TW403655B - Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains - Google Patents
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Description
403655 五、發明説明（3 ) 技術領域 本發明俗有關新穎之減弱之紐線.1璽.直JML( Pseudomonas aeruginosa)株，預防疫病之疫苗及網線假 翬胞閩傳染病之治療劑，及其製備方法。更待別地，本發 明偽有闢新穎之減弱之綱嫌假蜇胞菌株，其偽依據F i s h e r -Devlin免疫型呈純態單離銅級假翬胞il .接著藉著依序 通過老鼠而重複純化此單離菌株而得者；及有關由其製備 之預防疾病之疫苗，及由減弱之銅錄假單胞..菌._株分離之細 胞壁蛋白質誘發之治療性免疫球蛋白，及其製備方法。 枝術背軎 網線假翬胞菌偽活動之革蘭陰性桿菌，約為0.5wmX 1.5-3.0//πι,且具有單一鞭毛，廣泛出現於土壤，水，污 水及人類腸内（Mol. Microbiol. 4 , 1069-1075, 1990) 。铜线假蚩胞聞偽造成慢性傳染病之致病原菌株，如畋血 症，一般傳染病，慢性呼吸道傳染病，胰臓之胞囊餓維症 等。由銅線假g胞_引起之收血症偽由撤生物本身侵害或 其毒性構成物分泌進入因手術，裂傷，外傷等而使抵抗力 變弱之病患之血液中而引起者，毒素存在會引起高燒休克 ,向壓降低，及其他病擻，而最終可引致死亡。再者，由 於網線假菫胞_已於泌尿道傳染病中偵測到，因而網線假 單胞菌引起廣泛之興趣。據此，極需要發展可有效預防或 治療由網線假菫朐籣引起之慢性化膜性疾病（如敗血症及 泌尿道傳染病）之翳_薄I。然而，銅綠假單胞菌株對大部 份之抗生素物質具有抗性，且目前尚未發展錮線假單胞菌_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)_A4規格（ 210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -νβ 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 3 (修正頁）
403655 五、發明説明（3 ) 技術領域 本發明俗有關新穎之減弱之紐線.1璽.直JML( Pseudomonas aeruginosa)株，預防疫病之疫苗及網線假 翬胞閩傳染病之治療劑，及其製備方法。更待別地，本發 明偽有闢新穎之減弱之綱嫌假蜇胞菌株，其偽依據F i s h e r -Devlin免疫型呈純態單離銅級假翬胞il .接著藉著依序 通過老鼠而重複純化此單離菌株而得者；及有關由其製備 之預防疾病之疫苗，及由減弱之銅錄假單胞..菌._株分離之細 胞壁蛋白質誘發之治療性免疫球蛋白，及其製備方法。 枝術背軎 網線假翬胞菌偽活動之革蘭陰性桿菌，約為0.5wmX 1.5-3.0//πι,且具有單一鞭毛，廣泛出現於土壤，水，污 水及人類腸内（Mol. Microbiol. 4 , 1069-1075, 1990) 。铜线假蚩胞聞偽造成慢性傳染病之致病原菌株，如畋血 症，一般傳染病，慢性呼吸道傳染病，胰臓之胞囊餓維症 等。由銅線假g胞_引起之收血症偽由撤生物本身侵害或 其毒性構成物分泌進入因手術，裂傷，外傷等而使抵抗力 變弱之病患之血液中而引起者，毒素存在會引起高燒休克 ,向壓降低，及其他病擻，而最終可引致死亡。再者，由 於網線假菫胞_已於泌尿道傳染病中偵測到，因而網線假 單胞菌引起廣泛之興趣。據此，極需要發展可有效預防或 治療由網線假菫朐籣引起之慢性化膜性疾病（如敗血症及 泌尿道傳染病）之翳_薄I。然而，銅綠假單胞菌株對大部 份之抗生素物質具有抗性，且目前尚未發展錮線假單胞菌_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)_A4規格（ 210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -νβ 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 3 (修正頁） 4 Q 3.6 5 5 A7 B7 經濟部中夬橾準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（9 ) 1 1 3 種 類 型 之 細 胞 壁 蛋 白 質 以 製 備 本 發 明 之 疫 苗 Ο 1 1 1 本 發 明 之 又 一 具 體 例 傜 一 種 用 於銅._綠假單胞菌傳染病 * 1 i 之 治 療 劑 赘 其 含 有 至 少 一 種 免 疫 球 蛋 白 > 該 免 疫 球 蛋 白 像 • f«. 1 請 1 I 藉 培 養 至 少 一 種 安 全 之 減 弱 之銅一^.盤—單―胞_M—株 9 分 離 此 細 閱 | 讀 1 1 胞 壁 蛋 白 質 * 純 化 此 分 離 之 細 胞 壁 蛋 白 質 $ 接 箸 將 此 純 細 背 1 I 之 1 胞 壁 蛋 白 質 作 為 抗 體 誘 導 物 注 射 至 實 驗 動 物 中 並 誘 發 免 疫 意 1 # 1 球 蛋 白 而 製 得 者 及 —*‘ 種 製 備 此 治 療 劑 之 方 法 Ο 項 亦， 1 填’ ^ I 前 面 概 述 本 發 明 之 更 確 切 且 重 要 之 持 擞 以 使 下 列 之 % 本 裝 | 本 發 明 詳 細 敘 述 更 易 了 解 1 且 可 *=±=» 兀 全 認 知 本 發 明 對 本 技 蕕 頁 •—/ 1 1 之 貢 獻 0 後 述 之 本 發 明 額 外 持 徽 則 形 成 本 發 明 申 請 專 利 範 1 1 圍 之 的 〇 熟 悉 本 技 U 者 可 了 解 本 文 所 掲 示 之 概 及 特 定 1 1 具 體 例 可 輕 易 地 使 用 作 為 進 行 本 發 明 相 同 百 的 之 改 變 或 設 - 訂 | 計 其 他 結 構 之 基 礎 〇 再 者 » 熟 悉 本 技 U 者 可 了 解 對 等 結 構 - 1 I 並 未 違 離 申 請 專 利 範 圍 所 述 之 精 神 及 範 圍 〇 1 1 | ft. 式 之 簡 單 敘 W 1 I 線 為 了 更 充 分 了 解 本 發 明 之 性 質 及 百 的 9 需 配 合 附 圖 參 1 考 下 列 之 詳 細 敘 述 1 其 中 : 1 1 第 1圔顳示自本發明之減弱之鋇級假塱睢鋪株分_出 1 之 純 化 細 胞 壁 蛋 白 質 之 SDS- PAGE結果 ♦ 及 第2圖為代表以靜脈内注射本發明之減弱之| Ο ΙΛ 1_1 |_ 1 I 胞 Μ 之 細 胞 壁 蛋 白 質 之 雄 性 老 鼠 體 重 改 變 之 圖 形 0 1 1 | 谁 行 本 發 明 2 最 伴 槙 1 1 编拔假蜇胞蘭之F i s h e r -Devi i η免疫型分成7 種類型， 1 1 型 1 至 型 7 ·* 本 發 明 中 賣 係 選 擇 具 F i s h e r 免 疫 型 1 至 7 之 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ). Λ4規格（2丨Ο X 297公釐） 9 (修正頁） @6. 7. G7 修正 年月曰、士太 補充 403655 A7 _B7_ 五、發明説明（4 ) 傳染病之有效預防或治療劑。因而，逐漸增加銅綠假單胞 菌_傳染病之毒性。 铜錄假里胞菌株可以各種方式分類，一種分類系铳係 依據Fisher兔疫型將菌株分成7類，另一種系統係以
Terada所提出之0-抗原群為主。又另一種系統為國際抗原 ' . . , . \ 驗證體系（IATS)分類系統。由分類糸統之觀點來看，最常 發生於翻錄假里胞爾感染之病人之飼錄假翬胞菌株為：依 據 Fisher免疫型 /0-血清型之 5/2a, 2c, 3, 7/3a, 3c, 1/ 4a, 4b, 6/5 a , 5b, 4/6, 2/7 a , 7b, 7c, /10a, /13, /12, /11及3.7/3d, 3e型，最主要存在者為Fisher免疫型 之3,7,2及1型（相當於0 -血清型之3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a及 4b) 〇 治療掘錄假蜃胞菌傳染病之一方法係Μ抗毒素中和飼_ 錄假屋朐菌羞素；然而，抗毒素係一種治療劑，其僅對已 患有敗血症之患者有用，且不具有預防效果。再者，目前 所供應之抗毒素非常昂貴且其用途有限；此外，使用此抗 毒素最明顯之缺點為相當低之治癒率且伴随嚴重之副作·用 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Ο 在研究避免因抗毒素引起之缺點之一方法係使用用以 預防及治療铜錄假翬胞菌傳染病之一般抗原，研究獲得此 一般抗原之方法可分類為兩種。第一種方法係使用自具有 不同免疫型之额綠假翬胞菌株分雛及純化之一般抗原作為 抗铜錄假里胞蘭之預防疫苗抗原[J a p a n , J . Ε X p.. M e d . 45, 355-359, 1975]。第二種方法係有關使用藉利用其中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 4
五、發明説明彳1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之減弱之額錄假里胞莆株為新穎之微生物菌株。因 此，這些菌株於1993年5月12日寄存於布達佩斯條約認可 之國際寄存櫬構之韓國脚合培養中心（Korean Federation of Culture Collections)(後文中表示為 KCCM),及於 2000 年1月27日寄存於中華民國食品工業發展研究_所 （P I R D I) ,寄存代碼為（^[{(：,寄存號磚對0?0?丨10142為1[(^»{ 10029 (CCRC 910139)， CFCPA 20215為 KCCM 10030(CCRC910lS8 )，CFCPA 30720為 KCCM 10031(CCRC 910137)，CFCPA 40057 為 KCCM 10032(CCRC 910136), CFCPA 50243為 K.CCM 10033 (CCRC 910135), CFCPA 60534為 KCCM 10034(CCRC 910134 )及匸卩(：1>兵 7 0 018為1((^1< 10035((^1^910140)。 製造減弱之綑後铒置_莆柱之純化步驟通常係重複進 行至菌株呈現所需之LD 5〇值。雖然純化步驟之次數係視技 術貝之热練程度，母菌株之毒性等而異，但純化步驟較好 進行3至7次，例如盲至捆錄倨S胞菌之LDso至少為2X 107细胞。依據本發明所得之新穎減弱之铜_.綠假單胞，.菌株 在老鼠中之LD50值較好為2.0X107细胞或更高。 本發明亦提供一種尉润錄假輩胞菌有免疫作用之疫苗 ，其製備係自本發明上述所得之各新穎之飼.綠假單胞_菌_株 中分離里純態之细胞壁蛋白質，接著進一步純化此分雔之 细胞壁蛋白質，並Μ某種混合比例.較好為等量之得自各 尋求免疫作用之所需篇後假里睢菌秩之细胞壁蛋白質，而 混合所得之纯化细胞壁蛋白質而得。亦即，各菌株之用量 用 〇作 量疫 之免 用有 作蘭 疫睢 免里 之枏 中後 型猫 類對 主種 宿一 定供 特提 於明 株發 菌本 發 ， 誘外 Μ此 足 為 到 得 而 絚 · 之件 弱條 減長 為生 撖之 特宜 其適 •持 法維 方時 之同 苗育 疫培 梅 堍 "中塊 器株 酵I 發睢 E S 在屋 j 0M_ {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS )八4規格（210X297公釐） 11 (修正頁） 403655 A7 B7 五、發明説明（） 5 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 用於所需抗原之基因編碼係簞離並插入適宜媒傳者而獲得 重組媒傳者，且接著K所得重組媒傳者對適宜宿主轉形並 培養以表現所需抗原之基因工程技術而製得之一般抗原體 〇 雖然使用一般抗原之預防疫苗之發展理論上為非第有 效之方法，但目前有闞此方法之研究發展顯示此方法仍具 有許多未解決之問題。主要缺點為一般抗原無法預防具有 不同免疫型之所有種類之網綠假翬胞菌，因此其效果極低 。此種低效果建議除了一般抗原外，其他未知主要抗原之 存在可成為有效預防效果之原因。 另一種治療飼綠假里胞蔺傳染病之方法係投與對 假屋朐菌秩具有寬廣菌譜選擇性之抗生素或化學治療劑。 然而，由於有多種飼綠假簞胞菌株,且其通常具有非常髙 程度之藥物抗性，因而許多病患因無法有效K抗生素治療 之翻綠假簞胞菌株而死。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 此外，已發展使用治療性免疫球蛋白之方法，然而， 此種免疫球蛋白對所有铜錄假單胞菌傳染病並未圼現或圼 現極小的治療效果，因而僅可使用於非常有限種類之銅丨i 假厘朐菌傳染病。此主要係由於免疫球蛋白是依據製備對 某種微生物之多株抗體之方法所製備，因此無法普遍作用 於數種掘綠假簞胞菌株。 已嘗試發展可抗铜錄假簞胞菌之具有老鼠單株抗體之 價廉治療劑[J Inf Dis, 152， 1290-1299, 1985〕或具人 類單株抗體之價廉治療劑[FEMS Micsobiol Immunol 64, 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403655
Α7 Β7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（32 ) lOOOOxg在4它再_心30分鐘，而得透明上澄液；因而所得 之蛋白質溶液僅由本質上純的細胞壁蛋白質構成，並以蛋 白質定量分析調整使蛋白質濃度維持在lng/Bl至2mg/ml之 程度。再者，蛋白質溶液之純度藉至15〆濃度梯度電泳 方式測定，結果，鑑定得具有分子量範圃自1〇, 0 0 0至 100,000之所需細胞壁蛋白質存在（參見第1圖）。 實例7 :和蛋白《姑麽紳化- 進行下列方法，使濃度為1至2*8/·1之粗細胞壁蛋白 質溶液純化，使其僅含有效成分。 2至2.5升粗細壁蛋白質溶液先於卩611丨(：011〇83361^6 条統中接受分子量100,〇〇〇切斷膜濾紙，以移除分子量超 過100,000之蛋白霣分子。依據此方法，以濾液回收分子 置低於100 ,000之蛋白質·且分子置大於1〇〇,〇〇〇之蛋白質 曲績循環以自分子量低於1〇〇, 〇〇〇之小分子中分離出來。 蛋白質溶掖濃编成初釀積之10至20〆，並依序以20至 25升（蛋白質溶液之初醴積之1〇倍量）之殺菌璀酸塩緩衝溶 液（每升 Ha2HP〇4 1.15g, KC1 0.2g， ΚΗ2ΡΟ4 0.2g, HaCl 8.766g)洗滌，以回收90Y或更多之分子置低於100,〇〇〇之 蛋白質。以濾液分_之分子量低於100,000之蛋白質施加 至相同条統中之分子量10,000切斷膜濾紙上，以移除分子 量小於10,000之蛋白質及其他雜質，且同時濃縮分子量在 10,000至100,000之蛋白質至leg/nl之濃度。 最後，使上澄液超離心以移除脂g_(LPS)及細胞壁 相醑之Η段，其可能以徹量存在於上述所得上澄液中。超 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) -裝. 、1Τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） 32 (修正頁） 403655_ΐ,_ 五、發明説明（。） 6 / 263-268, 1990]。此處，细胞系可自细胞銀行選擇而以细 胞融合技術製造最有效之中和抗體，接著此细胞系可使用 作為起始物而製得工業量產之所需抗艘。然而，此方法目 的旨在經由抗體製造而治療翻綠假翬胞菌傳染病，而非預 防疫苗。此外，此方法之缺點為由於所有傳染病係由、具有 不同血清學及免疫學類型之不同铜綠假簞胞菌株所引起， 因而無法僅K 一種簞株抗體治療，亦即，單株抗體治療法 無法用以治療所有受铜綠假單胞莆感染之病患。 為了擴大此方法之有效治療，已發展K其研究之交錯 反應性為準而同時投與數種抗體；此處，自受銅綠假.單JS 1_感染之病患收集血液並檢定感染之铜錄假單胞菌株之血 清學及/或免疫學種類，接著對病患投與適合此鑑定類型 之單株抗體。然而，此方法需要時間因而無法用於需要立 即治療之病患。 習知技術中，已提出使用自铜綠假翬胞菌株之细胞壁 蛋白質作為疫苗之抗原[參見Vaccine, Vol.7, ” 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製
Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine”， 1989]。]然而 ，上述參考文獻中提出之方法使用4種一般之銅綠假單胞 菌株，即 NN170041, NN170015, NN868及 NN170046,其係 未經減弱者，因此有存在著錮綠假單胞-菌._株本身之毒性之 問題。再者，由於由此種掘綠假單胞菌株製備蛋白質成分 之疫苗，细胞會遭破壞而釋入中度外來核酸及毒'性高分子 物質，脂多釀（LPS)中，其係存在於细胞質中。接著這些 6 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標半（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403655 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 86. 7. 〇7 年月曰 修正補充 A7 B7
五、發明説明（33 ) 離心像在4t!以180,000xg至200,000xg進行3小時。移除沈 澱物後，以經過0 . 2 « B濾紙而過濾殺菌所得上澄液，得 2 50至26〇Bg之用於預防銅線假單胞舖傳染病之疫苗之蛋白 質組成物。 實例8 :自具有不同免炼型：> 滅韶编線假蜃睢聞抶紳化細 朐壁蛋白皙 本發明之剩餘6種減弱銅線假單胞ϋ株，即C P C P A 10142, CFCPA 20 2 1 5 , CFCPA 4005 7 , CFCPA 502 43 , CFCPA 6 0 5 34及CFCPA 700 1 8依據實例5,實例6及實例7所 述之用以製備疫苗組成物之CFCPA 30720鋦綠假犟朐舖株 之撇生物培育及純化之相同方法處理。因而所得之最終I 線假翬胞蘭疫苗組成物在10至15〆濃度涕度SDS-PAGE中， 顯現與CFCPA 30720疫IS組成物相同之帶狀圖形。此外， 與標準分子量標記物比較之結果，可測定含於疫苗組成物 中之所有蛋白質具有自10,000至100, 000之分子量範圍（第 1_ ) 〇 實施例Θ :以紐合之杭鹿准行夺錨保_能力測試 依實例7及8之方法經分離及純化步驟後之各減弱銅線 經i胞J—.株所得之細胞壁蛋白質，以0.2Bg/U量以腹膜内投 與至重23至25g之6週齡ICR雄性老鼠中，以使動物免疫； 各組像由10至15隻测試動物組成。免疫一週後，毎組取用 2至3隻老鼠之血液供ELISA(酵素鍵結之免疫吸附分析）。 對剩餘IC R老鼠，則以實例2表2所列各微生物菌株之初 L D 5 〇值為1 0至5 0倍量，注射相當於各別免疫型之溫和型I - 裝 n n 訂 線 • * -(請先閱讀背面之注意事11再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS } Μ規格（210X 297公釐〉 33 (修正頁） 403655 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 7 ) 物 質 作 為 / 雜 質 併 入 所 得 疫 曲 中 而 增 加 投 與 疫 苗 所 需 之 謹 慎 性 並 可 能 限 制 其 用 途 0 因 而 9 本 發 明 人 廣 泛 研 究 一 種 可 有 效 誘 發 抗 體 抗 铜 綠 假蜃胞菌並 Μ 極 少 危 瞼 性 而 顯 規 良 好 免 疫 原 (即抗原）活 性 > 該 危 險 性 係 由 於 綠 假 單 胞 Μ-Μ 本 身 固 有 之 毒 性 〇 i 结 果 * 本 發 明 人 證 實 當 白 受 铜 綠 假 單 胞 1 感 染 之 病 患 中 單 離 之 铜 綠 假 單 m Μ 株 Μ 其 免 疫 型 而 分 類 成 7 種 f 且 接 著 各 純 菌 株 藉 使 有 機 體 通 過 適 宜 動 物 宿 主 數 次 而 減 弱 時 9 可 得 到 新 穎 安 全 且 減 弱 之 铜 錄 1 單 朐 爾 株 〇 這 些 菌 株 具 有 细 胞 壁 蛋 白 質 » 其 不 僅 可 用 於 製 備 預 防 铜 JL 假 單 胞 爾· 一傳 染 病 之 疫 苗 t 亦 可 使 用 作 為 抗 體 誘 導 物 以 製 得 用 於 動 物 體 之 铜 綠 假 單 m 爾 _傳 染 病 之 免 疫 球 蛋 白 〇 依 據 本 發 明 所 得 之 免 疫 球 蛋 白 對 各 種 緬錄假里胞蘭傳 染 病 (包含嚴重病情） 呈 現 優 異 之 治 療 效 果 〇 因 此 本 發 明 之 巨 的 係 提 供 — 種 具 有 细 胞 壁 蛋 白 質 且 可 圼 現 抗 原 性 而 無 錮綠假輩胞菌株 本 身 之 毒 性 之 新 穎 安 全 之 減 弱 掘錄假厘胞Μ株 0 本 發 明 之 又 一 百 的 係 提 供 一 種 誘 發 免 疫 反 應 之 疫 苗 Μ 於 接 受 此 疫 ++- 田 之 病 患 中 > 治 療 因 緬綠假單胞菌引 起 之 併 發 疾 病 〇 本 發 明 之 又 — 百 的 係 提 供 一 種 製 備 疫 苗 之 方 法 0 本 發 明 之 另 一 0 的 係 提 供 一 種 治 療 鐧錄假翬胞菌傳 染 病 之 治 療 劑 其 包 括 用 於 綑綠假單胞Μ株 之 至 少 一 種 免 疫 球 蛋 白 0 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 7 403( 403(
A7 B7 二發明説明) 可證實本發明之疫苗可有效抗目前發生於K院及病患中之 所有貌嫌假菫朐聞株〇 實例1 0 :細睢檗萑白皙：> 塞袢學測試 為了製備預防由銅線假翬胞_弓丨起之傅染病之成分疫 苗，需確信欲使用作為成分疫苗之細胞壁蛋白質本身之安 全性，及實例2所述之撤生物菌株本身之安全性。此實例 中，像部份純化細胞壁蛋白質，接著檢視其於實驗動物即 老鼠中之安全性。特別地，各減弱撤生物以胰蛋白大豆湯 汁作為培餐介質，於5升發酵器中培育，接著依實例5, 6 及7所述步驟處理。由減弱銅嫌假蚩胞舖株萃取之細胞壁 蛋白質之上澄液收集在一起，再次於4t：以lOOOOxg離心 30分鐘，以移除溶液中可能存在之細顆粒。所得細胞壁蛋 白質經由Anico膜濾紙過濾，而得分子量在10 ,000至 (請先閱讀背面之注意事3?#填寫本頁) 濃 其 物 合 混 質 白 i S 壁 胞 細 之 圍 範 以 著 接 度 0 質 白 得 而 0 殺 紙 濾 η 至M 翁毒 LV t 供
E 之 試 測 學 性 源 質 白 Ε 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 雄 50 R k C / 1 00 之0B 8 0 2 1 M2gs 0 k 2 / 1 g 耋 n ΙΪ o 為 2 物射 動注 驗内 實脈 用靜 所以 P 9 中組 試試 測測 學於 性對 骞 。 於鼠 老 性 ί- ο 3 水體 塩對 食現 理顯 生天 之1 — 第 gl後 k # / _ B1投 5 E 2 在 予組 給試 則測 組 ，照出對看 可 源 質 白 S 之表 量由 圏 2 β 及 常 官 正器 現各 顯 ， 則後 , 之 後或 天天 2 7 «3Λ3 後在 藥至 投甚 。 在，兆 但外m ，此或 用。變 作兆改 制擞別 抑別特 徹待現 略無發 之且未 加長並 增生中 38 (修正頁） 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2!0'〆297公釐） 403655 B7 403655 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（） 8 , 本發明之又一目的係提供一種製備免疫球蛋白之方法 0 前述概述本發明之更適切目的。這些目的需解釋為僅 用Μ說明本發明之某些更適切特徵及應用。許多其他有益 结果可藉Κ不同方法而應用所揭示之發明或在揭示範.圍内 改質此發明。據此，除了申請專利範圍所界定之本發明範 圍並配合附圖之外，本發明之其他目的及更完全；了解尚 可藉由參考發明概述及較佳具體例之詳细敘述而達到。 琎明級诚 本發明之一具體例係有闞一種具有可顯現抗原性而無 泪綠假Μ朐菌秩本身毒性之细胞壁蛋白質之新穎、安全且 有效之減弱之铜綠假里胞菌株。更特別地，本發明係有闞 安全減弱之掘錄假蜇胞菌株，其獲得係藉由自受銅綠假屋. 胞菌搏雄夕病患蜇雜緬錄假里胞菌株，依據Fisher-Devlin免疫型將單離之微生物菌株分類成7種類型，選擇 各兔疫型之單一代表性菌株，經由重複注射/單離/再注射 至實驗動物中之步驟而純化經選擇之菌株，並選擇7種類 型之额錄假埴胞菌株之各最減弱之菌株。 本發明之又一具體例係有關一種新穎疫苗及製備此供 預防掘錄假星胞菌傳染病之疫苗之方法。疫苗之製備係自 下述之各7種類型之安全減弱之飼綠假單胞_菌-株中分離本 質上呈純態之细胞壁蛋白質，並進一步純化所分離之细胞 壁蛋白質，接著較好合併衍生自至少3種類型k弱之飼i 假鑒朐蘭秩之純化细胞壁蛋白質；較好使用等量之得自各 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注^|^項再填寫本頁) 訂 4 Q 3.6 5 5 A7 B7 經濟部中夬橾準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（9 ) 1 1 3 種 類 型 之 細 胞 壁 蛋 白 質 以 製 備 本 發 明 之 疫 苗 Ο 1 1 1 本 發 明 之 又 一 具 體 例 傜 一 種 用 於銅._綠假單胞菌傳染病 * 1 i 之 治 療 劑 赘 其 含 有 至 少 一 種 免 疫 球 蛋 白 > 該 免 疫 球 蛋 白 像 • f«. 1 請 1 I 藉 培 養 至 少 一 種 安 全 之 減 弱 之銅一^.盤—單―胞_M—株 9 分 離 此 細 閱 | 讀 1 1 胞 壁 蛋 白 質 * 純 化 此 分 離 之 細 胞 壁 蛋 白 質 $ 接 箸 將 此 純 細 背 1 I 之 1 胞 壁 蛋 白 質 作 為 抗 體 誘 導 物 注 射 至 實 驗 動 物 中 並 誘 發 免 疫 意 1 # 1 球 蛋 白 而 製 得 者 及 —*‘ 種 製 備 此 治 療 劑 之 方 法 Ο 項 亦， 1 填’ ^ I 前 面 概 述 本 發 明 之 更 確 切 且 重 要 之 持 擞 以 使 下 列 之 % 本 裝 | 本 發 明 詳 細 敘 述 更 易 了 解 1 且 可 *=±=» 兀 全 認 知 本 發 明 對 本 技 蕕 頁 •—/ 1 1 之 貢 獻 0 後 述 之 本 發 明 額 外 持 徽 則 形 成 本 發 明 申 請 專 利 範 1 1 圍 之 的 〇 熟 悉 本 技 U 者 可 了 解 本 文 所 掲 示 之 概 及 特 定 1 1 具 體 例 可 輕 易 地 使 用 作 為 進 行 本 發 明 相 同 百 的 之 改 變 或 設 - 訂 | 計 其 他 結 構 之 基 礎 〇 再 者 » 熟 悉 本 技 U 者 可 了 解 對 等 結 構 - 1 I 並 未 違 離 申 請 專 利 範 圍 所 述 之 精 神 及 範 圍 〇 1 1 | ft. 式 之 簡 單 敘 W 1 I 線 為 了 更 充 分 了 解 本 發 明 之 性 質 及 百 的 9 需 配 合 附 圖 參 1 考 下 列 之 詳 細 敘 述 1 其 中 : 1 1 第 1圔顳示自本發明之減弱之鋇級假塱睢鋪株分_出 1 之 純 化 細 胞 壁 蛋 白 質 之 SDS- PAGE結果 ♦ 及 第2圖為代表以靜脈内注射本發明之減弱之| Ο ΙΛ 1_1 |_ 1 I 胞 Μ 之 細 胞 壁 蛋 白 質 之 雄 性 老 鼠 體 重 改 變 之 圖 形 0 1 1 | 谁 行 本 發 明 2 最 伴 槙 1 1 编拔假蜇胞蘭之F i s h e r -Devi i η免疫型分成7 種類型， 1 1 型 1 至 型 7 ·* 本 發 明 中 賣 係 選 擇 具 F i s h e r 免 疫 型 1 至 7 之 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ). Λ4規格（2丨Ο X 297公釐） 9 (修正頁） @6. 7. G7 修正 年月曰、士太 補充 403655 A7 _B7_ 五、發明説明（） 10 / 翻錄假盥朐菌株作為減弱之菌株，係基於在飼綠假里胞菌 感染之病患中大部份血液中，即90至95〆或更多血液中可 偵測到該等菌株之故。特別是，7種類型中，銅綠假.單.胞. Μ型1及型3為最常於受飼錄假單胞菌感染之病患中偵測 到之菌株。然而，本發明之教示可用於任何铜錄遐藍胞_菌_ 株而提供保護作用或治療。 依據本發明之安全減弱之飼綠假簞胞菌株之獲得，係 自已檢定患有缅錄假厘朐莆傳染病之病患血中，Κ純態單 離七種類型之網綠假單胞菌株，接著Κ重複純化步驟使單 離之菌株減弱而得。因而所得之安全減弱之翻錄單胞菌_株 為所有7種類型且分別命名為CFCPA 10142(Fisher型1), C F C P A 2 0 2 1 5 ( F i s h e r 型 2 ) , C F C P A 3 0 7 2 0 ( F i s h e r 型 3 ), 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 C F C P A ( 4 0 0 5 7 ( F i s h e r 型 4 ) , C F C P A 5 0 2 4 3 ( F i s h e r 型 5 )， CFCPA 60534(Fisher型 6)及 CFCPA 70018(Fisher型 7)。本 文中，CFCPA為"Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa"之每個單字首字組成之頭字語，而” Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa"係由本發 人腋務之公司Cheil食品化學公司（Cheil Food and Chemical Inc.,)與主要菌株名稱"銅綠假單胞菌（ Pseudomonas aeruginosa) ”所構成。 Μ前述重複純化步驟所得之減弱之飼綠假單胞菌_株具 有本質上與對應母菌株相同之表現型及微生物學性質， 但顯現可用於製備預防飼綠假單胞._菌_傅染病之^苗抗原之 新性質，而無減弱前母菌株所存在之任何致病原。據此， 10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
五、發明説明彳1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之減弱之額錄假里胞莆株為新穎之微生物菌株。因 此，這些菌株於1993年5月12日寄存於布達佩斯條約認可 之國際寄存櫬構之韓國脚合培養中心（Korean Federation of Culture Collections)(後文中表示為 KCCM),及於 2000 年1月27日寄存於中華民國食品工業發展研究_所 （P I R D I) ,寄存代碼為（^[{(：,寄存號磚對0?0?丨10142為1[(^»{ 10029 (CCRC 910139)， CFCPA 20215為 KCCM 10030(CCRC910lS8 )，CFCPA 30720為 KCCM 10031(CCRC 910137)，CFCPA 40057 為 KCCM 10032(CCRC 910136), CFCPA 50243為 K.CCM 10033 (CCRC 910135), CFCPA 60534為 KCCM 10034(CCRC 910134 )及匸卩(：1>兵 7 0 018為1((^1< 10035((^1^910140)。 製造減弱之綑後铒置_莆柱之純化步驟通常係重複進 行至菌株呈現所需之LD 5〇值。雖然純化步驟之次數係視技 術貝之热練程度，母菌株之毒性等而異，但純化步驟較好 進行3至7次，例如盲至捆錄倨S胞菌之LDso至少為2X 107细胞。依據本發明所得之新穎減弱之铜_.綠假單胞，.菌株 在老鼠中之LD50值較好為2.0X107细胞或更高。 本發明亦提供一種尉润錄假輩胞菌有免疫作用之疫苗 ，其製備係自本發明上述所得之各新穎之飼.綠假單胞_菌_株 中分離里純態之细胞壁蛋白質，接著進一步純化此分雔之 细胞壁蛋白質，並Μ某種混合比例.較好為等量之得自各 尋求免疫作用之所需篇後假里睢菌秩之细胞壁蛋白質，而 混合所得之纯化细胞壁蛋白質而得。亦即，各菌株之用量 用 〇作 量疫 之免 用有 作蘭 疫睢 免里 之枏 中後 型猫 類對 主種 宿一 定供 特提 於明 株發 菌本 發 ， 誘外 Μ此 足 為 到 得 而 絚 · 之件 弱條 減長 為生 撖之 特宜 其適 •持 法維 方時 之同 苗育 疫培 梅 堍 "中塊 器株 酵I 發睢 E S 在屋 j 0M_ {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS )八4規格（210X297公釐） 11 (修正頁） 403655 A7 B7五、發明説明（) 12 / 。所得微生物塊依據一系列之步驟處理，包含以有櫬溶劑 處理而萃取细胞壁蛋白質，以分子量為準之分餾，超離心 ，而得所需之细胞壁蛋白質。由7種類型之減弱之銅綠假 翬胞爾株衍生之所得细胞壁蛋白質，彼此Μ所需比例，較 好以等量在適宜構成中混合。 、. 製備本發明前述疫苗之方法可概述如下： 表1自減弱之飼綠假翬胞菌株分離並純化细胞壁蛋白質及 製備疫苗之步驟 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 培育7種類型之減弱之铜錄假蜃胞爾株 分離微生物细胞 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 分離之细胞+有機溶劑 细胞壁蛋白質之萃取 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公羞) ΪΤ 403655_ 五、發明説明（） A7 B7 13 Μ分子量為主之第一次分餾 (超過濾） 以分子量為主之第二次分豳 (超過漶） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 超離心（180,000g) 訂. 分離之细胞壁蛋白質 (MW 1 0 , 00 0 <<! 00,000 ) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 翻綠假盟朐菌诗苗 随後，本發明之疫苗組成物可參考其製備方法而更特 別地說明。 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 13 403655 a? __B7_ 五、發明説明（14) / 至於製備本發明預防飼錄假簞胞莆之疫苗，在第一步 驟中，7種類型之減弱之拥綠假里胞莆秩，即CFCPA10142 ,CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534及CFCPA 70018分別培育於適宜大小 之發酵器中；至於用於此目的之培着介質•胰蛋白大\豆汁 或較好為下列之特別介質適合用於培育上述之網綠假...羞胞- Μ_〇 特別介霣包含葡萄糖（3〇g/l),朦U5s/1), MgS〇4( 0 · 5 g / 1 ) , C a C 0 3 ( 5 g / 1 )，K Η 2 P 0 4 (1 g / 1 )，F e S 0 4 (5 祖 g / 1)， CuS〇4(5mg/l)及ZnS〇4(5mg/l)。此特別介質係本發明人對 培育编錄假置睢莆株所能獨特設計且係新穎者。據此，此 特別介質包含於本發明範圃内。當铜綠假一單朐爾株在此特 別介質內生長時，细菌塊之產率比於胰蛋白大豆汁中生長 之细菌塊高至少30〆（M乾细菌塊重量為準）。因此，使用 此種特別介質為較佳具體例。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再壤寫本頁) 於此细菌塊培育步驟中，逋宜之培養條件為：溫度 37*0，通氣率lvvm(體積/體積♦分鐘），及播種體_為5〆 v/v之培養介質溶液，且培育係在100rpB先携拌2小時， 接著在600γρβ授拌10至20小時，較好為12至16小時之攪拌 率下進行。 培育完成後，於第二步驟中，以離心等方法自培養溶 液中分離出沈澱之细菌细胞；分離之细菌细胞於第三步嫌 中K有機溶劑處理以使微生物去活化，且同時移除细胞壁 脂質成份。此第三步驟中，有櫬溶劑較好選自丙酮，氣仿 本紙張尺度逍用中國國家搮準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 14 Α7 Β7 經濟部中央標準局眞工消費合作社印製 至減緩媛壁需分 _ 記 5 未塩塩胞 所呈激標 即並酸織'细ίτο而質糖質 ，悬瞵磷取^因白己胞 質含如於萃 Η ，蛋或细 白胞 ，好以 壞性 _ 為 蛋细中較 ， 破毒氫作 壁其液 ，用 S 胞之去而 胞而溶等作ΓΡ细中酸 ， 细因於液 Κ00免質乳壞 。取 ，留溶加20遊胞定破 佳萃身保衝機至意细測遭 最複本胞媛質00注於藉否 為重胞细烷均6$1別在需是 酮括细物甲或υ特存，胞 丙包壊生基機 4 需與中细 Κ 驟破微胺合在 ，持驟定 ，步未 ，基混好中保步測 等四時的甲以較驟可取績 醇第 同目羥並取步質萃連 丁 ， ，此三 ，萃四白 ，而 , 後取於 -中 。第 蛋而 ， 醇随萃基液液質於壁因在 乙 次。溶溶白 ，胞 。存 , 6 失衝衝蛋外细離之 五、發明説明（15) 酵素。 随後，於上述步躲上澄液中所得之減弱銅綠假單胞菌... 株之细胞壁蛋白質接受第一次及第二次超過滤而分餾，僅 得到分子量介於10, 000與100,〇〇〇間之蛋白質。此步驟中， 非常重要者為所得细胞壁蛋白質之分子量係在000至 100,000之範圍内。理由為细胞壁蛋白質之分子量低於 10,000者無法提供動物實驗所測定之所需預防效果，而高 於100,000之分子量由於存在有高分子脂多糖（LPS)因而會 引起毒性效果。 由各7種類型之減弱之網綠假里胞菌分離之具有介於 10 ,000及100,000間分子量之细胞壁蛋白質各Μ超離心進 一步純化，而移除任何可能存在之少量脂多糖：接著進行 移除任何细菌物質之步驟，以最後獲得非致病原且純度足 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1 n I nwi HI I I 1^1 I I (請先H讀背面之注意事項再填寫本頁) 15 403655 A7 B7_ 五、發明説明（16 ) Μ使用作_預防铜綠假埴睢莆傅染病之疫苗之減弱翻錄假 翬胞爾株之细胞壁蛋白質。 (請先聞读背面之注^^項再填寫本頁) 由7種類型之減弱飼綠假里胞菌_株所得之细胞壁蛋白 質Κ特定比例混合Μ調配疫苗。當考處減弱前網綠假屋朐 母菌株之疾病發生率時，則藉由混合由至少3種類型、，更 好為4種或多種類型，且最好由所有7種類型之貌錄假里 胞i株所得之细胞壁蛋白質，而製得细胞壁蛋白質之組合 物。雖然混合比例係視欲混合之细胞壁蛋白質所得來源之 網錄假簟胞菌株之類型而定，但细胞壁蛋白質較好Μ等量 比例混合。 經濟部t央標準局貝工消費合作社印裝 例如，本發明之較佳疫苗組成物為含有得自CFCPA 10142, CFCPA 20215， CFCPA 30720及 CFCPA 60534之细胞 壁蛋白質 Μ 1:1:1.5:0.5; 1:1:1:1 或 0.5:1.5:1.5:0.5比 例混合所得者，或含有得自CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 3 0 72 0 , CFCPA 40057 , CFCPA 50243 , CFCPA 60534 及CFCPA 70018之所有细胞壁蛋白質W本質上等量之比例 混合所得之疫苗。存在於疫苗中之各綱錄假翬胞莆株之细 胞壁蛋白質混合物之最少量，為足K在目標宿主/病患中 誘發免疫作用之最小量。 若需要，本發明之預防飼錄假里胞菌傳染病之疫苗， 除了上述所得之细胞壁蛋白質成份外，尚可包含S藥可接 受賦形劑，例如氫氧化鈣，磷酸鈣，IS C0M(免疫剌激錯合 物），SAP-I(Syntex佐劑配方-1)，SAFm(改質之 Syntex戈 劑配方）及本技藝人士热知之類似賦形劑。 16 本纸張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 403655 - 經濟部中央梂準局貞工消費合作社印裂 五、發明説明（ ) 17 至 於 使 用 作 為 铜 錄 假 單 胞 星 Μ 染 病 之 預 防 疫 苗 參 投 與 劑 量 係 視 曝 露 於 綠 假 單 胞 菌 之 百 標 物 之 性 別 $ 年 龄 > 體 重 9 健 康 狀 況 等 而 異 * 但 通 常 為 0 . 5至2 .5 mg 之 得 白 各 減 弱 菌 株 之 细 胞 壁 蛋 白 質 之 混 合 物 〇 此 量 通 常 係 由 0 . 1 δ 至 〇. 5 g 乾 重 之 细 菌 塊 (相當於0 .5 至 2 . 5 g 溼 重 )所得者， 較佳、之投 藥 途 徑 為 肌 肉 內 注 射 〇 依 據 本 發 明 之 另 一 目 的 9 Μ 純 態 白 本 發 明 之 減 弱 铜 綠 假 單 胞 η 株 所 得 之 细 胞 壁 蛋 白 質 亦 可 使 用 作 為 抗 體 誘 導 物 Μ 於 實 驗 動 物 中 誘 發 免 疫球 裹 白 〇 因 此 * 本 發 明 提 供 一 種 治 療 铜 綠 假 單 朐 1 -傳 染 病 之 治 療 劑 9 其 含 有 刖 述 分 離 及 純 化 所 得 之 圼 純 態 之 细 胞 壁 蛋 白 質 注 射 入 實 驗 動 物 中 9 而 誘 發 製 造 錮綠假里胞菌之 免 疫 球 蛋 白 所 產 生 之 免 疫 球 蛋 白 0 特 別 地 » Μ 前 述 特 別 說 明 之 步 驟 9 白 本 發 明 之 減 弱 1 絲假單胞菌株 所 得 之 分 離 且 純 化 之 细 胞 壁 蛋 白 質 係 用 Μ 對 賁 驗 動 物 (如羊， 兔子等） 接 種 Μ 誘 發 相 闞 抗 體 形 成 之 抗 原 〇 白 實 驗 動 物 收 集 血 液 » 接 著 分 離 血 清 9 分 離 之 血 清 以 已 知 方 法 處 理 » 而 得 純 化 態 之 所 需 免 疫 球 蛋 白 0 基 於 此 巨 的 ) 免 疫 球 蛋 白 白 分 離 血 清 中 之 分 離 及 純 化 可 依 據 相 闞 技 術 領 域 眾 所 皆 知 之 方 法 操 作 [參見Ρ r a C t i c a 1 I 扣m u η 〇 1 〇 g y , 第 3 版 (1989) » 2 92 - 29 4] 9 例 如 > 使 分 離 之 血 清 與 蒸 餾 水 混 合 1 將 混 合 物 添 加 至 DE ΑΕ -纖維素（ 二 乙 胺 乙 基 繼 維 素 ), Μ 吸 附 免 疫 球 蛋 白 9 移 除 上 澄 液 9 且 接 著 磷 酸 塩 鑀 衝 溶 液 洗 滌 吸 附 免 疫 球 蛋 白 之 DE ΑΕ -纖維素數次， 而得純化免 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 17 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403655 at B7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（ ) 1 / 18 1 疫 球 蛋 白 〇 1 I 用 於 治 療 铜 綠 假 單 m 爾 傳 染 病 之 治 療 劑 之 免 疫 球 蛋 白 * 1 1 係 藉 由 含 某 種 比 例 之 白 各 種 減 弱 铜 綠 侷 單 胞 m Μ 分 離 出 請 先 1 之 细 胞 壁 蛋 白 質 之 混 合 物 對 實 驗 動 物 進 行 免 疫 所 得 者 〇 基 閲 讀 背 J 1 於 此 百 的 9 可 使 用 K 由 各 7 種 類 型 之 減弱 銅 綠 假 單 胞 Μ Μ 之 注 I 所 得 之 某 種 比 例 (較好為等量） 之 各 细 胞 壁 蛋 白 質 所 組 成 之 意 事 1 項 1 混 合 物 對 實 驗 動 物 免 疫 所 得 之 組 合 免 疫 球 蛋 白 〇 然 而 當 再 填 i 考 慮 各 免 疫 球 蛋 白 之 交 錯 反 應 性 時 f 以 白 CFCPA 10142 , 本 頁 裝 1 CFCPA 202 1 5 , CFCP A 30720及 CFCPA 60534 四 種 類 型 之 減 1 1 弱 铜 綠 假 單 胞 直 株 分 離 之 细 胞 壁 蛋 白 質 >λ 1 ： 1 ： 1 ： 1比例組 1 成 之 混 合 物 對 實 驗 動 物 免 疫 所 得 之 免 疫 球 蛋 白 f 可 對 具 有 1 訂 F i s h e r 型 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6及7 之 所 有 齦綠假蜇胞菌株 所 引 起 之 I 傳 染 病 提 供 枏 當 的 治 療 效 果 〇 此 為 用 Μ 治 療 由 錮綠假里胞 1 I M_?l 起 之 疾 病 之 較 佳 組 合 免 疫 球 蛋 白 治 療 劑 〇 1 1 本 發 明 之 铜 i 假 單 胞 爾 之 免 疫 球 蛋 白 可 以 凍 乾 狀 或 液 1 f 態 狀 調 配 成 轚 藥 組 成 物 » 且 若 需 要 ， 可 再 含 有 輅 藥 可 接 受 1 1 載 劑 • 例 如 安 定 劑 f 保 存 劑 ， 等 張 劑 等 〇 在 凍 乾 製 劑 之 情 1 I 況 下 > 可 使 用 之 翳 藥 可 接 受 載 劑 較 好 包 含 » 例 如 9 甘 露 糖 1 1 I 醇 * 乳 糖 9 蔗 糖 * 人 類 白 蛋 白 i 等 在 液 體 製 劑 之 情 況 下 I 1 » 則 包 含 生 理 食 塩 水 > 注 射 用 水 磷 酸 塩 緩 衝 液 氫 氧 化 1 1 鋁 等 0 I I 免 疫 球 蛋 白 之 劑 量 係 視 巨 標 物 之 年 龄 > 體 重 > 性 別 及 I I 一 般 健 康 狀 態 錮錄假簞胞菌傳 染 病 之 嚴 重 性 欲 投 與 之 I I 姐 合 免 疫 球 蛋 白 之 成 份 而 異 0 此 免 疫 球 蛋 白 通 常 對 成 人 經 1 1 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 18 403655 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（） 19 / 由靜脈内途徑投藥為每天每公斤體重為O.lng至lOOOmg, 較好為lug至100ag之量。 本發明可由下列實例作更特別之說明，但本發明並非 僅限於這些實例。 實例1 :白勞緬錄假璽朐Μ感染夕病庚中里謔锎錄假厘睢 莆秩及其鑑g 自受铜綠假里胞菌感染之病患取出之260個不同樣品 血液，各無菌地收集約1至5 ml,並在室溫靜置1小時。 血液於4C冰箱中貯存隔夜後，在41C下Ml500xg(g:重力 )離心10分鐘以移除固體物質並得上澄液血清。上述所得 血清水K 1:10之比例（血清對溶液）M磷酸塩缓衝溶液（每 升 NaH2P〇4 1.15g, KC1 0.2g, KH2PO4 0.2g, HaCl 8.766 g)稀釋，接著塗於預先製備之添加有1.0至1.5〆洋菜之胰 蛋白大豆汁培養皿上。培養皿於維持37C恒溫及通氣條件 下之恒溫箱中培育1 2小時或更久。所得培養基移至新的培 養皿中，接著Κ已知之微生物純單離方法[參見Thomas D. Brock 及 Michael T. Madigan 之 Biology of Microorganisffls(1988),第 5 版，第 32-33頁，Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey]M純態單離所需 微生物。 對於單離之铜錄假單胞菌株，其血清學及免疫學特徵 已經揭示（參見Bergey之手冊）且其鑑定可依據J. Gem. Microbiol, 130, 631-644, 1984所述分析方法，使用市 售分析套組而測定。各翻錄假單胞菌株培育於含5 m 1胰蛋 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 19 經濟部中央梂準局貝工消費合作社印製 403655 at B7五、發明説明（2〇 ) 白大豆湯ή"之試管中，接著於通氣條件下在37t：培育，而 調整细菌塊澹度，使其在6 5 0 n m之可見光下維持約2 . 0或更 大之吸收度。 自此培養溶液中無菌地'取出lml ,並在4C於6 000)cg 離心10分鐘，移除上澄培養溶液並添加等量之殺菌食塩水 \ 懸浮沈澱之微生物；含於套組中之測試血清及對照血清（ 正常兔字血清）各15W1添加至96洞微盤之各洞中，並與上 述所述之1 5 μ 1微生物懸浮液，K測定在1 0至3 0分鐘內是 否發生凝集作用。此研究中，由於具陽性凝集作用之洞中 之微生物菌株，與其内所添加之血清具有相同之血清型， 因而易於達到單離微生物之鑑定。. 實例2 :自客屋雜夕缅錄假Μ朐菌秩镄棰減弱夕缅錄假蜇 朐窗秩 為了減弱铜錄假單胞菌__株而得到用於製備疫苗之安全 微生物，選擇具有不同兔疫型之各網綠假單胞菌株之一菌 株，接著經由重複純化而減弱。 於此步驟中，選擇毒性之额錄假里胞菌株GN 11189( 日本Episone協會）作為對照組，該菌株在Μ靜脈内（或腹 膜内）注射2.0Χ 106细胞之GN11189於重20至25g之雄性 ICR小鼠中之後3天內，圼現100〆之致死率。 上逑選擇之具有不同免疫型之飼綠假單胞菌株之各菌 株，在與實例1相同條件下，培育於液態胰蛋白大豆湯汁 中，並在4t：W6000xg雔心10分鐘。所得细胞沈澱物懸浮 於10ml生理食塩水中，在上述相同條件下再次雔心，接著 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
•C 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 20 經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 403655五、發明説明（21 ) / K新鲜生理食塩水稀釋，Μ調整细胞含量至每ml為5X105 ,5 X 1 06, 5 X 1 07及5X108细胞。各稀釋液經靜脈內（或 腹膜内）途徑對10隻ICR老鼠組成之組群投藥。對對照組， 則以每對照動物為2.0X 106细胞之量投與GN11189。在3 天内對照組中致死率為100〆時，自殘活之ICR老鼠最高 细胞濃度無菌地單離飼錄假盥胞菌株。此單雛之掘綠假單 胞菌株再次塗於胰蛋白大豆洋菜四介質上，依前述之微生 物純單離方法，Μ純態單離各微生物菌株。 所有7種第一次減弱之微生物依據上述方法重複通過 ICR老鼠約3至7次，直至各微生物菌株達至少2.0Χ107 细胞之所需LD5〇;各最終減弱之飼綠假單胞菌株之安全值 KLDso表示而列於下表2中。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
*1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 21 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 4〇3655_wi_ 五、發明説明“） t 表2 本發明之減弱飼錄假里胞莆株之安全值 選擇之網綠 饅里胞菌株 Fisher-Devi in 免疫型 初 LDso 最終LDso V 測 CFCPA 10142 1 <1.5x i〇e 7.6X l〇7 CFCPA 20215 2 <1.4x l〇6 2.7X l〇7 試 CFCPA 30720 3 <2.0 x l〇6 2.5x i〇8 CFCPA 40057 4 <3.7 X l〇6 4.5x l〇7 菌 CFCPA 50243 5 <5.0 x i〇6 3.0 x l〇7 CFCPA 60534 6 <1.5 X i〇6 . 2.0 X i〇7 株 CFCPA 70018 7 <3.8x l〇6 2.7x i〇7 對照 菌株 GN11189 - - ----- 2.0 x i〇6 ----,—.----^裝------訂，--------r. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度速用中國國家搮準（CNS ) A4規格（210x297公釐全2 40365 A7 B7 五、發明説明（ 23 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 上述所有7種微生物均圼現至少2.0X107细胞之 LD5〇值。據此，已確認選擇到減弱之撖生物。 實例3 :減辟缅錄假罝朐菌秩之鑑宙 在121C髙壓釜中蒸氣殺菌15分鐘所製備之液體營養 介質（ΡΗ7.2-7.4)中添加殺菌之溴棕三甲銨（cetrimide) 10知（w/γ)至0.3〆（v/v)之終濃度。無菌地取出因而所得 之介質l〇ml ,接著導入試管中，於其中滴加一滴上述實例 2K純態單離之各減弱銅綠假單胞菌株，並接種，接著在 30至37C進行種培養12至16小時。由其中生長有微生物之 試管中，取出0.5ml培養溶液，塗於作為飼綠假單胞菌.單 離介質之溴棕三甲銨洋菜介質皿上，接著培育。首先藉顔 料形成而鑑定為飼錄假里菌之菌落移轉並培育於供偵測螢 光素之翻錄假厘胞菌洋菜介質（购:胰（Proteose peptone) 3號（(^〇丨(3)2如，甘油（雙稀釋）1涔，1^211卩〇4(無水）0.15涔 ，MgS〇4.7H2〇 0.15涔，洋菜 1.5%(W/V), ρΗ7·2)中，接 著培育於供偵測錄瞧菌素之_錄假輩胞菌洋菜（陳（D i f c 〇 ) 2〆，甘油（雙稀釋）1〆，K2S〇4(無水）1〆，MgCl2(無水） 0.14〆，洋菜1.5¥(W/V), ρΗ7·2)中，接著再次檢視形態 測試，營業需求及氧化酶測試，K測定铜綠假電胞._§_株之 存在。使用翻綠假蜇朐菌杭原套組（由Difco實驗室， Detroit, Michigan, USA製造）依據IATS分類糸統測定所 選擇之翻錄假埴胞蔺株之類型，接著KFisher免疫-血清 型分類，其結果述於下表3中。 * (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度速用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 23 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 403655_b7_ 五、發明説明（24 ) 表3選擇飼錄假蜇菌株及其血清型及保護範圍之標準 測試項目 測試結果 於單離介質上生長 生長 於供偵測之飼綠假單胞_ 生長 1株介質上生長 形態學特徵 兩端環繞且存在單一極性鞭 (顯微鏡） 毛 革蘭氏著色 革蘭氏陰性 氧化酶反應 陽性反應（+ )或陽性- 陰性反應（*) 抗原-抗體反應 (第一次選擇之菌株） CFCPA 20215 M Fisher免疫型2對Fisher型 3及7之保護（0-血清型7) CFCPA 60534 M F i s h e r免疫型6對F i s h e r型 3及7之保護（0-血清型5) CFCPA 10142 M Fisher免疫型1對Fisher型 2及1之保護（0 -血清型4) CFCPA 30720, M Fisher免疫型3對Fisher型 CFCPA 30721 6之保護（0 -血清型3) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本瓦) .·· ΐ .裝 '1Τ 24 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) Α4規格（210Χ297公嫠） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 403655_^_五、發明説明（25) 實例4 :減弱夕緬綠假璽睢莆秩夕物理恃榭 (1)測定Μ實例2減弱之7種類型铜綠假簞胞菌株在不 同pH值時之各生長率。各微生物菌株接種至pH值為7.2之 50ml胰蛋白大豆湯汁中，接著K 2 00rpm之攪動速率在需氧 條件中於3 7 t：預培育1 2至1 6小時。各預培育之细菌塊菌株 Μ 终濃度為 l/(v/v)接種至 pH3.0, ρΗ5.0, ρΗ7·0 及 PH9.0 之500ml各新鲜胰蛋白大豆湯汁中，接著於上述相同條件 下於3 7 Ό之發酵器中培育；此期間，以2小時間隔自各培 養介質中得到樣品，接著藉分光儀在600ηιη測量樣品吸收 度而測定细菌塊之澹度，其结果述於下表4。 表4隨pH值之微生物生長率 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 菌 株 pH3 . 0 pH5 . 0 pH7 . 0 pH9 . 0 C FC P A 10142 - + + + + + + + + + CFCP A 2 0 2 1 5 - + + + + + + + + + CFCP A 30 7 20 - + + + + + + + + CFCP A 40 05 7 - + + + + + + + + CFCP A 50 2 43 - + + + + + + + + CFCPA 6 0 53 4 - + + + + + + + + CFCPA 7 0 0 1 8 - + + + + + + + + + 5主：+生長，**未生長。 由表4可看出，本發明之減弱網綠假m胞菌株在過酸 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 25 A7 B7 403655 五、發明説明（26) 條件（姐在PH3.0)下不生長，但在pH5.0至pH9.0之介質條 件下，顯示本質上相同或類似之生長率，因此，在本發明 中，所有7種微生物可在寬廣pH範圍内生長得非常好。 (2)依據上述（1)之相同方法，Μ溫度變數測定翻錄假 單胞菌株之生長率。7種減弱之網綠假里胞菌株各接種於 pH值7.0之50ml胰蛋白大豆湯汁中，接著在200rpm攪動率 下，在37C及需氧條件下預培育12至16小時。各預培育之 菌株接種至pH值7.0之500ml胰蛋白大豆湯汁中，接著於維 持在25^, 30TC, 37Ί3及42Ό之不同溫度下，在上述相同 條件下於發酵器中培育。此期間，Μ分光儀在600nm測量 培養溶液之吸收度而測定各發酵器中之生長率。結果述於 表5。 表5 随溫度變化之微生物生長率 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本萸) '裝. 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 菌 株 25 υ 3〇 r 37 42 t： CFCPA 10142 + + + + + + + + CFCPA 2 0 2 1 5 + + + + + + + + CFCP A 30 720 + + + + + + + + + CFCPA 40057 + + + + + + + CFCPA 5 0 243 + + + + + + + CFCPA 6 0 5 34 + + + + + + + + + CFCPA 70 0 1 8 + + + + + + +
L 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 26 A7 403655 B7 五、發明説明（27) 註j +生長，-未生長。 由表5可看出，所有7種減弱貌錄假翬胞莆株在37t： 顯現最佳生長，且在3〇υ, 25·〇亦顯現良好生長。然而， 在42 υ時，相對於其他溫度之生長率，7種掘錄假厘睢蘭 株各顯示相當低之生長率。 (3)下列實驗係用Κ测定碳源對飼_綠假單胞菌株生長 率之效果。7種減弱之掘綠假翬胞菌株各接種於ρ Η 7 . 0之 50ml胰蛋白大豆湯汁中，接著在2 0 0 rpm搅動率下，於需氧 條件下在3 7 t：培育1 2至1 6小時。培養介質接著在4 C下於 無菌條件中，以6000xg雛心10分鐘，Μ收取细菌塊，接著 再懸浮於10ml生理食塩水中。上述所得微生物懋浮液各50 wl分別接種於含不同碳源（參見下列）之50ml M9介質（ Ha2HP〇4 7H2〇 12.8g, Κ Η 2 Ρ 0 4 3g , NaC 1 0 . 5g , NH4C 1 U),接著培育12小時。接著，對各培養溶液，藉600ηπι測 量吸收度而測定微生物生長程度。 Γ ^ ^ /1 裝 訂--.----.W (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 27 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 403655 A7 B7 五、發明説明（28) 表6隨f源不同之減弱湿摄显里胞H株之生長特徵
註：+生長，-未生長。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
，1T 本紙张尺度適用中國國家揲準（CNS ) Α4規格（210Χ297公嫠）狀 403655 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（29) 視碳源而異之減弱飼錄假簞胞菌株之生長特徵，圼現 與視碳源而異之一般铜綠假里胞菌秩之生長特徵（參見 Bergey’s手冊）有本質上類似之圖形。然而，需注意即使 铜錄假單胞菌通常不使用甘露糖，但本發明之減弱飼綠假 翬胞菌在含甘露糖之介質中圼現某些生長。 由上述可看出，本發明之減弱綱綠假蜇胞Μ株可於含 有碳源，氮源，無櫬化合物，胺基酸，維他命及其他營養 物之習知介質中，在需氧條件下，在選定之溫度，pH等培 育，而獲得细菌塊。由所得细菌塊而得之细胞壁蛋白質可 用於製備铜錄假蜇胞蘭疫苗。 至於培育減弱飼錄假翬胞菌株之碳源，可使用备種糖 r 類如葡萄糖，甘露糖醇，果糖等，各種有機酸如醋酸，丙 酮酸，乳酸等。而氮源，則可使用各種有機及無櫬銨塩， 朦，酵母萃取物，胳蛋白水解產物及其他含氮物質。至於 無機化合物，可使用硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，硫酸亞 網，硫酸鋅及磷酸氫鉀及磷酸二氫鉀等。培育較好在需氧 條件下在25至37"0下進行，例如Μ片吠培養或液體培養如 搖晃培養成充氣旋轉器培養之方式進行。在培育期間，介 質之pH值較好維持在ρΗ5至9。較好使用培育12至16小時之 培養溶液離心所得细菌塊作為製備後述疫苗之起始物。 實例5 :減弱缅錄假Μ朐菌株夕焙眘 (1)於5升發酵器中，如下述培育實例2所得之铜綠假 翬胞菌之细菌塊而大量製造。每1升蒸豳水溶解30g胰蛋白 大豆湯汁所得之2.5L介質溶液調整至PH7.2,殺菌，接著 T9 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4说格（210X297公釐） ^n. it— 广— HI 1 m - - K. ^^^1 I J.. ... > (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁)
-1T A7 B7 經濟部中央標準局肩工消費合作社印褽 五、發明説明（ 30 ) 導 入 5升發酵器中； 培育條件為： 培育溫度為37 υ ; 通氣 率 為 1 v v m * f 接 種 量 為由實 例 2所得減弱飼綠假里胞菌细菌 塊 之 5 〆（v / V) 培 養 溶液； 且 搜 動 率 為 最 初 2小時維持在 100r pm 9 隨 後 在 6 0 0 r p m 之 固 定 搜 動 率 下 繼續 培 育 12至 16小 時 0 雖 然 所 得 细菌塊 之 量 視 铜 綠 假 單 胞爾 Μ 之 種類而 有 些 許 不 同 9 但 平 均產率 為 每 升 培 養 溶 液 約8 g (乾重）之细 菌 塊 〇 (2)7 埔滅弱緬錄假蜇胞菌株各在上述（1) 之 相 同條件 下 培 育 但 使 用 由 葡萄糖 (30g / 1 ), 臃（ 15 g / 1 ) » Mg S〇4 ( 0 . 5 g / 1 ), C aC〇3 (5 g / 1), KH 2 P 0 4 (1 g/ 1) 9 FeSO 4 (5 m g / 1), C u S〇4 (5m 8/ 1) 及 Zn S 0 4 ( 5 ID g / 1) 所 組 成 之 用 於培 養 Μ. 綠假匿 胞 爾 之 特 別 介 質 作 為介質 0 而 此 特 別 介 質 ,對 各 微 生物菌 株 可 獲 得 約 10 .4 g.至 1 0 . 5 g (乾重） 之 细 菌 塊 〇因 而 ， 使用此 特 別 介 質 可 提 供 比 於胰蛋 白 大 豆 湯 汁 中 高 至少 30 (以乾 重 為 準 )之细菌塊產率。 實 例 6 ·· 白逋®缅錄假留朐誧秩郤份饨仆衄朐孽番白皙 為 了 製 備 抗 铜 錄假望 m 菌 疫 苗 白 各7 種 減 躬緬綠 假 單 胞 爾 Μ 部 份 純 化细胞 壁 蛋 白 質 〇 後 文 中， 使 用 型3菌 株 9 即 CFCP A 30720 (KCCM 1 00 3 1 )作為典型實例； 然而， 其 他 減 弱 铜 綠 假 單 朐菌秩 亦 可 以 下 列 純 化 方法 之 相 同方法 9 獲 得 部 份 純 化 之 细胞壁 蛋 白 質 〇 如 上 述 實 例 4 (2)所用 之 特 別 介 質 2 . 5升導入5升 發酵器 中 接 著 培 育 12 至 16小時 同 時 維 持 上 述 之 相同 培 育 條件 〇 培 育 完 成 時 > 2 . 5升之培養溶液在4 Μ 6 0 0 0 X g 離 心20分 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公漦） 30
,JT 403655 A7 B7 五、發明説明（ 3 1 鐘，移除上澄液。沈澱细胞再懸浮於4t!之磷酸塩鍰衝 溶液（每升 Na2HP〇4 1.15g，KC1 0.2g, 〇2P〇4 0.2g,NaCl 8.766g, pH7.2)中，再次雔心，接著M相同磷酸塩 鑀衝溶液洗滌。於130g所得细胞中，添加相對於初溼细胞 體積為3體積（約390ml)之丙酮，且混合物在4t：靜置12小< 時或更久。自沈澱细胞移除丙嗣，並再次於殘留物中添加 相對於初溼细胞體積為2體積（約260ml)之新鲜丙酮。所得 混合物攪拌5至10分鐘，接著在4t： M8000xg離心20分鐘； 移除上澄丙嗣並於殘留物中添加相同體積之丙嗣，混合物 依上述相同方法搅拌並離心，而移除上澄液。沈澱细胞於 室溫在片狀物上乾煉而移除丙酮，添加250ml之上述相同 j 磷酸塩鑀衝溶液而再懋浮乾煉之微生物，使終濃度調整至 10涔（v/v)。所得混合物在500至1500rpm速率下Μ均質器 質分 白 ， 蛋液 壁澄 胞上 细得 取鐘 萃分 Μ30 , 心 度離 溫XS 之00 V 4 持 *--二 維 時 同 鐘 分懸 10得 理所 處 〇 ο 1X 至 ο ο ο 8Μ 液 浮 浮 懸 次 再 而 液 溶 ff 媛 塩 酸 磷 之 積 揸 同 相 加 添 胞 细0 沈 離 得 取 萃 次二 第 行 進 下 件 條 同 相 取 萃 次 一 第 述 上 在 著 接 ---^----裝------訂--，-----J. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局只工消費合作社印製 壁 胞 细 取 萃 複 S 件 條 同 相 之 法 方 取 萃 次 - 第 如 〇 用 液使 澄 上 至 5 解 溶 之氫 抱 税 ΜΗΠΜ»-"'* 细酸 。 乳 胞即 细， 何質 任物 丨記 標 質 壊胞 破细 不為 心作 小質 時白 同蛋 , 定 次特 '3 量 测 質藉 白壊 蛋破 液有 澄併 上未 取而 萃取 各萃 拌經 搅質 並白 集蛋 收壁 〇 胞 定细 測信 而確 SIM 激試 糖測 己經 或係 _ 液 澄蛋 上質 各 Μ 後 最 液 澄 上 著 接 者 酶 激 糖 己 及0 氫 脫 酸 乳 質 白 本紙张尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403655
Α7 Β7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（32 ) lOOOOxg在4它再_心30分鐘，而得透明上澄液；因而所得 之蛋白質溶液僅由本質上純的細胞壁蛋白質構成，並以蛋 白質定量分析調整使蛋白質濃度維持在lng/Bl至2mg/ml之 程度。再者，蛋白質溶液之純度藉至15〆濃度梯度電泳 方式測定，結果，鑑定得具有分子量範圃自1〇, 0 0 0至 100,000之所需細胞壁蛋白質存在（參見第1圖）。 實例7 :和蛋白《姑麽紳化- 進行下列方法，使濃度為1至2*8/·1之粗細胞壁蛋白 質溶液純化，使其僅含有效成分。 2至2.5升粗細壁蛋白質溶液先於卩611丨(：011〇83361^6 条統中接受分子量100,〇〇〇切斷膜濾紙，以移除分子量超 過100,000之蛋白霣分子。依據此方法，以濾液回收分子 置低於100 ,000之蛋白質·且分子置大於1〇〇,〇〇〇之蛋白質 曲績循環以自分子量低於1〇〇, 〇〇〇之小分子中分離出來。 蛋白質溶掖濃编成初釀積之10至20〆，並依序以20至 25升（蛋白質溶液之初醴積之1〇倍量）之殺菌璀酸塩緩衝溶 液（每升 Ha2HP〇4 1.15g, KC1 0.2g， ΚΗ2ΡΟ4 0.2g, HaCl 8.766g)洗滌，以回收90Y或更多之分子置低於100,〇〇〇之 蛋白質。以濾液分_之分子量低於100,000之蛋白質施加 至相同条統中之分子量10,000切斷膜濾紙上，以移除分子 量小於10,000之蛋白質及其他雜質，且同時濃縮分子量在 10,000至100,000之蛋白質至leg/nl之濃度。 最後，使上澄液超離心以移除脂g_(LPS)及細胞壁 相醑之Η段，其可能以徹量存在於上述所得上澄液中。超 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) -裝. 、1Τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） 32 (修正頁） 403655 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 86. 7. 〇7 年月曰 修正補充 A7 B7
五、發明説明（33 ) 離心像在4t!以180,000xg至200,000xg進行3小時。移除沈 澱物後，以經過0 . 2 « B濾紙而過濾殺菌所得上澄液，得 2 50至26〇Bg之用於預防銅線假單胞舖傳染病之疫苗之蛋白 質組成物。 實例8 :自具有不同免炼型：> 滅韶编線假蜃睢聞抶紳化細 朐壁蛋白皙 本發明之剩餘6種減弱銅線假單胞ϋ株，即C P C P A 10142, CFCPA 20 2 1 5 , CFCPA 4005 7 , CFCPA 502 43 , CFCPA 6 0 5 34及CFCPA 700 1 8依據實例5,實例6及實例7所 述之用以製備疫苗組成物之CFCPA 30720鋦綠假犟朐舖株 之撇生物培育及純化之相同方法處理。因而所得之最終I 線假翬胞蘭疫苗組成物在10至15〆濃度涕度SDS-PAGE中， 顯現與CFCPA 30720疫IS組成物相同之帶狀圖形。此外， 與標準分子量標記物比較之結果，可測定含於疫苗組成物 中之所有蛋白質具有自10,000至100, 000之分子量範圍（第 1_ ) 〇 實施例Θ :以紐合之杭鹿准行夺錨保_能力測試 依實例7及8之方法經分離及純化步驟後之各減弱銅線 經i胞J—.株所得之細胞壁蛋白質，以0.2Bg/U量以腹膜内投 與至重23至25g之6週齡ICR雄性老鼠中，以使動物免疫； 各組像由10至15隻测試動物組成。免疫一週後，毎組取用 2至3隻老鼠之血液供ELISA(酵素鍵結之免疫吸附分析）。 對剩餘IC R老鼠，則以實例2表2所列各微生物菌株之初 L D 5 〇值為1 0至5 0倍量，注射相當於各別免疫型之溫和型I - 裝 n n 訂 線 • * -(請先閱讀背面之注意事11再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS } Μ規格（210X 297公釐〉 33 (修正頁） 403655 A7 ___B7_ 五、發明説明（） 34 逢遐單胞菌株,對各網綠假厘睢菌秩之保護效果繼嫌檢視 一週。結果，所有測試組均顯現對相對應之额錄假里胞菌 株有保護效果，且對所有收集之血液之ELISAs亦圼現良好 之正值，其代表免疫學反應之改良。 本發明中，製備可對因任何類型之掘錄假里胞菌株引1 起之傳染病呈現一般保謅效果之疫苗，可處理4種類型之 減弱綱錄假里胞菌株(三種為最常於人體傳染病中偵測到 之麵綠JS單胞菌株,及一種為若感染則難以克服之铜綠假 里胞蘭株,IPCFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720及 CFCPA 60534),而得以等量比例組合之细胞壁蛋 白質，接著檢視各免疫型網綠里胞菌秩之交錯保護能力。 由上述4種減弱掘錄假里胞.菌秩分離出之细胞壁蛋白 質K重量等量比例（1:1:1:1)姐合，組合之细胞壁蛋白質 K腹膜内對ICR雄性老鼠投藥，K使測試動物免疫。對照 組則姶予0.3ml磷酸塩缓衝溶液（毎升Ha2iIP〇4 1.15g, KC1 0.2s， KH2PO4 0.2g, NaCl 8.766g)。免疫一週後， 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本育) M m m m m m m Ρί苗免疫之各測試組及以磷酸塩鍰衝溶液 免疫之對照組，則κ自ιχιο8细胞至ιχι〇4细胞內以10 倍級數稀釋之5種不同灌度之铜綠假轚睢菌Μ腹膜内投與， 且一週後，計算測試動物殘餘數，而計算有效指數（EI); 其结果列於下表7,其中有效指數係定義為測試組中LD50 除Μ對照組中LDso之值。由表7可看出，由4種減弱錮錄假 厘胞菌秩,IP CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 及CFCPA 60534所得之细胞壁蛋白質組成之疫苗，具有對 本纸張尺度逍用中國國家橾準（CNS ) Α·4规格（210X297公釐） 34 經濟部中央榇準局貝工消费合作社印裝 403655 A7 _B7_ 五、發明説明（ 3 5 各免疫型之網綠假單胞菌株有3.0至18或更高之ΕΙ值。因 此，當認為具有至少2之ΕΙ值之疫苗表示為具有良好免疫 學效果時，可看出本發明之疫苗對由7種網綠假單胞菌株 任何一種引起之傳染病顯現良好之保護效果。 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 35 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 403655 A7 _ B7__ 五、發明説明（36) 表7资用4棰不同種類之減弱緬..逯假所製備之 翻錄假厘胞菌疮苗對各種類微生物之交錯保護能力 測驗菌株 兔疫型 血清型 Em CFCPA 10142之母菌株 1 06 9.5 CFCPA 20215之母菌株 2 011 13 CFCPA 307 20之母菌株 3 02 >18 CFCPA 400 5 7之母菌株 4 01 3 CFCPA 50243之母菌株 5 010 4.5 CFCPA 605 3 4之母菌株 6 07 8.4 • CFCPA 70018之母菌株 7 05 7 依據上述步驟，但所製備之细胞壁蛋白質混合物係得 自3種減弱之铜錄假塱朐菌株CFCPA 10142, CFCPA 30 7 20 及CFCPA 2 02 1 5 (I組），及使用由所有7種減弱銅綠假單胞. 菌_株製備之细胞壁蛋白質之混合物（II組）取代4種蛋白質 之混合物，其中該7種细胞壁蛋白質係以等量比例存在； 檢定此兩種疫苗對各飼綠假單胞.1.傳染病之交錯保護能力 ,其结果述於表8。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 37 表8 -源自3種（I組）或7種（I I組）減弱额綠假蜇胞菌株之 疫苗對各種類微生物之交錯保護能力測試 測試 組之LDso Em (- -) 測驗菌株 對照 組之L D 5 〇 I組 II組 CFCPA 10142之母菌株 14.3 9.2 CFCPA 20 2 1 5之母菌株 12.0 10.7 CFCPA 3 07 20之母菌株 >18.0 15.0 CFCPA 40057之母菌株 2.5 8.3 CFCPA 50243之母菌株 4.0 10.6 CFCPA 6 0 5 3 4之母菌株 3.7 9.7 CPCPA 7 0 0 1 8之母菌株 2.8 12.9 由上述實驗结果可看出，由於本發明之混合蛋白質成 分疫苗係由至少3種彼此顯現不同免疫型之減弱銅綠..假單. 睢菌秩所製備之细胞壁蛋白質所構成，因此與單種一般抗 原比較，此疫苗顯現對任何免疫型銅綠假單有優異之 保護效果。亦即，雖然本發明疫苗之有效指數隨著由減弱 猫錄假置朐菌秩所選用之微生物之種類及數目，由其所得 细胞壁蛋白質之混合比例，免疫學目錄及方法等而異，但 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 37 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
403( 403(
A7 B7 二發明説明) 可證實本發明之疫苗可有效抗目前發生於K院及病患中之 所有貌嫌假菫朐聞株〇 實例1 0 :細睢檗萑白皙：> 塞袢學測試 為了製備預防由銅線假翬胞_弓丨起之傅染病之成分疫 苗，需確信欲使用作為成分疫苗之細胞壁蛋白質本身之安 全性，及實例2所述之撤生物菌株本身之安全性。此實例 中，像部份純化細胞壁蛋白質，接著檢視其於實驗動物即 老鼠中之安全性。特別地，各減弱撤生物以胰蛋白大豆湯 汁作為培餐介質，於5升發酵器中培育，接著依實例5, 6 及7所述步驟處理。由減弱銅嫌假蚩胞舖株萃取之細胞壁 蛋白質之上澄液收集在一起，再次於4t：以lOOOOxg離心 30分鐘，以移除溶液中可能存在之細顆粒。所得細胞壁蛋 白質經由Anico膜濾紙過濾，而得分子量在10 ,000至 (請先閱讀背面之注意事3?#填寫本頁) 濃 其 物 合 混 質 白 i S 壁 胞 細 之 圍 範 以 著 接 度 0 質 白 得 而 0 殺 紙 濾 η 至M 翁毒 LV t 供
E 之 試 測 學 性 源 質 白 Ε 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 雄 50 R k C / 1 00 之0B 8 0 2 1 M2gs 0 k 2 / 1 g 耋 n ΙΪ o 為 2 物射 動注 驗内 實脈 用靜 所以 P 9 中組 試試 測測 學於 性對 骞 。 於鼠 老 性 ί- ο 3 水體 塩對 食現 理顯 生天 之1 — 第 gl後 k # / _ B1投 5 E 2 在 予組 給試 則測 組 ，照出對看 可 源 質 白 S 之表 量由 圏 2 β 及 常 官 正器 現各 顯 ， 則後 , 之 後或 天天 2 7 «3Λ3 後在 藥至 投甚 。 在，兆 但外m ，此或 用。變 作兆改 制擞別 抑別特 徹待現 略無發 之且未 加長並 增生中 38 (修正頁） 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2!0'〆297公釐） 403655 A7 B7 五、發明説明（） 39 表9 /減弱網綠假單胞菌株之细胞壁蛋白質源之急性毒性 學測試 組別 劑量 測試目 標物 殘漶/ 測試目 標物 註 測試組A 2 0 m g / k g 20 20/20 體重未改變 測試組B 1 0 0 m g / kg 15 15/15 僅在第1天 體重有改變 對照組 生理食 塩水 15 15/15 體重未改變 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '，東. -户 經濟部中央梂準局負工消费合作社印製 實例11 : 油睢壁番ft皙杭原袢夕涌 以實例10相同方式由減弱铜錄假單胞菌株部份純化所 得之细胞壁蛋白質使用作為抗原，並M〇.lfflg/kg或0.2iag/ kg之量靜脈内注射至ICR老鼠中，Μ使實驗動物免疫，免 疫一遇後，自老鼠組之各老鼠取出某種量之血液，自所收 集之血液分雔出血清，並依據ELISA方法[J.Clin. M i c r 〇 b i ο 1 . 1 5 , 1 0 5 4 - 1 0 5 8 , 1 9 8 2 ]测定抗體之形成。 首先，已調整至濃度為O.lmg/kg於塗覆鍰衝液（由 NaHCOs 2.85g, Na2C〇3 1.70g, H2〇 1升組成之 0.05M碳酸 本紙張尺度逍用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 39 4〇iCi A7 ' B7五、發明説明（Λη ) 4 0 液 溶 福 缓 塩 之 中 著 接 中 洞 各 之 盤 微 洞 例 在 實 在 10或 原時 抗小 之 備 製 ο 1- 應 反 溫 室 。加時 上添小 盤洞I 至各 著中 附盤 質於 白 ， 蛋後 使液 ，溶), 時水SA 小除(B 14移白 至 蛋 12白 應 反 溫 室 在 著 接 免 〇 未 份用 部使 餘 ， 剩中 之試 質測 白此 I S 至 酸 磷Μ 盤 後 成 完 應 反 之鑀 疫塩 ο ο IX 加 添 中 洞 各 於 並 次
至 加 添 11 W 應 反 V 4 清 血 牛 合 结 未 中 洞 之斷 擅 MOB 抗 之 組 照 對 為 作 清 血 鼠 老 液 溶 搜 體 抗 -1WH1 種 二 第 之
至老 5抗 縣T 洗子 2)兔 • P 7 B 時 小 1Α 應 反 溫 常 在 其 使 常 物 合 結 酶 化 氧 過 - S I 鼠 Η Ρ /1\ 液 洗 0 媛 塩 酸 磷 之 同 相Μ 盤 後 隨 烈 激 整 加 添 中 洞 各 中 盤 於 則 質 基 於 至 ο 次 多 更 或 次 7 滌 洗 Μ 塩 .1酸 (0塩 液二 溶胺 衝二 媛苯 塩鄰 酸之 Γ 塩0) 酸5. 樣ΡΗ 擰 ， 於液 度衝 鍰 塩 酸 磷 * 塩 酸 檬 檸 0. II- 0 / g ffl 4 ο 至 3 ο 至 5C液 加溶 添應 別反 分各 著對 接 ， ; 著 接 ο 應 反 之 中 洞 各 止 停 鐘 分 ο 2 應 反 處 暗 於 並
U Μ 酸 硫 量 測 儀 光 分Μ —^1. · ί - ! I— -I ..........- - I /. - »1--1 I- -.1 — I - ，？ » · (請先聞讀背面之注意事項再填k本頁) 度 收 吸 之 0 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 本纸張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（2〗0X297公釐） 40 經濟部中央梯準局負工消费合作社印裝 403655 A7 B7 五、發明説明.（41 ) 表10對各微生物之细胞壁蛋白質之抗體形成（490nm) 抗體稀釋度 (mg/kg) 1/5 1/25 1/125 1/625 1/3125 1/15625 對照組 0.16 0.15 0.29 0.47 0.41 0.43 測試組 0.1 0.29 0.25 0.32 0.52 1.1 1.2 0.2 0.76 0.67 0.50 0.49 1.3 1.4 ^^^—-—^1— ^^^1 ^^^1 ^nn ·. ---- —^ϋ * φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)丨 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 29Μ釐）41 403655 at B7 五、發明説明（42 ) 由表，10可看出，测試組中，投與0.1或0.2ii^/kg抗原 導致比對照組高2至5倍之免疫性。 實例12:翻綠假盥朐菌夕免谗球番白夕靱诰 實例7所得之蛋白質溶液投與至兔子上，而製得對應 之免疫球蛋白；雖然自減弱飼綠假翬胞蘭株CFCPA 30 7 2 0 i 所得之细胞壁蛋白質使用作為典型實例，但對其他減弱I 綠假蜃胞爾株施用相同方法。 使用由實例7之CFCPA 30720所得之细胞壁蛋白溶液 0.5至lml (含100至200«g细胞壁蛋白質），在7天間隔接種 至白化病兔子上三次，接著定期自各兔子取出血液並分離 血清，100ml之分離兔子血清與300ml蒸餾水混合，混合物 在41添加至500g(溼重）之DEAE-纖維素中。所得混合物在 4υ充分搖晃1小時，使其靜置，接著分離並移除上澄液。 剩餘殘留物Μ每次200ml之0.01Μ磷酸塩緵衝溶液（每升 Na2HP〇4 1 . 15g , KH2PO4 0 . 2g , KC 1 0 . 2g , NaC 1 8 . 766 g) 洗滌3次，得具96%或更高純度之免疫球蛋白IgG 600mg。 實例:免疮球番白對緬綠假里朐菌傳染病^谄椿放果 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印製 上述實例1 2所得抗銅綠假單胞菌株之免疫球蛋白，依 據下列方式檢視其對飼綠假單胞菌傳染病之治療效果。後 文中，各組使用10隻老鼠。
Fisher免疫型1,2,3,4,5,6及7之各致病原洞.錄假單胞 菌_株1.0 — 3.〇x 106细胞Μ腹膜内注射至各老鼠中，以引起 猫綠假璽朐菌傅染病。注射2至6小時内，各菌株之純化免 疫球蛋白Κ每隻老鼠為0.1至2mg量，靜脈内注射至各老鼠 42 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 403655 at B7 五、發明説明（43) 中，以翁視其治療效果。 在對照組中，以靜脈內注射0.5ml生理食塩水Μ代替 免疫球蛋白。此测試中，所用之免疫球蛋白為CPCPA 10142， CFCPA 20215， CFCPA 30720及 CFCPA 60534,或此 4種兔疫球蛋白Μ等量比例之混合物。 结果，僅接受生理食塩水之對照組在48小時内圼現 50〆或更高之致死率及在72小時後呈現100允致死率。而 接受對應之免疫球蛋白之測試組在72小時後，圼現80涔或 更高之殘活率。據此，可證明此免疫球蛋白可有效治療由 具有對應Fisher免疫型之致病原铜綠假單胞蘭株引起之傳 染病。然而，無任何單一免疫球蛋白對由具有Fisher免疫 型4及5之致病原飼錄假簞胞菌株引起之傳染病有效。 另一方面，接受重量比例組合4種免疫球蛋 白之組合之老鼠組，由於其交錯反應性，因此甚至對 F i s h e r 4及5類之铜綠假簞_菌株圼現優異之治療效果。 據此，本發明之組合免疫球蛋白組成物可使用作為由具所 有F i s h e r免疫型之網綠假里胞菌株引起之傳染病之有效治 療劑。此實驗结果概述於表11及12。 表11使用個別免疫球蛋白或其組合之免疫學保護效果 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 43 I--------.裝------訂--；----J (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局員工消费合作社印製 403655 A7 B7 五、發明説明（） 4 4 用於製備免疫 蛋白之菌株 球 Fisher免疫型 免疫球蛋白保護範圍 僅 CFCPA20215菌株 2 F i sher 型 3 , 7 ' 僅 CFCPA60534菌株 • 6 Fisher 型 3,7 僅 CPCPA10142菌株 1 F i sher 型 2，1 僅 CFCPA30720菌株 3 F i s h e r 型 6 CFCPA20215— 混 Fisher^ CFCP A6 0 5 3 4— 合 2,6,1,3 3,7,2,1,6,4 CFCPA10142 — 菌 及5 CFCPA30720—— 株 ^ 裝 訂------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 44 A7 經濟部中央橾準局負工消费合作社印裝 403655 B7 五、發明説明（45) 表1 2免疫球蛋白對铜綠假單胞菌株之免疫學保護之相互 闞係
(請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) ，、裝. -'8- 45 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403655 A7 B7 五、發明説明（4 β) 4 6 實例1 4 :·姐合夕免痔球番白對锢綠假塱睢Μ搏雄病夕谄痗 放果 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例13中選擇之4種減弱網綠假單胞菌株，即C F C P A 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720及 CFCPA 60534依據實 例5, 6及7之相同步驟培育並萃取，而得细胞壁蛋白質之 組合組成物，接著以實例1 3之相同方法，Μ 1 . 5至2 m g之量 ，以一週間隔接種至羊上3次，而得大量之組合網綠假單 胞菌免疫球蛋白，並依據已知方法純化[參見Practical I m m u η ο 1 〇 g y 第 3 販，（1 9 8 9 ),第 2 9 2 - 2 9 4 頁]。 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 為了測定上述所得純化及組合之免疫球蛋白對各種 Fisher免疫型之致病原飼綠假II胞菌之免疫學保護效果及 治療效果，將具有各免疫型之致病原铜綠假單胞菌株,K 每隻老鼠1.0至3. 0X106细胞之量，接種至已預先注射3次 該組合兔疫球蛋白組成物之老鼠組（6組：每組20隻）及另 一組老鼠組（6組：每組10隻，其未接受免疫球蛋白組成物 ),Μ觀察此組合免疫球蛋白之免疫學保護效果。此外， 於另一老鼠組（6組：每組10隻）中，先接種致病原銅綠假 屋朐菌秩，及2至6小時後，Μ每隻重約20至25g老鼠為0.1 至5mg之量靜脈内注射上述所得之組合免疫球蛋白組成物， K觀察本發明免疫球蛋白組成物之治療效果。 由其结果，可證明本發明之組合免疫球蛋白組成物圼 現80涔或更高之免疫學保護效果，及75涔或更髙之治療效 果（M7天後殘活率（〆）測定），而所有對照組均在3天内死 亡〇 46 本紙張尺度逍用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 403655 _ B7_ 五、發明説明（47) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 據此，可決定本發明之組合免疫球蛋白組成物可使用 作為同時顯現優異治療效果及免疫學保護效果之有用發藥 劑。 實例15:免痔球番白夕辋配 依據實例5, 6及7之相同方法，藉使4種實例13中選擇 之減弱飼綠假單胞菌株，即CFCPA 10142, CFCPA 20215， CFCPA 30720及CFCPA 60534進行培育及萃取所得之细胞壁 蛋白質組合物，Μ實例14之相同方法，投與至雄性羊身上 ，而得分離及純化之組合鋼綠假簞胞爾免疫球蛋白，接著 使用各種醫槩可接受載劑調配，因而可以每公斤體重投與 1至lOOmg抗體免疫球蛋白。調配之免疫球蛋白投與至受I 綠假簞胞菌感染之老鼠上，以測定免疫球蛋白視所用載體 種類之效率。至於此结果，在液體配方之情況下，Μ注射 用生理食塩水或磷酸塩媛衝溶液作為載體之免疫球蛋白製 劑呈現高效率，及在凍乾配方之情況下，使用甘露糖醇， 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 蔗糖或乳糖作為載劑則可提供高效率之免疫球蛋白製劑。 另一方面，在凍乾配方中，人類白蛋白與本發明之鋼綠假 翬胞蘭免疫球蛋白一起使用會降低免疫球蛋白之效率，且 在液體配方之情況下，使用氫氧化鋁作為醫藥載劑則顯現 低效率。測試結果述於表13。 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 40·, Lb；. A7 B7 五、發明説明（48) 表13視路藥載劑而異之额綠假里朐菌免疫球蛋白之效率 配方種類 構成要素 效率 凍乾配方 純化之組合免疫球蛋白 組成物+甘露糖酵（5-20涔） 純化之組合免疫球蛋白 組成物+乳糖 （5-20涔） 純化之組合免疫球蛋白 組成物+蔗糖 （5-20〆） 純化之組合免疫球蛋白 組成物+人類白蛋白（1-5涔） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 方 配 橿 MM 液 水 求水 塩 蒸 疫 疫 食 用 免 免 理 射 合 合 — 生 i 注 组 + 绍 + 之 物之物 化成化成 純組純組 白 β § 經濟部中央標準局貞工消费合作社印製 例 實 白 B πβ 球 疫 免. 合 組 之 化 純 酸、 合 磷 + 組 物之 成化 組純 液 溶 Ky 8 緩 塩 白 蛋 球 疫 免 劑 溶 + 鋁 化 氧 氫 + 物 成 組 率 效 之 物 成 細 白 β S 球 疫 免 之 配 調 + + + + 緩 塩 酸 磷 與 之 率. 效 高 供 提 可 樣 一 ml/ 结 試 測 之 5 1± 例 實 與 48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403655 A7 B7 五、發明説明（49) 衝溶液調配之免疫球蛋白，檢視測定其作為裂傷，灼傷， 創傷等之二级皮嫌傳染病之預防劑及治療劑之效率。一老 鼠依據灼傷測試步驟[參見J. Infect. Dis. 1 3 1, 6 8 8 - 6 9 1, 1 9 7 5 ]進行灼傷。每lml磷酸塩緩衝溶液含0.5至lmg 組合铜綠假單胞菌免疫球蛋白之液體製劑，調配成噴霧劑 ,接著施用至測試組老鼠之受灼傷部份，Μ測定其與未Μ 免疫球蛋白噴蓀處理之對照組比較之效果。此實驗結果， Κ免疫球蛋白-磷酸塩媛衝溶液噴霧處理之老鼠組，比未 處理組顯現顯著之更高殘活率。據此，可證明本發明之含 额錄假翬胞菌免疫球蛋白之製劑，對鋼綠假單胞莆傳染病 圼現優異之保護效果及優異之治療效果，此實驗结果述於 下表14。 ,, ^ ·...裝 訂 t (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Β7 五、發明説%丨) -表14灼傷測試結果 治療 老鼠 數目 銅綠假 單胞菌 接種 殘活率 2 4小時 48小時 72小時 96小時， 灼傷（Μ免疫球 20 局部接 20/20 19/20 16/20 16/20 蛋白處理者） 種 灼傷（未Κ兔疫 20 局部接 18/20 4/20 0/20 - 球蛋白處理者） 種 對照組 10 未接種 10/10 10/10 10/10 10/10 ---^---_-----、裝—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，1T'. ί. 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 本紙張尺度逍用中國固家梯準（CNS )_Α4規格（210X297公釐） 50 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 403655 A7 _B7_五、發明説明（） ο I 如上述，本發明之各減弱铜綠假翬胞菌株相對於天然 的或致病原物種，為安全者。此外，由於其细胞壁蛋白質 顯現優異之安全性及交錯保護性質，且亦有優異之中和抗 體形成能力，因此，此细胞壁蛋白質不僅可使用作為預防 铜綠假Μ朐Μ傳染病之疫苗，且可作為實驗動物中$抗體 誘導物Κ產生可使用作為銅綠假單胞菌.傳染病之治療劑之 免疫球蛋白。據此，可看出本發明之減弱飼綠假單胞I.株 為製備翻綠假罝胞菌傳染病之預防疫苗及治療劑之非常有 用之微生物。 ------^----裝------訂'--Κ----d. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國囷家揲準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 51
Claims (1)
- 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 附件- 403655 H3 第83105105號專利申請案 一~申-错専利範j圍修正本 公告衣 （89年6月21日） 1. 一種疫苗組成物，係用Μ對翻綠假輩胞菌（Ps.eud.Q.JLQn.as. aeruginosa)傅染病產生免疫作用者，該組成物包括選 自下列組群之至少一種掘綠假里胞菌株: 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910139(CFCPA 10142)之網錄假里胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910138(CFCPA 20215)之掘錄假單胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910137(CFCPA 30720)之浪綠假翬胞莆株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910136(CFCPA 40057)之铜錄假翬胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910135(CFCPA 50243)之铜綠假翬胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910134(CFCPA 60534)之網錄假里胞菌株，及 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910140(CFCPA 70018)之網綠假里胞菌株。 2 . —種對由翻綠假翬胞菌引起之疾病產生免疫作用之疫 苗組成物，該姐成物包括得自選自下列組群之至少一 種減弱非致病原網綠假單胞_M_株之细胞壁蛋白質之非 致病原抗原： 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS )A4規格（210 X 297公衰)經濟部中央標準局員工福利委員會印製 附件- 403655 H3 第83105105號專利申請案 一~申-错専利範j圍修正本 公告衣 （89年6月21日） 1. 一種疫苗組成物，係用Μ對翻綠假輩胞菌（Ps.eud.Q.JLQn.as. aeruginosa)傅染病產生免疫作用者，該組成物包括選 自下列組群之至少一種掘綠假里胞菌株: 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910139(CFCPA 10142)之網錄假里胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910138(CFCPA 20215)之掘錄假單胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910137(CFCPA 30720)之浪綠假翬胞莆株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910136(CFCPA 40057)之铜錄假翬胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910135(CFCPA 50243)之铜綠假翬胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910134(CFCPA 60534)之網錄假里胞菌株，及 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910140(CFCPA 70018)之網綠假里胞菌株。 2 . —種對由翻綠假翬胞菌引起之疾病產生免疫作用之疫 苗組成物，該姐成物包括得自選自下列組群之至少一 種減弱非致病原網綠假單胞_M_株之细胞壁蛋白質之非 致病原抗原： 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS )A4規格（210 X 297公衰) H3 910139(CFCPA 10142)之翻綠假里胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910138(CPCPA 20215)之網錄假里胞菌株, 具有中華民画食品工業發展研究所寄存號CCRC 910137(CFCPA 30720)之钃綠假簞胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910136(CFCPA 40057)之額錄假蜃睢菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910135(CFCPA 50243)之網綠假單胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910134 (CFCPA 6 0 5 3 4 )之鋇錄假蜇胞菌株.及 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910140(CFCPA 70018)之掘錄悔翬朐菌株； 其中，該免疫作用係藉由將足Μ在受注射者内誘 發免疫反應之量的該組成物注射入需產生該免疫作用 的人體内，Μ預防随後由綱綠假蜃胞菌引起之疾病。 經濟部中央標準局員工福利委月會印製 3. 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其中衍生自減 弱翻錄假翬胞菌株之细胞壁蛋白質具有10,000至 9101, 0 0 0之分子量範圍。 4. 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其中细胞壁蛋 白質係以肌肉內注射投藥者。 5 . —種對由綱綠侮單胞菌引起之疾病誘發免疫反應之非 致病原疫苗組成物，包括衍生自選自下列組群之至少 一種減弱飼綠假里胞Μ株之细胞壁蛋白質之混合物： 具有中華民國食品工桊發展研究所寄存號CCRC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )A4規格（210X 297公釐) 403655 H3 910139(CFCPA 10142)之期嫌假里胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910138(CFCPA 20215)之编錄假翬胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910137(CFCPA 30720)之掘錄假里胞菌株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910136(CFCPA 40057)之铜綠假里胞菌秩, 具有中華民画食品工桊發展研究所寄存號 CCRC 910135(CFCPA 50243)之網錄假單胞爾株, 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號 CCRC 910134(CFCPA 60534)之網錄假翬胞菌株，及 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910140(CFCPA 70018)之網綠假翬胞菌株； 而可誘發免疫反應，Μ預防皤後由銳錄假里胞莆 引起之疾病。 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 6. 如申請專利範圍第5項之疫苗姐成物，其中減弱飼綠 悔轚_莆秩包括至少3種選自下列之菌株：CFCPA 10142. CFCPA 2021 5 , CFCPA 30720 , CFCPA 40057, CFCPA 502 43, CFCPA 60534及 CFCPA 7 00 1 8 〇 7. 如申諝専利範圃第6項之疫苗組成物，其中減弱篇錄 梅蜃_莆按係由下列所姐成：CFCPA 10142, CFCPA 20215¾ CFCPA 30720〇 8. 如申請專利範匾第6項之疫苗組成物，其中減弱篇1 梅盟睢锸秩係理自下列之組群：CFCPA 10142, CFCPA 202 1 5, CFCPA 307 20 及 CFCPA 60 5 3 4 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )A4規格（210 X 297公簸) 3 Fn A a 40 Η 13 · 14 · 15 . 16 經濟部中央標準局員工福利委貝會印製 17 . 18 · 19 · 同時以確定作為细胞質禰記酵素之乳糖去氫_或己糖 隳之存在，而测定網綠假里胞菌株之细胞是否遭破埭； (i) 使此萃取之细胞壁蛋白質進行超遇濾，K僅選 擇分子量範圍在10,000至100,000之细胞壁蛋白質； (j) 使细胞壁蛋白質超_心以進一步移除任何脂多 糖及任何细菌物質； (k) M純態回收所選擇之细胞壁蛋白質；及 (l) 使用此選擇之细胞壁蛋白質作為抗原物質以誘 發免疫作用而製備疫苗。 如申請專利範圍第12項之方，其中萃取係將經處理之 網錄假翬胞菌细胞置於媛衝溶液中而進行。 如申請專利範圍第13項之方法，其中缓衝溶液係選自 磷酸塩鑀衡溶液及三羥甲基胺基甲烷媛衝溶液所組成 之姐群。 如申請專利範圍第12項之方法，其中细胞壁蛋白質之 萃取係藉使细菌塊靜置或K混合機或均質機作用於經 處理之铜錄假輩胞菌细胞上而進行者。 如申請專利範圍第15項之方法，其中混合機係在41C於 100至2000rpm下操作者。 如申請專利範圍第12項之方法，其中萃取係進行5至6次。 如申請專利範圍第12項之方法，其中有櫬溶爾係選自 丙酮，氛仿，乙酵，丁酵之組群，且最好有櫬溶劑為 丙嗣。 如申請專利範圍第12項之方法，其中單離之銅錄假1 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS )A4規格（210 X 297公董） 5 403655 H3 _ _a—株包含 CFCPA 10142, CFCPA 20215，CFCPA 30720 ，CFCPA 40057 , CFCPA5 0243, CFCPA 60534¾ CFCPA 7001 8 〇 2 0.如申請專利範圃第12項之方法，其中第二種培着介質 係選自胰蛋白大豆湯汁及包括葡萄糖（30g/l), (15g /1), MgS04(0.5g/l), CaC〇3(5g/l), ΚΗ2Ρ〇4(18/1), FeS〇4(5ng/l , CuS〇4(5mg/l)及 ZnS〇4(5aig/l)之培養介 霣之組群。 21 .如申謫專利範画第12項之方法，其中減弱钃後《苗睢 I培育條件包括：溫度37P,通氣率lvvn(體積/體積 分鐮）及播種饅積為培養介質溶液之5涔v/v,而培育係 先在lOOrp·攪拌率下進行2小時，接著在600rp·進行1〇 至2 0小時，較好進行1 2至1 6小時。 經濟部中央標準局貝工福利委員會印製 2 2 . —種於患有掘後假璽_ M-傳染病之病患中治療此傅染 病之治療劑組成物，該姐成物包括至少一種對至少一 種緬錄假里胞莆秩有特異抗性之免疫球蛋白，其中該 免疫球蛋白係藉由注射衍生自至少一種理自下列之減 弱篇綠假翬胞菌株之细胞壁蛋白霣至缠宜宿主中而誘 發者： 具有中華民國食品工業發展研究所寄存號CCRC 910139(CFCPA 10142)之钃錄遐_單胞菌株, 具有中華民_食品工業發展研究所寄存號CCRC 910138(CFCPA 20215)之 _ H.胞菌株, 具有中華民B食品工業發展研究所寄存號CCRC 910137(CFCPA 30720)之綱嫌昼_軍.胞菌株, 本紙張尺度適用中國國家楳準（CNS ) A4规格（210 X 297公«) 6
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