CN105695539A - 一种细菌外毒素抗原灭活的方法 - Google Patents

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Abstract

<b>本发明涉及一种细菌外毒素抗原的灭活方法，其特征在于：（</b><b>1</b><b>）菌株的传代及扩增，（</b><b>2</b><b>）发酵罐培养，（</b><b>3</b><b>）外毒素的分离和纯化，（</b><b>4</b><b>）外毒素的灭活，（</b><b>5</b><b>）类毒素的纯化。本发明采用福尔马林、赖氨酸和双氧水共同作为脱毒剂，能在更短的时间内使外毒素脱毒完全，提高脱毒效率，更大程度的保留类毒素的免疫原性，具有脱毒效果可靠，对外毒素结构影响小，可广泛应用于细菌外毒素脱毒制备类毒素抗原的特点。</b>

Description

一种细菌外毒素抗原灭活的方法
技术领域
本发明涉及一种外毒素抗原灭活的方法，特别是涉及一种细菌外毒素抗原灭活的方法，属于生物技术领域。
背景技术
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。铜绿假单胞菌分泌的外毒素A(ExoA)是最重要的致病、致死性物质，进入敏感细胞后被活化而发挥毒性作用，使哺乳动物的蛋白合成受阻并引起组织坏死，造成局部或全身疾病过程。动物模型表明给动物注射外毒素A后可出现肝细胞坏死、肺出血、肾坏死及休克等，如注射外毒素A抗体则对铜绿假单胞菌感染有保护作用。铜绿假单胞菌尚能产生蛋白酶，有外毒素A及弹性蛋白酶同时存在时则毒力最大;胞外酶S是铜绿假单胞菌所产生的一种不同于外毒素A的ADP核糖转移酶，它可以破坏细胞骨架，从而促进铜绿假单胞菌的侵袭扩散，感染产此酶的铜绿假单胞菌患者，可有肝功能损伤而出现黄疸。此外，如碱性蛋白酶、磷酸酶、细胞毒素等铜绿假单胞菌外毒素亦常是造成组织破坏、细菌散布的重要原因。
外毒素的灭活包括物理作用灭活和化学作用灭活，物理作用灭活：1加热灭活，使蛋白质变性从而使病原体失去传染性，但处理后抗原有效成分也可能失活；2紫外线灭活，存在灭活程度不完全，且病原体有光复活的可能。灭活方式应用较多的是化学作用灭活，灭活剂包括福尔马林、丙酮、苯酚、β-丙内酯(β-propiolactone，BPL)、乙烯亚胺(ethylenimine)、双乙烯亚胺(binaryethylenimine，BEl)、磷酸三丁酯、乙醇、硫柳汞等。细菌外毒素灭活最常采用的是福尔马林灭活，但单用福尔马林脱毒对于某些细菌外毒素存在脱毒时间长，脱毒效果不完全等缺点。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，给出新的一种细菌外毒素抗原灭活的方法。本发明采用福尔马林、赖氨酸和双氧水共同作为脱毒剂，其能在更短的时间内使外毒素脱毒完全，提高脱毒效率，更大程度的保留类毒素的免疫原性。具有脱毒效果可靠，对外毒素结构影响小，可广泛应用于细菌外毒素脱毒制备类毒素抗原。
本发明给出的技术方案是：这种细菌外毒素抗原灭活的方法，其特征在于有以下步骤：
（1）菌株的传代及扩增
（2）发酵罐培养
（3）外毒素的分离和纯化
（4）外毒素的灭活
（5）类毒素的纯化。
所述步骤（1）菌株的传代及扩增：将铜绿假单胞菌从2~8℃保存的NA斜面接种至新鲜的NA斜面，37℃培养1天。从培养获得的血平板上挑菌落接种至含有发酵培养基的摇瓶中，100~300r/min，32~35℃培养1~2天。从培养获得的摇瓶取样用分光光度计法检测获得的种子液菌浓，经革兰氏染色镜检合格后用于发酵罐培养。
所述步骤（2）发酵罐培养：发酵培养基的组成，牛肉提取物9~17g/L，细菌学蛋白胨17~26g/L，谷氨酸钠6~12g/L，NaCl3~8g/L，甘油4~15ml/L，葡萄糖1~4g/L，将牛肉提取物和细菌学蛋白胨按比例配制成基础培养基，经1kd膜包超滤浓缩，当膜下液收集3~10%发酵液体积时，停止浓缩，按前述比例加入谷氨酸钠，氯化钠，葡萄糖，再经高压蒸汽灭菌的0.2+0.1μm孔径套筒滤器过滤除菌，将上述甘油115~121℃湿热灭菌15~30min后加入上述发酵液中。发酵罐培养：将发酵培养基加入发酵罐中，调节温度至30~35℃，搅拌转速为250~450rpm，pH7.2~7.4，通风6~12L/min，待发酵条件稳定后向发酵罐内加入种子液，设置溶氧与通气量偶联，设定溶氧量为10~30%，培养至对数生长期后再继续培养2~6小时，发酵结束，下罐放料。
所述步骤（3）外毒素的分离和纯化：将发酵液经800~14000rpm于4℃条件下离心15~30min，收获上清液，上清液经0.45+0.2um孔径套筒滤器过滤澄清。
所述步骤（4）外毒素的灭活：按如下比例加入脱毒剂，赖氨酸15~20g/L，福尔马林0.1~0.5%；H2O20.1~0.3%的比例加入澄清液中，调节PH为7.6~8.4，温度32~35℃，脱毒12~36小时。
所述步骤（5）类毒素的纯化：将脱毒液经10kd超滤膜包浓缩至原体积5%~10%，加入纯化水至原体积，经10kd超滤膜包透析浓缩至5%~10%，重复上述步骤2~4次，即获得类毒素抗原。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用福尔马林、赖氨酸和双氧水共同作为脱毒剂，其能在更短的时间内使外毒素脱毒完全，提高脱毒效率，更大程度的保留类毒素的免疫原性。
具体实施方式
实施例1。
菌株的传代及扩增：将铜绿假单胞菌从2~8℃保存的NA斜面接种至新鲜的NA斜面，37℃培养1天。从培养获得的血平板上挑菌落接种至含有发酵培养基的摇瓶中，100~300r/min，32~35℃培养1~2天。从培养获得的摇瓶取样用分光光度计法检测获得的种子液菌浓，经革兰氏染色镜检合格后用于发酵罐培养。
发酵罐培养：发酵培养基的组成，牛肉提取物9~17g/L，细菌学蛋白胨17~26g/L，谷氨酸钠6~12g/L，NaCl3~8g/L，甘油4~15ml/L，葡萄糖1~4g/L，将牛肉提取物和细菌学蛋白胨按比例配制成基础培养基，经1kd膜包超滤浓缩，当膜下液收集3~10%发酵液体积时，停止浓缩，按前述比例加入谷氨酸钠，氯化钠，葡萄糖，再经高压蒸汽灭菌的0.2+0.1μm孔径套筒滤器过滤除菌，将上述甘油115~121℃湿热灭菌15~30min后加入上述发酵液中。发酵罐培养：将发酵培养基加入发酵罐中，调节温度至30~35℃，搅拌转速为250~450rpm，pH7.2~7.4，通风6~12L/min，待发酵条件稳定后向发酵罐内加入种子液，设置溶氧与通气量偶联，设定溶氧量为10~30%，培养至对数生长期后再继续培养2~6小时，发酵结束，下罐放料。
外毒素的分离和纯化：将发酵液经800~14000rpm于4℃条件下离心15~30min，收获上清液，上清液经0.45+0.2um孔径套筒滤器过滤澄清。
外毒素的灭活：按如下比例加入脱毒剂，赖氨酸15~20g/L，福尔马林0.1~0.5%；H2O20.1~0.3%的比例加入澄清液中，调节PH为7.6~8.4，温度32~35℃，脱毒12~36小时。
类毒素的纯化：将脱毒液经10kd超滤膜包浓缩至原体积5%~10%，加入纯化水至原体积，经10kd超滤膜包透析浓缩至5%~10%，重复上述步骤2~4次，即获得类毒素抗原。
本发明使用的菌株为铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa（PA101），来自于中国医科大学附属盛京医院。本公司将铜绿假单胞菌菌株的采集和初步筛选工作委托给中国医科大学附属盛京医院来完成。中国医科大学附属盛京医院负责采集和筛选来自中国华南、东南、西北、西南及东北五个地域的三甲医院临床分离的铜绿假单胞菌。根据《用于PSP疫苗的匹配菌株采集协议》中国医科大学附属盛京医院提供125株铜绿假单胞菌。根据项目研究要求，本公司筛选出1株铜绿假单胞菌作为项目研究原始菌株。

Claims (6)

1.一种细菌外毒素抗原灭活的方法，其特征在于有以下步骤：
（1）菌株的传代及扩增；
（2）发酵罐培养；
（3）外毒素的分离和纯化；
（4）外毒素的灭活；
（5）类毒素的纯化。
2.根据权利要求1所述的细菌外毒素抗原灭活的方法，其特征在于：步骤（1）菌株的传代及扩增是指：将铜绿假单胞菌从2~8℃保存的NA斜面接种至新鲜的NA斜面，37℃培养1天；从培养获得的血平板上挑菌落接种至含有发酵培养基的摇瓶中，100~300r/min，32~35℃培养1~2天；从培养获得的摇瓶取样用分光光度计法检测获得的种子液菌浓，经革兰氏染色镜检合格后用于发酵罐培养。
3.根据权利要求1所述的细菌外毒素抗原灭活的方法，其特征在于：步骤（2）发酵罐培养是指：发酵培养基的组成，牛肉提取物9~17g/L，细菌学蛋白胨17~26g/L，谷氨酸钠6~12g/L，NaCl3~8g/L，甘油4~15ml/L，葡萄糖1~4g/L，将牛肉提取物和细菌学蛋白胨按比例配制成基础培养基，经1kd膜包超滤浓缩，当膜下液收集3~10%发酵液体积时，停止浓缩，按前述比例加入谷氨酸钠，氯化钠，葡萄糖，再经高压蒸汽灭菌的0.2+0.1μm孔径套筒滤器过滤除菌，将上述甘油115~121℃湿热灭菌15~30min后加入上述发酵液中；发酵罐培养：将发酵培养基加入发酵罐中，调节温度至30~35℃，搅拌转速为250~450rpm，pH7.2~7.4，通风6~12L/min，待发酵条件稳定后向发酵罐内加入种子液，设置溶氧与通气量偶联，设定溶氧量为10~30%，培养至对数生长期后再继续培养2~6小时，发酵结束，下罐放料。
4.根据权利要求1所述的细菌外毒素抗原灭活的方法，其特征在于：步骤（3）外毒素的分离和纯化是指：将发酵液经800~14000rpm于4℃条件下离心15~30min，收获上清液，上清液经0.45+0.2um孔径套筒滤器过滤澄清。
5.根据权利要求1所述的细菌外毒素抗原灭活的方法，其特征在于：步骤（4）外毒素的灭活是指：按如下比例加入脱毒剂，赖氨酸15~20g/L，福尔马林0.1~0.5%；H2O20.1~0.3%的比例加入澄清液中，调节PH为7.6~8.4，温度32~35℃，脱毒12~36小时。
6.根据权利要求1所述的类毒素的纯化的方法，其特征在于：步骤（5）类毒素的纯化是指：将脱毒液经10kd超滤膜包浓缩至原体积5%~10%，加入纯化水至原体积，经10kd超滤膜包透析浓缩至5%~10%，重复上述步骤2~4次，即获得类毒素抗原。
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