CN102534027A - MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物及使用该引物的检测方法。所述的MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物其特征在于，包括：QacEΔ1基因正向引物5′-cttccgccgttgtcataatc-3′；QacEΔ1基因反向引物5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′。检测方法为：取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株作为检测样品，取不携带QacEΔ1基因的铜绿假单胞菌菌株作为阴性对照品，高温灭活，提取样本DNA；人工合成QacEΔ1序列，构建携带QacEΔ1基因的重组质粒为阳性对照品；分别进行PCR反应。本发明检测率高、可重复性强。

Description

MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂QacEΔ1基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

消毒防腐剂在生活中的应用和发展已有几个世纪。从经验性地用铜和银打造的容器来储存饮用水，用醋和蜂蜜清洗伤口，用香料保存鱼和肉，到用碘酒作为伤口消毒剂，在产科中应用含氯水溶液，将苯酚作为伤口敷料以及在外科中作为抗菌剂，和将二价汞离子用作杀芽孢剂，整个消毒防腐剂都处在不断的发展之中。20世纪初人类又进一步开发了双胍类(CRAs)和季胺类消毒剂(quatemaryammon ium compounds，QACs)。到了20世纪40年代，常用的消毒防腐剂已有酚类化合物、有机汞、双胍类消毒剂、季胺类消毒剂、碘及其复合物、乙醇、甲醛、过氧化氢、银化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和两性表面活性剂。直到目前，这些消毒剂中的大多数仍在广泛地使用。尽管消毒防腐剂一直在更新换代之中，但是在其广泛的选择压力下，细菌仍然渐渐产生了耐药性。现已发现，细菌对季胺类、双胍类以及重金属等消毒防腐剂的耐药与细菌本身的耐药基因有关。

QacEΔ1从质粒R751上的I类整合子中分离得到。该质粒最先从肺炎克雷伯菌中分离。核酸测序分析表明，其DNA整合酶基因的3′端有3个开放读码框(ORF1、ORF4和ORF5)，并且ORF1的100个编码子有94个与ORF4相同。它与QacC有高度同源性。Paulsen等把ORF1命名为qacE，ORF4命名为QacEΔ1，并且从表型耐药分析qacE对消毒剂的耐药谱与QacC相似，QacEΔ1对这些消毒剂呈较低水平的耐药。因此，QacEΔ1可能是由于携带磺胺(sulI)耐药基因DNA片断插入到ORF1之中进化而来，其最终导致编码的蛋白比ORF1白蛋白少了162氨基酸的羧基末端。荧光试验表明，QacE的耐药也是质子泵介导的。氨基酸测序结果表明QacE也属于小的多重耐药家族蛋白，并有四个跨膜片段。两者均对季铵盐类消毒剂(如苯扎溴铵、苯扎氯铵和溴化米芬)、双胍类化合物(如氯己定)、腙类化合物和染料耐药。QacEΔ1对季铵盐类消毒剂和染料的耐药水平低于QacE。进一步研究表明，与QacE相比，这些差异是由于QacEΔ1蛋白失去了第四个跨膜片段和羧基末端的高度保守残基所造成的。

目前检测QacEΔ1基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。

发明内容

本发明的目的是提供多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂QacEΔ1基因携带情况的PCR检测引物及其检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物，其特征在于，包括：

(A).QacEΔ1基因正向引物：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′；

(B).QacEΔ1基因反向引物：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′。

本发明还提供了一种MDRPA中QacEΔ1基因的检测方法，其特征在于，采用上述MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacEΔ1基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacEΔ1序列，构建携带QacEΔ1基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因检测探针溶液；QacEΔ1基因正向引物的序列为：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′，QacEΔ1基因反向引物的序列为：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′，QacEΔ1基因检测探针的序列为：FAM-tggtcgggactcggc-MGBNFQ；

第三步：在每一个PCR反应孔依次中加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的QacEΔ1基因正向引物溶液0.1-1ul、QacEΔ1基因反向引物溶液0.1-1ul、QacEΔ1基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；

第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacEΔ1基因。

本发明是对多药耐药铜绿假单胞菌中是否还有耐消毒剂QacEΔ1基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中QacEΔ1基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。

本发明基于实时荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测率高、可重复性强，检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。

附图说明

图1为携带QacEΔ1基因的阳性对照品的Realtime PCR曲线图；

图2为Realtime PCR阴性对照品的Realtime PCR曲线图；

图3为携带QacEΔ1基因检测样品的Realtime PCR曲线图；

图4为QacEΔ1基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为QacEΔ1基因检测样品的测序图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1、采用固相亚磷酰胺三酯法制备一组用于检测MDRPA中QacEΔ1基因携带情况的引物，包括：

QacEΔ1基因正向引物：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′；

QacEΔ1基因反向引物：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′。

2、检测方法：

(1)取经培养后鉴定为多药耐药铜绿假单胞菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul(浓度10ng/ul)，置-20℃保存，待用；将标准铜绿假单胞菌株(保藏单位：中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：

高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul(浓度10ng/ul)，作为阴性对照品；人工合成QacEΔ1序列(由上海生工合成)，构建携带QacEΔ1基因的重组质粒，稀释至30ul(浓度10ng/ul)，为阳性对照品。

(2)根据QacEΔ1基因的保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物及Taqman探针，探针序列一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料(由上海生工合成)，用无菌水配制浓度为10umol/L的QacEΔ1基因正向引物溶液，浓度为10umol/L的QacEΔ1基因反向引物溶液以及浓度为10umol/L的QacEΔ1基因检测探针溶液，其中，引物和检测探针序列如下：

QacEΔ1基因正向引物：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′；

QacEΔ1基因反向引物：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′；

QacEΔ1基因检测探针：FAM-tggtcgggactcggc-MGBNFQ。

(3)在每一个PCR反应孔中加入PCR Master Mix(Applied Biosystems公司生产的Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括10×PCR缓冲液、MgC12、dNTP、DNA聚合酶)12.5ul，QacEΔ1基因正向引物溶液0.5ul，QacEΔ1基因反向引物溶液0.5ul，QacEΔ1基因检测探针溶液0.5ul。然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤(1)得到的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0.5ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul。在ABI7300型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50℃保温2分钟，95℃保温2分钟，再运行40个循环，每个循环包括在95℃保温15秒，再在60℃保温1分钟；

(4)用软件SDS2.2进行结果分析，如图1所示，为阳性对照品的Realtime PCR曲线，呈S形。如图2所示，为阴性对照品的Realtime PCR曲线，为非S形。如图3所示，为检测样品的Realtime PCR曲线，呈S形。得出判断，该样品为携带QacEΔ1基因菌株。

利用本发明对超过100例MDRPA样本的检测结果显示，根据上述方法进行的QacEΔ1基因携带情况检出率可达99％以上，可重复性达到100％。而琼脂糖凝胶电泳法的检出率约75％，如图4所示，为QacEΔ1基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；本发明与直接测序法相比，结果一致性可达到99.5％以上，如图5所示，为QacEΔ1基因检测样品的测序图。

Claims (2)

1.MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物，其特征在于，包括：

(A).QacEΔ1基因正向引物：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′；

(B).QacEΔ1基因反向引物：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′。

2.一种MDRPA中QacEΔ1基因的检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacEΔ1基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacEΔ1序列，构建携带QacEΔ1基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的QacEΔ1基因检测探针溶液；QacEΔ1基因正向引物的序列为：5′-cttccgccgttgtcataatc-3′，QacEΔ1基因反向引物的序列为：5′-atcaagcttttgcccatgaa-3′，QacEΔ1基因检测探针的序列为：FAM-tggtcgggactcggc-MGBNFQ；

第三步：在每一个PCR反应孔依次中加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的QacEΔ1基因正向引物溶液0.1-1ul、QacEΔ1基因反向引物溶液0.1-1ul、QacEΔ1基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；

第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacEΔ1基因。

Images