CN1086588C - 假单胞菌活性蛋白及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种假单胞菌活性蛋白及其生产方法。它由微粒蛋白、内毒素蛋白、粘液蛋白、类毒素蛋白所组成，采用绿脓假单胞菌1、2、3、4、5、6、11、血清型标准菌种和嗜麦芽假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、产硷假单胞菌冻干标准菌株，共11个假单胞菌，分离提取微粒蛋白、外毒素的类毒素和内毒素蛋白(OEP)，用这些具有良好免疫活性组分(抗原成分)合成——假单胞菌活性蛋白。本产品预防和治疗慢性肺心病肺部感染和各种假单胞菌感染，显示出高效和特异性，无耐药性，使用安全，无副作用。
Description
假单胞菌是广泛存在于自然的一种见的低毒致病菌，常称为条件致病菌(Opportunisticor conditioned pathogen)，对本菌的易感者与其机体免疫功能低下有密切关系，如免疫缺损、恶性肿瘤联合化疗患者，应用免疫抑制剂、组织移植、大手术、泌尿系感染、大面积烧伤等均可合并本菌感染，常导致败血症和死亡。近几年来假单胞菌发病率有所增加，由于本菌具有天然耐药性，相当部分菌株产生β-内酰胺酶，对抗生素耐药，因此对已感染者或可能受感染的假单胞菌易感者，应用特异性免疫预防和治疗代替化学疗法或作为抗生素治疗的辅助药物当今受到极大重视，特别用细菌提取物作特异性自动免疫以预防感染是行之有效的最好方法。
假单胞菌是慢性肺心病肺部感染病情加重和死亡原因之一，由其引起的院内感染并有逐年上升趋势，死亡率高达50％。在抗生素高速发展的年代，假单胞菌的发病率和死亡率仍有增无减，说明临床对本病的治疗仍有一定困难。呼吸系统绿脓假单胞菌发病率占30～50％，其他假单胞菌占40～70％，且对抗生素有高度的适应性和耐药是本病感染延续时间长和难治的主要原因。有关假单胞菌治疗药物研究，目前可用于治疗的药物包括生物提取、化学合成、结构改造的抗生素近300多种，这些药物均有一定疗效，但药理作用可受多种因素影响，使药物的抗菌作用发挥受到限制。
本发明的目的在于提供一种抗假单胞菌的特异性防治药物，而能彻底解决对肺心病假单胞菌预防和治疗之假单胞菌活性蛋白及其生产方法。
本发明的组成成分及各成分的比例(重量比)为：微粒蛋白40％、内毒素蛋白20％、粘液蛋白20％、类毒素20％。其生产方法为：分别取用11种不同假单胞菌第三代20小时液体培养物，12000转/分4℃连续离心，取沉淀，用0.1M Tris·Hcl，pH7.2，1mM EDTA洗三遍，再用上述液体溶解沉淀物，在冰浴中加入新鲜配制的溶菌酶<溶菌酶活力>25000)，轻轻摇匀，在零度下作用20～30分钟，将此菌悬液置-30℃，反复冻融三次，使菌体完全裂解，用胶体磨悬磨二次，每次10分钟，4℃离心，3000转/分，30分钟，弃沉淀(菌体残渣)，取上清，加入5％硫酸铝钾，放4℃过夜，次日取出，4℃离心，5000转/分，30分钟，取沉淀，悬于pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)中常温透析24小时，取透析物——微粒蛋白。
用上述第三代培养物经离心后的上清液，用蔡司氏漏斗除菌过滤，取滤液加入5％硫氰酸钾，边加边搅，室温静置2小时，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃过夜，次日取出，4℃离心，12000转/分，取沉淀，加0.03N-NaOH的95％乙醇溶解沉淀物，35℃静置16小时(把内毒素中的脂肪酸去掉，并使内毒素脱毒)，转置于PBS pH6.8中，4℃低温透析24小时(样品与透析液比例为1∶50)，连续换水三次，置4℃冰箱备用——内毒素蛋白(OEP)。
取假单胞菌第三代24小时液体培养物，15000转/分，4℃连续离心，弃沉淀取上清，用0.3um的醋酸纤维膜过滤，收集滤液，放冷库冷冻至1-2℃，加入硫氰酸钾(先配成溶液)，边加边搅，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃冰库过夜，12000转/分，4℃连续离心，弃上清，取沉淀，加入预冷95％乙醇，充分溶解沉淀物，4℃离心3000转/分，弃沉淀取上清，用0.1N NaOH调至pH5.5，4℃离心，3000转/分，30分钟，弃上清，取沉淀，置PBS pH6.8，4℃透析24小时(样品与PBS比例为1∶100)——粘液蛋白。
取假单胞菌第三代24小时液体培养物，15000转/分，4℃连续离心，弃沉淀取上清，用蔡氏漏斗加滤纸板除菌过滤，收集滤液，加5％硫氰酸钾，边加边搅，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃冰库过夜，取出，12000转/分，4℃连续离心，加入预冷95％乙醇，充分溶解沉淀物，用0.1N NaOH调至pH7.8，4℃离心，5000转/分30分钟，弃上清，取沉淀，置于含有4％福尔马林和0.3M L-赖氨酸的0.1M Tris·Hcl缓冲液(pH8.0)中透析，于37℃透析4天脱毒，再于pH8.0，0.1MTris·Hcl缓冲液中，4℃透析24小时(换液三次)，以除去福尔马林，取透析物——外毒素的类毒素。
下面结合实施例对本发明作详细描述。
分别取出11种不同假单胞菌第三代20小时液体培养物20升，12000转/分4℃连续离心，取沉淀，用0.1M Tris·Hcl，pH7.2，1mM EDTA洗三遍，再用上述液体1000ml溶解沉淀物，在冰浴中加入新鲜配制的溶菌酶800～1000mg<溶菌酶活力>25000)，轻轻摇匀，在零度下作用20～30分钟，将此菌悬液置-30℃，反复冻融三次，使菌体完全裂解，用胶体磨悬磨二次，每次10分钟，4℃离心，3000转/分，30分钟，弃沉淀(菌体残渣)，取上清，加入5％硫酸铝钾100ml，放4℃过夜，次日取出，4℃离心，5000转/分，30分钟，取沉淀，悬于pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)中常温透析24小时，取透析物——微粒蛋白。得微粒蛋白1200mg。
用上述第三代培养物经离心后的上清液，用蔡司氏漏斗除菌过滤，取滤液加入5％硫氰酸钾2000ml，边加边搅，室温静置2小时，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃过夜，次日取出，4℃离心，12000转/分，取沉淀，加0.03N-NaOH的95％乙醇600ml溶解沉淀物，35℃静置16小时(把内毒素中的脂肪酸去掉，并使内毒素脱毒)，转置于PBS pH6.8中，4℃低温透析24小时(样品与透析液比例为1∶50)，连续换水三次，置4℃冰箱备用——内毒素蛋白(OEP)，得内毒素蛋白760mg。
取假单胞菌第三代24小时液体培养物20升，15000转/分，4℃连续离心，弃沉淀取上清，用0.3um的醋酸纤维膜过滤，收集滤液，放冷库冷冻至1-2℃，加入硫氰酸钾(先配成溶液)，边加边搅，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃冰库过夜，12000转/分，4℃连续离心，弃上清，取沉淀，加入预冷95％乙醇1000ml，充分溶解沉淀物，4℃离心3000转/分，弃沉淀取上清，用0.1N NaOH调至pH5.5，4℃离心，3000转/分，30分钟，弃上清，取沉淀，置PBS pH6.8，4℃透析24小时(样品与PBS比例为1∶100)——粘液蛋白。得粘液蛋白1030mg。
取假单胞菌第三代24小时液体培养物20升，15000转/分，4℃连续离心，弃沉淀取上清，用蔡氏漏斗加滤纸板除菌过滤，收集滤液，加5％硫氰酸钾1850ml，边加边搅，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃冰库过夜，取出，12000转/分，4℃连续离心，加入预冷95％乙醇1000ml，充分溶解沉淀物，用0.1N NaOH调至pH7.8，4℃离心，5000转/分30分钟，弃上清，取沉淀，置于含有4％福尔马林和0.3M L-赖氨酸的0.1M Tris·Hcl缓冲液(pH8.0)中透析，于37℃透析4天脱毒，再于pH8.0，0.1M Tris·Hcl缓冲液中，4℃透析24小时(换液三次)，以除去福尔马林，取透析物——外毒素的类毒素。得外毒素的类毒素812mg。
该方法制得的假单胞菌活性蛋白组合比例：微粒蛋白0.4gm，内毒素蛋白0.2gm，粘液蛋白0.2gm，类毒素0.2gm。合并后用PBS 1000ml(pH6.8)稀释分装成1mg/ml或2mg/ml供皮下或肌肉注射。
本发明不限于上述一个实施例。
应用本品防治肺心病肺部和各种假单胞菌感染，自动免疫效果非常理想，显示出高效和特异性，活性蛋白稳定性好，反复服用无耐药性，使用安全，无副作用。
Claims (2)
1、一种假单胞菌活性蛋白，其特征为它的组成成分及各成分的比例(重量比)为：微粒蛋白40％、内毒素蛋白20％、粘液蛋白20％、类毒素20％。
2、一种假单胞菌活性蛋白之生产方法，其特征为：
A.分别取用11种不同假单胞菌第三代20小时液体培养物，12000转/分4℃连续离心，取沉淀，用0.1M Tris·Hcl，pH7.2，1mM EDTA洗三遍，再用上述液体溶解沉淀物，在冰浴中加入新鲜配制的溶菌酶活力为25000的溶菌酶，轻轻摇匀，在零度下作用20～30分钟，将此菌悬液置-30℃，反复冻融三次，使菌体完全裂解，用胶体磨悬磨二次，每次10分钟，4℃离心，3000转/分，30分钟，弃沉淀，取上清，加入5％硫酸铝钾，放4℃过夜，次日取出，4℃离心，5000转/分，30分钟，取沉淀，悬于pH7.2磷酸盐缓冲液中常温透析24小时，取透析物——微粒蛋白；
B.用上述第三代培养物经离心后的上清液，用蔡司氏漏斗除菌过滤，取滤液加入5％硫氰酸钾，边加边搅，室温静置2小时，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃过夜，次日取出，4℃离心，12000转/分，取沉淀，加0.03N-NaOH的95％乙醇溶解沉淀物，35℃静置16小时，把内毒素中的脂肪酸去掉，并使内毒素脱毒，转置于PBS pH6.8中，4℃低温透析24小时，样品与透析液比例为1∶50，连续换水三次，置4℃冰箱备用——内毒素蛋白；
C.取假单胞菌第三代24小时液体培养物，15000转/分，4℃连续离心，弃沉淀取上清，用0.3um的醋酸纤维膜过滤，收集滤液，放冷库冷冻至1-2℃，加入先配成溶液的硫氰酸钾，边加边搅，用1N盐酸调至pH3.0，放4℃冰库过夜，12000转/分，4℃连续离心，弃上清，取沉淀，加入预冷95％乙醇，充分溶解沉淀物，4℃离心3000转/分，弃沉淀取上清，用0.1N NaOH调至pH5.5，4℃离心，3000转/分，30分钟，弃上清，取沉淀，置磷酸盐缓冲液pH6.8，4℃透析24小时，样品与磷酸盐缓冲液比例为1∶100——粘液蛋白；
D.取假单胞菌第三代24小时液体培养物，15000转/分，4℃连续离心，弃沉淀取上清，用蔡氏漏斗加滤纸板除菌过滤，收集滤液，加5％硫氰酸钾，边加边搅，用1N盐酸调至PH3.0，放4℃冰库过夜，取出，12000转/分，4℃连续离心，加入预冷95％乙醇，充分溶解沉淀物，用0.1N NaOH调至pH7.8，4℃离心，5000转/分30分钟，弃上清，取沉淀，置于含有4％福尔马林和0.3M L-赖氨酸的pH8.0的0.1M Tris·Hcl缓冲液中透析，于37℃透析4天脱毒，再于pH8.0，0.1MTris·Hcl缓冲液中，4℃透析24小时，换液三次，以除去福尔马林，取透析物——外毒素的类毒素；
E.由假单胞菌微粒蛋白、粘液蛋白、内毒素蛋白、外毒素的类毒素按一定比例合并，组成假单胞菌活性蛋白。
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