ES2270433T3 - Una vacuna con adyuvante que esta sustancialmente libre de albumina no del huesped. - Google Patents
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Abstract
SE MUESTRA UNA VACUNA ADYUVANTE BASADA EN SUERO QUE ESTA SUSTANCIALMENTE LIBRE DE ALBUMINA EXTRAÑA Y EL USO DE LA MISMA EN LA REDUCCION O PREVENCION DE LAS REACCIONES SISTEMICAS POSTVACUNACION.
Description
Una vacuna con adyuvante que está
sustancialmente libre de albúmina no del huésped.
La presente invención se refiere a vacunas
basadas en suero que contienen albúmina del huésped y están
sustancialmente libres de albúmina no del huésped y a
procedimientos para prepararlas y usarlas. Más específicamente, la
presente invención se refiere al concepto de la invención de
vacunas que previenen o reducen sustancialmente las reacciones
sistémicas adversas post-vacunación asociadas con
regímenes de vacuna adyuvante.
Se conoce en la técnica que la vacunación de
animales con regímenes de vacuna que implican el uso de adyuvantes
puede provocar reacciones sistémicas adversas. El régimen de vacuna
puede comprender la administración de vacuna inactivada que
contiene un adyuvante. Como alternativa, el régimen de vacuna puede
comprender la administración de una vacuna viva modificada y una
vacuna inactivada que contiene un adyuvante. De forma ilustrativa,
la mayoría de los regímenes de vacuna felina comprenden la
administración de una vacuna que contiene un organismo vivo
modificado de forma concomitante con una vacuna que contiene un
organismo inactivado y un adyuvante. Con estos regímenes de
vacunación se asocian reacciones sistémicas adversas
post-vacunación. Por ejemplo, el uso de vacunas
contra leucemia felina (FeLV) puede causar reacciones
post-vacunación incluyendo salivación excesiva,
vómitos y diarrea. Véase la monografía sobre la vacuna
FEL-O-VAX Lv-K en el
Compendium of Veterinary Products, página 486, Tercera Edición,
1995-1996. Las reacciones sistémicas adversas
incluyen anafilaxis, hipersensibilidad y reacciones atípicas tales
como vómitos y diarrea.
Contrariamente al concepto de la presente
invención, la técnica anterior ha atribuido las reacciones
sistémicas anteriormente mencionadas a la presencia de adyuvantes,
endotoxinas, residuos de restos celulares, alta concentración de
virus vivos modificados o alta masa antigénica. Dodds, Vaccine
Safety and Efficacy Revisited: Autoimmune and Allergic Diseases on
the Rise, Vet. Forum, págs. 68-71, mayo, 1993
observó un aumento en enfermedades autoinmunes y alérgicas
post-vacunación. Dodds ha postulado que el aumento
se debe a la carga inmunológica sobre animales susceptibles
expuestos a una vacuna de combinación que contiene organismos vivos
modificados y bacterias muertas, potenciadas administradas al mismo
tiempo (como diluyente). Dodds también postuló que la carga
inmunológica se produce por el efecto de los organismos vivos
modificados.
La búsqueda de vacunas seguras y eficaces ha
estado limitada por la escasez de información con respecto a la
fuente del problema de las reacciones
post-vacunación. No hay indicación, en la
bibliografía o de otra manera, que indique que estas reacciones
sistémicas podrían estar provocadas por una interacción de albúmina
no del huésped con un adyuvante. El uso dominante de albúmina no del
huésped en presencia de adyuvantes está indicando lo contrario. Los
perros reciben vacunas contra la rabia potenciadas al mismo tiempo
que reciben vacunas de combinación vivas modificadas que contienen
albúmina no del huésped. Los gatos reciben vacuna contra FeLV
potenciada en un régimen de vacuna que comprende la administración
concomitante de una vacuna viva modificada que contiene albúmina no
del huésped. Además, las combinaciones de albúmina y adyuvantes se
usan comúnmente en la técnica para evaluar la eficacia de
adyuvantes. La albúmina, generalmente en forma de Albúmina de Suero
Bovino (BSA), se formula con diversos adyuvantes y cada formulación
se inyecta en animales no bovinos. Se toman muestras de sangre de
los animales en alguna fecha posterior, y sus sueros se miden para
respuestas de anticuerpos a BSA. Se considera que los animales que
muestran las mejores respuestas de anticuerpos han recibido los
adyuvantes más eficaces. Prince y col, Patente de Estados Unidos Nº
4.164.565 describe el uso de albúmina no del huésped como
estabilizante en vacunas. Wiedmeier y col., Pediatric Research Vol.
3, página 262-267, septiembre, 1987 describe
reactividad en ratones producida mediante inmunización con
Bordetella pertussis combinada con Albúmina bovina. En
particular, Wiedmeier y col muestran que la causa de reactividad es
la toxina de pertussis en combinación con albúmina.
Para ayudar a reducir las reacciones sistémicas,
se pueden purificar vacunas para retirar componentes de las mismas
que presumiblemente provoquen las reacciones sistémicas. Las
preparaciones de vacuna animal se purifican típicamente mediante
procedimientos convencionales tales como filtración, diafiltración o
centrifugado para retirar componentes tales como células y restos
celulares. Otros procedimientos de purificación que producen
antígenos altamente purificados se emplean pocas veces porque su
coste es prohibitivo en la preparación de vacunas animales. La
cromatografía en columna es ilustrativa de los otros procedimientos
de purificación, incluyendo cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de interacción
hidrófoba. Además, los antígenos altamente purificados son difíciles
de potenciar con los adyuvantes usados comúnmente porque no son lo
suficientemente eficaces para estimular una respuesta protectora con
antígenos purificados. En todo caso, estos procedimientos de
purificación no fueron eficaces para retirar albúmina no del
huésped de vacunas o precursores de las mismas.
La técnica no ha atribuido la causa de
reacciones sistémicas a la presencia de adyuvantes y albúmina no del
huésped. Sin ninguna duda, la técnica no ha atribuido la causa de
reacciones sistémicas a la presencia de albúmina no del huésped en
el régimen de vacuna que implica el uso de adyuvantes.
El documento EP327305 describe un procedimiento
para la preparación de una vacuna de subunidad recombinante contra
infección por pseudorabies, en el que el virus se cultiva en suero
bovino fetal y la vacuna de subunidad se purifica en una columna de
lectina.
Mediante la presente invención, se ha constatado
que la presencia de albúmina no del huésped en una vacuna o régimen
de vacuna potenciada puede provocar reacciones sistémicas. Mediante
la presente invención, se proporciona una nueva vacuna o régimen de
vacuna potenciada basada en suero que está sustancialmente libre de
albúmina no del huésped y un procedimiento de preparación de la
misma.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención abarca una vacuna basada en suero que comprende una
cantidad inmunogénicamente eficaz de un antígeno y un adyuvante
donde dicha vacuna contiene menos de 1,0 mg/ml de albúmina del
huésped y está sustancialmente libre de albúmina no del huésped. La
expresión "basada en suero" se usa en este documento para
indicar que las vacunas de la invención o sus precursores emplean
suero, incluyendo suero no del huésped. Típicamente, el suero se
emplea en medios de cultivo para potenciar el crecimiento de
organismos que se emplean en la preparación de la vacuna. Por la
expresión "precursor de la vacuna" se entiende componentes de
vacuna, particularmente antígeno, proteínas diferentes de antígeno,
organismos completos y material de recolección. Por la expresión
"cantidad inmunogénicamente eficaz" se entiende que el antígeno
contiene un componente protector en una concentración que es
suficiente para proteger a los animales de una enfermedad diana
cuando se administra a los animales una vacuna potenciada que
contiene el antígeno. Por el término "antígeno" se entiende un
material biológico (natural, recombinante o sintético) que estimula
una respuesta inmune protectora en animales. Por la expresión
"vacuna potenciada" se entiende una vacuna que contiene un
adyuvante, o una pluralidad de vacunas administradas como una parte
de un régimen de vacuna en el que al menos una de las vacunas
contiene un adyuvante. Por la expresión albúmina no del huésped se
entiende albúmina del suero de una especie animal diferente de la
especie animal que se vacuna. La albúmina es una proteína sencilla
que se encuentra en el suero y tiene un peso molecular de
aproximadamente 66.000 dalton. Una vacuna que está sustancialmente
libre de albúmina no del huésped contiene menos de 1,0 mg/ml de
albúmina no del huésped.
La invención también abarca un procedimiento de
preparación de la vacuna basada en suero de acuerdo con las
reivindicaciones que está sustancialmente libre de albúmina no del
huésped, que comprende retirar albúmina no del huésped de la vacuna
o de un precursor de la misma. Un procedimiento alternativo de
preparación de la vacuna basada en suero que está sustancialmente
libre de albúmina no del huésped comprende proporcionar un suero
del huésped que contiene albúmina del huésped en la preparación de
la vacuna.
De acuerdo con la invención se prepara una
vacuna añadiendo suero o albúmina del huésped al antígeno de vacuna
después de recoger o purificar el antígeno de un cultivo de un
organismo del que se obtiene el antígeno, pero antes de potenciar
el antígeno. Adicionalmente, el suero o albúmina del huésped puede
añadirse al antígeno después de recoger pero antes de liofilizar el
antígeno si el antígeno es un organismo vivo modificado. Cuando se
usa de esta manera suero del huésped o albúmina del huésped, actúa
como estabilizante. El término "estabilizante" significa
cualquier aditivo que se añade a una vacuna para prevenir la
degradación del antígeno y la consiguiente pérdida de
inmunogenicidad de la vacuna.
De acuerdo con las reivindicaciones, el
procedimiento de preparación de una vacuna basada en suero que
contiene una cantidad inmunogénicamente eficaz de un antígeno y un
adyuvante en el que dicha vacuna está sustancialmente libre de
albúmina no del huésped comprende:
- (a)
- cultivar un organismo que produce el antígeno en un cultivo que contiene albúmina no del huésped;
- (b)
- recoger el cultivo;
- (c)
- clarificar la recolección;
- (d)
- separar el antígeno y la albúmina no del huésped de la recolección clarificada;
- (e)
- separar la albúmina no del huésped del antígeno;
- (f)
- recoger el antígeno; añadir suero del huésped de albúmina del huésped; y
- (g)
- formular el antígeno con un adyuvante.
De acuerdo con las reivindicaciones, el
procedimiento de preparación de una vacuna basada en suero que
contiene una cantidad inmunogénicamente eficaz de un antígeno y un
adyuvante en el que dicha vacuna está sustancialmente libre de
albúmina no del huésped puede comprender:
- (a)
- cultivar un organismo que produce el antígeno en un cultivo que contiene albúmina no del huésped;
- (b)
- recoger el cultivo;
- (c)
- clarificar la recolección;
- (d)
- separar el antígeno de la albúmina no del huésped pasando la recolección clarificada a través de una columna con una matriz que se une de forma selectiva al antígeno;
- (e)
- lavar la matriz de la columna para retirar el exceso de albúmina no del huésped;
- (f)
- descartar la solución de lavado;
- (g)
- lavar la matriz de la columna con una solución que eluya el antígeno de la matriz de la columna;
- (h)
- recoger el antígeno; añadir suero del huésped de albúmina del huésped; y
- (i)
- formular el antígeno con un adyuvante.
De acuerdo con las reivindicaciones, el
procedimiento de preparación de una vacuna basada en suero que
contiene una cantidad inmunogénicamente eficaz de un antígeno y un
adyuvante, en el que dicha vacuna está sustancialmente libre de
albúmina no del huésped puede comprender:
- (a)
- cultivar un organismo que produce el antígeno en un cultivo que contiene albúmina no del huésped;
- (b)
- recoger el cultivo;
- (c)
- clarificar la recolección;
- (d)
- separar el antígeno de la albúmina no del huésped pasando la recolección clarificada a través de una columna con una matriz que se une de forma selectiva a la albúmina no del huésped;
- (e)
- recoger el antígeno; añadir suero del huésped de albúmina del huésped; y
- (f)
- formular el antígeno con un adyuvante.
La invención también abarca un procedimiento
para estabilizar un antígeno como se define en las reivindicaciones,
que comprende añadir suero del huésped o albúmina del huésped a
dicho antígeno antes de potenciar el antígeno. Dicho procedimiento
para estabilizar un antígeno puede comprender también añadir suero
del huésped o albúmina del huésped a dicho antígeno antes de
liofilizar el antígeno.
Las vacunas de la invención son aplicables para
uso en prevenir o tratar enfermedades de todas las especies
animales. Son particularmente adecuadas para uso en prevenir o
tratar enfermedades de animales de compañía tales como gatos,
perros y caballos que son particularmente sensibles a regímenes de
vacuna potenciada que comprenden albúmina no del huésped. En
particular, las vacunas de la invención son adecuadas para uso en
prevenir leucemia felina (FeLV) y rabia porque no tienen problemas
que normalmente acompañan a dichas vacunas. Las vacunas contra FeLV
tienen mala fama por causar reacciones adversas tales como
hipersalivación, vómitos, diarrea y en algunos casos muerte. A
menudo, estas reacciones se producen a los pocos minutos de la
administración de la vacuna.
Sorprendentemente, se ha descubierto que los
animales a los se les han administrado las vacunas de la invención,
no tienen virtualmente reacciones sistémicas adversas. El
descubrimiento de que una albúmina no del huésped en una vacuna que
contiene un adyuvante o administrada en un régimen de vacuna con una
vacuna que contiene un adyuvante puede provocar reacciones
sistémicas es, por tanto, una parte de la invención. Este y otros
aspectos de la invención se describen con más detalle a
continuación en este documento.
La Fig. 1 es un gráfico que presenta una
comparación de la reactividad de una vacuna que contiene un
adyuvante combinado con albúmina no del huésped, con la falta de
reactividad de una vacuna que contiene un adyuvante en combinación
con albúmina del huésped.
La Fig. 2 es una fotografía de un gel de
SDS-PAGE que compara 9 vacunas felinas diferentes,
en la que se muestra el contenido de albúmina no del huésped.
Como se ha mostrado anteriormente, la presente
invención abarca la preparación de una vacuna basada en suero que
comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un antígeno y un
adyuvante, en la que la vacuna está sustancialmente libre de
albúmina no del huésped y procedimientos de fabricación y uso de la
misma. Además, abarca un procedimiento para estabilizar un antígeno
que comprende añadir suero del huésped o albúmina del huésped a
dicho antígeno antes de potenciar el antígeno. Dicho procedimiento
para estabilizar un antígeno también puede comprender añadir suero
del huésped o albúmina del huésped a dicho antígeno antes de
liofilizar el antígeno.
La albúmina no del huésped se obtiene de suero
no del huésped que se usa típicamente en cultivar organismos de los
que se obtienen los antígenos. Pueden seleccionarse ejemplos típicos
de suero no del huésped (que contiene albúmina no del huésped)
entre el grupo constituido por suero bovino, suero bovino fetal,
suero equino, suero equino fetal, suero de oveja y suero de cabra.
Por otro lado, si está presente albúmina equina en una vacuna
equina, se considera que la vacuna contiene albúmina del
huésped.
El antígeno se obtiene de un organismo
seleccionado entre el grupo constituido por bacterias, virus,
parásitos, rickettsia y protozoos. Los ejemplos de las bacterias
pueden seleccionarse entre el grupo constituido por Bordetella
spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp.,
Clostridium spp., Leptospira spp., Escherichia
spp., Salmonella spp., Pasteurella spp.,
Mycobacteria spp., Mycoplasma spp., Moraxella
spp., Haemophilus spp., Borrelia spp.,
Fusobacteria spp., Bacteroides spp. y Rhodococcus
spp. Los ejemplos de los virus pueden seleccionarse entre el
grupo constituido por herpesvirus, virus de parainfluenza, reovirus,
rotavirus, morbillivirus, retrovirus, coronavirus, adenovirus,
togavirus, parvovirus, parapoxvirus, paramixovirus, citomegalovirus,
arbovirus y hantavirus. Más específicamente, dichos virus podrían
incluir aunque sin limitación, virus de la leucemia felina,
rinotraqueítis felina, calicivirus felino, virus de la panleucopenia
felina, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la
peritonitis infecciosa felina, hepatitis canina, adenovirus canino
de tipo 2, parvovirus canino, virus de la rabia, virus de la
parainfluenza canina, coronavirus canino, herpesvirus equinos, virus
de la gripe equina y virus de la encefalomielitis equina. Los
ejemplos de parásitos y protozoos pueden seleccionarse entre el
grupo constituido por Neospora spp., Toxoplasma spp.,
Dirofilaria spp., Cryptosporidium spp., Giardia
spp., Babesia spp., y Coccidia spp. Un ejemplo de
rickettsia puede seleccionarse entre el grupo constituido por
Chlamydia spp., Fiebre Equina del Potomac (Erliquiosis
monocítica equina), Ehrlichia canis, y otras Ehrlichia
spp.
Los antígenos pueden obtenerse de un miembro
seleccionado entre el grupo constituido por: un cultivo completo de
un organismo tal como una recolección de un cultivo completo, una
recolección de un cultivo completo parcialmente purificado, una
subunidad purificada extraída de la recolección, una subunidad
obtenida mediante tecnología recombinante y expresada en el
homólogo o un organismo heterólogo, un mutante de deleción del
organismo completo (convencional o mutante con genes de ADNr
delecionados), péptidos, ADN desnudo, antígenos sintetizados
químicamente, ADNc desnudo transcrito de forma inversa o
combinaciones de los mismos.
Generalmente, el antígeno puede producirse
mediante técnicas de cultivo y recogida de organismos conocidas en
la técnica, concentrando y/o purificando de manera convencional
antígenos de dichos organismos. Por ejemplo, el antígeno puede
producirse: cultivando el organismo seleccionado en un cultivo que
tiene medio de cultivo que contiene un suero no del huésped
(cultivo basado en suero). Más específicamente, el organismo puede
cultivarse en un cultivo tisular preparado a partir de células de
mamífero o vegetales, en el que el suero no del huésped se añade al
medio para potenciar el crecimiento del organismo. El organismo
puede cultivarse también en medios de fermentación en los que el
organismo crece sin cultivo tisular pero al que se le añade un medio
de cultivo que contiene un suero no del huésped. Típicamente, el
suero no del huésped puede seleccionarse entre el grupo constituido
por suero bovino fetal, suero bovino, suero de ternero, suero equino
fetal, suero de caballo, suero de cabra, suero de cordero y suero
de oveja. Cuando finaliza el crecimiento, se recoge el cultivo y,
si fuera necesario, se purifica de forma convencional por, digamos,
filtración y/o ultrafiltración para retirar células, restos
celulares y contaminantes extraños. Sin embargo, estas técnicas no
retiran la albúmina no del huésped. En este punto, la recolección
de cultivo aún contiene albúmina no del huésped y no sería aceptable
si se combinara con adyuvante y/o se administrara en un régimen con
una vacuna potenciada. Por lo tanto, la recolección de cultivo
resultante se purifica adicionalmente de acuerdo con esta invención
para retirar la albúmina no del huésped antes de su formulación en
una vacuna potenciada.
De acuerdo con la invención, la albúmina no del
huésped puede retirarse mediante un procedimiento de purificación
de la vacuna o de un precursor de la vacuna de tal manera que se
retiraría la albúmina no del huésped. El procedimiento de
purificación del precursor de la vacuna puede realizarse mediante
una técnica de cromatografía seleccionada entre el grupo
constituido por Cromatografía de perfusión^{TM} (PerSeptive
Biosystems), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
exclusión molecular, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad y combinaciones de las mismas.
Preferiblemente, el procedimiento de purificación es mediante
Cromatografía de perfusión^{TM} usando matrices de cromatografía
de interacción hidrófoba o una combinación de cromatografía de
interacción hidrófoba y cromatografía de intercambio iónico. Lo
siguiente es una descripción ilustrativa pero no limitante de la
cromatografía de interacción hidrófoba con una matriz de
Cromatografía de perfusión^{TM} utilizando medios POROS
(PerSeptive Biosystems).
La Cromatografía de perfusión^{TM} se realiza
usando una matriz (medios POROS) que tiene grandes poros acanalados
que llevan moléculas rápidamente al interior de cada perla mediante
un flujo de convección así como poros de difusión que se ramifican
a partir de los poros acanalados proporcionando un gran área de
superficie interna para la unión. Esta combinación de poros
proporciona alta capacidad, alta resolución y purificación a alta
velocidad. La cromatografía de interacción hidrófoba implica el uso
de grupos polares sobre una matriz no cargada para interaccionar
con restos polares (por ejemplo, fenilalanina) en proteínas,
provocando retraso y separación de proteínas en base a sus
hidrofobicidades relativas. El uso de la matriz de medios POROS
permite caudales mucho mayores a presiones más altas de modo que el
tiempo de purificación se reduce, reduciendo de este modo el coste
y permitiendo que la cromatografía sea eficaz en cuanto al coste
para productos veterinarios.
La cromatografía de interacción hidrófoba se
realiza añadiendo un tampón de alta fuerza iónica a fluidos de la
recolección del cultivo que contienen la albúmina no del huésped
antes de añadir dichos fluidos a la columna hidrófoba. La columna
se lava varias veces con un tampón de alta fuerza iónica tal como
fosfato sódico 20 milimolar (mM)/sulfato sódico 650 mM antes de la
adición de los fluidos tamponados de alta fuerza iónica de la
recolección del cultivo que contienen la albúmina no del huésped
(material de alimentación de la columna). Se pasan múltiples
volúmenes de columna de material de alimentación de la columna a
través de la columna. La matriz de la columna se une a la albúmina
no del huésped y al antígeno (contenidos dentro de los fluidos
tamponados de la recolección del cultivo). Para eluir albúmina no
del huésped de la columna, se lava la columna múltiples veces con
un tampón de alta fuerza iónica tal como fosfato sódico 20
mM/sulfato sódico 650 mM o hasta que la lectura de la densidad
óptica del eluato a la longitud de onda de 280 nanómetros (nm) sea
menos de 0,03. El antígeno (purificado) se eluye de la columna
lavando la matriz de la columna con múltiples volúmenes de una
solución de baja fuerza iónica que puede ser agua estéril. El
antígeno purificado se recoge en un recipiente de recolección
diferente cuando la densidad óptica del eluato aumenta por encima de
0,15. La recolección del eluato cesa cuando la densidad óptica del
eluato cae por debajo de 0,10.
Otro procedimiento para la retirada de albúmina
no del huésped de acuerdo con esta invención abarca el uso de
cromatografía de afinidad para la unión del antígeno o de la
albúmina no del huésped. Por ejemplo, el antígeno puede producirse
mediante técnicas de cultivo y recogida de organismos conocidas en
la técnica y clarificando, concentrando y/o purificando dichos
organismos de manera convencional como se ha descrito previamente.
Para la retirada de la albúmina no del huésped la recolección
clarificada puede añadirse a una columna que contenga una matriz
que se une al antígeno o que se une a la albúmina no del huésped.
Dicha matriz puede ser una lectina tal como CibaCron^{TM}Blue
(Pharmacia) o Mimetic Blue (Affinity Chromatography Ltd), las cuales
se unen a albúmina no del huésped, o una matriz que contenga un
anticuerpo policlonal o monoclonal específico para el antígeno o
albúmina no del huésped, sea cual sea el que se unirá a la matriz.
La recolección clarificada se convierte en el material de
alimentación de la columna y se añade a la columna. Si la columna
contiene una matriz tal como una lectina, un anticuerpo policlonal
o un anticuerpo monoclonal específico para albúmina no del huésped,
la albúmina no del huésped se une a la columna y el antígeno pasa a
través de la columna y se recoge. El antígeno recogido se formula
después con adyuvante para preparar una vacuna. Si la columna
contiene una matriz tal como un anticuerpo policlonal o anticuerpo
monoclonal específico para antígeno, el material de recolección
clarificado se añade a la columna y el antígeno se une a la matriz.
La albúmina no del huésped pasa a través de la columna y se
descarta. El exceso de albúmina no del huésped se retira de la
matriz de la columna lavando con un tampón que no retira el
antígeno. Después se lava la matriz con una solución que eluye el
antígeno de la matriz de la columna. Dichos tampones de lavado y
elusión pueden basarse en diferencias de pH, fuerza iónica, o
polaridad del antígeno a eluir. El antígeno se recoge después y se
formula con un adyuvante para producir la vacuna. Si se usa una
lectina para unirse a albúmina no del huésped, el antígeno que se
recoge tendrá que purificarse adicionalmente a través de una segunda
columna de lectina o usando otro tipo de cromatografía para retirar
toda la albúmina no del huésped.
Si se tiene un organismo completo tal como un
virus o bacteria o un antígeno muy grande, por ejemplo, uno con un
peso molecular mayor de 100.000 dalton, puede usarse cromatografía
de exclusión molecular para separar el antígeno de la albúmina no
del huésped que tiene un peso molecular de solamente aproximadamente
66.000 dalton. La cromatografía de exclusión molecular separa
moléculas en base al peso molecular. La matriz se selecciona de
modo que las moléculas de bajo peso molecular tales como albúmina no
del huésped pasen a través de la columna a una velocidad más rápida
que las moléculas de gran peso molecular tales como grandes
antígenos. Usando esta técnica, el organismo se cultiva en un
cultivo que contiene albúmina no del huésped y se recoge, clarifica
y/o concentra y purifica mediante técnicas convencionales como se ha
descrito previamente. Para separar la albúmina no del huésped de,
por ejemplo, un virus completo, el virus se cultiva en cultivo
tisular, se recoge por recolección de los fluidos del cultivo
tisular y se clarifica para retirar los restos celulares. Esta
recolección clarificada es el material de alimentación de la columna
y se añade a la columna. El primer fluido que pasa a través de la
columna se recoge y descarta puesto que contiene la albúmina no del
huésped. El virus pasa a través de la columna más lentamente y
puede lavarse en un recipiente de recolección usando tampones que
no dañen al virus. El virus que se ha recogido de esta manera puede
formularse con un adyuvante para preparar una vacuna.
Un procedimiento alternativo para preparar la
vacuna basada en suero que contiene una cantidad inmunogénicamente
eficaz de un antígeno y un adyuvante, donde dicha vacuna está
sustancialmente libre de albúmina no del huésped comprende cultivar
el organismo en suero del huésped donde hay albúmina no del huésped.
Mediante este procedimiento, se cultiva el organismo en cultivo
tisular o medios de fermentación que contienen suero del huésped en
lugar de suero no del huésped. Puede usarse recolección,
concentración y purificación convencionales si se desea un producto
puro. No se requiere purificación adicional para retirar albúmina no
del huésped puesto que la preparación no contiene albúmina no del
huésped. Mediante este procedimiento, el material de recolección en
bruto puede usarse también para formular la vacuna. Usando este
procedimiento el material de recolección puede combinarse
simplemente con adyuvante para formular la vacuna.
Después de la purificación y/o retirada de la
albúmina no del huésped o del cultivo del organismo en suero del
huésped, el antígeno se inactiva y potencia mediante técnicas
convencionales. Como se afirma generalmente, el antígeno puede
inactivarse tratándolo con un agente inactivante que no
desnaturaliza el componente protector del antígeno.
Específicamente, el antígeno puede inactivarse tratándolo
químicamente, por irradiación, por calentamiento o por
congelación-descongelación. De forma ilustrativa, se
pueden emplear agentes inactivantes químicos seleccionados entre el
grupo constituido por formalina, beta-propiolactona,
detergentes y etilenimina binaria. Para otros organismos se
prefieren agentes inactivantes químicos diferentes de éstos.
El antígeno inactivado puede también
concentrarse o reunirse con otro antígeno recogido antes de
potenciarla. La cantidad de concentración sería tal que la cantidad
media de antígeno o el valor de Potencia Relativa (PR) alcance o
supere el valor mínimo aceptable para una vacuna. El antígeno
inactivado puede concentrarse hasta 100 veces, si fuera necesario,
por ultrafiltración con un límite de peso molecular que mantendrá
adecuadamente el antígeno y permitirá que la contaminación pase a
través y se descarte, o por centrifugación diferencial. Después de
la inactivación, el valor de antígeno debe estar por encima del
nivel mínimo aceptable de PR. Después se almacena a temperaturas de
-70ºC a +10ºC hasta que se mezcla o se microfluidiza con un
adyuvante.
El antígeno inactivado se formula o combina con
un adyuvante. Los adyuvantes son productos químicos o componentes
bacterianos o derivados de virus añadidos a vacunas para potenciar
la producción de una respuesta inmune por el animal que recibe la
vacuna. Los adyuvantes entran en las categorías generales de
polímeros, co-polímeros en bloque, aceites, aceite
en agua, sales de aluminio, y extractos bacterianos y virales. La
mayoría de los adyuvantes funcionan produciendo una irritación en
el sitio de inyección provocando que los leucocitos (células
inmunes) se infiltren en el área y/o produciendo un efecto de
depósito (manteniendo los antígenos en el sitio de inyección
durante tanto tiempo como sea posible). Algunos de los adyuvantes
más nuevos actúan como mecanismos de liberación lenta, liberando
antígenos encapsulados por ellos a una velocidad relativamente baja.
Incluso los adyuvantes más nuevos afectan directamente a las
células-B o células-T del sistema
inmune y se denominan estimuladores inmunes, reguladores inmunes,
moduladores inmunes o potenciadores inmunes. Si un adyuvante provoca
una amplia infiltración de leucocitos al sitio de inyección, se
producirán hinchazón y reacciones del sitio de inyección. La
respuesta inmune a adyuvantes también puede potenciar la reactividad
a contaminantes tales como endotoxinas, aumentando de este modo la
probabilidad de reacciones sistémicas tales como anafilaxis. Por lo
tanto, aunque los adyuvantes son necesarios para la estimulación de
la respuesta inmune por vacunas inactivadas, pueden producir
efectos secundarios perjudiciales. El adyuvante se selecciona entre
el grupo constituido por polímeros, co-polímeros en
bloque, aceites, aceite en agua, agua en aceite, sales de aluminio,
inmunomoduladores y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el
adyuvante es un polímero o co-polímero en bloque.
El adyuvante puede emplearse en una cantidad de 0,01% a 50%. La
cantidad de adyuvante se correlaciona estrictamente con el tipo de
adyuvante usado. Sin embargo, es importante que el adyuvante se
emplee en una cantidad eficaz para estimular inmunogénicamente los
antígenos inactivados. Cuando se usan en dicha cantidad, los
adyuvantes pueden estimular reacciones adversas a la albúmina no del
huésped.
Después de inactivar y potenciar el antígeno, la
potencia o Potencia Relativa (PR) del antígeno puede ajustarse a un
nivel apropiado que alcance o supere la cantidad mínima aceptable de
antígeno para producir una vacuna inmunogénicamente eficaz. Los
ensayos usados para ensayar dicha potencia o potencia relativa se
describen a continuación en este documento. El (los)
antígeno(s) puede(n) formularse con otros antígenos.
Por ejemplo, un virus de la leucemia felina inactivado y
potenciado, preparado de acuerdo con la invención puede formularse
con calicivirus felino, virus de panleucopenia felina, virus de la
rinotraqueítis felina y clamidia felina. Además, un virus de la
rabia inactivado y potenciado preparado de acuerdo con la invención
puede formularse con parvovirus canino, virus del moquillo canino,
virus de la parainfluenza canina, adenovirus canino tipo 2 y
diversas especies de Leptospira spp. Además, pueden prepararse virus
equinos inactivados y potenciados y antígenos bacterianos de
acuerdo con la invención. Algunos o todos estos antígenos
adicionales pueden prepararse de acuerdo con la presente invención.
Algunos de los antígenos adicionales pueden ser vivos modificados.
Sin embargo, las vacunas de combinación finales estarán
sustancialmente libres de albúmina no del huésped si la vacuna de
combinación o el régimen de vacuna en el que se administra la vacuna
de combinación, contiene un adyuvante. La vacuna potenciada
resultante que está sustancialmente libre de albúmina no del huésped
es segura y eficaz y puede administrarse a animales con
esencialmente ninguna reacción sistémica adversa
post-vacunación.
Como una medida de la potencia de vacuna que
equivale a la protección de vacuna en el animal huésped, cada lote
individual de antígeno (en bruto o purificado) y serie de vacuna
experimenta el ensayo. La medición puede implicar vacunación de
animales de laboratorio o animales huésped seguida de una exposición
de los animales, vacunación de los animales de laboratorio o
animales huésped seguida de evaluación de una respuesta serológica
o la realización de un Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas
(ELISA) para medir la cantidad de antígenos en la vacuna. Es
preferible un Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA)
puesto que elimina el ensayo con animales. En este procedimiento,
la concentración de antígeno en la vacuna de ensayo se mide contra
el contenido de antígeno en una Vacuna de Referencia que ha
demostrado ser protectora en el animal huésped. Una vacuna de
ensayo que mide 1,0 en comparación con la Vacuna de Referencia se
considera potente y se dice que tiene una potencia relativa (PR) de
1,0. La PR puede medirse antes o después de que el antígeno se haya
recogido, purificado, inactivado o potenciado. Antes de la
inactivación y potenciación, la PR debe estar por encima de 1,0 de
modo que después de la inactivación y potenciación no caiga por
debajo de 1,0.
El antígeno purificado puede concentrarse o
reunirse con otro antígeno recogido purificado de modo que la
cantidad media de antígeno alcance o supere el valor mínimo
aceptable para una recolección. El antígeno purificado puede
concentrarse hasta 100 veces, si fuera necesario, mediante
ultrafiltración con un límite de peso molecular que mantendrá
adecuadamente el antígeno y permitirá que los contaminantes pasen a
través y se descarten, o mediante centrifugado diferencial. Es
importante observar que incluso si se usan niveles muy bajos de
suero para potenciar el crecimiento, es virtualmente imposible
retirar su contenido de albúmina de cultivos de los organismos o
vacunas mediante procedimientos de purificación convencionales,
especialmente si se usa concentración. Por ejemplo, si el antígeno
se concentra 100 veces, un nivel de albúmina no del huésped del 0,1%
(1 mg/ml) en el antígeno antes de la concentración se concentraría
al 10% ó 100 mg/ml después de la concentración. Dicho nivel sería
totalmente inaceptable en la vacuna final.
Como se entendería a partir de lo anterior, una
característica distinta de la invención es el descubrimiento de la
fuente del problema de las reacciones sistémicas adversas
post-vacunación y las soluciones para el problema.
Sin limitarse por ninguna teoría particular, se cree que las
reacciones sistémicas adversas post-vacunación
resultan de la presencia de adyuvantes y albúmina no del huésped en
vacunas o regímenes de vacuna. Por la presente, se ha descubierto y
descrito una solución que incluye retirar albúmina no del huésped de
vacunas que contengan un adyuvante o que se administren en
regímenes de vacuna que contengan vacunas potenciadas o usar suero
del huésped para la preparación de antígenos en lugar de suero no
del huésped y administrar vacunas y regímenes de vacuna que estén
sustancialmente libres de albúmina no del huésped.
Este y otros aspectos de la invención se
ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no
limitantes. En los ejemplos y en toda la memoria descriptiva, las
partes son en peso a menos que se indique otra cosa.
Para evaluar si existía una diferencia en la
reactividad de vacunas equinas preparadas con suero no del huésped
(suero bovino fetal como el enfoque convencional) o vacunas equinas
preparadas con suero del huésped (suero equino fetal) se prepararon
dos simulacros de vacuna. Una vacuna contenía medio potenciado con
suero bovino fetal al 15% (enfoque de suero no del huésped)
mientras que la segunda vacuna contenía suero equino fetal al 15%
(suero del huésped). Se usaron veinte caballos para este estudio. El
adyuvante en los dos enfoques fue del mismo lote de material y fue
un adyuvante basado en "Carbopol". Diez caballos recibieron
cada uno una dosis de 2,0 ml del simulacro de vacuna que contenía
suero bovino fetal inyectada por vía intramuscular en el cuello y
cada uno de los otros diez caballos recibió una dosis 2,0 ml del
simulacro de vacuna que contenía suero equino fetal inyectada por
vía intramuscular en el cuello. Se administró una inyección de
refuerzo de las respectivas vacunas cada 28 días durante
aproximadamente 8 meses. Se observaron los caballos para reacciones
en los días 1, 2, 3, 4, 7 y 14 después de cada inyección. Justo
antes de la segunda inyección, uno de los caballos que recibieron
la preparación de suero bovino fetal murió de torsión intestinal.
Los 9 caballos restantes recibieron una inyección de refuerzo y se
observaron después de las dosis de refuerzo del simulacro de vacuna
que contenía suero bovino fetal. Los resultados de estas
observaciones se muestran en la Figura 1.
Después de la administración de todas las
inyecciones del simulacro de vacuna que contenía suero equino fetal,
no hubo reacciones sistémicas (0 de 480 observaciones posibles).
Solamente se observaron 2 casos de 480 posibles de hinchazón de
10,16 cm (4'') o más de diámetro. La hinchazón se produjo en 2
observaciones consecutivas en el mismo caballo después de recibir 4
inyecciones. Se observó hinchazón de 2,54-7,62 cm
(1-3'') de diámetro en 3 de 480 observaciones
posibles. Se observaron treinta y una (31) reacciones de cualquier
tipo de 480 observaciones posibles. Todas las reacciones se
produjeron solamente en 1 de los 10 caballos (10%) hasta la
vacunación Nº 8 después de la cual 2 de los 10 caballos mostraron
una reacción local. Comparativamente, después de la administración
de todas las inyecciones del simulacro de vacuna de suero bovino
fetal, había una posible reacción sistémica (la muerte del caballo
Nº 606). Se observó hinchazón grave (más de 10,16 cm (4'') de
diámetro) en 22 de 432 observaciones posibles. Se observó hinchazón
visible (2,54-7,62 cm (1-3'') de
diámetro) en 34 de 432 observaciones posibles. Se observaron ciento
cuarenta y seis (146) reacciones de 432 observaciones posibles. Ocho
de los 9 caballos restantes (89%) mostraron reactividad por
vacunación Nº 8 reaccionando 5 de los 9 caballos de forma rutinaria
después de cada vacunación. Estos datos indican que en inyección
reiterada con vacunas potenciadas, la presencia de suero no del
huésped (suero bovino fetal en vacunas equinas) provoca
considerablemente más reacción que la presencia de suero del
huésped (suero equino fetal).
Se cultivaron células CFRK (riñón de gato
Crandell) infectadas de forma persistente con FeLV hasta el 95% de
confluencia de la siguiente manera. Las células se cultivaron en
frascos cilíndricos de 850 cm^{2} con rotación a 37ºC. Como medio
de cultivo se empleó Medio Mínimo Esencial de Dulbecco con altos
niveles de glucosa (DMEM-Hi) que contenía suero
bovino fetal al 10% y 30 \mug/ml de neomicina. Después de que las
células alcanzaron la confluencia, se cambiaron los medios a medios
de mantenimiento (medios DMEM-Hi que contenían suero
bovino fetal al 5%). Después de 4 días se decantaron estos medios y
se recogieron los fluidos virales. Las células se
re-alimentaron con medios de mantenimiento y se
recogieron los fluidos virales cada tres o cuatro días para un
total de siete recolecciones. Se ensayó la esterilidad en los
fluidos virales decantados de cada recolección, se pusieron
alícuotas en recipientes estériles de plástico y se almacenaron
congelados a -70ºC. Después de un ensayo de esterilidad
satisfactorio, se descongelaron los fluidos virales a temperatura
ambiente y se reunieron en un único recipiente de recepción
estéril. Los fluidos virales se clarificaron a través de un filtro
de polipropileno de 3 micrómetros para retirar restos celulares y
después se concentraron 10 veces usando un dispositivo de
ultrafiltración de flujo tangencial con un límite de peso molecular
de 30.000 dalton. Después se lavaron los fluidos en
Na_{2}HPO_{4} 50 mM para un factor de concentración final de 9
veces. El concentrado reunido tenía un contenido total de proteínas
de 16,59 mg/l.
Se usó inicialmente una columna de cromatografía
de intercambio catiónico para purificar el virus y sus subunidades
del resto de los fluidos. Una columna de 1 litro, 14 cm x 10 cm se
llenó con resina de cromatografía de Q Sepharose (Pharmacia) y se
desinfectó con dos volúmenes de columna de NaOH 1 M. Además, los
accesorios de la columna tales como bombas, tuberías y adaptadores
de la columna se desinfectaron con NaOH 1 M. La columna y los
accesorios se aclararon después con un tampón de Na_{2}HPO_{4}
50 mM (pH 7,0) hasta que el efluente de la columna estaba a pH 7,0.
Todos los tampones se esterilizaron con un filtro de 0,2 \mum
antes de su uso. Un sistema BioPilot Chromatography (Pharmacia) fue
el instrumental para todo este procedimiento.
Se inyectó en la columna una muestra de 1500 ml
de los fluidos virales de FeLV concentrados (material de
alimentación de la columna). La columna se lavó con 9 volúmenes de
columna de Tampón A (Na_{2}HPO_{4} 50 mM) a 80 ml/min antes de
la elusión del virus con un gradiente lineal de Tampón B
(Na_{2}HPO_{4} 50 mM, NaCl 1 M) del 0% al 50% de Tampón B en 10
volúmenes de columna. Se consiguió una elución final del virus
residual con 5 volúmenes de columna de Tampón B al 100%. Las
fracciones eluidas de la columna se recogieron y examinaron para el
contenido total de proteínas. El contenido total de proteínas fue de
3,12 mg/ml. Aproximadamente la mitad de esto sería albúmina no del
huésped. Las fracciones que contenían el virus se reunieron después
y se cromatografiaron de nuevo en una columna de interacción
hidrófoba para retirar el resto del contenido de albúmina no del
huésped.
Se añadió sulfato de amonio a las fracciones
virus eluido de la columna de Q Sepharose (que aún contenían >1
mg/ml de albúmina no del huésped) para conseguir una concentración
final de 0,5 M. Este material de alimentación de la columna de
fracción de virus se introdujo en una columna de interacción
hidrófoba de baja sustitución de fenil Sepharose de 1 litro, que se
había equilibrado previamente con Na_{2}HPO_{4} 50 mM. La
columna se lavó con una combinación de Na_{2}HPO_{4} 50 mM y
(NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5 M para 5 volúmenes de columna.
El virus se eluyó después de la columna con un tampón de
Na_{2}HPO_{4} 50 mM. En las fracciones de virus eluidas de la
columna se ensayó la esterilidad, contenido total de proteínas y de
albúmina no del huésped. Todas las fracciones de virus eran
estériles, el contenido total de proteínas estaba entre 0,9 y 1,2
mg/ml y el contenido de albúmina no del huésped estaba por debajo de
0,5 mg/ml. La fracción viral (fluidos) se inactivó con formalina al
0,03% y se formuló en vacunas combinándola con adyuvante
POLYGEN^{TM} al 5% (obtenido de MVP Laboratories, Ralston,
Nebraska), estabilizante glicerol/EDTA al 0,25% y 30 \mug/ml de
nistatina (FLV011) o adyuvante carbopol al 0,125%, estabilizante
glicerol/EDTA al 0,25% y 30 \mug/ml de nistatina (FLV009).
Se inmunizaron gatos de diez a doce semanas de
edad con una dosis de un ml de vacuna por vía subcutánea. Tres
semanas después se dio a los gatos una inmunización de refuerzo de
un ml. Los gatos se expusieron diez días después de la vacunación
de refuerzo con virus de la leucemia felina virulento. Esta
exposición se realizó de la siguiente manera: 1) se
inmunosuprimieron los gatos con 10 mg/kg de peso corporal de acetato
de metilprednisolona por vía intramuscular durante dos días
sucesivos; y 2) se expusieron los gatos con aproximadamente 1,5 x
10^{6} unidades formadoras de focos (UFF) de virus de la leucemia
felina virulento por vía intranasal cada día de inmunosupresión.
Los gatos se examinaron en el día 15 y el día 1 antes de la
exposición al estímulo para asegurar que no estaban ya infectados
con FeLV o no eran portadores. Empezando tres semanas después de la
exposición, se recogió sangre de los gatos durante nueve semanas
sucesivas y se examinó para antígeno "p27e" mediante un ensayo
de inmunofluorescencia indirecta. Todos los resultados de los gatos
vacunados y de control se presentan en la Tabla 1. Un resultado del
ensayo positivo para un gato se definió como tres semanas
consecutivas de viremia o cinco semanas de viremia durante el
periodo de doce semanas. Los resultados indican que el 100% de los
gatos vacunados con vacuna "FLV011" y el setenta por ciento de
los gatos vacunados con vacuna "FLV009" estaban protegidos
contra la exposición, mientras que, el 81 por ciento de los gatos de
control estaban infectados por la dosis de exposición. Esto es
igual a o mejor que la protección proporcionada por vacunas contra
FeLV comerciales producidas de forma convencional pero reactivas,
que protegen del 15 al 80 por ciento de los gatos vacunados en una
exposición similarmente intensa. Esta serie de vacuna FLV009 se
convirtió en el Patrón de Referencia para futuros ensayos de ELISA
y, por definición, contiene una PR de 1,0.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La vacuna del Ejemplo 2A se evaluó para
seguridad por 21 veterinarios en ensayos clínicos de campo
realizados en cinco estados. Se administraron un total de 913 dosis
de vacuna a 850 gatos entre 8 semanas y 15 años de edad. Se pidió a
los veterinarios que observaran específicamente cualquier reacción
sistémica y que registraran las circunstancias del entorno de
dichas incidencias en caso de que se produjeran. Solamente se
observó una reacción sistémica. Esta reacción se produjo en un gato
que recibió una vacuna de combinación felina viva modificada
concomitante que contenía albúmina no del huésped. Por lo tanto, se
concluye que la vacuna contra FeLV era segura y que la reactividad
sistémica a la vacuna puede eliminarse administrando vacunas que no
contengan una combinación de albúmina no del huésped y un adyuvante
ya se administren en la misma vacuna o se administren en una vacuna
concomitante como parte de un régimen de vacunación.
Se cultivaron células CFRK infectadas de forma
persistente con FeLV hasta el 95% de confluencia en
DMEM-Hi que contenía suero bovino fetal al 10% y 30
mg/ml de neomicina usando frascos cilíndricos de 850 cm^{2}
incubados con rotación a 37ºC como en el Ejemplo 2A. Después de que
las células alcanzaron confluencia, se cambiaron los medios a
medios de mantenimiento (medios DMEM-hi que
contenían suero bovino fetal al 5%). Después de cuatro días, estos
medios se decantaron y se recogieron los fluidos virales. Se
realimentaron las células con medios de mantenimiento y los fluidos
virales se recogieron cada tres a cuatro días para un total de siete
recolecciones. Se ensayó la esterilidad en los fluidos virales
decantados de cada recolección. Se descubrió que todos los fluidos
de recolección eran estériles. Los fluidos virales de cada
recolección se pusieron alícuotas en recipientes estériles de
plástico y se almacenaron congelados a -70ºC. Después de un ensayo
de esterilidad satisfactorio, los fluidos virales se descongelaron
a temperatura ambiente y se reunieron en un único recipiente de
recepción estéril. El contenido total de proteínas de este FeLV
reunido fue 2,5 mg/ml. Los fluidos virales se clarificaron a través
de un filtro de polipropileno de 5 micrómetros y uno de 1 micrómetro
para retirar restos celulares.
Los fluidos virales clarificados (fluido de
recolección material de alimentación de la columna) se purificaron
para retirar albúmina no del huésped usando una técnica de
purificación que comprende Cromatografía de Perfusión^{TM} usando
una matriz de cromatografía de interacción hidrófoba. La matriz
usada se obtuvo de PerSeptive Biosystems y fue sus medios POROS PE
50. Esta técnica usa grupos polares en una matriz no cargada para
interaccionar con restos polares (por ejemplo fenilalanina) en
proteínas, provocando retraso y separación de proteínas en base a
sus hidrofobicidades relativas. Esta interacción se potenció
añadiendo sulfato sódico/fosfato sódico de alta fuerza iónica a los
fluidos virales antes de añadirlos a la columna hidrófoba. La
columna se lavó con tres volúmenes de columna de un tampón que
contenía fosfato sódico 20 mM, sulfato sódico 650 mM antes de la
adición del fluido de recolección como material de alimentación de
la columna. Se pasó después a través de la columna el equivalente a
cinco volúmenes de columna de fluido de recolección como material de
alimentación de la columna (antes de la dilución con sulfato
sódico/fosfato sódico). Para eluir albúmina no del huésped de la
columna, se lavó la columna con cinco volúmenes de columna de
fosfato sódico 20 mM/sulfato sódico 650 mM o hasta que la lectura
de densidad óptica del eluato fue <0,03 a una longitud de onda de
280 nm. Los componentes virales purificados resultantes se eluyeron
de la columna lavando la resina de la columna con cinco volúmenes
de columna de agua estéril. Las fracciones virales purificadas se
recogieron en un recipiente de recolección diferente cuando la
densidad óptica (a 280 nm) del eluato aumentó por encima de 0,15 y
la recogida del eluato cesó cuando la densidad óptica del eluato
cayó por debajo de 0,10.
En los fluidos virales purificados se ensayó
cuantitativamente el contenido total de proteínas y se ensayó
cualitativamente por SDS-PAGE el contenido de
albúmina no del huésped. El contenido total de proteínas fue 1,35
mg/ml y el contenido de albúmina no del huésped fue menos de 0,5
mg/ml. Para retirar el exceso de sales que están retenidas por los
fluidos virales purificados, estos fluidos se diafiltraron con diez
volúmenes de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
usando un dispositivo de ultrafiltración de flujo tangencial con un
límite de peso molecular de 30.000 dalton. Los fluidos se
concentraron en este momento para conseguir una concentración viral
suficiente de FeLV gp70 para el lote de vacuna. Los fluidos virales
se inactivaron con formalina al 0,03% durante 72 horas a 4ºC.
Se produjo una vacuna contra leucemia felina a
partir de fluidos virales purificados, inactivados mediante la
adición de 0,125 mg/ml de Carbopol, glicerol/EDTA al 0,25% y 30
\mug/l de nistatina a los fluidos virales inactivados a una
concentración suficiente para ser inmunogénicamente eficaces cuando
se combinan con el adyuvante. Esta vacuna se comparó con la vacuna
en el Ejemplo 2A usando un ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a
Enzimas) para medir potencia (eficacia inmunogénica). Este ELISA
mide la cantidad de componente antigénico en la vacuna contra FeLV
en comparación con un Patrón de Referencia. El Patrón de Referencia
es la vacuna descrita en los Ejemplos 2A y 2B (FLV 009), que se ha
demostrado que protege a los gatos en un estudio de
vacunación/exposición. Un resultado de 1,00 en el ELISA indica que
la cantidad de componente antígeno protector contra FeLV en la
vacuna ensayada es equivalente a la de la vacuna de los Ejemplos 2A
y 2B y protegerá a los gatos igualmente bien. La vacuna de este
ejemplo demostró una potencia de 1,32. Tenía un contenido de
proteínas de 1,1 mg/ml con albúmina no del huésped no
detectable.
De este modo se demuestra que el paso de
material de recolección de FeLV que contiene albúmina no del huésped
a través de una matriz hidrófoba en solitario puede retirar la
albúmina y usarse para producir una vacuna inmunogénicamente
eficaz.
Se formularon seis simulacros de vacuna que
contenían solamente fracción V de albúmina bovina al 5% (albúmina
no del huésped) diluida en solución salina tamponada con fosfato y
combinada con diferentes adyuvantes. Las formulaciones de vacuna se
administraron a cincuenta y ocho (58) gatos de aproximadamente
22-26 semanas de edad que habían recibido
previamente dos dosis de una vacuna muerta de combinación contra
virus de
rinotraqueítis-calicivirus-virus de
panleucopenia, que contenía proteínas de suero de componentes de
cultivo tisular. Los gatos también habían sido vacunados con una
vacuna purificada contra leucemia felina que contenía albúmina no
del huésped no detectable. Los gatos se asignaron al azar a un
grupo de vacuna con albúmina no del huésped/adyuvante y se
inmunizaron con una dosis de 1,0 ml de vacuna una vez por semana
durante 3 semanas sucesivas. Se realizaron observaciones diarias
para la evaluación de la reactividad. Los resultados de estas
observaciones se muestran en la Tabla 2. Aproximadamente seis horas
después de la primera vacunación semanal, dos gatos mostraron
síntomas clínicos de reacciones sistémicas. Las vacunaciones dadas
a estos gatos fueron de dos formulaciones de albúmina no del
huésped/adyuvante diferentes. Los síntomas clínicos incluían
debilidad y descoordinación, vocalización, vómito espumoso teñido
de sangre, extremidades cianóticas, membranas mucosas pálidas con
tiempo de relleno capilar retrasado (3,5 segundos), hipersalivación
e hiperpnea. El tratamiento con dexametasona y fluidos subcutáneos
hizo poco para aliviar los síntomas. Estos dos gatos se sacrificaron
posteriormente.
Aproximadamente cuatro horas después de la
segunda inyección semanal, un gato adicional demostró síntomas más
moderados de una reacción sistémica a la vacunación. Los síntomas
clínicos asociados con este animal incluían letargia, membranas
mucosas rojas, aurícula cianótica/enrojecida y ojos hinchados. Este
experimento prueba que la reactividad inusual asociada comúnmente
con las vacunas contra FeLV (vómitos y diarrea) puede reproducirse
mediante una combinación de albúmina no del huésped con un
adyuvante. La tasa de reacción que se demostró en este experimento
parece baja. Sin embargo, en la situación clínica, dichas reacciones
solamente se observan en menos del 1,0% de los gatos. Este
experimento demostró una tasa de reacción del 2,0% si se incluyen
todos los gatos en el cálculo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En la técnica se conocen vacunas felinas de
cinco-componentes de combinación, preparadas a
partir de virus vivos modificados o inactivados de rinotraqueítis
felina, calicivirus felino, panleucopenia felina, clamidia felina y
leucemia felina, y se asocian también con la reactividad descrita
previamente. Se preparó una vacuna de combinación contra
rinotraqueítis felina, calicivirus felino, panleucopenia felina,
clamidia felina y leucemia felina de acuerdo con esta invención.
Los componentes del antígeno protectores contra virus de la
rinotraqueítis felina, calicivirus felino, virus de la
panleucopenia felina y virus de clamidia felina se cultivaron
individualmente en cultivo tisular sin el uso de suero o albúmina.
Se recogieron los componentes del antígeno protectores y todos
contenían restos celulares. Los fluidos de recolección individuales
se clarificaron a través de filtros de 3 \mum, se inactivaron
individualmente con etilenimina binaria 0,1 M y se potenciaron
individualmente con Polygen^{TM} al 5%. La leucemia felina usada
para esta combinación fue la preparada en el Ejemplo 3. Los
componentes inactivados y potenciados individualmente se combinaron
en proporciones adecuadas para producir un volumen de dosis de 1,0
ml. Los cinco componentes del antígeno protectores, demostraron
todos ser inmunogénicamente eficaces mediante ensayo en los ensayos
ELISA específicos como se ha descrito en el Ejemplo 3. El componente
de rinotraqueítis felina tenía una PR de 1,12 en comparación con
una vacuna con un valor de 1,0 que protegía al 100% de los gatos en
un ensayo de vacunación/exposición riguroso. El componente de
calicivirus felino demostró una PR de 1,69 en comparación con una
vacuna con un valor de 1,0 que protegía al 100% de los gatos en un
ensayo de vacunación/exposición riguroso. El virus de panleucopenia
felina mostró una PR de 1,26 en comparación con una vacuna con un
valor de 1,0 que protegía al 100% de los gatos en un ensayo de
vacunación/exposición riguroso. El componente de clamidia se ensayó
para su capacidad protectora en un ensayo de vacunación/exposición
de gatos. Protegió al 100% de los gatos vacunados.
La combinación felina de
cinco-componentes de esta invención se comparó con
productos de la competencia que se sabe que provocan reactividad de
la clase descrita, usando SDS-PAGE. La Figura 2 es
una fotografía de este gel que demuestra las cantidades de albúmina
no del huésped y otras proteínas en los diversos productos. Debe
observarse que dichas técnicas de electroforesis han demostrado
detectar albúmina a niveles de 0,5 mg/ml en vacunas. Las pistas de
gel están numeradas de izquierda a derecha siendo el Nº 1 la pista
más a la izquierda y siendo el Nº 10 la pista más a la derecha. En
la Figura 2, las pistas 1, 2 y 4 son vacunas contra FeLV
monovalentes que se descubrió que eran altamente reactivas en el
campo. Contienen una cantidad significativa (>1,0 mg/ml) de
albúmina no del huésped que es detectable mediante una banda de
aproximadamente 66.000 dalton. Estas vacunas provocaron reacciones
sistémicas del tipo descrito previamente, así como muerte en una
cantidad significativa de animales cuando se ensayaron en ensayos
de campo de seguridad similares al ensayo descrito en el Ejemplo
2B. La pista 3 es un marcador de peso molecular que contiene bandas
a 14,3, 20, 29, 34,8, 58,1 y 97 kilodalton. La pista 5 es la vacuna
fabricada de acuerdo con el Ejemplo 2A que no produjo reacciones
sistémicas cuando se ensayó para seguridad en el ensayo de campo
descrito en el Ejemplo 2B. Contiene un nivel no detectable de
albúmina no del huésped. La banda que aparece a 70 kilodalton es
indicativa de la presencia del componente antigénico gp70. La pista
6 es albúmina de suero bovino (BSA) al 5% que sirve como albúmina no
del huésped de control. Obsérvese que la banda de gp70 en la pista
5 es ligeramente mayor que el punto medio de esta banda de albúmina
no del huésped. La pista 7 es una vacuna felina de combinación
inactivada de 5-componentes con los mismos
componentes que los mencionados anteriormente, que se comercializa
por Fort Dodge Laboratories con el nombre
FEL-O-VAX^{R} Lv-K
IV. Como se ha mencionado previamente, el Compendium of Veterinary
Products indica que se han asociado reacciones sistémicas con esta
vacuna. La pista 8 es una vacuna felina de combinación viva
modificada/inactivada de 5-componentes con los
mismos componentes que los mencionados anteriormente, que se
comercializa por Solvay con el nombre Eclipse^{R} 4 + FeLV. Se
sabe también que esta vacuna es reactiva en gatos. La pista 9
contiene una vacuna felina de combinación viva modificada de
3-componentes que solamente contiene rinotraqueítis
felina, calicivirus felino y panleucopenia felina, que se
comercializa por Intervet con el nombre
PROTEX^{TM}-3. Esta vacuna no contiene FeLV, así
que gp70 no debe estar presente. Por lo tanto, la banda a 66
kilodalton es albúmina no del huésped. Esta vacuna, cuando se
combinó con una vacuna contra FeLV inactivada y potenciada en el
mismo régimen de vacuna, provocó reacciones sistémicas en un estudio
realizado en colaboración con los inventores. La pista 10 es una
vacuna felina de combinación viva modificada de
3-componentes que contiene rinotraqueítis felina,
calicivirus felino y panleucopenia felina, que no contiene adyuvante
y se comercializa por Solvay con el nombre
Eclipse^{R}-3. No contiene FeLV así que no debe
mostrar bandas entre 60 y 70 kilodalton. Sin embargo, hay una banda
tenue a aproximadamente 66 kilodalton que indica que esta vacuna
contiene albúmina no del huésped. Se esperaría que este producto,
cuando se usa en un régimen de vacuna con una vacuna potenciada
produjera reacciones sistémicas. Es obvio a partir de este Figura
que la vacuna de combinación de 5-componentes
contra FeLV fabricada de acuerdo con esta invención, contiene la
menor cantidad de albúmina no del huésped de cualquier vacuna que
contenga los cinco componentes. También es obvio que todas las
vacunas reactivas contienen una banda marcada que representa
albúmina no del huésped a una concentración por encima de 0,5
mg/ml.
Claims (8)
1. Uso de una composición que contiene
antígeno y un adyuvante para la preparación de una vacuna donde la
composición esta sustancialmente libre de albúmina no del huésped y
contiene menos de 1,0 mg/ml de albúmina no del huésped y la
composición se obtiene:
(a) cultivando un organismo que produce el
antígeno en un cultivo que contiene albúmina no del huésped;
(b) recogiendo el cultivo;
(c) clarificando la recolección;
(d) separando el antígeno y la albúmina no del
huésped de la recolección clarificada;
(e) separando la albúmina no del huésped del
antígeno;
(f) recogiendo el antígeno; y añadiendo suero
del huésped o albúmina del huésped; y
(g) formulando el antígeno con un adyuvante.
2. El uso de la reivindicación 1, en el
que el antígeno se selecciona entre el grupo constituido por un
virus, una bacteria, una rickettsia, un parásito, un protozoo,
subunidades de los mismos y combinaciones de los mismos.
3. El uso de la reivindicación 2, en el
que el antígeno de virus se selecciona entre el grupo constituido
por retrovirus, herpesvirus, adenovirus, paramixovirus, coronavirus,
morbillivirus, hantavirus, reovirus, rotavirus, togavirus,
parvovirus, parapoxvirus, citomegalovirus, arbovirus, virus de
parainfluenza, subunidades de los mismos y combinaciones de los
mismos.
4. El uso de la reivindicación 2, en el
que el antígeno es una bacteria seleccionada entre el grupo
constituido por Clostridium spp., Streptococcus spp.,
Staphylococcus spp., Bordetella spp., Pasteurella
spp., Salmonella spp., Mycobacteria spp.,
Mycoplasma spp., Leptospira spp., Borrelia
spp., Fusobacteria spp., Bacteriodes spp.,
Rhodococcus spp., Escherichia spp., Salmonella
spp., Moraxella spp., Haemophilus spp.,
subunidades de las mismas y combinaciones de las mismas.
5. El uso de la reivindicación 2, en el
que el antígeno es una rickettsia seleccionada entre el grupo
constituido por Chlamydia spp., Ehrlichia spp.,
subunidades de las mismas y combinaciones de las mismas.
6. El uso de la reivindicación 2, en el
que el antígeno es un parásito seleccionado entre el grupo
constituido por Toxoplasma spp., Dirofilaria spp.,
Cryptosporidium spp., Coccidia spp., Babesia
spp., Neospora spp., subunidades de los mismos y
combinaciones de los mismos.
7. El uso de la reivindicación 1, en el
que el adyuvante se selecciona entre el grupo constituido por
polímeros, co-polímeros en bloque, aceites, aceite
en agua, sales de aluminio, e inmunoestimulantes no
específicos.
8. El uso de la reivindicación 1, en el
que el adyuvante se presenta en una cantidad de del 0,01 al
50%.
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