CN106976990A - 一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法 - Google Patents

一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，包括如下步骤：(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得；(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150‑180rpm，培养50‑60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20‑30克菌粉计，自然降解15‑30天。本发明降解迅速、无残毒、成本低。

Description

一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法
技术领域
本发明涉及海洋污染处理技术领域，特别涉及一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法。
背景技术
石油污染经常与石油工业事故，坦克及管道运输，石油储存罐泄露等有关，据统计每年至少有400000吨的原油泄露到海洋环境中。除了这些海事事故造成的石油泄露以外，海上油田的开发也是一个重要的污染源。随着全球经济的增长，全球贸易日趋激烈，海上运输也会越来越频繁，海上事故也将越来越多，海上石油污染必将愈演愈烈。利用生物的方法来修复石油污染环境近些年来越来越受关注，因为这种方法迅速、无残毒、低成本。
目前最常用的生物方法是人工培育和改良嗜油微生物，将这些微生物投入到污染的海洋环境中，进行石油烃类降解，以达到生物修复的目的。
微生物通过生产生物表面活性剂来降解石油，但是由于微生物底物价格高，下游加工工序成本昂贵，产量低等原因，将微生物用于工业化生产生物表面活性剂的范例较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，降解迅速、无残毒、成本低。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，
包括如下步骤：
(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16S rDNA PCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；
(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；
(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。
作为优选，高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得的具体步骤为：
A、取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液；
B、将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；
C、以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16S rDNA PCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记；
D、将16S rDNA PCR产物使用HhaⅠ限制性内切酶进行酶切，37℃金属浴恒温过夜，酶切产物利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离，最后通过荧光成像系统观察凝胶，各样本出现同样条带，确定为同一种菌；
E、对16S rDNA PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定确定为铜绿假单胞菌。
本发明通过RFLP的方法对优势菌进行检测和筛选，简单，成本低廉，高效快速，因此能够大大节约实验成本和时间，获得高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌。
作为优选，基础培养基配方为：Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
作为优选，液体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
作为优选，固体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，琼脂15g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
作为优选，27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，Y为C或T。
作为优选，步骤C的PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。
作为优选，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳缓冲液为TBE，电泳条件为100v恒压，2h。
作为优选，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳凝胶配方为：蒸馏水5.5mL，30％Acr-Bis(30％为Acr-Bis(质量比为29:1)的混合物质量浓度)25mL，1M的pH 8.8Tris19mL，10％过硫酸铵(10％质量浓度)0.5mL，TEMED 0.02mL。
本发明的有益效果是：筛选获得的铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂，对石油的降解效果好，降解迅速、无残毒、成本低。
附图说明
图1是乳化活性微生物的分离，图中：(A)细胞生长和表面张力测定。(B)微生物种群的RFLP模式变化。(C)挑取7个菌落进行RFLP鉴定。(D)7个菌落培养后的表面张力检测。
图2是ZS1进化树。
图3是排油圈和乳化指数(E24)；
排油圈：a.MSM+YE培养菌液滴入原油中排油圈，b.MSM+Glu培养菌液滴入原油中排油圈；
乳化指数(E24)：c.3ml蒸馏水与3ml原油，d.3ml MSM+Glu培养菌液与3ml原油，e.3ml MSM+YE培养菌液与3ml原油。
MSM+Glu即液体培养基：葡萄糖20g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO34.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。MSM+YE配方为：酵母粉20g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。
图4是鼠李糖脂-排油圈标准曲线
图5 ZS1在不同葡萄糖浓度条件下生产鼠李糖脂的情况。(A)分离株ZS1在不同葡萄糖浓度下生长的情况。(B)分离株ZS1在不同葡萄糖浓度下生产鼠李糖脂的情况。(C)在不同葡萄糖浓度下ZS1的鼠李糖脂生产的碳源得率。(D)在不同葡萄糖浓度下ZS1的鼠李糖脂生产率。
图6分离株ZS1在添加轻原油或十六烷为唯一碳源的基础培养基中的生长情况。(A)在含1％轻原油基础培养基中的生长情况。黑实线和灰实线分别示意轻原油总量(％)和细胞质量；虚线示意乳化的轻原油。(B)培养液中原油从挂壁到完全悬浮的现象。时间与(A)一致。(C)分离株ZS1在添加2％十六烷的基础培养基中生长情况。图示与(A)一致。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一、铜绿假单胞菌ZS1的筛选与鉴定
1.取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液。
基础培养基配方为：Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
2.将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；DNA提取使用Axygen公司的DNA提取试剂盒。
固体培养基配方为：葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
3.16S rDNA PCR：以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16S rD NA PCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记。27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)，Y为C或T。
PCR采用Takara公司的试剂盒R001B。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。
PCR反应体系：
4.限制性内切酶酶切：将16S rDNA PCR产物使用HhaⅠ(takara,1056A)进行酶切，37℃金属浴恒温过夜。样品实验过程中用锡箔纸包裹保持黑暗条件进行。
酶切反应体系如下：
5.微型垂直PAGE凝胶电泳：酶切产物凝胶电泳缓冲液为TBE。电泳条件为100v恒压，2h。
电泳凝胶配制:
5×TBE的配制(1L)
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20mL
。
6.凝胶成像观察：将PAGE凝胶置于天能5200multi凝胶成像仪，观察荧光，各样本出现同样条带，确定为同一种菌，命名为ZS1。
7.菌种分离鉴定：对16S rDNA PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，结果显示该菌株ZS1为铜绿假单胞菌，进化树见图2。
二、扩大培养：将铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉。
三、降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。
试验部分：
铜绿假单胞菌ZS1乳化活性
铜绿假单胞菌通过分泌鼠李糖脂，后者通过乳化作用降解石油。本发明通过测量细菌培养发酵液排油圈的大小OSZ(oil-spreading zone)、乳化指数(E24)和不同稀释倍数下的表面张力(surface tension)来测定铜绿假单胞菌的乳化活性。
1.上清液排油圈测定：50ml的蒸馏水加入15cm的平板中，先在平板的水面滴加一层油膜，然后在油膜上滴加20ul的石油，形成油滴，在油滴中间滴加5ul细菌培养后的上清液，等待30s，看是否有排油圈的出现。
2.上清液乳化指数E24测定：3ml的ZS1发酵上清液与3ml的原油等体积混合，用震荡器以最高速震荡2min，然后静置24小时。E24就是得到的乳化层高度除以总的液体体积的高度。
3.表面张力测定：取15ml上清液，倒入小培养皿中，使用BZY-B表面张力仪测量表面张力，每次测量之前校准，蒸馏水72mN/m，乙醇22mN/m。每个样品重复测三次。
图1A为将油泥在葡萄糖为唯一碳源培养时测得的生长曲线(600nm处的吸光度)和表面张力，说明微生物生长良好；图1B为分别将培养0,10,20,32,64小时的微生物进行抽提DNA，16S rDNA PCR，RFLP后获得的结果，一条带代表一类物种，说明随着时间的推移，优势菌种逐渐积累，同时可以推测对菌种进行涂布筛选的时间点；图1C为将油泥混合物在葡萄糖为唯一碳源下培养64小时后涂布到固体培养基上，过夜培养后随机挑取7个单菌落进行单独培养，再抽提DNA，16S rDNA PCR，RFLP，单菌落的条带和混合物的条带(图1B)在同一位置，说明7个单菌落为优势菌种，可用于后续研究；图1D为7个单菌落的表面张力检测，上方(灰色)为不加菌液上清液时培养基的表面张力，下方(黑色)为加入菌液上清液后培养基的表面张力，表面张力下降，说明分离得到的7个单菌落具有降解油的能力。
图3表明使用葡萄糖为唯一碳源培养可促进ZS1分泌鼠李糖脂，上清液排油圈直径达到7.5cm，E24为100％，对原油具有很强的乳化活性。
铜绿假单胞菌ZS1鼠李糖脂产量的测定
寻找最佳培养条件(寻找培养基中不同浓度的Glu含量(0,0.12,0.25,0.5,1,2,4％)，2％换算后即20g/L，并测量哪种百分比条件下鼠李糖脂产量最大)，使得ZS1鼠李糖脂产量的最大化，通过排油圈法测量ZS1发酵鼠李糖脂产量。
方法
培养：将铜绿假单胞菌ZS1接种到液体培养基中培养，Glu百分比分别为0,0.12,0.25,0.5,1,2,4％，摇床培养条件为30℃，180rpm，在0-110小时培养期内多次取样，测定鼠李糖脂产量。
发酵液鼠李糖脂产量的测定：利用鼠李糖脂标准品建立排油圈与鼠李糖脂浓度的线性关系，得到公式y＝22.459x+15.326(R2＝0.9401)，y为排油圈面积(cm2)，x为鼠李糖脂浓度(g/l)，测定MSM+4％Glu培养条件下的上清液的排油圈后计算相应的鼠李糖脂产量(图4)。
为了优化鼠李糖脂的生产效率，我们分析了ZS1分离株在添加不同葡萄糖浓度的矿物盐培养液中生产鼠李糖脂的情况。通过鼠李糖脂-排油圈标准曲线测得，在4％葡萄糖浓度中，鼠李糖脂的生产最高，可达每升44克，是迄今发表的自然分离株中鼠李糖脂产量最高的之一(图5A-B)。按碳源使用效率(碳源投入/产出比)，2％葡萄糖浓度生产鼠李糖脂效率最高，即生产每摩尔鼠李糖脂只需不到四摩尔的葡萄糖(图5C)。在2％葡萄糖培养液中生产鼠李糖脂产量最佳，达每升·小时0.8克(图5D)。
铜绿假单胞菌ZS1石油降解活性的测定
利用新筛选得到的铜绿假单胞菌ZS1降解石油，通过测量OD的方法确定其降解活性。
降解油活性的测定：将ZS1分别接种到以原油和正十六烷为唯一碳源的基础培养基中生长，隔一定的时间取出菌液除去细胞测量乳化液的OD600，并用正己烷萃取乳化液测量残存的油量。
轻原油的吸收利用是在乳化发生时开始，直至进入生长静止期(图6A-B)。在12天后，50％的轻原油量被ZS1细胞吸收利用了，即轻原油吸收率为0.4克/升·天。然而，我们发现，ZS1在含2％十六烷基础培养基中吸收利用十六烷的效率要比吸收轻原油快许多，十六烷的吸收率为2克/升·天(图6C)。显然，ZS1分离株有明显的吸收利用碳氢油的能力，是生物治理油污的有效品系。
利用铜绿假单胞菌ZS1降解石油污染的方案设计
海洋石油污染通常高达千吨，以3000吨计算一次海洋石油污染，用本专利中的ZS1菌株降解石油，在30℃条件下，降解1克原油约需加0.2克菌粉，降解时间约为14天。在3000吨石油污染情况下，需向海洋抛洒约600吨菌粉以降解石油。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学舟山海洋研究中心
<120> 一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法
<130> 2017.02
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (9)

1.一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16SrDNA PCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；
(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；
(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得的具体步骤为：
A、取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液；
B、将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；
C、以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16S rDNA PCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记；
D、将16S rDNA PCR产物使用HhaⅠ限制性内切酶进行酶切，37℃金属浴恒温过夜，酶切产物利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离，最后通过荧光成像系统观察凝胶，各样本出现同样条带，确定为同一种菌；
E、对16S rDNA PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定确定为铜绿假单胞菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基础培养基配方为：Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，水余量。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，固体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，琼脂15g/L，Na2HPO4 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，NaNO3 4.0g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，Y为C或T。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤C的PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳缓冲液为TBE，电泳条件为100v恒压，2h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳凝胶配方为：蒸馏水5.5mL，30％Acr-Bis 25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％过硫酸铵0.5mL，TEMED 0.02mL。
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