NL194910C - Verzwakte stam van Pseudomonas aeruginosa, alsmede een vaccin en een geneesmiddel tegen Pseudomonas aeruginosa-infecties, en een werkwijze ter bereiding van het vaccin. - Google Patents

Description

1 194910

Verzwakte stam van Pseudomonas aeruginosa, alsmede een vaccin en een geneesmiddel tegen Pseudomonas aeruginosa-infecties, en een werkwijze ter bereiding van het vaccin

De uitvinding verschaft in de eerste plaats een verzwakte bacteriestam van Pseudomonas aeruginosa, 5 gekozen uit de stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035, welke verzwakte stammen een LD^ van ten minste 2,0 x 107 cellen in muizen hebben en verkregen zijn door isolering van Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype uit met Pseudomonas aeruginosa geïnfecteerde patiënten, gevolgd door herhaalde passages door een tussengastheer ter verzwakking van de geïsoleerde stammen.

10 In de tweede plaats verschaft de uitvinding een polyvalent vaccin voor het opwekken van een immuun-respons tegen infecties veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa, welk vaccin een mengsel van celwandproteïnen, afkomstig uit ten minste twee Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype bevat, welke celwandproteïnen een molgewicht tussen 10.000 en 100.000 hebben en nagenoeg geen lipopolysacchariden bevatten.

15 Een dergelijk vaccin is bekend uit een artikel van E.S. Stanislawsky et al. in Nacaine, 7, pag. 562-566 (1989).

Verdere aspecten van de uitvindingen zullen hieronder worden toegelicht.

Pseudomonas aeruginosa is een bacterie, die uit beweeglijke gram-negatieve staafjes met afmetingen van ca. 0,5 pm x (1,5-3,0) pm, met een enkel flagellum, bestaat. Deze bacterie, waarvan talrijke stammen 20 bekend zijn, komt wijd verspreid in de natuur voor, bijvoorbeeld in de bodem, in water, in rioolwater en ook in de menselijke darm (Mol. Microbiol., 4,1069-1075,1990). Het gaat hier om een pathogene bacteriesoort, die hardnekkige infecties zoals septichemie, gegeneraliseerde infecties, chronische infecties van het ademhalingsstelsel, kystische pancreasfibrose en dergelijke kan veroorzaken. De door Pseudomonas aeruginosa veroorzaakte septichemie ontstaat ofwel door invasie van de bacterie zelf ofwel door afscheiding 25 van giftige bestanddelen in het bloed en treedt vooral op bij patiënten met verminderde weerstand als gevolg van chirurgische ingrepen, laceratie, verwondingen en dergelijke. De aanwezigheid van het toxine veroorzaakt "shock” met hoge koorts, verlaagde bloeddruk en andere symptomen, die uiteindelijk tot de dood kunnen leiden. Nadat Pseudomonas aeruginosa ook in infecties van de urinewegen was aangetroffen, is de belangstelling voor deze "blauwe etterbacterie” sterk toegenomen.

30 Er bestaat zodoende behoefte aan het ontwikkelen van medicijnen waarmee de door Pseudomonas aeruginosa veroorzaakte ziekten, zoals septichemie en infecties van de urinewegen, effectief kunnen worden voorkomen of bestreden.

De stammen van Pseudomonas aeruginosa zijn echter tegen de meeste antibiotica resistent, terwijl een volkomen bevredigend preventief of therapeutisch middel tegen de door deze bacterie veroorzaakte infecties 35 tot nu toe niet is gevonden. Intussen is de virulentie van infecties door Pseudomonas aeruginosa met de tijd sterker geworden.

Bij een bekende methode voor het bestrijden van Pseudomonas aeruginosa-infecties worden de toxinen van deze bacterie met een antitoxine geneutraliseerd. Het antitoxine werkt echter alleen goed bij patiënten die reeds geïnfecteerd zijn en vertoont geen profylactisch effect. Bovendien is het tegenwoordig verkrijgbare 40 antitoxine uiterst kostbaar en is zijn toepassing beperkt. Het belangrijkste nadeel van het antitoxine wordt gevormd door de betrekkelijk geringe genezingsgraad en door ernstige neveneffecten.

Een andere methode voor het bestrijden van Pseudomonas aeruginosa-infecties berust op de toediening van antibiotica of chemotherapeutische middelen met een over een breed spectrum uitgeoefende selectiviteit voor de Pseudomonas aeruginosa-stammen. Aangezien er echter vele stammen van Pseudomonas 45 aeruginosa zijn, die doorgaans een grote resistentie tegen antibiotica of andere middelen vertonen, worden vele patiënten het slachtoffer van Pseudomonas aeruginosa-stammen die met antibiotica niet doeltreffend kunnen worden behandeld.

Daarnaast is een methode ontwikkeld, die gebruik maakt van een therapeutisch immunoglobuline, opgewekt in een geschikte tussen-gastheer. Een dergelijk immunoglobuline heeft doorgaans echter geen 50 therapeutisch effect tegen alle Pseudomonas aeruginosa-infecties en wordt daarom alleen voor een beperkt aantal typen van dergelijke infecties gebruikt. Dit komt doordat het immunoglobuline, in de vorm van polyklonaie antilichamen, slechts tegen een bepaalde stam van het micro-organisme is opgewekt, zodat het niet gemeenschappelijk tegen de vele Pseudomonas aeruginosastammen kan werken.

Er zijn ook reeds pogingen gedaan om een goedkoop geneesmiddel te ontwikkelen uit monoklonale 55 antilichamen tegen Pseudomonas aeruginosa, opgewekt in muizencellen (J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, (1985)) of menselijke cellen (FEMs Microbiol. Immunol., 64, 263-268, (1990)). Bij deze methode worden cellijnen uit een celbank, die met een fusietechniek zijn gevormd, op hun vermogen geselecteerd om de 194910 2 meest doeltreffende neutraliserende antilichamen te vormen, waarna één van die cellijnen als uitgangsmateriaal voor het produceren van de gewenste antilichamen op industriële schaal kan worden gebruikt. Deze methode is evenals de voorgaande alleen op het bestrijden van bestaande infecties gericht, en heeft ook het nadeel, dat niet alle bestaande infecties met een enkel type monoklonaal antilichaam kunnen 5 worden bestreden, aangezien deze infecties door Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend type kunnen worden veroorzaakt. Bij het classificatiesysteem volgens Terada worden namelijk 14 verschillende serotypen, en bij het classificatiesysteem volgens Fisher-Devlin 7 verschillende immunotypen onderscheiden.

Teneinde een meer effectieve behandeling met deze methode mogelijk te maken, is een gelijktijdige 10 toediening van diverse soorten monoklonale antilichamen op basis van hun onderzochte kruisreactiviteit voorgesteld. Dan blijft echter altijd het bezwaar bestaan, dat men eerst nog bloed uit de met Pseudomonas aeruginosa geïnfecteerde patiënten moet verzamelen en daarin het serologische en/of immunologische type van de infecterende Pseudomonas aeruginosa-stammen moet vaststellen, voordat men twee of meer soorten monoklonale antilichamen, die tezamen voor de behandeling van het gevonden type geschikt zijn, 15 gelijktijdig aan de patiënt kan toedienen. Deze methode kost tijd en is daarom ongeschikt voor patiënten, wier toestand een onmiddellijke behandeling nodig maakt.

Naast methoden voor de therapeutische behandeling van patiënten die reeds met Pseudomonas aeruginosa zijn geïnfecteerd, zijn ook methoden voorgesteld voor het voorkomen van dergelijke infecties met behulp van een profylactisch vaccin.

20 Hoewel in principe diverse componenten van de bacteriecellen en zelfs gehele cellen voor het gebruik als antigeen in een dergelijk vaccin in aanmerking zouden komen, geeft men in de praktijk de voorkeur aan het gebruik van celwandproteïnen (CWP’s), die relatief gemakkelijk uit de bacteriecellen kunnen worden afgescheiden. Deze celwandproteïnen vormen een splitsingsproduct van in de celwand aanwezige ehdotoxinen en zijn daarom aanvankelijk als ’’oorspronkelijk endotoxine product” (OEP) aangeduid. Terwijl 25 de complete endotoxinen (dat wil zeggen: complexen van proteïnen met lipopolysacchariden) het nadeel hebben, dat zij bij gebruik in een vaccin slechts specifiek tegen een enkel type van de bacteriestammen werken, namelijk het type waaruit zij zelf zijn voortgekomen, wordt van de celwandproteïnen verwacht en ook gesteld, dat zij minder specifiek werken en daarmee in de richting komen van een ’’gemeenschappelijk antigeen” voor het verhinderen van infecties door alle bestaande Pseudomonas aeruginosa-stammen of 30 althans de meest voorkomende daarvan. Bovendien zullen de celwandproteïnen waarschijnlijk minder giftig dan de complete endotoxinen zijn. Ter illustratie wordt verwezen naar de octrooischriften US 3.928.565 en US 3.987.164 (gebaseerd op een Japanse octrooiaanvrage uit 1970), en het artikel van Chiyoji Abe et al. in Japan J. Exp. Med., 45, 5, pag. 355-359 (1975).

Hoewel de ontwikkeling van een profylactisch vaccin op basis van een "gemeenschappelijk antigeen” in 35 theorie een veelbelovende methode is, wijst de huidige stand van het onderzoek er op dat deze methode nog vele onopgeloste problemen vertoont. Het belangrijkste nadeel is wel, dat met het gemeenschappelijk antigeen lang niet alle infecties met Pseudomonas aeruginosa-stammen kunnen worden verhinderd, zodat de doeltreffendheid ervan betrekkelijk gering is. Naast het gemeenschappelijke antigeen zullen altijd nog een of meer andere antigenen nodig zijn.

40 In een recent artikel van E.S. Stanislawsky et al. in Vaccine, 7, pag 562-566 (dec. 1989) (in de aanhef genoemd) wordt het idee van een vaccin op basis van een gemeenschappelijk antigeen dan ook niet meer gehuldigd. In plaats van een monovalent vaccin, gemaakt uit de celwandproteïnen van een Pseudomonas aeruginosa-stam met immunotype 7, welk vaccin een slechte bescherming tegen stammen van de immunotypen 1 en 6 gaf, wordt nu een polyvalent vaccin, bereid uit de gezamenlijke celwandproteïnen van 45 4 verschillende Pseudomonas aeruginosastammen (immunotypen 1, 2, 6 en 7) voorgesteld. Dit vaccin blijkt, althans bij laboratoriumproeven, een goede bescherming tegen stammen van alle zeven immunotypen op te leveren.

In het genoemde artikel van Stanislawsky et al. wordt verder een bereidingswijze voor het polyvalente vaccin beschreven, bestaande uit het kweken van de bacteriecellen in een geschikt medium, het afschei-50 den, inactiveren en extraheren van de gekweekte cellen, en het zuiveren van het extract door ultrafiltratie, totdat alleen nog proteïnen van molgewicht 20.000-100.000 plus hooguit 0,08% lipopolysacchariden daarin aanwezig zijn.

Tenslotte beschrijft het genoemde artikel een antiserum tegen Pseudomonas aeruginosa, dat door immunisatie van konijnen met het polyvalente vaccin is verkregen en dat als therapeutisch middel tegen 55 infecties door Pseudomonas aeruginosa kan worden gebruikt.

De uitvinding bouwt voort op de onderzoeksgegevens van Stanislawsky et al. en beoogt de nog overblijvende problemen te ondervangen.

3 194910 Eén van deze problemen betreft de inherente giftigheid van de Pseudomonas aeruginosa-stammen, waarvan men bij de bereiding van het vaccin moet uitgaan. Een ander probleem is, dat bij het winnen van de celwandproteïnen uit de gekozen bacteriestammen gemakkelijk cellen worden opengebroken, die in het medium vreemde nucleïnezuren en giftige hoogmoleculaire stoffen, zoals in het cytoplasma aanwezige 5 lipopolysacchariden kunnen afgeven. Deze stoffen worden in zo’n geval als verontreiniging in het verkregen vaccin opgenomen, waardoor een grote zorgvuldigheid bij het toedienen van het vaccin is vereist en de toepassing mogelijk wordt beperkt.

In overeenstemming met de uitvinding is nu gebleken, dat het probleem van de inherente giftigheid van de Pseudomonas aeruginosa-stammen doeltreffend kan worden ondervangen door bij de bereiding van het 10 vaccin uit te gaan van stammen, die op geschikte wijze zijn verzwakt, zonder hun antigene werking te verliezen. Dergelijke verzwakte stammen kunnen dan veilig voor de winning van celwandproteïnen daaruit worden gebruikt.

Bovendien is gebleken, dat het gevaar voor vrijkomen van giftige stoffen tijdens de winning van de celwandproteïnen doeltreffend kan worden ondervangen door bij het extraheren van de bacteriecellen 15 zodanige condities te hanteren dat de celwanden niet openbreken. Er wordt dan een extract zonder cytoplasmatische bestanddelen zoals lipopolysacchariden verkregen.

Verzwakte stammen van Pseudomonas aeruginosa, die veilig voor de vaccinbereiding kunnen wórden gebruikt, zijn door de onderhavige uitvinders in het eigen laboratorium bereid en maken deel uit van de uitvinding. Zij hebben een LD50 van ten minste 2,0 x 107 cellen in muizen en zijn verkregen door isolering 20 van Pseudomonas aeruginosa-stammen van zuiver immuuntype uit met dergelijke stammen geïnfecteerde patiënten, gevolgd door herhaalde passages door een tussengastheer ter verzwakking van de geïsoleerde stammen. Hun fenotype en hun microbiologische eigenschappen zijn nagenoeg gelijk aan die van de overeenkomstige ouderstammen. In totaal zijn zeven van deze verzwakte stammen gemaakt, elk met een eigen immuuntype volgens Fisher-Devlin.

25 De zeven verzwakte stammen hebben de interne nummers CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 en CFCPA 70018 gekregen. Omdat zij als nieuwe stammen kunnen worden beschouwd, zijn zij op 12 mei 1993 gedeponeerd bij het Korean Culture Center of Microorganisms in the Korean Federation of Culture Collections_(hierna KCCM), dat voor deze gelegenheid als internationale depositaris onder het Verdrag van Boedapest fungeerde. De toelatingsnummers (in 30 dezelfde volgorde als de interne nummers) zijn resp. KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035.

De uitvinding verschaft dan ook in de eerste plaats een verzwakte bacteriestam van Pseudomonas aeruginosa, gekozen uit de stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035, welke verzwakte stammen een LDgo van ten 35 minste 2,0 x 107 cellen in muizen hebben en verkregen zijn door isolering van Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype uit met Pseudomonas aeruginosa geïnfecteerde patiënten, gevolgd door herhaalde passages door een tussengastheer ter verzwakking van de geïsoleerde stammen.

In de tweede plaats verschaft de uitvinding een polyvalent vaccin voor het opwekken van een immuun-respons tegen infecties als in de aanhef beschreven met als onderscheidend kenmerk, dat de celwand-40 proteïnen afkomstig zijn uit ten minste twee verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen, gekozen uit de stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10032, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035, welke celwandproteïnen geen cytoplasmatische bestanddelen bevatten.

In de derde plaats verschaft de uitvinding een werkwijze voor het bereiden van een vaccin als profylactisch middel tegen infecties veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa, welke werkwijze de volgende 45 stappen omvat: a) het kweken van Pseudomonas aeruginosa-stammen en het afscheiden van de gekweekte bacteriecellen uit het kweekmedium; b) het inactiveren van de afgescheiden bacteriecellen met een organisch oplosmiddel dat ook lipide bestanddelen verwijdert; 50 c) het extraheren van de geïnactiveerde bacteriecellen met een geschikt extractiemiddel onder verkrijging van een extract dat celwandproteïnen bevat; d) het fractioneren en zuiveren van het verkregen extract door ultrafiltratie en/of ultracentrifugering onder verkrijging van een specifieke proteïnefractie met een molgewicht tussen 10.000 en 100.000, dat nagenoeg geen lipopolysachariden bevat; en 55 e) het vermengen van de specifieke proteïnefracties, afkomstig uit ten minste twee Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype.

Een dergelijke werkwijze is eveneens bekend uit het genoemde artikel van Stanislawski. Volgens de 194910 4 uitvinding wordt deze werkwijze gekenmerkt doordat de in stap (a) gebruikte Pseudomonas aeruginosa* stammen zijn gekozen uit de verzwakte stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035; en dat stap (c) onder zodanige milde condities wordt uitgevoerd dat de celwanden van de bacteriestam niet 5 openbreken, zodat een extract zonder cytoplasmatische bestanddelen wordt verkregen.

Het kweken van de verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen in de stap (a) kan op normale wijze met een trypsinesoyabouillon geschieden, maar volgens een voorkeursuitvoeringsvorm worden de verzwakte Pseudomonas aerugino-stammen in stap a) gebruikt in een kweekmedium dat 30 g glucose, 15 g pepton, 0,5 g MgS04, 5 g CaC03,1 g KH2P04, 5 mg FeS04, 5 mg CuS04 en 5 mg ZnS04 per liter bevat. 10 Omdat de juiste condities in stap (c) uiterst belangrijk zijn, wordt volgens een voorkeursuitvoeringsvorm het extract tijdens of na de stap (c) geïnspecteerd ter vaststelling of de cellen van het micro-organisme als dan niet zijn opengebroken, en wel door de aanwezigheid van lactosedehydrogenase of hexokinase als cytoplasmatisch merk-enzym na te gaan.

Tenslotte verschaft de uitvinding een geneesmiddel tegen infecties veroorzaakt door Pseudomonas 15 aeruginosa-bacteriên, welk geneesmiddel ten minste twee soorten immunoglubuline bevat die specifiek tegen Pseudomonas aeruginosa-stammen werken, met als onderscheidend kenmerk, dat de immunoglobuli-nen zijn verkregen uit een geschikte gastheer die ter verkrijging van een immuunrespons met het bovengenoemde polyvalente vaccin of het met bovengenoemde bereidingswijze verkregen vaccin is geënt.

Dankzij al deze aspecten van de uitvinding kan het gestelde doel goed worden bereikt. Door het gebruik 20 van de verzwakte stammen kan men de inherente giftigheid van de Pseudomonas aeruginosa-stammen bedwingen en door de zorgvuldige keuze van de condities bij de extractie van de cellen wordt ook vermeden, dat giftige cytoplasmastische bestanddelen in het extract en daarmee in het vaccin geraken.

Al met al is de veiligheid van het verkregen vaccin daarmee sterk verbeterd. Het verschaffen van zeven verzwakte stammen van uiteenlopend immuuntype zorgt er bovendien voor, dat men bij het combineren van 25 de celwandproteïnen tot een polyvalent vaccin een grotere keuze dan voorheen heeft, hetgeen tot grotere doeltreffendheid van de vaccins kan leiden.

Thans zullen enkele aspecten van de uitvinding meer in detail worden besproken.

Een belangrijk aspect wordt natuurlijk gevormd door de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, zoals die in het voorgaande zijn gekenschetst. Er wordt hier op gewezen, dat het bij de uitvinding om 30 7 verzwakte stammen gaat, die elk een afzonderlijk immuuntype (één van de zeven immuuntypen in het systeem van Fisher-Devlin) vertegenwoordigen.

De verzwakte stammen kunnen, globaal gezien, worden verkregen door isolering van Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype uit met de bedoelde bacterie geïnfecteerde patiënten, gevolgd door herhaalde passages van deze stammen door een tussengastheer ter verzwakking ervan. Meer 35 specifiek worden de verzwakte stammen verkregen door het isoleren van Pseudomonas aeruginosa- stammen uit het bloed van patiënten die met Pseudomonas aeruginosa zijn geïnfecteerd, het indelen van de geïsoleerde stammen in zeven groepen aan de hand van het immuuntype volgens Fisher-Devlin, het selecteren van een enkele representatieve stam voor elk afzonderlijk immuuntype, en het verzwakken van elke geselecteerde stam door herhaalde stappen van injectie/isolering/herinjectie in proefdieren totdat de 40 gewenste veilige waarde van de LDS0 is bereikt.

Het aantal benodigde passages door proefdieren ter verzwakking van de geselecteerde stammen kan in afhankelijkheid van de vaardigheid van de technicus, de giftigheid van de geselecteerde stammen en dergelijke variëren. Meestal zijn echter 3-7 passages nodig voordat de gewenste veilige waarde van de LDgQ is bereikt. Deze veilige waarde van de LD50 is hier op ten minste 2,0 x 107 cellen, gemeten in muizen, 45 gesteld.

De verzwakte stammen hebben nagenoeg hetzelfde fenotype en dezelfde microbiologische eigenschappen als de overeenkomstige ouderstammen, maar missen een groot deel van de pathogene eigenschappen daarvan.

Een ander belangrijk aspect van de uitvinding wordt gevormd door de bereidingswijze van het vaccin.

50 Deze bereidingswijze omvat diverse stappen.

In de eerste stap van de bereidingswijze worden de verzwakte bacteriestammen van Pseudomonas aeruginosa in een geschikt kweekmedium gekweekt, waarna de gekweekte cellen uit het kweekmedium worden afgescheiden. Het verdient aanbeveling om alle 7 verzwakte stammen (en wel elk afzonderlijk) aan deze kweekbewerking en de navolgende bewerkingen van winning en zuivering van celwandproteïnen te 55 onderwerpen, teneinde in een later stadium, bij het samenvoegen van de gezuiverde celwandproteïnen uit de diverse verzwakte stammen een voldoende grote keuzevrijheid te hebben.

Het kweken van de verzwakte stammen kan geschieden in een fermentatietoestel van geschikte 5 194910 afmetingen. Een geschikt kweekmedium is trypsine-soyabouillon, maar bij voorkeur wordt een ander kweekmedium gebruikt, dat speciaal voor deze gelegenheid is ontwikkeld.

Dit speciale kweekmedium bevat glucose (30 g/l), pepton (15 g/l), MgS04 (0,5 g/l), CaC03 (5 g/l), KH2P04 (1 g/l), FeS04 (5 mg/l), CuS04 (5 mg/l) en ZnS04 (5 mg/l). Worden Pseudomonas aeruginosa-5 stammen in dit medium gekweekt, dan is de opbrengst aan bacteriemassa (droog gewicht) ten minste 30% hoger dan na het kweken van de stammen in trypsinesoyabouillon. Het gebruik van dit speciale kweekmedium vormt dan ook een voorkeursuitvoering van de bereidingswijze volgens de uitvinding.

De optimale kweekomstandigheden voor de verzwakte stammen zijn: temperatuur 37°C, beluchtings-graad 1 wm (volume/volume.minuut) en inzaaivolume 5% (v/v) betrokken op de kweekmediumoplossing.

10 Het kweken geschiedt met een roersnelheid van 100/min voor de eerste 2 uren en van 600/min tijdens de navolgende 10-20 uren. De totale duur is bij voorkeur 12-16 uren.

Na voltooiing van het kweken worden de bacteriecellen door centrifugeren of dergelijke van het kweekmedium afgescheiden.

In de tweede trap worden de afgescheiden bacteriecellen met een organisch oplosmiddel geïnactiveerd, 15 waarbij ook lipiden uit de celwanden worden verwijderd. Het organische oplosmiddel kan worden gekozen uit de groep van aceton, chloroform, ethanol, butanol en dergelijke, waarbij aceton de voorkeur geniet

In de derde trap worden de geïnactiveerde cellen met geschikte middelen geëxtraheerd, onder verkrijging van een extract dat celwandproteïnen bevat. Hiertoe worden de cellen in een waterige bufferoplossing zoals een fosfaatbuffer, een trisbuffer en dergelijke (bij voorkeur een fosfaatbuffer) gebracht en wordt een menger 20 of homogenisator gebruikt om de celwandproteïnen vrij te maken. De extractie geschiedt bij voorkeur door roeren bij 100/min tot 2000/min en bij 4°C. Deze bewerking wordt 5-6 malen achter elkaar toegepast.

Bij de extractie dienen speciale voorzorgen te worden genomen om het openbreken van de cellen te voorkomen, zodat de gewenste celwandproteïnen gescheiden blijven van bestanddelen (In het bijzonder giftige proteïnen) uit het cytoplasma. Tijdens de extractieprocedure is het dan ook noodzakelijk om continu 25 te bepalen of de cellen al dan niet opengebroken zijn, en wel door de aanwezigheid van lactaatdehydroge-nase of hexakinase als cytoplasmatisch merker-enzym in het extract na te gaan. Eventueel kan deze inspectie na afloop van de extractie geschieden.

In de vierde trap wordt het gewonnen extract, dat hoofdzakelijk uit celwandproteïnen in een bovendrijvende vloeistof bestaat, gefractioneerd en gezuiverd ter verkrijging van een specifieke proteïnefractie met 30 een molgewicht tussen 10.000 en 100.000. Deze begrenzing van het molecuulgewicht is belangrijk, omdat celwandproteïnen met een molgewicht kleiner dan 10.000 blijkens dierproeven niet het gewenste profylactische effect opleveren, en celwandproteïnen met een molgewicht groter dan 100.000 giftige effecten kunnen meebrengen door de aanwezigheid van hoogmoleculaire lipopolysacchariden.

Het fractioneren en zuiveren van de celwandproteïnen geschiedt meestal in drie fasen, namelijk een 35 eerste fractionering door ultrafiltratie, waarbij stoffen met een molgewicht groter dan 100.000 worden verwijderd, een tweede fractionering door ultrafiltratie, waarbij stoffen met een molgewicht kleiner dan 10.000 worden verwijderd, en een zuivering door ultracentrifugering (bv. 180.000 g) ter verwijdering van resthoeveelheden lipopolysacchariden. Zodoende wordt de genoemde specifieke proteïnefractie verkregen.

Indien men alle zeven verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen aan de genoemde vier stappen 40 heeft onderworpen, resulteren dus zeven specifieke proteïnefracties, die slechts in immuuntype van elkaar verschillen.

In de daaropvolgende vijfde stap worden de verkregen proteïnefracties van uiteenlopend immuuntype in een bepaald aantal en een bepaalde verhouding met elkaar gecombineerd ter formulering van het polyvalente vaccin. Er dienen dus ten minste twee soorten proteïnefracties met elkaar samengevoegd te 45 worden. Rekening houdend met de frequentie waarmee infectieziekten veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosastammen van bepaald immuuntype optreden, dienen echter ten minste drie of vier soorten proteïnefracties met elkaar te worden vermengd. Voor een maximale bescherming zijn alle zeven soorten proteïnefracties nodig. De mengverhouding kan nogal variëren, afhankelijk van de gebruikte soorten of typen, maar vaak is een vermenging in equivalente hoeveelheden voldoende.

50 Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van het vaccin volgens de uitvinding bevat het een mengsel van celwandproteïnen afkomstig uit de toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031 en KCCM 10034, waarbij de mengverhouding van deze celwandproteïnen 1:1:1,5:0,5 of 1:1:1:1 of 0,5:1,5:1,5:0,5 is. Men kan ook celwandproteïnen uit alle zeven verzwakte bacteriestammen in een mengverhouding van nagenoeg gelijke hoeveelheden toepassen. De kleinste hoeveelheid celwandproteïnen uit elk der verzwakte 55 stammen, die in het polyvalente vaccin aanwezig is, dient gelijk te zijn aan de minimumhoeveelheid welke voldoende is voor het opwekken van immunisatie in een willekeurige patiënt.

Met de samenvoeging van diverse soorten celwandproteïnen, elk in een bovendrijvende vloeistof, is de 194910 6 bereiding van het polyvalente vaccin volgens de uitvinding in principe voltooid. Desgewenst kunnen echter nog farmaceutisch aanvaardbare excipiëntia worden toegevoegd, zoals bij voorbeeld calciumhydroxide, calciumfosfaat, ISCOM (immunostimulerend complex), SAF-1 (syntex Adjuvant Formulation-1), SAFm (modified syntex Adjuvant Formulation) en andere excipiëntia die aan de deskundige bekend zijn.

5 Bij toepassing van het vaccin als profylactisch middel tegen infecties door Psèudomonas aeruginosa-bacteriên, varieert de toe te dienen dosis met het geslacht, de leeftijd, het gewicht en de gezondheidstoestand van de te vaccineren persoon. In het algemeen bedraagt deze dosis 0,5 tot 2,5 mg, gerekend als mengsel van celwandproteïnen uit de verzwakte bacteriestammen. Deze hoeveelheid wordt doorgaans verkregen uit een bacteriemassa van 0,1 g tot 0,5 g droog gewicht (overeenkomend met 0,5 tot 2,5 g nat 10 gewicht). De toediening geschiedt bij voorkeur door intramusculaire injectie.

Daarnaast kan het polyvalente vaccin ook worden gebruikt voor het aanmaken van immunoglobulinen, die voor het bestrijden van reeds bestaande infectieziekten, veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa-bacteriën, bruikbaar zijn. Hiertoe worden proefdieren, zoals schapen of konijnen met het vaccin geënt, teneinde daarin antilichamen tegen het vaccin, dat wil zeggen diverse soorten immunoglobulinen, op te 15 wekken. Vervolgens wordt bloed van de proefdieren afgetapt en het serum daaruit afgescheiden, waarna dit serum op bekende wijze wordt opgewerkt ter verkrijging van de immunoglobulinen in gezuiverde toestand. Deze gezuiverde immunoglobulinen kunnen dan tot een geneesmiddel worden verwerkt.

De afscheiding en zuivering van de immunoglobulinen uit het serum kan met een methode geschieden die in het betreffende vakgebied algemeen bekend is (zie Practical Immunology, 3de Editie (1989), pag 20 292-294), bij voorbeeld door het serum met gedestilleerd water te vermengen, het mengsel ter absorptie van de immunoglobulinen aan DEAE-cellulose (diëthylaminoethylcellulose) toe te voegen, de bovendrijvende vloeistof te verwijderen en het DEAE-cellulose met de geabsorbeerde immunoglobulinen vele malen met een fosfaatbufferoplossing te wassen. Zodoende wordt een vloeistof met gezuiverde immunoglobulinen verkregen.

25 De aanvankelijke enting van de proefdieren kan desgewenst geschieden met een vaccin, dat celwand-proteïnen uit elk van de 7 typen verzwakte bacteriestammen bevat, bij voorkeur In onderling equivalente hoeveelheden. Houdt men echter rekening met de kruisreactiviteit van de immunoglobulinen, dan zullen de immunoglobulinen, die uit de immunisering van een proefdier met een mengsel van celwandproteïnen afkomstig uit de vier verzwakte bacteriestammen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCP 30720 en CFCPA 30 60534 in een verhouding 1:1:1:1 resulteren, een aanzienlijk therapeutisch effect leveren bij alle infecties die door Pseudomonas aeruginosa-stammen van de immuuntypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7 volgens Fisher worden veroorzaakt.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het geneesmiddel daarom immunoglobulinen tegen elk immuuntype van de Pseudomonas aeruginosa-stammen, overeenkomend met de immuuntypen 1 tot 7 35 volgens Fisher-Devlin.

De immunoglobulinen tegen Pseudomonas aeruginosa kunnen tot farmaceutische preparaten in gelyofiliseerde vorm of in vloeibare vorm worden verwerkt, welke preparaten daarnaast nog farmaceutisch aanvaardbare dragers, zoals stabilisatoren, conserveringsmiddelen, isotonische middelen en dergelijke kunnen bevatten. Voorbeelden van geschikte farmaceutisch aanvaardbare dragers zijn mannitol, lactose, 40 saccharose en menselijk albumine in het geval van gelyofiliseerde preparaten en een fysiologische zoutoplossing, water, een fosfaatbufferoplossing en aluminiumhydroxide in het geval van vloeibare preparaten.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm verkeert het geneesmiddel dus in een farmaceutische toedieningsvorm zoals een injectiepreparaat, tabletten, capsules, oogdruppels, een verstuifbaar middel of 45 een zalf, en bevat voorzover nodig een farmaceutisch aanvaardbare drager.

De dosering van het geneesmiddel varieert in afhankelijkheid van de leeftijd, het lichaamsgewicht, het geslacht en de algemene gezondheidstoestand van de geïnfecteerde persoon, de ernst van de infectie en de bestanddelen van de immunoglobulinencombinatie die wordt toegediend. De immunoglobulinen worden doorgaans in een hoeveelheid van 0,1 mg tot 1000 mg, bij voorkeur 1 mg tot 100 mg, per dag per kilogram 50 lichaamsgewicht aan een volwassene toegediend en wel langs intraveneuze weg.

De onderhavige uitvinding wordt meer specifiek geïllustreerd door de volgende voorbeelden. Daarbij zal enkele malen worden verwezen naar de tekening, waarin: figuur 1 het resultaat laat zien van een SDS-PAGE van gezuiverde celwandproteïnen, afkomstig uit 55 verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de uitvinding; en figuur 2 een grafiek is die de gewichtsverandering bij manlijke muizen aangeeft, welke een injectie met celwandproteïnen uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de uitvinding hebben 7 194910 ondergaan.

Voorbeeld 1: Isolering van een Pseudomonas aeruginosa-stam uit met Pseudomonas aeruginosa geïnfecteerde patiënten en identificatie daarvan 5 Uit elk van 260 verschillende bloedmonsters, genomen van met Pseudomonas aeruginosa geïnfecteerde patiënten, werd een evenredig deel van ca. 1 tot 5 ml aseptisch afgenomen. Dit bloed mocht 1 uur bij kamertemperatuur blijven staan. Nadat het bloed 's nachts in een koelkast op 4°C was bewaard, werd het 10 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 1500 x g (g = versnelling van de zwaartekracht) ter verwijdering van de vaste stoffen en ter verkrijging van een bovendrijvend serum. Het zo verkregen serum werd met een 10 fosfaatbufferoplossing (NaH2P041,15 g, KCI 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCI 8,766 g per liter) in een verhouding van 1:10 (serum tot oplossing) verdund en dan verspreid over een vooraf gemaakte kweekplaat met trypsine soyabouillon onder toevoeging van 1,0 tot 1,5% agar. De kweekplaat werd 12 uren of meer geïncubeerd In een incubator die onder aerobe condities op een constante temperatuur van 37°C werd gehouden. De zo verkregen kweken werden overgevoerd naar verse kweekplaten, waarna de gewenste 15 micro-organismen in zuivere toestand met behulp van een bekende zuivere isoleringsmethode voor micro-organismen werden geïsoleerd (zie Thomas D. Broek en Michasel T. Madigan, Biology of Microorganisms (1988), 5e editie, pp 32-33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey).

De serologische en immunologische kenmerken van de geïsoleerde Pseudomonas aeruginosa-stammen zijn reeds gepubliceerd (zie het handboek van Bergey), zodat hun identificatie kan geschieden met een 20 analyse "kit” uit de handel volgens de in J. Gen. Microbiology, 130, 631-644,1984 beschreven analytische methode. Elke Pseudomonas aeruginosastam werd geënt in een proefbuis die 5 ml trypsine-soyabouillon bevatte en daarna bij 37°C onder aerobe omstandigheden geïncubeerd teneinde de concentratie van de bacteriënmassa zodanig in te stellen dat een absorbantie van ca. 2,0 of meer onder zichtbaar licht van 650 nm behouden bleef.

25 Uit deze kweekoplossing werd een evenredig deel van 1 mm aseptisch afgenomen en 10 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 6000 x g. De bovendrijvende kweekvloeistof werd verwijderd waarna het neergeslagen micro-organisme werd gesuspendeerd door toevoeging van een zelfde hoeveelheid gesteriliseerde fysiologische zoutoplossing. In elke holte van een microplaat met 96 holtes werd 15 pi testserum uit de ”kit” en 15 μΙ controleserum (normaal konijnenserum) gebracht waarna dit werd vermengd met 15 μΙ van de 30 bovenverkregen suspensie van micro-organisme en waarna werd nagegaan of binnen 10-30 minuten agglutinatie optrad. Aangezien de stam van het micro-organisme bij dit onderzoek in een holte met positieve agglutinatie van het zelfde serotype is als dat van het toegevoegde serum, kon de identificatie van de geïsoleerde micro-organismen gemakkelijk worden verricht.

35 Voorbeeld 2: Selectie van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen uit elk van de geïsoleerde Pseudomonas aeruginosa-stammen

Terwille van het verzwakken van Pseudomonas aeruginosa-stammen ter verkrijging van veilige micro-organismen voor toepassing bij het bereiden van een vaccin, werd voor elk van de Pseudomonas aeruginosa-stammen met een apart immuuntype één stam geselecteerd en dan via herhaalde zuiveringen 40 verzwakt.

Bij deze procedure werd als controle een giftige Pseudomonas aeruginosa-stam GN 11189 (Episome Institute, Japan) gekozen, welke een sterfte van 100% binnen 3 dagen veroorzaakt na intraveneuze (of intraperitoneale) injectie van 2,0 x 10® cellen van GN 11189 in een mannelijke ICR-muis met een gewicht van 20-25 g.

45 Elk van de geselecteerde Pseudomonas aeruginosastammen met verschillend immuuntype werd onder dezelfde condities als in voorbeeld 1 in vloeibare trypsine-soyabouillon gekweekt en daarna 10 minuten bij 4°C gecentrifugeerd bij 6000 x g. Het verkregen celprecipitaat werd in 10 ml fysiologische zoutoplossing gesuspendeerd, opnieuw gecentrifugeerd onder dezelfde condities als eerder en dan verdund met een verse fysiologische zoutoplossing teneinde het celgehalte op 5 x 10s, 5 x 10®, 5 x 107 en 5 x 108 cellen per 50 ml in te stellen. Elke celverdunning werd langs intraveneuze (of intraperitoneale) weg toegediend aan een groep van 10 ICR-muizen. Aan de controlegroep werd de stam GN 11189 toegediend in een hoeveelheid van 2,0 x 10® cellen per proefdier. Op het punt waar de sterfte binnen drie dagen in de controlegroep 100% was werden Pseudomonas aeruginosastammen aseptisch geïsoleerd uit ICR-muizen die bij de hoogste celconcentratie overleefden. De geïsoleerde Pseudomonas aeruginosa-stammen werden opnieuw verspreid 55 over een plaatmedium van trypsine-soya en agar. Na de bovenstaande isoleringsmethode van het micro-organisme werd elke stam van het micro-organisme in zuivere toestand geïsoleerd.

Alle zeven (7) soorten van de eerste verzwakte micro-organismen werden herhaaldelijk (ca. 3-7 maal) 194910 8 met de beschreven methode door ICR-muizen gevoerd totdat voor elke stam van het micro-organisme de gewenste LD^, van ten minste 2, 0 x 107 cellen was bereikt. De veiligheidswaarde, voor elke tenslotte verkregen verzwakte stam van Pseudomonas aeruginosa, uitgedrukt in de waarde van LD50, is in de volgende tabel 1 weergegeven.

5 TABEL 1

Veiligheidswaarden van geselecteerde verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderhavige uitvinding 10 --:-

Gekozen P. Fisher-Devlin Begin LD^, Eind LD^ aeruginosas- Immunotype tammen 15 Test Stam CFCPA 1 <1.5x10® 7,6x107 10142 CFCPA 2 <1,4x10® 2,7x107 20215 CFCPA 3 <2.0x10® 2,5x10® 20 30720 CFCPA 4 <3,7x10® 4,5x107 40057 CFCPA 5 <5,0x10® 3.0x107 50243 25 CFCPA 6 <1,5x10® 2,0x107 60534 CFCPA 7 <3,8x10® 2,7x107 70018

Controle stam GN11189 - . “ - 2,0x10® 30--—--

Alle zeven (7) soorten micro-organismen, zoals hierboven genoemd, vertoonden een LD^ waarde van ten minste 2,0 x 107 cellen. Hieruit blijkt dat verzwakte micro-organismen waren geselecteerd.

35 Voorbeeld 3: Identificatie van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam

Aan een vloeibaar voedingsmedium (pH 7,2-7,4), dat bereid was door 15 minuten steriliseren met stoom in een autoclaaf bij 121°C, werd gesteriliseerd 10% (gew/vol) cetrimide toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,3% (vol/vol). Uit het zo verkregen medium werd aseptisch een evenredig deel van 10 ml afgenomen en in een proefbuis gebracht, waarna dit werd geënt met 1 druppel van elke verzwakte Pseudomonas 40 aeruginosa-stam, die volgens voorbeeld 2 in zuivere toestand was geïsoleerd. De stam werd 12-16 uren bij 30-37°C in zaaicultuur gekweekt. Uit de proefbuis, waarin de groei van het micro-organisme plaatsvindt, werd 0,5 ml kweekoplossing genomen en over een plaat van cetrimideagar-medium als isolatiemedium voor Pseudomonas aeruginosa verspreid, waarna de plaat werd geïncubeerd. De kolonie, die reeds door pigmentvorming als Pseudomonas aeruginosa kon worden geïdentificeerd, werd overgebracht naar en 45 geïncubeerd op een Pseudomonas aeruginosa-agar-medium voor het aantonen van fluoresceïne (Proteose pepton nr. 3 (oxoïde), 2%, Glycerol (dubbel gedestilleerd) 1%, K2HP04 (watervrij) 0,15%, MgS04.7H2 0,15%, Agar 1,5% (gew./vol), pH 7,2) en vervolgens naar en op een Pseudomonas aeruginosa-agar-medium voor het aantonen van pyocyanine (Pepton (Difco) 2%, Glycerol (dubbel gedestilleerd) 1%, K2S04 (watervrij) 1%, MgCI2 (watervrij) 0,14%, Agar 1,5% (gew/vol), pH 7,2). Vervolgens werd het opnieuw 50 beoordeeld met een morfologische proef, een proef naar voedingsbehoefte en een oxidatietest teneinde de aanwezigheid van de Pseudomonas aeruginosa-stam te bepalen. De typen van de geselecteerde Pseudomonas aeruginosa-stammen werden volgens het lATS-classificatiesysteem bepaald onder gebruikmaking van een antigeenkit voor Pseudomonas aeruginosa (gemaakt door Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) waarna zij werden geclassificeerd volgens de immuno-serotypen van Fisher. De resultaten daarvan zijn in 55 de volgende tabel 2 weergegeven.

9 194910 TABEL 2

Criteria voor selectie van Pseudomonas aeruginosastammen, alsmede hun serotype en beschermings-gebied 5 ----—------

Test Testresultaat

Groei op isolatiemedium Groei

Groei op Pseudomonas aeruginosa-medium voor detectie Groei

Morfologische kenmerken (microscoop) Beide einden zijn rond en een 10 enkel polair flagellum is aanwezig

Gramkleuring Gram-negatief

Oxidasereactie Positieve respons (+) of positieve-negatieve respons (+)

Antigeen-antilichaam-reactie (eerste geselecteerde stammen) 15 CFCPA 20215 Beschermend voor Fisher-typen 3 en 7 als Fisher-immuuntype 2 (O-serotype 7) CFCPA 60534 Beschermend voor Fisher-typen 3 en 7 als Fisher-immuuntype 20 6 (O-serotype 5) CFCPA 10142 Beschermend voor Fisher-typen 2 en 1 als Fisher-immuuntype 1 (O-serotype 4) CFCPA 30720, CFCPA 30721 Beschermend voor Fisher-type 25 6 als Fisher-immuuntype 3 (O-serotype 3)

Voorbeeld 4: Fysiologische eigenschappen van verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen 30 (1) Bij elk van de zeven soorten Pseudomonas aeruginosa-stammen, die volgens voorbeeld 2 waren verzwakt, werd de groeisnelheid in afhankelijkheid van verschillende pH-waarden bepaald. Elke stam van het micro-organisme werd geënt in 50 ml trypsine-soyabouillon met een pH-waarde van 7,2 en daarna 12-16 uren bij 37°C onder aerobe omstandigheden met een roersnelheid van 200/min gepreïncubeerd. Elke gepreïncubeerde bacteriemassa werd tot een eindconcentratie van 1% (vol/vol) geënt in 500 ml verse 35 trypsine-soyabouillon met een pH van 3, 0, een pH van 5,0, een pH van 7, 0 en een pH van 9,0, en daarna in fermentatietoestellen bij 37°C onder dezelfde omstandigheden als hierboven geTncubeerd. Tijdens deze periode werd van elk kweekmedium met intervallen van 2 uren een monster genomen waarna de concentratie aan bacteriemassa werd bepaald door de absorbantie van het monster bij 600 nm met behulp van een spectrofotometer te meten. De resultaten zijn weergegeven in de volgende tabel 3.

40 TABEL 3

Groeisnelheden van micro-organisme in afhankelijkheid van de pH-waarde 45 Stammen pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0 CFCPA 10142 - +++ +++ +++ CFCPA 20215 - +++ +++ +++ CFCPA - +++ +++ ++ CFCPA - +++ +++ ++ 50 CFCPA - +++ +++ ++ CFCPA - +++ +++ ++ CFCPA - +++ +++ +++ 55 Opmerking: + groei, - geen groei

Zoals blijkt uit tabel 3 vertoonden de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderhavige uitvinding geen groei onder sterk zure omstandigheden, bijv. bij pH 3,0, maar hadden zij 194910 10 nagenoeg gelijke of soortgelijke groeisnelheden in media met een pH van 5,0 tot 9,0. Daarom kunnen bij de onderhavige uitvinding alle zeven soorten micro-organismen zich goed binnen een breed pH-gebied worden gekweekt.

(2) Met dezelfde methode als in het bovenstaande onderdeel (1) werd de groeisnelheid van Pseudomonas 5 aeruginosa-stammen bij wisselende temperatuur bepaald. Elk van de zeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen werd geënt in 50 ml trypsine-soyabouillon bij een pH-waarde van 7,0 en daarna 12-16 uren bij 37°C onder aerobe omstandigheden en een roersnelheid van 200/min gepreïncubeerd. Elk van de gepreïncubeerde stammen werd geënt in 500 ml trypsinesoyabouillon met een. pH van 7,0 en daarna in fermentatietoestellen onder dezelfde omstandigheden als hierboven geïncubeerd, waarbij de 10 toestellen op temperaturen van 25°C, 30°C, 37°C en 42°C werden gehouden. Tijdens deze periode werd de groeisnelheid in elk fermentatietoestel bepaald door de absorbantie van de kweekopiossing bij 600 nm met behulp van een spectrofotometer te meten. De resultaten zijn weergegeven in tabel 4.

TABEL 4 15 -

Groeisnelheden van micro-organisme bij wisselende temperatuur

Stammen 25°C 30eC 37°C 42°C

CFCPA10142 + +++ +++ + 20 CFCPA 20215 + +++ +++ + CFCPA 30720 ++ +++ +++ + CFCPA 40057 + ++ +++ + CFCPA 50243 + ++ +++ + CFCPA 60534 ++ +++ +++ + 25 CFCPA 70018 + ++++++

Opmerking: + groei, - geen groei 30 Zoals blijkt uit tabel 4 vertoonden alle zeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen de beste groei bij 37°C en verder een goede groei bij 30°C en 25°C. Bij 42°C vertoonde elk van de zeven soorten Pseudomonas aeruginosa-stammen echter een relatief langzame groei, vergeleken met de groeisnelheid bij andere temperaturen.

(3) Het volgende experiment werd gedaan ter bepaling van het effect van een koolstofbron op de groei- 35 snelheid van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen. Elk van de zeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen werd geënt in 50 ml trypsine-soyabouillon bij een pH van 7,0 en daarna 12-16 uren bij 37°C onder aerobe omstandigheden en een roersnelheid van 200/min geïncubeerd. Het kweekme-dium werd vervolgens 10 minuten bij 4°C onder aseptische omstandigheden gecentrifugeerd met 6000 x g, waarna de bacteriemassa werd gewonnen en gehersuspendeerd in 10 ml fysiologische zoutoplossing. Van 40 de zo verkregen suspensies van micro-organisme werd telkens 50 pi geënt in 5 ml M9-medium (Na2HP04.7H20 12,8g, KH2P04 3g, NaCI 0,5g, NH4CI 1g) dat uiteenlopende koolstofbronnen bevatte (zie hieronder) en daarna 12 uren geïncubeerd. Voor elke kweekopiossing werd vervolgens de mate van groei van het micro-organisme bepaald door meting van de absorbantie bij 600 nm.

45 TABEL 5

Groei-eïgenschappen van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in afhankelijkheid van de koolstofbron

50 P. aeruginosastammen CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA

Koolstofbronnen 10142 20215 30720 40057 50243 60534 70018

Glucose +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ 55 Xylose - - - -

Mannitol ++++++++++++++ 11 194910 TABEL 5 (vervolg)

Groei-eigenschappen van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in afhankelijkheid van de koolstofbron 5 .........

P. aeruginosastammen CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA CFCPA

Koolstofbronnen 10142 20215 30720 40057 50243 60534 70018 10 Glucose +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++

Galactose - - ± - ±

Sorbitol -------

Inositol -------

Maltose _______ 15 saccharose -------

Arabinose - - - - - - -

Mannose - ± ± - ± ± - β-Alanine +++ ++ ++ ++ +++ +++ ++

Zouten alon _______ 20 -

Opmerking: + groei, - geen groei

De groei van verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen op diverse koolstofbronnen vertoonde een patroon dat nagenoeg gelijk was aan dat van de groei van algemene Pseudomonas aeruginosa-stammen 25 op diverse koolstofbronnen (zie het handboek van Bergey). Opgemerkt wordt echter dat hoewel gerapporteerd is dat Pseudomonas aeruginosa in het algemeen geen mannose gebruikt, de verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen volgens de onderhavige uitvinding wel enige groei in een mannose-houdend medium vertoonden.

Zoals blijkt uit het bovenstaande, kunnen de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de 30 onderhavige uitvinding ter verkrijging van een bacteriemassa onder aerobe condities bij geselecteerde temperatuur, pH en dergelijke in een gebruikelijk medium met een koolstofbron, een stikstofbron, anorganische verbindingen, aminozuren, vitaminen en andere voedingsstoffen worden geïncubeerd. De celwand-proteTnen uit de verkregen bacteriemassa worden gebruikt voor het bereiden van Pseudomonas aeruginosa-vaccins.

35 Als koolstofbron voor het incuberen van de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen kunnen diverse koolhydraten zoals glucose, mannitol, fructose etc., diverse organische zuren, zoals azijnzuur, pyrodruivenzuur, melkzuur en dergelijke worden gebruikt. Voor de stikstofbron kunnen diverse organische en anorganische ammoniumzouten, pepton, gistextracten, caseïne, hydrolisaten en andere stikstofhoudende stoffen worden gebruikt. Als anorganische verbindingen kunnen magnesiumsulfaat, calciumcarbonaat, 40 ferrosuifaat, cuprosulfaat, zinksulfaat en kaliumwaterstoffosfaat en kaliumdiswaterstoffosfaat en dergelijke worden gebruikt. De incubatie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 25-37°C onder aerobe omstandigheden, bijv. door middel van een plaatcultuur of een vloeibare cultuur zoals een schudcultuur of een beluchtings-spinnercultuur. De pH-waarde van het medium wordt tijdens de incubatieperiode bij voorkeur op een waarde van 5-9 gehandhaafd. Bij voorkeur wordt de bacteriemassa, die door centrifugeren van de 12-16 uren 45 geïncubeerde kweekoplossing wordt verkregen, als uitgangsmateriaal voor het bereiden van vaccins gebruikt, zoals hierna beschreven.

Voorbeeld 5: Incubatie van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen (1) De volgens voorbeeld 2 verkregen bacteriemassa van Pseudomonas aeruginosa werd terwille van de 50 massale productie in een fermentatievat van 5 I als volgt geïncubeerd. 2,51 van een medium, verkregen door tryptine-soyabouillon in gedestilleerd water op te lossen (30 g op 1 I) werd op pH 7,2 gebracht, gesteriliseerd en daarna in het vat van 51 gebracht. De incubatieomstandigheden waren: incubatie-temperatuur 37°C; beluchtingsgraad 1 wm; entingshoeveelheid 5% (vol/vol) bacteriemassa van verzwakte Pseudomonas aeruginosa verkregen uit voorbeeld 2, betrokken op kweekoplossing; roersnelheid 100/min 55 voor de eerste 2 uren en daarna een vaste roersnelheid van 600/min voor de volgende 12-16 uren.

Ofschoon de verkregen hoeveelheden bacteriemassa enigszins verschilden, afhankelijk van het type van de Pseudomonas aeruginosa-stam, was de gemiddelde opbrengst ca. 8 g (droog gewicht) bacteriemassa per 194910 12 liter kweekvloeistof.

(2) Elk van de zeven typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen werd onder dezelfde incubatie-omstandigheden als in het bovenstaande onderdeel (1) geïncubeerd, met als verschil dat als medium een speciaal medium voor het kweken van Pseudomonas aeruginosa werd gebruikt, dat bestond uit glucose 5 (30 g/l), pepton (15 g/l), MgS04 (0,5 g/l), CaC03 (5g/l), KH2P04 (Ig/I), FeS04 (5mg/l), CuS04 (5mg/l) en ZnS04 (5mg/l). Met dit speciale medium werd ca. 10,4 g tot 10,5 g (droog gewicht) bacteriemassa voor elke stam van het micro-organisme verkregen. Door het gebruik van dit speciale medium kan derhalve een opbrengst aan bacteriemassa worden verkregen die ten minste 30% groter is (betrokken op droog gewicht) dan die in een trypsine-soyabouillon.

10

Voorbeeld 6: Partiële zuivering van celwandproteïnen uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen Voor het bereiden van vaccins tegen Pseudomonas aeruginosa, werden de celwandproteïnen uit elk van de zeven soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen partieel gezuiverd. Hierna wordt de stam van type 3, namelijk CFCPA 30720 (KCCM 10031) als typerend voorbeeld gebruikt. De andere verzwakte 15 Pseudomonas aeruginosa-stammen kunnen echter aan dezelfde methode als de navolgende zuiverings-methode worden onderworpen ter verkrijging van partieel gezuiverde celwandproteïnen.

2,5 I van het speciale medium, zoals gebruikt in het bovenstaande voorbeeld 4(2), werd in een fermentatievat van 51 gebracht en daarna 12-16 uren onder handhaving van dezelfde incubatie-omstandigheden als hierboven geïncubeerd.

20 Na voltooiing van de incubatie werd 2,5 I van de kweekoplossing 20 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 6000 x g ter verwijdering van de bovendrijvende vloeistof. De neergeslagen cellen werden gehersuspen-deerd in een fosfaatbufferoplossing (Na2HP04 1,15 g, KCI 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCI 8,766 g, per liter, pH 7,2) bij 4°C, dan opnieuw gecentrifugeerd en gewassen met dezelfde fosfaatbufferoplossing. Aan 130 g van de zo verkregen cellen werden 3 volumina (ca. 390 ml) aceton betrokken op het oorspronkelijke natte 25 celvolume toegevoegd waarna het mengsel 12 uren of langer bij 4°C mocht blijven staan. Nadat het aceton van de neergeslagen cellen was verwijderd werden opnieuw twee volumina (ca. 260 ml) verse aceton, betrokken op het oorspronkelijke natte celvolume, aan het residu toegevoegd. Het verkregen mengsel werd 5-10 minuten geroerd en daarna 20 minuten gecentrifugeerd met 8000 x g. De bovendrijvende aceton werd verwijderd waarna een zelfde volume aceton aan het residu werd toegevoegd. Het mengsel werd op 30 dezelfde wijze als hierboven beschreven doorgeroerd en gecentrifugeerd ter verwijdering van de bovendrijvende vloeistof. De neergeslagen cellen werden bij kamertemperatuur op een plaat gedroogd ter verwijdering van de aceton. De gedroogde micro-organismen werden gehersuspendeerd door toevoeging van 250 ml van dezelfde fosfaatbufferoplossing als hierboven, zodat de eindconcentratie kon worden ingesteld op 10% (vol/vol). Het verkregen mengsel werd 10 minuten bij een draaisnelheid van 500-1500/min onder 35 handhaving van een temperatuur van 4°C in een homogenisator behandeld ter extractie van de celwandproteïnen. De verkregen suspensie werd 30 minuten gecentrifugeerd bij 8000 x g tot 10.000 x g ter verkrijging van de bovendrijvende vloeistof. De neergeslagen cellen werden afgescheiden, opnieuw gesuspendeerd door toevoeging van een zelfde volume fosfaatbufferoplossing en daarna onderworpen aan een tweede extractie onder dezelfde omstandigheden als de eerste extractie ter verkrijging van de 40 bovendrijvende vloeistof.

Door gebruikmaking van dezelfde omstandigheden als bij de eerste extractie werden de celwandproteïnen herhaaldelijk (5-6 maal) geëxtraheerd, waarbij gezorgd werd dat geen van de cellen openbrak (lysis vertoonde). Het openbreken van de cellen kan worden bepaald door een speciaal proteïne als cytoplastische merkstof te meten, namelijk lactaatdehydrogenase of hexokinase. De geëxtraheerde 45 bovendrijvende vloeistoffen, die elk waren getest om te zorgen dat de celwandproteïnen zonder meenemen van cytoplastische proteïnen (lactaatdehydrogenase en hexokinase) waren geëxtraheerd, werden gezameld, doorgeroerd en tenslotte opnieuw 30 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 10.000 x g ter verkrijging van een heldere vloeistof. De zo verkregen proteïne-oplossing bestond enkel uit nagenoeg zuivere celwandproteïnen en werd met een kwantitatieve proteïnetest ingesteld op een proteïneconcentratie op het niveau van 1 50 mg/ml tot 2 mg/ml. Verder werd de zuiverheid van de proteïneoplossing bepaald met behulp van elektrofo-rese met een concentratiegradiënt van 10-15%. Als resultaat kon worden aangetoond dat de gewenste celwandproteïnen met een molgewicht tussen 10.000 en 100.000 aanwezig waren (zie figuur 1).

Voorbeeld 7: Verdere zuivering van ruwe proteïnen 55 De volgende methode werd uitgevoerd ter zuivering van de ruwe oplossing van celwandproteïnen met een concentratie van 1-2 mg/ml, teneinde te zorgen dat alleen de doeltreffende bestanddelen aanwezig waren.

2-2,5 I van de ruwe oplossing van celwandproteïnen werd eerst gefiltreerd door een membraanfilter uit 13 194910 het Pellicon Cassette System met maximale doorlaat van molgewicht 100.000, teneinde de proteïne-moleculen met een molgewicht boven 100.000 te verwijderen. Bij dit proces werden de proteïnen met een molgewicht beneden 100.000 ais filtraat verkregen en werden de proteïnen met een molgewicht boven 100.000 continu rondgevoerd ter scheiding van de kleine moleculen met een molgewicht beneden 100.000.

5 Als gevolg hiervan werd de proteïneoplossing tot 10-20% van het oorspronkelijke volume geconcentreerd. Vervolgens werd zij gewassen met 20-251 (tien maal het oorspronkelijke volume van de proteïneoplossing) aan gesteriliseerde fosfaatbufferoplossing (Na2HP04 1,15 g KCI 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCI 8,766 g/l) teneinde 90% of meer der proteïnen met molgewicht beneden 100.000 terug te winnen. De proteïnen met molgewicht beneden 100.000, die als filtraat werden verkregen, werden over een membraanfilter van 10 hetzelfde systeem met een minimale doorgang van molgewicht 10.000 gevoerd teneinde proteïnen met een molgewicht kleiner dan 10.000 en andere onzuiverheden te verwijderen en tegelijkertijd de proteïnen met molgewicht 10.000 tot 100.000 te concentreren tot een waarde van 1 mg/ml.

Tenslotte werd de bovendrijvende vloeistof aan ultracentrifugering onderworpen ter verwijdering van lypopolysacchariden (LPS) en celwandverwante fragmenten, die in de bovenverkregen vloeistof mogelijk in 15 sporenhoeveelheden aanwezig zijn. Het ultracentrifugeren werd 3 uren bij 4°C uitgevoerd met 180.000 x g tot 200.000 x g. Na verwijdering van de neerslagen werd de verkregen vloeistof gesteriliseerd door filtratie door een filter van 0,2 pm, zodat 250 tot 260 mg proteïnepreparaat werd verkregen dat in vaccins voor profylaxe tegen Pseudomonas aeruginosa-infecties kon worden gebruikt.

20 Voorbeeld 8: Zuivering van celwandproteïnen uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen met verschillende immuuntypes

De overblijvende zes soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de onderhavige uitvinding, dat wil zeggen de stammen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 en CFCPA 70018 werden behandeld met dezelfde methode voor incubatie van het 25 micro-organisme en zuivering als in voorbeeld 5, voorbeeld 6 en voorbeeld 7 is beschreven voor het bereiden van een vaccin uit de Pseudomonas aeruginosa-stam CFCPA-30720rDe zo verkregen vaccin-preparaten uit Pseudomonas aeruginosa vertoonden hetzelfde bandpatroon als het vaccinpreparaat uit CFCPA 30720 bij SDS-PAGE met een concentratiegradiënt van 10-15%. Bovendien kon bij vergelijking met een merkstof van standaard molecuulgewicht worden vastgesteld dat alle proteïnen in de vaccinpreparaten 30 een molgewicht tussen 10.000 en 100.000 hadden (figuur 1).

Voorbeeld 9: Test op kruisbeschermend vermogen met gecombineerde antigenen

De celwandproteïnen, afkomstig van elke verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam na de afscheidings- en zuiveringstrappen volgens de methoden van de voorbeelden 7 en 8 werden in een hoeveelheid van 35 0,2 mg/kg intraperitoneaal toegediend aan mannelijke ICR-muizen van 6 weken oud met een gewicht van 23-25 kg teneinde de dieren te immuniseren. Elke groep bestond uit 10-15 proefdieren. Eén week na de immunisatie werd van 2 tot 3 muizen per groep bloed afgenomen ter wille van een ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Bij de overblijvende ICR-muizen werd een ’’wilde” Pseudomonas aeruginosa-stam, die met het betreffende immuuntype overeenkwam, geïnjecteerd in een hoeveelheid van 10-50 maal de 40 oorspronkelijke LD^-waarde voor elke in tabel 2 van voorbeeld 2 genoemde stam van het micro-organisme. De doeltreffendheid van de bescherming tegen elke Pseudomonas aeruginosa-stam werd gedurende één week continu nagegaan. Als gevolg daarvan bleken alle testgroepen een beschermend effect tegen de overeenkomstige Pseudomonas aeruginosa-stammen te hebben en gaven de ELISA-proeven bij al het verzamelde bloed ook goede positieve waarden, hetgeen een verbetering in immunologische respons 45 betekent.

Voor het bereiden van vaccins volgens de onderhavige uitvinding, die in staat zijn om een gemeenschappelijk beschermend effect te geven tegen infecties die door een willekeurig type van Pseudomonas aeruginosa-stammen worden veroorzaakt, werden vier typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen (drie typen Pseudomonas aeruginosa-stammen die het meest frequent bij infecties van het menselijk 50 lichaam worden gevonden en één type Pseudomonas aeruginosa-stam die bij aantreffen moeilijk te bedwingen is, namelijk CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534) behandeld ter verkrijging van celwandproteïnen, die daarna in equivalente hoeveelheden werden gecombineerd en vervolgens werden onderzocht op hun vermogen tot kruisbescherming tegen elk immunotype van de Pseudomonas aeruginosa-stammen.

55 Celwandproteïnen, afkomstig van de bovengenoemde vier typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, werden in equivalente hoeveelheden (1:1:1:1), betrokken op het gewicht, met elkaar gecombineerd. De gecombineerde celwandproteïnen werden intraperitoneaal toegediend aan mannelijke ICR-muizen 194910 14 ter immunisering van de proefdieren. De controlegroep kreeg 0,3 ml fosfaatbufferoplossing (Na2HP04 1,15g, KCI 0,2g, KH2P04 0,2g, NaCI 8,766g per liter) toegediend. Na één week, gerekend vanaf de immunisatie, werd aan elk van de met Pseudomonas aeruginosa-vaccin geïmmuniseerde testgroepen en aan de met fosfaatbufferoplossing geïmmuniseerde controlegroep intraperitoneaal Pseudomonas aeruginosa toegediend 5 in vijf (5) verschillende concentraties die een reeks van telkens 10-voudige verdunning vormen, gaande vanaf 1x10® cellen tot 1 x 104 cellen. Na één week werd het aantal overlevende testdieren geteld ter berekening van de efficiëntie-index (El). De resultaten zijn weergegeven in de onderstaande tabel 6, waarin de efficiëntie-index is gedefinieerd als de waarde van LD50 in de testgroep, gedeeld door de waarde van LDS0 in de controlegroep. Zoals blijkt uit tabel 6 heeft een vaccin, bestaande uit de celwandproteïnen 10 afkomstig van vier soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen, namelijk CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534, een El-waarden van 3,0 tot 18 of meer tegen elk immunotype van de Pseudomonas aeruginosa-stammen. In aanmerking nemens dat vaccins met een El-waarde van ten minste twee als vaccins met een goed immunologische effect worden beschouwd, volgt hieruit dat het vaccin volgens de onderhavige uitvinding een goed beschermend effect heeft tegen infecties die door elk 15 willekeurig type van de zeven soorten Pseudomonas aeruginosa-stammen worden veroorzaakt.

TABEL 6

Test naar kruisbeschermend vermogen van Pseudomonas aeruginosa-vaccin, bereid uit vier (4) verschii-20 lende soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, tegen elk type van het micro-organisme

Onderzochte stam Immunotype Serotype El-waarde

Ouderstam CFCPA 10142 1 06 9,5

Ouderstam CFCPA 20215 2 011 13 25 Ouderstam CFCPA 30720 3 02 >18

Ouderstam CFCPA 40057 4 01 3

Ouderstam CFCPA 50243 5 010 4,5

Ouderstam CFCPA 60534 6 07 8,4

Ouderstam CFCPA 70018 7 05 7 30 —--—:-

Door herhaling van de bovenstaande methode met als verschil dat in plaats van het mengsel van vier soorten proteïnen nu een mengsel van celwandproteïnen afkomstig uit drie typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen namelijk CFCPA 10142, CFCPA 30720 en CFCPA 20215 (groep I) of een mengsel 35 van celwandproteïnen afkomstig uit alle zeven typen verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen (groep II) werd gebruikt, waarbij alle celwandproteïnen in equivalente hoeveelheid ten opzichte van elkaar aanwezig waren, werd het kruisbeschermend vermogen van deze twee soorten vaccins tegen infectie door elke soort Pseudomonas aeruginosa onderzocht. De.resultatemdaarvan zijn vermeld in tabel 7.

40 TABEL 7

Test op kruisbeschermend vermogen van vaccins afkomstig van drie typen (groep I) of zeven typen (groep II) verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, tegen elk type van het micro-organisme 45 Onderzochte stam LD*, in test groep

El-waarde (-)

LDgo in controlegroep Groep I Groep II

Ouderstam CFCPA 10142 14,3 9,2 50 Ouderstam CFCPA 20215 12,0 10,7

Ouderstam CFCPA 30720 >18,0 15,0

Ouderstam CFCPA 40057 2,5 8,3

Ouderstam CFCPA 50243 4,0 10,6

Ouderstam CFCPA 60534 3,7 9,7 55 Ouderstam CFCPA 70018 2,8 12,9 15 194910

Uit de bovenstaande experimentele resultaten kan worden afgeleid dat, aangezien het vaccin volgens de uitvinding met gemengde proteïnebestanddelen uit celwandprotelnen bestaat die van ten minste drie (3) verschillende soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen met onderling verschillende immunoty-pen afkomstig zijn, dit vaccin een uitstekend beschermend effect tegen elk soort immuuntype van Pseudom-5 onas aeruginosa vertoont, in tegenstelling tot slechts een enkel soort gemeenschappelijk antigeen. Hoewel de efficiëntieindex van het vaccin volgens de uitvinding varieert met het soort en het aantal geselecteerde micro-organismen uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, de mengverhouding van de daaruit afgeleide celwandprotelnen, het immunologische schema en de methode, etc., wordt zodoende bevestigd dat het vaccin van de onderhavige uitvinding doeltreffend werkt tegen alle Pseudomonas aeruginosa-10 stammen die momenteel in ziekenhuizen en bij patiënten optreden.

Voorbeeld 10: Toxicologische test op celwandprotelnen

Ter bereiding van een deelvaccin voor profylaxe tegen infecties die door Pseudomonas aeruginosa worden veroorzaakt, dient men zeker te zijn van de veiligheid van de celwandprotelnen zelf, die als deelvaccin 15 worden g ruikt en ook van de veiligheid van de stammen van het micro-organisme zelf zoals beschreven in voorbeeld 2. In dit voorbeeld werden celwandproteïnen partieel gezuiverd en daarna onderzocht op hun veiligheid in een proefdier, bijv. een muis. In het bijzonder werd elk van de verzwakte micro-organismen in een fermentatietoestel van 5 liter geïncubeerd met trypsinesoyabouillon als kweekmedium en dan verder behandeld op de wijze van de voorbeelden 5, 6 en 7. De bovendrijvende vloeistoffen van celwandprotelnen, 20 geëxtraheerd uit verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, werden samengevoegd en opnieuw 30 minuten gecentrifugeerd bij 4°C met 10.000 x g ter verwijdering van fijne deeltjes die mogelijk in oplossing aanwezig waren. De resulterende celwandproteïnen werden door een membraanfilter van Amicon gefiltreerd ter verkrijging van een mengsel van celwandproteïnen met molecuulgewichten tussen 10.000 en 100.000, welk mengsel tot een proteïneconcentratie van 1 mg/ml werd geconcentreerd en daarna met een filter van 25 0,2 pm werd gesteriliseerd ter verkrijging van een proteïnebron voor toxicologische proeven.

Bij de toxicologische proef bestonden de gebruikte proefdieren uit mannelijke ICR-muizen met een gewicht van 20-22 gram. De proteïnebron werd intraveneus bij de testgroep geïnjecteerd in een hoeveelheid van 20 mg/kg en van 100 mg/kg. De controlegroep kreeg een fysiologische zoutoplossing in een hoeveelheid van 25 ml/kg toegediend. Zoals blijkt uit tabel 8 en de bijgevoegde figuur 2, vertoonde de testgroep 30 een lichte remming van de gewichtstoename op de eerste dag na de toediening, terwijl deze groep op de tweede dag na toediening en later een normale groei en geen speciale symptomen vertoonde. Bovendien kon zelfs op en na de zevende dag geen specifieke wijziging of symptomen in enig orgaan worden gevonden.

35 TABEL 8

Acute toxicologische test voor celwandproteïnen afkomstig van verzwakte Pseudomonas aeruginosastam-men 40 Groep Dosis Testdieren Overlevende/ Opmerkingen

Testdieren

Testgroep A 20 mg/kg 20 20/20 Geen wijziging van lichaamsgewicht

Testgroep B 100 mg/kg 15 15/15 Wijziging van 45 lichaamsgewicht alleen op eerste dag

Controlegroep Fysiologisch zout 15 15/15 Geen wijziging van lichaamsgewicht 50 -

Voorbeeld 11: Bepaling van de antigene werking van celwandproteïnen

Celwandproteïnen, verkregen door partiële zuivering van verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen op dezelfde wijze als in voorbeeld 10, werden als antigeen gebruikt en werden in een hoeveelheid van 0,1 55 mg/kg of 0,2 mg/kg intraveneus in ICR-muizen geïnjecteerd teneinde de proefdieren te immuniseren. Eén week na de immunisatie werd een bepaalde hoeveelheid bloed bij elke muis van de groep muizen afgenomen, waarna het serum uit het verzamelde bloed werd afgescheiden en de vorming van antilichamen 194910 16 met behulp van een ELISA-methode werd bepaald (J. Clin. Microbiol. 15,1054-1058,1982).

Eerst werd 100 μΙ van het in voorbeeld 10 verkregen antigeen, dat op een concentratie van 0,1 mg/ml in een bekledingsbuffer was ingesteld, (0,05 M carbonaatbufferoplossing bestaande uit NaHCOg 2,85 g, Na2C03 1,70g, H20 1, pH 9,6) in elke holte van een microplaat met 96 holtes gebracht en daar 2 uren op 5 kamertemperatuur of 12-14 uren op 4°C gehouden teneinde het proteïne aan de plaat te laten hechten.

Na het verwijderen van de waterige oplossing werd aan elke holte van de plaat 200 μ11% runderserum-albumine (BSA) toegevoegd, dat 1 uur bij kamertemperatuur in reactie werd gebracht, teneinde het overblijvende deel in de holtes, dat niet aan proteïne was gebonden, te blokkeren.

Bij deze test werd het serum van niet-geïmmuniseerde muizen als antilichaam voor de controlegroep 10 gebruikt. Bij voltooiing van de reactie werd de plaat opnieuw 5-6 malen gewassen met een fosfaatbuffer-oplossing (pH 7,0 tot 7,2) en werd 100 μΙ van een tweede antilichaam, namelijk konijn-antimuis-IG-peroxidaseconjugaat, aan elke holte toegevoegd en 1 uur bij normale temperatuur daarmee in reactie gebracht.

Daarna werd de plaat 7 malen of meer met dezelfde fosfaatbufferoplossing (pH 7,0 tot 7,2) krachtig 15 gewassen. Als substraat werd 50 μΙ orthofenyleendiamine-dihydrochloride, ingesteld op een concentratie van 0,3 tot 0,4 mg/ml in een citraat-fosfaatbufferoplossing (0,1 M citraat-fosfaatbuffer, pH 5,0) aan elke holte van de plaat toegevoegd en 20 minuten bij uitsluiting van licht in reactie gebracht. Daarna werd telkens 50 μ11 N zwavelzuur toegevoegd teneinde de reactie in elke holte te stoppen. Voor elke reactieoplossing werd vervolgens de absorbantie bij 490 nm met behulp van een spectrofotometer gemeten.

20 TABEL 9

Vorming van antilichamen tegen celwandproteïnen van elk micro-organisme (490 nm) 25 Antilichaam 1/5 1/25 1/125 1/625 1/3125 1/15625 verdunning -

Antigeengehalte (mg/kg)

Controlegroep 0,16 0,15 0,29 0,47 0,41 0,43 30 Testgroep 0,1 0,29 0,25 0,32 0,52 1,1 1,2 0,2 0,76 0,67 0,50 0,49 1,3 1,4

Zoals uit tabel 9 blijkt, resulteert de toediening van 0,1 of 0,2 mg/kg aan antigeen en de testgroep in een 35 immuniteit die 2 tot 5 maal hoger is dan in de controlegroep.

Voorbeeld 12: Productie van immunoglobuline tegen Pseudomonas aeruginosa De in voorbeeld 7 verkregen protelneoplossing werd aan konijnen toegediend ter productie van het overeenkomstige immunoglobuline. Ofschoon de celwandproteïnen afkomstig van de verzwakte Pseudomo-40 nas aeruginosa-stam CFCPA 30720 als typerend voorbeeld werd gebruikt, kan dezelfde methode worden toegepast op de andere verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen.

0,5 tot 1 ml van de in voorbeeld 7 uit de stam CFCPA 30720 verkregen oplossing van celwandproteïnen, (met 100*200 pg celwandproteïnen daarin) werd gebruikt om albinokonijnen 3 malen met tussenpozen van 7 dagen te enten. Daarna werd bij één der konijnen met regelmatige tussenpozen bloed afgenomen, waaruit 45 het serum werd afgescheiden. 100 ml van het afgescheiden konijnenserum werd vermengd met 300 ml gedestilleerd water, waarna het mengsel bij 4°C werd toegevoegd aan 500 g (nat gewicht) DEAE-cellulose. Het verkregen mengsel werd 1 uur bij 4CC krachtig doorgeschud, waarna het mocht blijven staan en waarna de bovendrijvende vloeistof werd afgescheiden en verwijderd. Het overblijvende residu werd drie maal gewassen met telkens 200 ml 0,01 M fosfaatbufferoplossing (Na2HP04 1,15 g, KH2P04 0,2 g, KCI 0,2 g, 50 NaCI 8,766 g per liter, pH 8,0) waardoor 600 mg immunoglobuline IgG met een zuiverheid van 96% of meer werd verkregen.

Voorbeeld 13: Therapeutische effect van het immunoglobuline op een Pseudomonas aeruginosa-infectie Bij de in voorbeeld 12 verkregen immunoglobufinen tegen Pseudomonas aeruginosa-stammen werd het 55 therapeutisch effect op een infectie door Pseudomonas aeruginosa op de volgende wijze bepaald. Hierbij werden 10 muizen in elke groep gebruikt.

Elk van de pathogene Pseudomonas aeruginosa-stammen met de immuuntypen 1,2,3,4,5,6 en 7 volgens 17 194910

Fisher werden in hoeveelheden van 1,0-3,0 x 106 intraperitoneaal bij elke muis geïnjecteerd ter opwekking van een Pseudomonas aeruginosa-infectie. Binnen 2-6 uren na de injectie werd het gezuiverde immunoglo-buline tegen elke stam intraveneus bij elke muis geïnjecteerd in een hoeveelheid van 0,1-2 mg per muis en werd het therapeutische effect daarvan nagegaan.

5 In de controlegroep werd in plaats van immunoglobuline 0,5 ml fysiologische zoutoplossing (voor injectiedoeleinden) intraveneus geïnjecteerd. Bij deze proef waren de gebruikte immunoglobulinen: CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534, of een mengsel van deze vier soorten immunoglobulinen in equivalente hoeveelheden ten opzichte van elkaar.

Als gevolg hiervan vertoonde de controlegroep, die alleen een fysiologische zoutoplossing had ontvan-10 gen, een sterfte van 50% of meer binnen 48 uren en 100% na 72 uren terwijl de testgroep, die het overeenkomstige immunoglobuline ontving, een overlevingspercentage van 80% of meer na 72 uren vertoonde. Hieruit kan worden afgeleid dat het immunoglobuline werkzaam is bij de behandeling van infecties, die door pathogene Pseudomonas aeruginosa-stammen met het overeenkomstige immunotype volgens Fisher worden veroorzaakt.

15 Geen enkel immunoglobuline had daarentegen veel effect tegen een infectie, veroorzaakt door pathogene Pseudomonas aeruginosa-stammen met immuuntypen 4 en 5 volgens Fisher.

Anderzijds vertoonde de groep muizen, die een combinatie van vier soorten immunoglobulinen in een gewichtsverhouding 1:1:1:1 hadden ontvangen, dankzij de kruisreactiviteit daarvan een uitstekend therapeutisch effect, zelfs op de typen 4 en 5 volgens de Fisher van Pseudomonas aeruginosa-stammen. Het 20 gecombineerde immunoglobulinepreparaat volgens de onderhavige uitvinding kan dan ook als doeltreffend geneesmiddel worden gebruikt tegen infecties die door Pseudomonas aeruginosa-stammen van alle immuuntypes volgens Fisher worden veroorzaakt. De resultaten van deze proef zijn samengevat in de tabellen 10 en 11.

25 TABEL 10

Immunologisch beschermend effect bij gebruik van immunoglobulinen individueel of in combinatie

Stammen gebruikt voor bereiding Fisher immunotype * Immunologisch beschermd 30 immunoglobuline gebied CFCPA 20215 stam alleen 2 Fishertypen 3,7 CFCPA 60534 stam alleen 6 Fishertypen 3,7 CFCPA 10142 stam alleen 1 Fishertypen 2,1 CFCPA 30720 stam alleen 3 Fishertype 6 35 CFCPA 2021 Sgemengde stam 2,6,1,3 Fishertypen 3, 7, 2,1, 6, 4 en 5 CFCPA 60534 CFCPA 10142 CFCPA 30720 194910 18 TABEL 11 5 5 -:-

Door stam CFCPA 20215 .Immunologische bescherming opgewekt immunoglobuline tegen Fisher-type 3 en

Fisher-type 7_ 10 10__

Door stam CFCPA 60534 opgewekt immunoglobuline 15 15 Door stam CFCPA 10142 Immunologische bescherming opgewekt immunoglobuline tegen Fisher-type 2 en 20 Fisher-type 1_

Door stam CFCPA 30720 _ Immunologische bescherming 20 opgewekt immunoglobuline tegen Fisher-type 6 25 --

Combinatie van de boven- Immunologische bescherming 30 staande 4 soorten immuno-__tegen alle Fisher-typen 1, 25 globulinen_ 2, 3, 4, 5, 6 en 7_

Voorbeeld 14: Therapeutisch effect van de gecombineerde immunoglobulinen op een infectie door Pseudomonas aeruginosa 35 Vier soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosastammen die in voorbeeld 13 waren geselecteerd, dat wil zeggen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534, werden op dezelfde wijze als in de voorbeelden 5, 6 en 7 geïncubeerd en geëxtraheerd ter verkrijging van een gecombineerd preparaat van celwandproteïnen, dat vervolgens op dezelfde wijze als in voorbeeld 13 drie malen met tussenpozen van 1 week en in hoeveelheden van 1,5 tot 2 mg bij een geit werd geënt ter verkrijging van de gecombineerde 40 Pseudomonas aeruginosa-immunoglobulinen in grote hoeveelheid. Deze hoeveelheid werd met een bekende methode gezuiverd (zie Practical Immunology, 3de editie (1989), pag. 292-294).

Ter bepaling van het immunologisch beschermend effect en het therapeutische effect van de op bovenstaande wijze verkregen gezuiverde en gecombineerde immunoglobulinen ten opzichte van pathogene Pseudomonas aeruginosa-stammen van diverse immuuntypes volgens Fisher, werden Pseudomonas 45 aeruginosa-stammen van elk immuuntype in een hoeveelheid van 1,0 tot 3,0 x 106 cellen per muis geënt op een groep muizen (zes groepen, 20 muizen per groep) die vooraf drie maal een injectie met het gecombineerde immunoglobulinepreparaat hadden gekregen, en op een andere groep muizen (zes groepen: 10 muizen per groep) die geen immunoglobulinepreparaat hadden ontvangen, teneinde het immunologisch beschermende effect van het gecombineerde immunoglobuline waar te nemen.

50 Daarnaast werd een andere groep muizen (zes groepen, 10 muizen per groep) eerst geënt met een pathogene Pseudomonas aeruginosa-stam, waarna deze groep na 2 tot 6 uren een intraveneuze injectie met het op bovenstaande wijze verkregen gecombineerde immunoglobulinepreparaat in een hoeveelheid van 0,1 tot 5 g per muis van 20 tot 25 g kregen, ter waarneming van het therapeutisch effect van het immunoglobulinepreparaat volgens de onderhavige uitvinding.

55 Als gevolg daarvan kon worden aangetoond dat het gecombineerde immunoglobulinepreparaat volgens de uitvinding een immunologisch beschermend effect van 80% of meer en een therapeutisch effect van 75% of meer vertoont (bepaald als overlevingsgraad (%) na zeven dagen) terwijl de muizen van alle controle- 19 194910 groepen binnen drie dagen stierven.

Zodoende kan worden vastgesteld dat het gecombineerde immunoglobulinepreparaat volgens de uitvinding bruikbaar is als nuttig geneesmiddel, dat zowel een uitstekend therapeutisch effect als een immunologisch beschermend effect vertoont.

5

Voorbeeld 15: Formulering van de immunoglobulinen

De combinatie van celwandproteïnen, verkregen door incubatie en extractie van vier soorten verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen uit voorbeeld 13, namelijk CFCPA'10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 en CFCPA 60534 op dezelfde wijze als in de voorbeelden 5, 6 en 7, werd op de wijze van voorbeeld 10 14 aan een mannelijke geit toegediend ter verkrijging van het gecombineerde Pseudomonas aeruginosa-immunoglobuline. Dit werd afgescheiden en gezuiverd en daarna onder gebruikmaking van diverse farmaceutisch aanvaardbare dragers geformuleerd, zodanig dat 1-100 mg antilichaam-immunoglobuline per kg lichaamsgewicht kan worden toegediend. Het geformuleerde immunoglobuline werd toegediend aan muizen, die met Pseudomonas aeruginosa waren geïnfecteerd, teneinde de doeltreffendheid van het 15 immunoglobuline in afhankelijkheid van de soort drager voor het immunoglobuline te bepalen. Als resultaat hiervan bleek dat in het geval van een vloeibare formulering het immunoglobulinepreparaat met een fysiologische zoutoplossing voor injectie of een fosfaatbufferoplossing als drager een hoge doeltreffendheid heeft en dat in het geval van een gelyofiliseerde formulering een hoge doeltreffendheid van het immunoglobulinepreparaat kan worden geleverd door het gebruik van mannitol, saccharose of lactose als 20 drager. Anderzijds wordt in een gelyofiliseerde formulering de doeltreffendheid van het immunoglobuline door het gebruik van menselijk albumine naast het Pseudomonas aeruginosa-immunoglobuline volgens de uitvinding verlaagd en wordt een geringe doeltreffendheid bereikt in het geval van een vloeibare formulering door het gebruik van aluminiumhydroxide als farmaceutische drager. De testresultaten zijn verzameld in tabel 12.

25 TABEL 12 --

Doeltreffendheid van Pseudomonas aeruginosa-immunoglobuline in afhankelijkheid van de farmaceutische drager 30 -:-

Soort formulering Bestanddelen doeltreffendheid

Gelyofiliseerde formulering Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + ++++ mannitol (5-20%) 35 Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + +++ lactose (5-20%)

Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + +++ saccharose (5-20%)

Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + ++ 40 menselijk albumine (1-5%)

Vloeibare formulering Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + ++++ fysiologische zoutopl.

Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + ++++ gedestilleerd water voor injectie 45 Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + ++++ fosfaatbufferoplossing

Gezuiverd gecombineerd immunoglobulinepreparaat + ++ aluminiumhydroxide + oplosmiddel 50

Voorbeeld 16: Doeltreffendheid van het geformuleerde immunoglobulinepreparaat Het geformuleerde immunoglobuline met een fosfaatbufferoplossing, dat volgens het testresultaat van voorbeeld 15 een hoge doeltreffendheid levert, werd gebruikt ter bepaling van zijn doeltreffendheid als profylactisch en therapeutisch middel voor een secondaire huidinfectie bij lacerata'es, verbrandingen, 55 verwondingen en dergelijke. Bij een muis werd een brandptek veroorzaakt volgens de brandtestprocedure (zie J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975). Het vloeibare preparaat met 0,5-1 mg gecombineerd Pseudomonas aeruginosa-immunoglobuline per ml fosfaatbufferoplossing werd tot een spoeivloeistof omgezet, die

Claims (9)

194910 20 vervolgens op de brandplek van de muis in de testgroep werd gesproeid ter bepaling van het effect daarvan in vergelijking met het effect bij de controlegroep, die geen behandeling met de immunoglobulinespray ontving. Bij dit experiment bleek dat de met de opgesproeide immunoglobuline-fosfaatbuffer-oplossing besproeide groep muizen een aanmerkelijk hogere overlevingsgraad dan de niet-behandelde groep 5 vertoonde. Hieruit volgt dat het preparaat volgens de uitvinding met Pseudomonas aeruginosa- immunoglobuline een uitstekend beschermend effect en een uitstekend therapeutisch effect op infecties met Pseudomonas aeruginosa uitoefent. De resultaten van dit experiment zijn weergegeven in de volgende tabel 13. 10 TABEL 13 Resultaat van brandtest Behandeling Aantal Enting Overlevingsgraad 15 muizen met Pseu domonas aerugi nosa 20 24 uur 48 uur 72 uur 96 uren of meer Brandplek (behandeld 20 lokale 20/20 19/20 16/20 16/20 met immunoglobuline) enting Brandplek (niet 20 lokale 18/20 4/20 0/20 - 25 behandeld met enting immunoglobuline) Controlegroep 10 geen 10/10 10/10 10/10 10/10 enting 30 Zoals hierboven beschreven is elke verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stam volgens de onderhavige uitvinding in hoge mate veilig, vergeleken met de wilde of pathogene soorten. Aangezien verder de celwandproteïnen daarvan een uitstekende veiligheid, een uitstekend kruisbeschermend vermogen en ook een uitstekend vermogen tot het vormen van neutraliserende antilichamen hebben, kunnen de celwand-35 proteïnen niet alleen worden gebruikt als vaccin voor profylaxe tegen Pseudomonas aeruginosa-infecties, maar ook als een opwekker van antilichamen bij proefdieren teneinde immunoglobulinen te leveren die als therapeutisch middel voor infecties met Pseudomonas aeruginosa kunnen worden gebruikt. Zo blijkt dat de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen volgens de uitvinding zeer nuttige micro-organismen zijn voor het bereiden van een profylactisch vaccin en een therapeutisch middel tegen Pseudomonas 40 aeruginosa-infecties.

1. Verzwakte bacteriestam van Pseudomonas aeruginosa, gekozen uit de stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035, welke verzwakte stammen een LD^ van ten minste 2,0 x 107 cellen in muizen hebben, en verkregen zijn door isolering van Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype uit met Pseudomonas aeruginosa geïnfecteerde patiënten, gevolgd door herhaalde passages door een tussengastheer ter 50 verzwakking van de geïsoleerde stammen.

2. Polyvalent vaccin voor het opwekken van een immuunrespons tegen infecties veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa, welk vaccin een mengsel van celwandproteïnen, afkomstig uit ten minste twee Pseudomonas aeruginosastammen van uiteenlopend immuuntype bevat, welke celwandproteïnen een molgewicht van 10.000 tot 100.000 hebben en nagenoeg geen lipopolysacchariden bevatten, met het 55 kenmerk, dat de celwandproteïnen afkomstig zijn uit ten minste twee verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen, gekozen uit de stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035, en dat deze celwandproteïnen geen « 21 194910 cytoplasmatische bestanddelen bevatten.

3. Polyvalent vaccin volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het een mengsel van celwandprotelnen afkomstig uit de stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031 en KCCM 10034 bevat, waarbij de mengverhouding van deze celwandproteïnen 1:1:1:1 of 1:1:1,5:0,5 of 0,5:1,5:1,5:0,5 5 is.

4. Werkwijze voor het bereiden van een polyvalent vaccin als profylactisch middel tegen infecties veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa, welke werkwijze de volgende stappen omvat a) het kweken van Pseudomonas aeruginosa-stammen van uiteenlopend immuuntype, en het afscheiden van de gekweekte bacteriecellen uit het kweekmedium; 10 b) het inactiveren van de afgescheiden bacteriecellen met een organisch oplosmiddel, dat ook lipide bestanddelen verwijdert; c) het extraheren van de geïnactiveerde bacteriecellen met een geschikt extractiemiddel onder verkrijging van een extract dat celwandproteïnen bevat; d) het fractioneren en zuiveren van het verkregen extract door ultrafiltratie en/of ultracentrifugering onder 15 verkrijging van een specifieke proteïnefractie met een molgewicht tussen 10.000 en 100.000, welke fractie nagenoeg geen lipopolysacchariden bevat; en e) het vermengen van de specifieke proteïnefracties, afkomstig uit ten minste 2 van de gebruikte Pseudomonas aeruginosa-stammen; met het kenmerk: - dat de in stap (a) gebruikte stammen zijn gekozen uit de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-20 stammen met toelatingsnummers KCCM 10029, KCCM 10030, KCCM 10031, KCCM 10032, KCCM 10033, KCCM 10034 en KCCM 10035; en - dat stap (c) onder zodanig milde condities wordt uitgevoerd, dat de celwanden van de bacterie niet openbreken, zodat een extract zonder cytoplasmatische bestanddelen wordt verkregen.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het extract tijdens of na stap (c) wordt geïnspec-25 teerd ter vaststelling of de cellen van het micro-organisme al dan niet zijn opengebroken, en wel door de aanwezigheid van lactose-dehydrogenase of hexokinase als cytoplasmatisch merk-enzym na te gaan.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de verzwakte Pseudomonas aeruginosa-stammen in stap (a) worden gekweekt in een kweekmedium dat 30 g glucose, 15 g pepton, 0,5 g MgS04l 5 g CaC03, 1 g KH2P04, 5 mg FeS04, 5 mg CuS04 en 5 mg ZnS04 per liter bevat.

7. Geneesmiddel tegen infecties veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa, welk geneesmiddel ten minste twee soorten immunoglobuline bevat, die specifiek tegen Pseudomonas aeruginosa-stammen werken, met het kenmerk, dat de immunoglobulinen tezamen zijn verkregen uit een geschikte gastheer die ter verkrijging van een immuunrespons met het vaccin volgens conclusie 2-3 of het met de werkwijze van conclusie 4-6 verkregen vaccin is geënt.

8. Geneesmiddel volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het immunoglobulinen tegen elk immuuntype van de Pseudomonas aeruginosa-stammen, overeenkomend met de immuuntypen 1 tot 7 volgens Fisher-Devlin, bevat.

9. Geneesmiddel volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk, dat het verkeert in een farmaceutische toedieningsvorm zoals een injectiepreparaat, tabletten, capsules, oogdruppels, een verstuifbaar middel of 40 een zalf, en voorzover nodig een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat. Hierbij 2 bladen tekening