 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001703B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 10142를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001707B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 50243을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| US5223255A (en) | Bordetella pertussis variants | |
| Malina et al. | Informative value of a mouse model of Klebsiella pneumoniae infection used as a host-resistance assay | |
| KR970001709B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 70018을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001706B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 40057을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| Watanabe et al. | Production of vibrio El Tor toxin in a liquid medium | |
| KR970001705B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 30720을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001708B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 60534를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| Bermudez et al. | Regulation of the expression of Mycobacterium avium complex proteins differs according to the environment within host cells | |
| JPS6332332B2 (nl) | ||
| RU2149898C1 (ru) | Штамм бактерий vibrio cholerae 0139 серовара км 115 (и-1262), авирулентный тест-штамм, не содержащий ctx ав оперон, для иммунологических и генетических исследований | |
| RU2169187C1 (ru) | Штамм бактерий vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара огава - продуцент холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| V1 | Lapsed because of non-payment of the annual fee |
Effective date: 20110101 |