KR970001703B1 - 약독화 녹농균주 cfcpa 10142를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 - Google Patents

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Description

약독화 녹농균주 CFCPA 10142를 이용한 녹농균 감염 예방 백신

본 발명은 녹농균 감염증 치료제 및 예방용 백신의 제조를 위한 신규한 약독화 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)균주, 특히 약독화 녹농균주 CFCPA 10142의 용도에 관한 것이다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 길이가 1.5 내지 3.0μm이고, 폭이 0.5μm 정도인 간균으로서 1개의 편모를 갖고 있고 운동성이 있는 그람 음성균이며 토양, 물, 하수 및 사람의 장관에 널리 분포되어 있다[Mol.Microbiol. 4, 1069-1075, 1990]. 이러한 녹농균은 패혈증, 전신감염, 만성기도감염증, 췌낭포성 섬유증 등의 난치성 감염을 일으키는 병원성 균이다. 특히 녹농균에 의해 야기되는 패혈증은 수술, 열상 및 외상등에 의해 저항력이 저하된 환자의 혈액중에 미생물 그 자체가 침입하거나 그의 독성 구성성분이 분비됨으로써 유발되는 질병으로 고열, 혈압저하 등의 쇼크를 일으켜 결국 사망에까지 이르게 하는 것으로 알려져있다. 더구나 최근에는 녹농균이 요도감염증에서도 검출되어 더욱 주목을 받게 되었다. 따라서 녹농균에 의해 야기되는 패혈증, 요도감염증 등의 난치성 화농성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제의 개발이 절실이 요구되어 왔다. 그러나, 녹농균은 일부의 항생제를 제외한 상용 항생물질에 대한 내성을 갖고 있을 뿐만 아니라 현재까지도 좋은 효과를 갖는 예방 및 치료제가 개발되어 있지 않은 상태이므로 녹농균 감염으로 인한 치사율이 갈수록 높아지고 있다.

현재까지 개발되어 실용화된 녹농균 감염증에 대한 유일한 치료법은 녹농균에 대한 항독소를 만들어 독소를 중화시키는 방법이다. 그러나, 항독소는 이미 패혈증이 진행된 환자에게만 사용할 수 있는 치료제이며, 예방적인 기능은 없을 뿐만 아니라 가격도 상당히 고가이므로 일반 환자에게 범용적으로 사용할 수는 없다는 단점을 지니고 있다. 또한, 가장 커다란 결점은 이 항독소의 투여를 통해서 치료될 수 있는 완치율이 비교적 낮으며, 부작용 또한 크다는 점이다.

따라서, 최근에는 이러한 항독소 이용방법의 단점을 해소시키는 한가지 방법으로 공통항원을 이용하는 방법이 적극적으로 연구되고 있다. 현재, 녹농균 감염증의 예방 또는 치료를 목적으로 이루어지고 있는 공통항원에 대한 연구는 크게 두가지 분야로 분류할 수 있다. 그중 한가지는 서로 다른 면역형태를 가진 녹농균들로부터 공통항원을 분리 정제하여 녹농균 감염증에 대한 예방 백신용 항원으로 사용하는 방법[Japan, JExp. Med. 45, 355-359, 1975]이며, 다른 한가지 방법은 최근에 급속도로 발전되고 있는 유전공학적 방법에 의해 이 항원을 암호화하고 있는 유전자를 꺼내서 적절한 백터에 재조합시켜 형질발현시킨 후, 공통항원을 대량 생산하여 항원으로 사용하려는 시도이다. 공통항원을 사용한 예방 백신의 개발은 매우 효과적인 접근 방법이기는 하지만, 연구가 진행됨에 따라 최근에 이르러는 이러한 접근방법에 해결해야 할 문제가 많은 것으로 지적되고 있다. 그중 가장 결정적인 단점은 공통항원 한가지만으로 여러가지 면역형태를 가진 녹농균을 모두 예방할 수 없기 때문에 효과가 지극히 낮다는 점이다. 이러한 낮은 효과는 현재까지 밝혀진 공통항원이외에도 어떤 미지의 주요 항원이 같이 존재하여야만 효과적인 예방이 가능할 것이라는 점을 시사하는 것이다.

또 다른 방법으로는 세포융합 기술을 이용하여 녹농균에 대한 마우스 모노클로날 항체[J, Inf, Dis, 152, 1290-1299,1985] 또는 인간 모노 클로날 항체[FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268,1990]를 생산하고, 각 항체중에서 녹농균을 가장 잘 중화시킬 수 있는 항체생산 세포주를 선별하여 이것을 생산 균주로 이용한 대량 샌산을 통해 저가의 치료제를 개발하려 하는 시도가 있다. 그러나 이 방법 역시 항체생산을 통한 녹농균 감염증의 치료에만 목적이 있는 것이지 예방 백신으로 사용하는 것은 아니며, 또한 한 종류의 모노클로날 항체에 의해서만은 현재까지 혈청학적, 면역학적으로 알려진 수십여종의 녹농균에 의한 감염증을 모두 치료할 수는 없기 때문에 감염된 환자 모두를 효과적으로 치료할 수 없다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 서로간의 교차반응성(cross-reactivity)을 조사하여 몇가지의 항체를 동시에 투여하는 방법과 녹농균 감염 환자의 혈액을 채취하여 녹농균의 혈청학적 또는 면역학적 형태를 규명하여 여기에 맞는 모노클로날 항체를 투여하는 방법이 제시되기도 하였으나, 이것 역시 시간이 많이 소요되기 때문에 시간을 다투는 환자의 치료법으로는 부적절하다.

선행기술로는 또한 녹농균주로부터 세포단백질을 분리하여 항원백신으로 사용하는 방법이 제안되어있다.(참조 : Vaccine, vol. 7, Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine 1989]. 그런 이 문헌에 제시된 방법에서는 약독화시키지 않는 NN 170041, NN 170015, Nn 868 및 NN 170046의 4종의 일반균주를 사용하였기 때문에 균주 자체의 독성이 문제가 될 뿐 아니라, 이러한 균주로부터 단백질 성분백신을 제조하는 과정에서도 세포의 파쇄가 일어나 세포질내에 존재하는 이종의 핵산 도는 유독성 고분자 물질인 리포폴리사카라이드(PLS)등의 불순물이 백신 성분내에 혼재하게 되므로 사용시 상당히 주의를 기울여야 하는 단점이 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 녹농균 자체의 고유한 독성의 위험은 없으면서 인체의 투여시에 효과적으로 녹농균에 대한 항체의 형성을 유발함으로써 우수한 면역원성(즉, 항원성) 작용을 나타낼 수 있는 수단을 찾기 위해 광범한 연구를 수행하였다. 그 결과, 녹농균-감염환자로부터 분리된 녹농균을 피셔 면역형태에 따라 구분하여, 이들은 각각 반복 순화시킴으로써 약독화시키면, 그의 세포벽 단백질이 녹농균 감염 예방용 백신의 제조에 유용한 신규의 안전한 약독화 녹농균주가 수득됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 녹농균 자체의 독성은 없으면서 그의 세포벽 단백질이 항원성만을 나타내도록 약독화시킨 신규의 안전한 녹농균주, 특히 녹농균에 감염된 환자로부터 녹농균주를 분리하여, 이들 분리된 미생물을 피셔-데블린 면역형태(Fisher-Devilin Immunotype)에 따라 7종의 형태로 구분한 후, 이중 피셔 면역형 타입 1에 해당하는 미생물만을 선택하여 이를 실험동물에 반복적으로 주입하여 순화시켜 가장 약독화된 균주를 선별함으로써 수득되는 안전한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따르는 상기한 바와같이 약독화된 안전한 녹농균주 CFCPA 10142로부터 순수하게 분리하여 정제한 세포벽 단백질은 그 자체로 녹농균 감염 예방용 백신으로 사용할 수 있거나, 또는 이러한 세포벽 단백질에 의해 동물체내에서 유도된 항체 면역글로부린은 녹농균 감염증 치료제로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 녹농균 감염증 치료제 및 녹농균 감염 예방용 백신의 제조를 위한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142의 용도에 관한 것이다.

녹농균의 피셔-데블린 면역형태는 타입 1로부터 7까지의 7종으로 구분되는데 본 발명에서는 이들 7중의 녹농균중에서 타입 1의 녹농균이 가장 빈번하게, 약 21% 이상의 감염환자의 혈액으로부터 검출된다는 사실에 기초하여 이 균주를 대상균주로 선택하였다.

본 발명에 따르는 안전한 약독화 녹농균주는 녹농균에 감염된 것으로 판정된 환자의 혈액으로부터 피셔 면역형태의 타입 1에 해당하는 녹농균주를 순수하게 분리하여 반복적인 순화과정을 통해 약독화시킴으로써 수득된다. 이렇게 하여 수득되는 안전한 약독화 녹농균주는 균주 CFCPA 10142로 명명한다.

이러한 반복한 순화과정에 의해 수득되는 약독화 녹농균주 CFCPA 10142는 형태학적이나 균학적 성질 등의 여러면에서 약독화시키기 전의 모 균주와 거의 동일하나, 모 균주가 가지고 있던 병원성은 나타내지 않으면서 오히려 녹농균 감염에 대한 항원적 성질을 새로이 나타내므로 신규의 균주인 것으로 분류된다. 따라서 균주 CFCPA 10142는 1993년 5월 12일자로 국제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국 미생물보존센터에 기탁하여 KCCM 10029의 기탁번호를 부여 받았다.

이와같이 약독화 녹농균주를 수득하는 순화과정을 일반적으로 균주가 목적하는 LD₅₀치를 나타낼때까지 반복수행하는데, 그 반복횟수는 조작하는 기술자나 모균주의 독성상태 등에 따라 다르지만 바람직하게는 3 내지 7회 반복수행한다. 이렇게 하여 수득되는 본 발명에 따르는 신규한 약독화 녹농균주의 LD₅₀치는 2.0×10⁷세포 이상, 바람직하게는 7.6×10⁷세포 이상이 된다.

또한 본 발명은 녹농균 감염증 치료제 및 녹농균 감염 예방용 백신의 제조에 있어서 신규한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142의 용도를 제공한다.

본 발명에 따라 약독화된 녹농균주 CFCPA 10142는 다양한 크기의 발효조에서 최적 생장조건을 유지한 상태로 배양하여 다량의 균체를 수득하고, 이어서 수득한 균체를 유기용매 처리 및 추출, 분자량 크기에 따른 분리, 초원심분리 등의 일련의 과정에 따라 처리함으로써 세포벽 단백질을 수득한 후, 통상의 백신제의 제조방법에 따라 처리하여 녹농균 예방 백신제를 제조할 수 있다.

이하에서는 상기 언급한 백신 조성물의 제조방법을 더욱 상세히 설명한다.

우선 1단계에서는 본 발명에 따른 약독화된 피셔 타입 1의 녹농균주 CFCPA 10142를 적절한 크기의 배양기내에 배양한다. 이때 배지로는 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)를 사용하거나, 특히는 상기와 같은 녹농균주의 배양에 적합하도록 구성된 특수 배지를 사용한다.

이 특수배지는 클루코즈(30g/), 펩톤(15g/), MgSO₄(0.5g/), CaCO₃(5g/), KH₂PO₄(1g/), FeSO₄(5mg/), CuSO₄(5mg/) 및 ZnSO₄(5mg/)로 구성된다. 이 특수 배지는 녹농균주의 배양에 적합하도록 본 발명자들에 의해 특별히 고안된 것이다. 이들 녹농균주는 특수배지에 배양하면 트립틱 소이 브로스 배지에 배양하였을 때에 비해 건조 균체의 중량을 기준하여 적어도 30% 이상 높은 건조균체를 수득할 수 있으므로 특수배지를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

이러한 균체 배양단계에서 최적 배양 조건은 온도 37℃, 통기량 1vvm(volume/volume. minute), 접종량은 배양배지액5(v/v)%로 하는 것이며, 초기 2시간은 교반속도를 100rpm으로 하고, 그 후에는 600rpm으로 하여 10 내지 20시간, 바람직하게는 12 내지 16시간 동안 배양한다.

배양이 완료되면, 제2단계로 배양액으로부터 침전된 세포를 원심분리 등의 방법에 의해 분리된다. 분리한 세포를 제3단계에서는 유기용매로 처리하여 미생물을 불활성화시키는 동시에 세포벽 지질 성분을 제거한다. 이때 유기용매로 바람직하게는 아세톤, 클로르포름, 에탄올, 부탄올 등이 사용되며, 가장 바람직하게는 아세톤이 사용된다.

계속해서, 제4단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 하면서 5 내지 6회 반복해서 세포벽 단백질을 추출한다. 이를 위해서는 미생물 세포를 인산염완충액, 트리스염 완충액 등의 용매, 바람직하게는 인산염 완충액중에서 정치시키거나 믹서(mixer) 또는 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 추출한다. 추출과정은 4℃에서 100 내지 2000rpm으로 교반하여 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 제4단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 주의하여야 하며, 이는 목적하는 세포벽 단백질에 세포질내의 유독성 단백질이 혼입되는 것을 방지하기 위해서이다. 따라서, 추출과정중에 세포질내 표자효소인 락테이트 데하이드로게나제 또는 헥소키나제를 측정함으로써 세포의 파쇄여부를 계속 확인하는 것이 필요하다.

이렇게 하여 상등액으로 수득되는 약독화 녹농균주의 세포벽 단백질은 1차 및 2차 한외여과하여 분자량이 10,000 내지 100,000 범위의 단백질만이 수득되도록 분획화시킨다. 이때 세포벽 단백질의 분자량 범위가 10,000 내지 100,000이 되도록 하는 것은 매우 중요한데, 이는 분자량이 10.000 미만이면 동물실험에 의해 밝혀진 것으로 목적하는 항원적 성질이 나타나지 않으며 분자량이 100,000보다 큰 범위에서는 고분자량의 리포폴리사카라이드(LPS)의 존재로 인해 독성이 야기될 수 있기 때문이다.

분리된 분자량 범위 10,000 내지 100,000의 세포벽 단백질 분획은 다시 초원심분리(ultracentrifuge)하여 잔존할 수 있는 미량의 독성 리포폴리사카라이드를 제거한 후에 멤브레인 필터 등을 사용하여 제균시켜 최종적으로 약독화 녹농균 세포벽 단백질을 수득한다.

이렇게 하여 수득된 약독화 녹농균주로부터의 세포벽 단백질을 단독으로 또는 다른 피셔 면역형태의 녹농균주에 의해 수득된 상응하는 세포벽 단백질과의 일정비율의 혼합물로 하여 백신으로 사용한다.

녹농균 감염 예방 백신으로 사용시에 사용용량은 녹농균의 감염이 우려되는 투여 대상의 성별, 연령, 체중, 건강상태 등에 따라 달라지지만, 일반적으로는 균체의 건조중량 0.1 내지 0.5g(습윤중량 0.5g 내지 2.5g에 해당)으로부터 수득되는 세포벽 단백질을 투여하며, 이 양은 일반적으로 0.5 내지 2.5mg이다. 투여경로는 바람직하게는 근육내 투여한다.

상기한 바와같은 단계에 따라 순수하게 분리된 약독화 녹농균의 세포벽 단백질은 또한 녹농균 감염증에 대한 치료제의 제조에 이용될 수도 있다. 즉, 이러한 세포벽 단백질을 항원으로 하여, 양, 토끼 염소 등의 실험동물에게 접종하여 항체 형성을 유도한 후, 실험동물로부터 채혈하여 혈청을 분리한다. 분리된 혈청을 공지의 방법으로 처리하여 목적하는 면역글로부린을 정제된 형태로 수득한다. 이때, 혈청으로부터 면역글로부린을 정제하여 분리하는 방법을 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 수행하며,[참조: Practical Immunology, 3rd Ed., pp 292-294] 예를들면 분리된 혈청을 증류수와 혼합하여 DEAE-셀룰로즈에 가하여 흡착시킨 후, 상등액을 버리고 면역글로부린이 흡착된 DEAE-셀룰로즈를 인산염 완충액으로 수회 반복 세척하여 정제된 면역글로부린을 수득할 수 있다. 이렇게 하여 수득한 면역글로부린은 단독으로 사용할 수 있다. 그러나 필요에 따라, 본 발명의 약독화 균주 CFCPA 10142로부터 수득한 세포벽 단백질은 다른 면역형태의 녹농균 균주의 세포벽 단백질과 일정비율로 혼합하여 동물을 면역시킴으로써 유도된 면역 글로부린을 녹농균 감염증에 대한 치료제로 사용할 수도 있다.

투여용량은 녹농균에 감염된 환자의 연령, 체중, 성별, 건강상태 및 녹농균 감염증의 중증도에 따라 광범하게 변화하지만, 일반적으로 성인 체중 kg당 1일 0.5mg 내지 1000mg, 바람직하게는 5mg 내지 100mg을 정맥내 투여한다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시에에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

녹농균 감염 환자로부터 피셔 면역형 타입 1의 녹농균의 분리 및 동정

녹농균 감염증 환자들로부터 채혈된 서로 상이한 260종의 혈액을 각각 약 1 내지 5ml씩 무균적으로 분양받아 실온에서 1시간 정도 방치한 후, 4℃의 냉장고에서 밤새 보관한 다음 4℃에서 1500g으로 10분간 원심분리하여 고형물을 제거하고 상등액으로 혈청을 수득하였다. 미리 준비된 1.0 내지 1.5% 아가(agar)를 첨가한 트립틱 소이 브로스 배양평판에 상기에서 얻어진 혈청을 인산염 완충용액(당 Na₂HPO₄1.15g, KCl 0.2g, KH₂PO₄0.2g, NaCl 8.766g)으로 1:10의 비로 희석하여 각각을 도말한 후, 37˚로 유지되는 호기성 조건의 배양기에서 12시간 이상 배양하였다. 이렇게 하여 수득된 배양물을 새로운 배양 평판에 옮겨서 공지의 미생물 순수분리방법[참조:Biology of Microorganisms]을 사용하여 미생물을 순수한 형태로 분리하였다.

분리된 녹농균들의 혈청학적, 면역학적 분류는 이미 알려져 있으며(참조:Bergey's Manual), 시판되고 있는 분석키트를 이용하여 다음과 같은 분석방법으로 동정한다[J.Gen.Microbiol. 130,631-644, 1984]. 트립틱 소이 브로스 5ml를 시험관에 넣고 각각의 균을 접종한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건하에서 배양하여 600nm에서의 흡광도가 대략 2.0 이상이 유지되도록 균체농도를 조절하였다. 이 배양액 1ml를 무균적으로 분취하여 4℃에서 6000g으로 10분간 원심분리한 후, 상층의 배양액을 제거하고 침전된 미생물에 동량의 멸균 식염수를 가하여 현탁시켰다. 준비된 96-웰 마이크로플레이트에 시험혈청 및 대조혈청(정상토끼혈청) 15μl씩을 각각 가한후, 각 혈청에 상기에서 수득된 미생물 현택약 15μl씩을 가하여 혼합시키고 10 내지 30분 사이에 응집반응(agglutination)이 일어나는지 여부를 관찰하였다. 여기에서 양성의 응집반응이 일어나는 웰의 균주는 거기에 첨가한 혈청과 일치되는 혈청학적 형태(Serotype)를 가지는 것이므로 쉽게 구별할 수 있다.

실시예 2

분리된 녹농균으로부터 약독화된 미생물의 선별

녹농균을 백신 제조에 사용될 수 있는 안전한 미생물로 약독화시키기 위해서 타입 1의 면역형태를 가진 미생물을 반복적인 순화를 통해서 약독화시켰다. 이때 대조군으로 사용되는 독성 녹농균은 NG 11189(일본의 Episome Institute로부터 구입)를 선택하였으며, 후 11189은 2.0×10⁶세포를 체중 20 내지 25g의 수컷 ICR 생쥐에 정맥(또는 복강)을 통해서 주입하게 되면 3일 이내에 100%의 치사율을 나타낸다.

선택된 타입 1의 면역형태를 갖는 녹농균(LD₅₀1.5×10⁶)을 트립틱 소이 브로스 내에서 실시예 1에서와 동일한 조건하에 액체 배양한 후, 4℃에서 6000g으로 10분간 원심분리한다. 수득된 세포 침전물을 생리 식염수 10ml에 현탁시켜 상기와 동일한 조건으로 재원심분리한 후, 신선한 생리식염수로 ml당 5×10⁵, 5×10⁶,5×10⁷및 5×10⁵, 세포가 되도록 적절히 희석하여 각각의 세포들을 한 그룹당 10마리씩의 생쥐에어 정맥(또는 복강을 통해)투여하였다. 이때 대조군에게는 GN 11189 균주 2.0×10⁶세포만을 투여하였으며, 3일 이내 모두 100% 치사율을 보이는 시점에서 가장 높은 균체 농도에서 생존한 ICR 생쥐로부터 녹농균을 다시 무균적으로 분리하였다. 분리한 녹농균을 다시 트립틱 소이 아가 평판배지에 도말하여 상기에 언급한 미생물 순수 분리방법을 사용하여 각각의 미생물을 순수하게 분리하였다.

상기와 같이 생쥐를 통해 1차 약독화시킨 미생물을 재차 상기와 동일한 방법으로 3 내지 7회 반복 투여하여 LD₅₀이 적어도 2.0×10⁷세포 이상이 되도록 반복해서 처리하였다. 여기에서 수득된 약독화 균주의 LD₅₀은 7.6×10⁷세포이상으로 측정되었다. 이렇게 해서 안전하게 약독화된 미생물 균주를 CFCPA 10142(기탁번호:KCCM 10029)로 명명하였다.

실시예 3

약독화된 녹농균주의 생리학적 특성

(1) 실시예2에서 수득한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142에 대해 pH 변화에 따른 성장속도를 측정하였다. 우선, 균주 CFCPA 10142를 pH 7.2로 유지된 트립틱 소이 브로스 50ml에 접종하여 37℃에서 200rpm의 호기성 조건을 유지하면서 12 내지 16시간 동안 전배양하였다. 이렇게 전배양하여 수득된 균체를 pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0, pH 9.0으로 각각 유지된 신선한 트립틱 소이 브로스 500ml에 최종 농도1(v/v)%가 되도록 접종한 후, 37℃에서 상기와 동일한 조건으로 배양하면서 2시간 간격으로 샘플을 취하면 본광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 균체의 농도를 측저하였다.

그 결과 균주 CFCPA 10142는 pH 5.0이상의 조건하에서는 우수한 성장 속도를 나타내는 반변에 pH 3.0의 강산성 조건하에서는 성장을 하지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 상기 (1)에서와 같은 방법으로 온도의 변화에 따른 약독화 녹농균주 CFCPA 10142의 성장속도를 측정하였다. 균주 CFCPA 10142를 pH 7.0으로 유지된 트립틱 소이 브로스 50ml에 접종하여 37℃에서 200rpm으로 호기성 조건을 유지하면서 12 내지 16시간 동안 전배양하였다. pH 7.0으로 조정한 트립틱 소이 브로스 500ml에 전배양된 균체를 최종농도 1(v/v)%가 되도록 접종한 후, 온도가 25℃, 30℃, 37℃, 42℃로 서로 다른게 유지되는 배양기에서 동일한 조건으로 배양하면서 각각의 성장정도를 600nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 그 겨과, 균주 CFCPA 10142는 30 내지 37℃에서 우수한 성장을 나타내며 25℃나 42℃에서는 비교적 느린 성장을 나타냄을 확인할 수 있었다.

(3) 하기의 실험은 약독화된 녹농균의 탄소원에 따른 성장속도를 측정하기 위한 것이다. 균주 CFCPA 10142를 각각 pH 7.0으로 저정된 트릭틱 소이 브로스 50ml에 접종하고 37℃에서 200rpm으로 유지되는 호기성 조건하에서 12 내지 16시간 동안 배양한 후, 무균상태하에 4℃에서 6000g으로 10분간 원심분리하여 미생물을 수확한 다음 10ml의 생리식염수에 현탁시켰다. 각각 서로 다른 탄소원을 함유하는 M9 배지(Na₂HPO₄·7H₂O 12.8g,KH₂PO₄3g,NaCl 0.5g, NH₄Cl 1g) 5mg에 상기에서 수득한 미생물 현탁액 5μl씩을 가하여 12시간 동안 배양한 후, 각각의 배양액에 대해 600nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 장여부를 조사하였다.

그 결과, 균주 CFCPA 10142는 글루코즈나 β-알라닌 및 만니톨의 존재하에서는 우수한 성장속도를 나타내지만 다른 탄소공급원, 예를들면 크실로즈, 갈락토즈, 솔비톨, 이노시톨, 말토즈, 슈크로즈, 아라비노즈, 만노즈 등의 존재하에서는 성장을 하지 못함을 알 수 있었다. 이러한 탄소공급원 이용특성은 CFCPA 10142 균주의 모주인 피셔 면역형태의 타입 1에 해당하는 녹농균주의 일반적 성장 특성(참조:Bergey's Manual)과 실질적으로 동일한 형태이다.

상기에서 보는 바와같이, 본 발명에 따르는 약독화 녹농균주는 온도, pH 등을 적절히 조절하면서 호기성 조건하에서 탄소원, 질소원, 무기화합물, 아미노산, 비타민 및 기타 영양물질들을 함유한 통상의 배지에 배양하여 생성된 균체를 이용하여 이로부터 수득된 세포벽 단백질 성분을 녹농균 백신 제조에 이용할 수 있다. 배양에 필요한 탄소원으로는 글루코즈, 만니톨 등과 같은 각종 탄수화물, 아세트산, 피루브산 및 락트산과 같은 각종 유기산이 사용될 수 있고, 질소원으로는 각종 유기 및 무기 암모늄염, 펩톤, 효모추출물, 카제인가수분해물 및 기타 질소-함유 물질 등이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 황산 마그네슘, 탄산칼슘, 황산철, 황산구리, 황산아염 및 인산일수소칼륨 및 인산일이수소칼륨 등이 사용될 수 있다. 배양은 바람직하게는 25 내지 37℃에서 호기적 조건하에, 예를 들면 평판 배양하거나, 진탕배양 또는 통기교반 배양등의 액체배양하여 수행된다. 배지의 pH는 배양 기간 동안에는 pH 5 내지 9로 유지되도록 하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 12 내지 16시간 배양시킨 배양액을 원심분리하여 얻어지는 균체를 후술하는 백신제조의 출발물질로서 사용한다.

실시예 4

약독화 녹농균의 배양

(1) 실시예 2에 따라 수득된 녹농균의 균체를 다량으로 수득하기 위해 5L 배양기를 사용하였다. 5L 배양기에 증류수 1당 트릭틱 소이브로스 30g을 용해시켜 수득한 배지용액 2.5를 pH 7.2로 조정하여 멸균시킨 후에 도입시켰다. 배양온도는 37℃, 통기량은 1vvm, 접종량은 배양용액에 대해 실시예 2에서 수득한 약독화 녹농균 균체 5(v/v)%의 조건으로 사용하였으며 초기 2시간 동안은 교반 속도를 100rpm으로 유지하고, 이 후에는 600rpm으로 고정시킨 후 12 내지 16시간 동안 배양하였다. 수득된 균체의 양은 평균적으로 배양액 l당 대략 8g(건조중량)이었다.

(2) 배지로 클루코즈(30g/), 펩톤(15g/), MgSO₄(0.5g/), CaCO₃(5g/), KH₂PO4(1g/), FeSO₄(5mg/), CuSO₄(5mg/) 및 ZnSO₄(5mg/)로 구성된 녹농균 배양용 특수배지를 사용하는 것을 제외하고는 상기 (1)에서와 동일한 배양조건으로 균주 CFCPA 10142를 배양하였다. 이 특수배지를 사용함으로써 건조중량 약 10.4 내지 10.5g의 균체를 수득하였다. 따라서 트립틱 소이 브로스를 사용한 경우에 비해 최소 30% 이상 높은 건조 중량의 균체를 수득할 수 있었다.

실시예 5

약독화 녹농균으로부터 세포벽 단백질의 부분 정제

녹농균에 대한 백신을 제조하기 위해 약독화 녹농균주 CFCPA 10142로부터 세포벽 단백질을 부분 정제하였다.

5L 발효조에서 2.5L의 상기 실시예4(2)에서 사용된 특수배지를 가한 후, 상기에서 언급한 것과 동일한 배양조건을 유지하면서 12 내지 16시간 동안 배양하였다. 배양인 완료된 후, 2.5L의 배양액을 4℃에서 6000g으로 20분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전된 세포를 4℃의 인산염 완충액(당 Na₂HPO₄1.15g, KCl 0.2g, KH₂PO₄0.2g, NaCl 8.776g, pH 7.2)에 현탁시키고 다시 원심분리한 후, 동일한 인산염 완충액으로 세포를 세척하였다. 수득된 세포 130g에 3용적의 아세톤을 가하여 4℃에서 12이상 동안 방치하였다. 침전된 세포로부터 아세톤을 제거한 후, 2용적의 신선한 아세톤을 다시 가하여 5 내지 10분동안 고반하고 4℃에서 8000g으로 20분간 원심분리시켰다. 상층의 아세톤을 제거하고 잔류물에 동일 용적의 아세톤을 가하여 상기와 동일한 방법으로 교반한 다음 원심분리하고 상등액을 제거하여 침전된 세포를 실온상태로 평판상에서 건조시켜 아세톤을 제거하였다. 건조시킨 미생물을 10(w/v)% 최종농도가 되도록 250ml의 상기와 동일한 인산염 완충액을 가하여 현탁시켰다. 4℃로 유지된 상태에서 균질화기를 사용하여 10분 동안 500 내지 1500rpm의 속도로 세포벽 단백질을 추출하였다. 수득된 현탁액을 8000 내지 10000g으로 30분간 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, 침전세포에서 다시 동일 용적의 인산염 완충액을 가하여 현탁시킨 후, 상기의 추출방법과 동일한 조건으로 2차 추출하여 다시 상등액을 얻었다.

상기에서 사용한 추출방법과 동일한 조건을 사용하여 세포가 파쇄되지 않는 상태로 유지해 주면서 5 내지 6회 반복 추출하였다. 이때 세포의 파쇄여부는 세포질내 표지물질인 특정 단백질, 즉 락테이트 데하이드로게나제 또는 헥소키나제를 측정함으로서 확인하였다. 세포질내 단백질인 락테이트 데하이드로게나제 및 헥소키나제가 혼입되지 않은 상태로 세포벽 단백질이 추출되어 있는 것으로 확인된 각각의 추출된 상등액을 모아 교반한 다음, 최종적으로 4℃에서 10,000g으로 30분간 재원심분리하여 등명한 상등액을 수득하였다. 이렇게 하여 수득된 단백질 용액은 거의 순수한 세포벽 단백질만으로 구성되어 있으며 단백질 정량을 통해서 농도가 1mg/ml 내지 2mg/ml로 유지되도록 조정하였다.

실시예 6

조단백질의 순수 정제

1 내지 2mg/ml의 농도로 조정된 조세포벽 단백질을 유효성분만을 갖도록 순수 분리하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다. 2 내지 2.5L의 조세포벽 단백질 수용액을 페리콘 카세트 싯(Pellicon Cassette System)에서 분자량 100,000-절단 막 여과기(Cut-of membrane filter)를 사용하여 먼저 분자량 100,000이상의 단백질 분자를 제거한다. 이렇게 하면 분자량이 100,000이하인 단백질은 여과액(filtrate)으로 빠져 나가게 되며 분자량이 100,000보다 큰 단백질은 계속 순환되면서 분자량이 100,000보다 작은 분자들을 분리시키게 된다.

최초 용적은 10 내지 20%로 농축된 단백질 수용액을 최초 용적의 10배인 20 내지 25L의 멸균된 인산염 완충액(당 Na₂HPO₄1.15g, KCl 0.2g, KH₂PO₄0.2g, NaCl 8.766g)으로 계속 세척해 줌으로써 분자량 100,000-절단 막 여과기를 사용하여 분자량이 10,000 미만인 단백질 및 기타 성분을 제거하는 동시에 분자량 100,000이하인 단백질을 90% 이상 회수할 수 있었다. 여과액으로 분리된 분자량 100,000 이하의 단백질을 동일 시스템에서 분자량 10,000 - 절단 및 여과기를 사용하여 분자량이 10,000 미만인 단백질 및 기타 성분을 제거하는 동시에 분자량 10,000 내지 100,000 사이의 단백질을 1mg/ml의 농도가 될 때까지 농축시켰다. 또한, 단백질 용액에 대한 10 내지 15% 농도구배 SDS-PAGE 전기영동방법에 의해 순도를 확인한 결과 목적하는 분자량 10,000 내지 100,000 범위의 세포벽 단백질의 존재를 확인할 수 있었다.

최종적으로, 상기에서 수득한 상등액에 미량으로 존재하는 리포폴리사카라이드(LPS)나 세포벽 관련 단편들을 제거하기 위해 상등액을 초원심분리시켰다. 초원심분리는 4℃로 유지된 상태에서 180,000g 내지 200,000g으로 3시간 동안 수행하여 침전물을 제거한 후, 수득한 상등액을 0.2μm 필터를 사용하여 제균함으로써 최종적으로 녹농균 감염에 대한 예방 백신용 단백질 조성물 250 내지 260mg을 수득하였다.

실시예 7

CFCPA 10142 세포벽 단백질 항원에 의한 교차방어 능력 시험

실시예 6의 방법에 따라 정제하여 수득한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142 세포벽 단백질을 0.2mg/kg의 용량으로 6주된 체중 23 내지 25g의 ICR 수컷 생쥐 15마리에게 복강내 투여하여 면역시켰다. 면역시킨지 1주일 후에 3마리의 생쥐로부터 ELISA(Enyzyme-linked immunosorbent assay)를 위한 혈액을 취하였다. 나머지 ICR 생쥐에는 피셔 면역형태 타입 1에 해당하는 야생형 녹농균을 야생형 녹농균주의 LD₅₀치(1.5×10⁶)의 10 내지 50배에 해당하는 양으로 주입시켰다. 각 녹농균에 대한 방어효과 여부는 1주일까지 지속적으로 조사하였다. 이 시험에서 CFCPA 10142의 세포벽 단백질은 그의 모주인 피셔 면역형태의 타입 1에서 해당하는 녹농균에 대해 거의 완벽한 방어 효과를 나타냈으며 채혈된 혈액에 대한 ELISA의 결과도 모두 양성반응으로 즉 면역기능이 형성된 것으로 나타났다.

또한 CFCPA 10142 균주의 세포벽 단백질이 피셔 면역형태의 타입 1 이외에 타입 2,3,4,5,6,7 녹농균 균주에 의한 감염증에 대해서도 예방적 항원으로서 작용할 수 있는지 여부를 검토하기 위하여, 야생형 녹농균주로 피셔 면역형태의 타입 2,3,4,5,6,7에 해당하는 녹농균주를 사용하여 상기 실험을 반복수행하였다. 그 결과 CFCPA 10142 균주의 세포벽 단백질은 피셔 타입 2에 해당하는 녹농균주에 대하여도 우수한 교차 방어 능력을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 8

세포벽 단백질의 독성시험

녹농균 감염에 대한 예방 목적의 성분 백신으로 사용하기 위해서는 실시예 2에 기재된 균주 자체의 안정성 뿐만 아니라, 성분 백신으로 사용하고자 세포벽 단백질 자체의 안정성도 보장되어야 한다. 본 실시예에서는 세포벽 단백질을 정제하여 실험동물인 생쥐에게서 안전한지 여부를 조사해 보았다. 즉, 약독화된 CFCPA 10142 균주를 5L 발효기에서 트리틱 소이 브로스를 배양배지로 사용하여 배양한 후, 실시예 4,5 및 6에 따라 처리하여 추출된 세포벽 단백질의 농도가 1mg/ml가 되도록 조정한 후, 제균하여 독성시험의 단백질원으로 사용하였다.

독성시험에서 실험동물로는 체중 20 내지 22g의 ICR계 수컷 생쥐를 사용하였다. 단백질원의 주입경로는 정맥주사이며, 시험군에 사용한 단백질의 양은 20mg/kg, 100mg/kg이었고, 대조군에는 생리식염수 25ml/kg을 투여하였다. 표 1에서 보는 바와 같이 CFCPA 10142 균주의 세포벽 단백질은 실험동물의 체중에 전혀 영향을 미치지 않으며 정상적인 성장을 나타냈고, 그 이외의 별다른 증상도 관찰되지 않았다. 또한 각 장치의 특이한 변화나 증상도 발견할 수 없었다.

실시예 9

세포벽 단백질의 항원성 측정

실시예 8에서와 동일하게 약독화 녹농균주 CFCPA 10142로부터 정제하여 수득한 세포벽 단백질을 항원으로 사용하여 실험동물인 ICR 생쥐에게 0.1mg/kg 또는 0.2mg/kg의 용량으로 정맥주사하여 면역시키고, 면역시킨지 1주일후에 각 그룹의 쥐로부터 일정량의 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 항체생성 여부를 ELISA 방법을 사용하여 아래와 같이 측정하였다[J.Clin. Microbiol. 15, 1054-1058, 1982].

우선 코팅 버퍼(0.05M 탄산염 완충액, pH 9.6)내에서 0.1mg/ml의 농도로 조정된 항원을 96-마이크로플레이트의 각 웰에 100μl씩 가하여 실온에서 2시간 또는 4℃에서 12 내지 14시간 반응시켜 플렝트에 단백질을 부착시킨 다음 수용액을 제거하고, 여기에 1% 우혈청알부민(BSA) 200μl를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 단백질-비결합부분을 차단시켰다. 이때 단백질 항원으로 면역시킨 생쥐로부터 혈청을 PBS로 계열회석하여 100μl씩 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 대조군의 항체로는 면역시키지 않은 생쥐의 혈청을 사용하였다. 반응종류후, 다시 인산염완충액으로 5 내지 6회 세척하고, 생쥐의 항체에 대한 토끼의 항체에 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체(Rabbit-anti mouse Ig-Peroxidase Conjugate) 100μl를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 동일한 인산염완충 세척액으로 7회 이상 격렬하게 세척하였다. 여기에 기질로서 시트레이트-포스페이트 완충액(0.1M Citrate-Phosphate buffer, pH 5.0)에 오르토-페닐렌디아민 디하이드로 클로라이드를 0.3 내지 0.4mg/ml의 농도로 조정하여 50μl씩 첨가하여, 20분간 차광하에 반응시킨 후, 1N-황산 50μl씩을 가하여 반응을 정지시켰다. 그후, 각 반응용액을 분광광도계를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

ELISA를 이용하여 분석한 결과, 시험군의 경우 0.1 또는 0.2mg/kg의 항원투여에 의해 대조군에 비해 2 내지 5배 정도의 높은 면역가를 나타냄을 알 수 있다.

실시예 10

녹농균에 대한 면역글로부린의 생성

실시예 5에서 CFCPA 10142 균주로부터 수득한 세포벽 단백질 용액 0.5 내지 1ml(세포벽 단백질 100 내지 200μg을 함유)를 알비노 토끼에게 7일 간격으로 3회 접종하였다. 그후 토끼의 혈액을 일정한 간격으로 채혈하여 혈청을 분리시켰다. 분리된 토끼 혈청 100ml를 증류수 300ml와 혼합하여 4℃의 DEAE-셀룰로즈 500g(습윤중량)에 가하였다.

이 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 충분히 진탕한 후, 정치시켜 분리되는 상등액을 제거하고 잔류물을 증류수로 수회 세척한 다음에 0.01M 인산염완충액( Na HP₂O₄·H₂O 13.8g/, KCl 0.2g, Na₂HPO₄14.2g/, pH 8.0) 200ml씩으로 3회 세척하여 순도 96% 이상의 면역글로부린 IgG 600mg을 수득하였다.

실시예 11

면역글로부린의 녹농균 감염증에 대한 치료효과

실시예 10에서 수득한 CFCPA 10142 균주에 대한 면역글로부린의 녹농균 감염증에 대한 치료효과를 다음과 같은 방법에 의해 확인하였다. 이하에서는 각 군당 10마리씩의 생쥐를 사용하였다.

생쥐에서 피셔 면역형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 각각의 병원성 녹농균 균주를 각각 1.0 내지 3×10⁶세포씩 복강내 주사하여 녹농균 감염증을 야기시키고, 2시간 내지 4시간 후에 생쥐에게 CFCPA 10142 균주에 대한 면역글로부린을 1내지 10mg/생쥐의 양으로 복강내 주사하여 치료효과를 시험하였다. 대조군에는 면역글로부린에 대한 주사용 생리식염수 0.5ml를 정맥주사하였다.

그 결과, 주사용 생리식염수만을 투여하나 대조군에서는 48시간 이내에 50% 이상, 72시간에 100%의 치사율로 나타낸 반면에 면역글로부린을 투여한 군중 피셔 면역형 1 및 2의 간염군에서는 72시간후에도 80% 이상의 생존율을 나타내었다. 그러나, 피셔 면역형 3, 4, 5, 6 및 7의 감염군에서는 CFCPA 10142 균주에 대한 면역글로부린이 생존을 연장시키지 못하는 것으로 입증된다.

실시예 12

면역글로부린의 제제화

실시예 10에서 수득한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142에 대한 정제된 녹농균 면역글로부린을 체중 kg당 항체 면역글로부린 1 내지 100mg이 투여될 수 있도록 다양한 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제제화하였다. 제제화된 면역글로부린을 녹농균 감염증이 유발된 생쥐에게 투여하여 담체의 종류에 따른 면역글로부린의 유효성 차이를 관찰하여 보았다. 그 결과, 액체제제의 경우에는 담체로 주사용 생리식염수 또는 인산염 완충액을 사용한 면역글로부린 제제가 유효성이 높았으며, 동결 건조제제인 경우에는 만키톨, 사카로즈 또는 락토즈를 담체로 사용한 경우가 높은 유효성을 나타내었다. 반면에 동결 건조 제제의 경우에 인체알부민을 본 발명에 따른 녹농균 면역글로부린과 병용한 경우에는 오히려 유효성이 낮아졌으며, 액체제제의 경우에는 수산화알루미늄을 약제학적 담체로 사용한 경우에 효과가 낮아졌다. 시험 결과는 다음 표2에 요약하여 기재하였다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 약독화된 녹농균주 CFCPA 10142(KKCM 10029)는 독성면에서 상당히 안전한 미생물이면서 동시에 세포벽 단백질의 안전성 및 항체생성능이 우수하고, 또한 피셔 면역형태중 모주인 타입 1의 녹농균 뿐 아니라 타입 2의 녹농균에 대해서도 우수한 교차방어 능력 및 치료효과를 나타내므로 녹농균 예방 성분 백신 및 녹농균 감염증 치료제의 제조를 위한 미생물로서 매우 우수함을 알 수 있다

Claims (3)

1. 피셔 면역형의 타입 1에 해당하는 녹농균주를 순수하게 분리하여 순화시켜 약독화시킨 안전한 약독화 녹농균주 CFCPA 10142(KCCM 10029)로부터 순수하게 분리, 정제하여 수득한 세포벽 단백질을 함유함을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
2. 제1항에 있어서, 약독화 녹농균주 CFCPA 10142의 LD₅₀이 7.6×10⁷) 세포 이상임을 특징으로 하는 녹농균 감염 예방 백신.
3. 제1항에 있어서, 세포벽 단백질 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 녹농균 감염 예방 백신.