ES2281936T3 - Vacuna contra neospora. - Google Patents
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Abstract
Una vacuna contra Neospora caninum que comprende una Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular inactivada o sus subunidades protectoras, un adyuvante, y como agente de inactivación beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI).
Description
Vacuna contra Neospora.
La presente invención se refiere a una vacuna
para la protección de mamíferos de una enfermedad causada por
Neospora caninum. Más específicamente, la invención se
refiere a vacunas seguras e inmunogénicamente eficaces para la
protección de animales bovinos y caninos contra un aborto causado
por Neospora caninum.
Neospora caninum se presentó por primera
vez por Dubey y col (JAVMA, Vol. 192, Nº 9, 1 de mayo de 1988) como
una enfermedad de tipo Toxoplasmosis que afecta a los perros. Se
descubrió que Neospora caninum era estructuralmente distinta
de Toxoplasma gondii y no reaccionaba con antisuero
anti-T. gondii en un ensayo de inmunoperoxidasa. Dubey y col
describieron las lesiones principales asociadas con el organismo
como meningoencefalomielitis y miositis. En los pasados años, la
neosporosis ha llegado a reconocerse como una enfermedad
reproductora principal en el ganado (Anderson y col., 1994, Food
Animal Practice, 10: 439-461) con casos presentados
en América del Norte y del Sur, Europa, África, los países de la
vertiente del Pacífico así como en los Estados Unidos. La
manifestación clínica principal de la neosporosis bovina es el
aborto fetal, con encefalitis necrotizante no supurante focal,
miocarditis no supurante, y miositis en el feto (Anderson y col.,
1991, Journal of the American Veterinary Medical Association, 198:
241-244). De acuerdo con Anderson y col., 1997
(Journal of the Veterinary Medical Association, 210:
1169-1172), los estudios retrospectivos del ganado
en California indican que la neosporosis ha sido endémica desde al
menos 1985. Estos autores indican que del 18 al 19% de todos los
fetos bovinos abortados presentados al California Veterinary
Diagnostic Laboratory System tienen infección por Neospora
sp. En una encuesta prospectiva de granjas de lechería
seleccionadas en California, la cantidad de abortos atribuidos a
infección por Neospora sp fue incluso mayor (42,5%).
Ho y col (J. Parasitol., 1997, 83(3)) han
informado recientemente de la reproducción exitosa del aborto bovino
y la infección fetal infectando vacas preñadas con taquizoitos de
Neospora caninum. Esta publicación sugiere que puede haber
una correlación entre el título serológico medido por ensayo de
anticuerpos de fluorescencia indirecta (IFA) y la protección del
aborto causado por Neospora caninum en vacas. Las vacas con
títulos IFA de 320 y 640 no abortaron después de la infección con
taquizoitos de este organismo.
Como se ha mencionado previamente, la
neosporosis también se ha presentado en cachorros y en perros de 15
años de edad. El porcentaje de perros infectados que muestran signos
clínicos es desconocido. En perros, Neospora caninum puede
infectar cualquier tejido, aunque se encuentra más habitualmente en
el sistema nervioso central y las raíces de los nervios espinales.
Las infecciones más graves se observan en cachorros que se
infectaron en el útero. Estos cachorros muestran una parálisis
ascendente. El aborto puede reproducirse en una infección
experimental de perras preñadas durante la fase temprana de
gestación. Se han usado sulfonamidas, pirimetamina y clindamicina
para tratar la neosporosis en perros.
Neospora caninum también puede producir
una infección fatal en gatos inoculados experimentalmente. Sin
embargo, aún no se ha indicado que la enfermedad suceda de forma
natural en gatos.
Se ha observado que la neosporosis causa aborto
en ovejas y cabras pero a un menor grado que el encontrado en
ganado. La infección experimental se induce fácilmente en ovejas y
cabras por inyección subcutánea de taquizoitos.
Aunque la neosporosis, especialmente en el
ganado, parece plantear un problema grave creciente y realmente
existe una necesidad importante de solucionar este problema
protegiendo a los mamíferos usando una vacuna, el documento
WO9525541 describe vacunas contra Neospora caninum que
comprenden un extracto bruto de taquizoitos, bradizoitos y otras
fases de Neospora u otros parásitos químicamente fijados. Las
vacunas también pueden contener un adyuvante.
Un objetivo de esta invención es describir una
composición de vacuna para la protección de mamíferos de una
enfermedad causada por Neospora caninum que comprende
taquizoitos de Neospora caninum que ha crecido en cultivo
tisular inactivados, como un cultivo completo o una forma de
extracto o como antígenos de subunidad protectores obtenidos de los
mismos, un adyuvante, y beta-propiolactona (BPL) o
etilenimina binaria (BEI) como agente de inactivación. Un
procedimiento para producir una vacuna para la protección de
mamíferos de una enfermedad causada por Neospora caninum
comprende las etapas de: 1) hacer crecer Neospora caninum en
un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un CPE; 2)
recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo
tisular; 3) inactivar dicha Neospora caninum que ha crecido
en cultivo tisular con un agente de inactivación que es BPL o BEI;
y 4) potenciar con adyuvante la Neospora caninum que ha
crecido en cultivo tisular recogida e inactivada para producir una
vacuna. Otro procedimiento más para producir una vacuna para la
protección de mamíferos de una enfermedad causada por Neospora
caninum comprende las etapas de: 1) hacer crecer Neospora
caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca
un CPE; 2) recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en
dicho cultivo tisular; 3) extraer antígenos protectores de la
Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular para
producir subunidades; 4) inactivar las subunidades con un agente de
inactivación que es BPL o BEI; y 5) potenciar con adyuvante las
subunidades para producir una vacuna. Está dentro de la alcance de
esta invención inactivar la Neospora caninum antes de la
extracción de las subunidades de antígeno protector.
Como se ha expuesto anteriormente, la presente
invención se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una
Neospora caninum potenciada con adyuvante, inactivada, que ha
crecido en un cultivo tisular susceptible o subunidades derivadas
de Neospora caninum. El procedimiento para producir
composiciones de la vacuna anterior comprende hacer crecer
Neospora caninum en condiciones artificiales, en cultivo
tisular, para el propósito de obtener antígenos del parásito para
su uso en vacunas. Puede obtenerse Neospora caninum de
cualquier fuente. Se prefiere que una vacuna para animales bovinos
contenga una Neospora caninum aislada de un feto bovino
abortado. Además, se prefiere que una vacuna pretendida para
animales caninos contenga una Neospora caninum aislada de un
animal canino. De forma ilustrativa, se recoge el cerebro de un feto
infectado, se homogeneiza en un medio de crecimiento tal como Medio
Esencial Mínimo (MEM) o en un diluyente tal como solución salina
tamponada con fosfato (PBS) suplementado con antibióticos para
minimizar el potencial de contaminación. Dicho homogeneizado se
centrifuga para retirar la materia particulada grande y se inocula
el sobrenadante en diversos cultivos tisulares y se hacen pases en
cultivos tisulares, si fuera necesario, hasta que se produzca un
efecto citopático en al menos un cultivo tisular. El cultivo tisular
es preferiblemente una línea celular en la que el parásito crece a
un elevado título de modo que pueda prepararse una Semilla Maestra.
Un elevado título significa que los taquizoitos parásitos crecen
produciendo un recuento, visualizado en un microcopio, o un título
que cuando se coloca de nuevo en cultivo tisular es de al menos 1 x
10^{4} de dosis infecciosa de cultivo tisular_{50}/ml
(DICT_{50}/ml). Preferiblemente, se producen 1 x 10^{5}
DICT_{50}/ml y más preferiblemente, se producen 1 x 10^{6}
DICT_{50}/ml. Una Semilla Maestra significa que la Neospora
sp que ha crecido en cultivo tisular crece a un elevado título,
se preparan alícuotas en volúmenes equivalentes en viales de
congelación y se congelan, después de lo cual se ensaya para ver si
están libre de contaminantes (bacterias, hongos y virus) y después
se usan para preparar Semillas de Trabajo y Semillas de Producción.
Las Semillas de Trabajo y las Semillas de Producción significan
pases adicionales de la Semilla Maestra en un cultivo tisular
susceptible, formación de alícuotas y repetición del ensayo de modo
que puedan producirse vacunas a partir de las Semillas de
Producción en lugar de usar la Semilla Maestra y se prepara toda la
vacuna a partir del mismo material de origen. Un cultivo tisular
susceptible significa un cultivo tisular que, cuando se inocula con
Neospora sp, es capaz de hacer crecer los taquizoitos
parásitos y producir un CPE.
Pueden prepararse diferentes tipos de vacunas de
acuerdo con esta invención, una vacuna inactivada o una vacuna de
subunidad protectora.
El procedimiento para la preparación de una
vacuna de Neospora caninum inactivada requiere que el
organismo crezca a un título mayor y comprende las etapas de hacer
crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible
hasta que se produzca un CPE, recoger dicha Neospora caninum
que ha crecido en cultivo tisular, inactivar dicha Neospora
caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida con un agente
de inactivación que es BPL o BEI; y potenciar con adyuvante la
Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida
e inactivada para producir una vacuna.
El procedimiento para la preparación de una
vacuna de Neospora caninum de subunidad comprende las etapas
de hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular
susceptible hasta que se produzca un CPE, recoger dicha Neospora
caninum que ha crecido en cultivo tisular, extraer antígenos
protectores de la Neospora caninum que ha crecido en cultivo
tisular recogida para producir subunidades de antígeno protector,
inactivar las subunidades con un agente de inactivación que es BPL
o BEI; y potenciar con adyuvante las subunidades para producir una
vacuna. Está dentro del alcance de esta invención inactivar la
Neospora caninum antes de la extracción de las subunidades
de antígeno protector para preparar la vacuna de subunidad.
Los agentes de inactivación pueden seleccionarse
entre el grupo constituido por beta-propiolactona
(BPL) o etilenimina binaria (BEI).
Los adyuvantes usados para aumentar la
inmunogenicidad de las vacunas de Neospora de esta invención pueden
seleccionarse entre el grupo constituido por polímeros tales como
Carbopol, HAVLOGEN® y POLYGEN®, emulsiones de aceite en agua tales
como EMULSIGEN® y EMULSIGEN PLUS®, emulsiones de agua en aceite en
agua, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de
aluminio, inmunomoduladores tales como BAYPAMUN®, adyuvantes
basados en lípidos tales como Bay R-1005 y liposomas
y combinaciones de los mismos.
Las vacunas de Neospora inactivada de esta
invención pueden incluir estabilizadores que se añaden antes o
después de potenciar con adyuvante para mantener el contenido de
antígeno durante periodos largos de tiempo y en condiciones
adversas de altas o bajas temperaturas. Los estabilizadores se
seleccionan entre el grupo constituido por inhibidores de proteasa,
azúcares tales como sacarosa y glicerol, polímeros de encapsulación,
agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA), proteínas y polipéptidos tales como gelatina y poliglicina
y combinaciones de los mismos.
\newpage
Los siguientes ejemplos representan
composiciones de vacunas de Neospora caninum y describen sus
procedimientos de producción incluyendo el crecimiento de
taquizoitos de este organismo en diversas líneas celulares tales
como una línea celular Dérmica Equina (ATCC Nº
CCL-57), una línea celular Vero y una línea celular
de riñón de Mono Verde Africano (BIOWHITTAKER Nº
75-104) que se clonó en Bayer Corporation para
producir una línea celular denominada MA 104 Clone B, y también
describen su uso en la vacunación de animales bovinos para producir
títulos de anticuerpos protectores de fluorescencia indirecta
(IFA).
La invención se ilustra adicionalmente pero no
se pretende que esté limitada por los siguientes ejemplos en los
que todas las partes y porcentajes son en peso salvo que se
especifique de otro modo.
Ejemplo
1
Para determinar si las vacunas de Neospora
caninum pueden producir protección contra el aborto en vacas
preñadas en un modelo conocido en la técnica (Ho y col., 1997), se
produjeron vacunas de Neospora caninum haciendo crecer
Neospora caninum en un línea celular Vero en frascos
rotatorios de 850 cm^{2}. Se retiró un vial de Células de
Trabajo de la línea celular Vero del almacenamiento en nitrógeno
líquido, se descongeló rápidamente, se diluyó y se colocó en
frascos rotatorios de 850 cm^{2} que contenían 250 ml de DMEM
(elevado nivel de glucosa), a partir de ahora denominado DMEMH, a
un índice de 4 x 10^{7} células por frasco rotatorio. El medio
estaba suplementado con Sulfato de Neomicina a 1 ml/l y Suero de
Caballo al 5% v/v. Las células se incubaron de 36 a 38ºC durante 5
a 7 días hasta que las células estuvieron a una confluencia entre el
95 y el 100%. Las Células de Trabajo se retiraron de los frascos
rotatorios aclarando la lámina de células con Solución Salina
Tamponada con Fosfato (PBS) y después añadiendo 10 ml de una
solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
con Tripsina (2,5 g/l de Tripsina + 1 g/l de EDTA) a cada frasco
rotatorio, agitando los frascos suavemente durante al menos 10
minutos hasta que las células se separaron de la superficie y
después aclarando la superficie del frasco con DMEMH y combinando
los contenidos de todos los frascos. Se volvieron a inocular las
células de estos frascos (Células de Producción) en nuevos frascos
rotatorios de 850 cm^{2} a 4,5 x 10^{7} células por frasco
rotatorio. Las Células de Producción se incubaron durante 24 horas
de 36 a 38ºC después de lo cual se infectaron con taquizoitos de
Neospora caninum de un pase reciente de la Cepa
BPA-1 (3 x 10^{8} a 4,5 x 10^{8}/frasco
rotatorio de 850 cm^{2}). En el momento de la infección, las
células de producción tenían una confluencia de al menos el 50%. Se
incubaron los frascos rotatorios infectados de 36 a 38ºC durante
120 a 168 horas en bandejas de frascos rotatorios ajustadas a entre
0,2 y 0,4 rpm. En ese momento, la lámina de células presentaba un
CPE típico que afectaba al menos al 80% de la lámina de células. Al
final del periodo de incubación se recogieron los fluidos de
Neospora combinando los contenidos de todos los frascos rotatorios
en un recipiente estéril y se retiró una muestra para la titulación
de Neospora viva. Los fluidos recogidos aceptables deben tener un
título de al menos 3 x 10^{5}/ml. El título recogido para el
presente lote fue 3 x 10^{5}/ml. Los fluidos recogidos se
congelaron y se descongelaron dos veces manteniendo los fluidos
recogidos a -70ºC y descongelándolos rápidamente a temperaturas no
mayores de 37ºC. Después de este tratamiento se inactivaron los
fluidos recogidos durante un periodo de 48 horas a 4ºC con
Etilenimina Binaria (BEI) 0,2 M. Después de la inactivación, se
neutralizó la BEI con tiosulfato sódico 3,16 M. Los fluidos
recogidos inactivados se concentraron por centrifugación a 3500 rpm
durante 15 minutos y se resuspendió el sedimento en PBS a una
concentración de 3,0 x 10^{7} en base a un recuento en
microscopio. Se potenciaron con adyuvante alícuotas de estos
fluidos recogidos inactivados y concentrados con dos diferentes
tipos de adyuvantes para preparar dos formulaciones de vacuna
diferentes. Una mitad de los fluidos recogidos inactivados y
concentrados se potenció con HAVLOGEN® al 10% (v/v) mientras que el
resto del fluido recogido inactivado y concentrado se potenció con
EMULSIGEN® al 15% (v/v). HAVLOGEN® es un adyuvante basado en
polímero que contiene Carbopol mientras que EMULSIGEN® es un
adyuvante basado en emulsiones de
aceite en agua.
aceite en agua.
Se usaron las dos formulaciones de vacuna para
vacunar vaquillas que varían en edad de dos a dos años y medio
Todas las vaquillas se reprodujeron y cuando se confirmó que estaban
preñadas a los 30 \pm 5 días, se dividieron estos animales en
cuatro grupos que se trataron del siguiente modo:
Se inyectó a las vaquillas del Grupo 1 (Nº 21,
30, 39 y 20) por vía subcutánea dos veces a intervalos de 4 semanas
con una vacuna de Neospora que contenía adyuvante HAVLOGEN® al
10%.
Se inyectó a las vaquillas del Grupo 2 (Nº 18,
37, 40 y 431) por vía subcutánea dos veces a intervalos de 4
semanas con una vacuna de Neospora que contenía EMULSIGEN® al
15%.
Las vaquillas del Grupo 3 (Nº 429, 25, 28 y 2)
sirvieron como controles y se les inyectó por vía subcutánea dos
veces a intervalos de 4 semanas con una preparación de control que
contenía solamente cultivos de células Vero no infectadas que
contenían EMULSIGEN® al 15%.
Las vaquillas del Grupo 4 (Nº 19, 10, 4 y 14)
sirvieron como controles de contacto y ni se vacunaron ni se
expusieron.
Se tomaron muestras de suero de todas las
vaquillas al menos una semana antes de la vacunación (P.V.), en el
día de la primera vacunación (día 0) y en las semanas 5, 6 y 7
después de la vacunación, en el día del refuerzo (refuerzo), el día
de la exposición (entre la semana 11 y 12), y semanalmente después
de ello hasta la semana 16 después de la vacunación. Todas las
vaquillas comenzaron el estudio como seronegativas. En la Tabla 1
se enumeran solamente los títulos medidos en el día de la exposición
ya que éstos son los títulos mayores para este estudio.
Las vaquillas de los Grupos 1-3
se expusieron a 8 x 10^{7} taquizoitos de Neospora caninum
virulentos de la cepa BPA-1 que han crecido en
células Vero. La exposición sucedió a los 85 \pm 5 días de
gestación. Se retiraron los fetos por cesárea de las vaquillas a
los 40 \pm 6 días (114 a 120 días) de gestación y se evaluaron por
examen global. La presencia de fetos muertos se interpretó como
indicativo de que la vacuna no protegía a los fetos y habría
provocado el aborto de los fetos. La presencia de fetos vivos se
interpretó como demostrativo de protección de los fetos y que no
habría sucedido aborto.
La Tabla 1 muestra los resultados de la
evaluación fetal y enumera los títulos serológicos de las vaquillas
en el día de la exposición. Los resultados mostrados en esta tabla
indican que las vaquillas del Grupo 1 contenían dos fetos vivos y
dos fetos muertos lo que sugiere que la vacuna de Neospora
potenciada con adyuvante HAVLOGEN® produjo una protección del 50%
del aborto. Debe observarse que las dos vaquillas protegidas tenían
títulos en la exposición de 320 y 640 respectivamente. Las
vaquillas del Grupo 2 vacunadas con vacuna de Neospora potenciada
con adyuvante EMULSIGEN® contenían un feto vivo de una vaquilla con
un título serológico de 320. Las vaquillas restantes de este grupo
de vacuna tuvieron fetos muertos y títulos menores de 320 en la
exposición. Las dos primeras vaquillas del Grupo 3 (Grupo de
Control que recibió células Vero potenciadas con adyuvante sin
Neospora) tuvieron fetos muertos y títulos <80. Las dos vaquillas
restantes de este grupo se expusieron en un momento posterior que
todas las demás vaquillas y se propone que no recibieron una dosis
de exposición suficientemente alta y, por lo tanto, tuvieron fetos
vivos. Sus títulos fueron <80 en el día de la exposición y en un
examen histológico posterior se demostró que estas vaquillas no
estaban infectadas. Las vaquillas del Grupo 4 no desarrollaron
títulos de anticuerpos durante el estudio lo que indica que los
otros grupos no desprendieron organismos Neospora. Este último
grupo no se expuso ya que sólo sirvió como controles de
contacto.
Este experimento apoya la interpretación de los
datos de Ho y col que propusieron que un título IFA de 320 podría
ser indicativo de protección de aborto fetal.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
2
Este experimento se realizó para determinar si
un organismo de Neospora caninum podría crecer en otra línea
celular de cultivo tisular, inactivarse y formularse para preparar
una vacuna que podría producir títulos de anticuerpos en ganado que
serían similares a los observados en el Ejemplo 1 con vacunas de
Neospora producidas en una línea celular Vero.
Se diluyó una Línea Celular Dérmica Equina, Pase
de la Célula Maestra 11, derivada de la ATCC Nº
CCL-57 a un recuento celular de 2 x 10^{7}
células por frasco rotatorio en un Medio de Eagle Modificado por
Dulbecco (DMEM) que contenía Suero de Caballo al 10% y se inoculó
en frascos rotatorios de 850 cm^{2} a un volumen de 250 ml por
frasco rotatorio. Se cultivaron las células hasta confluencia
después de lo cual se infectaron con 2,4 x 10^{7} taquizoitos de
Neospora caninum en 14,1 ml de DMEM. Cada frasco rotatorio
contenía 264 ml de DMEM más Suero de Caballo al 10%. Los cultivos
titulares infectados con neospora se incubaron a 37ºC hasta que al
menos el 50% de las células demostraron un CPE (aproximadamente 7 a
9 días). Se recogieron los fluidos y se centrifugaron los
taquizoitos durante 30 minutos a 3500 rpm para concentrar el
antígeno recogido. El antígeno de Neospora caninum
concentrado y sedimentado se resuspendió en 200 ml de sobrenadante
de DMEM decantado de los taquizoitos centrifugados. Esta
preparación concentrada que contenía 8 x 10^{6} taquizoitos por
ml se congeló durante 16 horas a -70ºC y después se descongeló a
temperatura ambiente. Después se inactivo la preparación usando
etilenimina binaria (BEI) 0,05 M incubada a 4ºC durante 48 horas. La
preparación inactivada se neutralizó usando tiosulfato sódico 3,16
M. Después se potenciaron dos alícuotas iguales de la preparación
de antígeno de Neospora caninum neutralizado, inactivado, con
diferentes adyuvantes como en el Ejemplo 1. Una mitad de la
preparación se potenció con HAVLOGEN®, un adyuvante polimérico
basado en Carbopol, añadiendo adyuvante a una concentración del 10%
(v/v). La otra mitad de la preparación se potenció con EMULSIGEN®,
un adyuvante basado en aceite, añadiendo adyuvante a una
concentración del 15% (v/v).
Las vacunas de Neospora caninum
potenciadas con adyuvante producidas en Células Dérmicas Equinas se
inyectaron por vía subcutánea en terneros que variaban en edad de 9
a 12 meses. Un ternero (Nº 954) recibió una dosis de 5,0 ml de la
vacuna potenciada con adyuvante HAVLOGEN® mientras que un segundo
ternero (Nº 955) recibió una dosis de 5,0 ml de vacuna potenciada
con adyuvante EMULSIGEN®. Cada ternero se reforzó con la vacuna
homóloga 10 días después. Se extrajo sangre de los terneros en cada
vacunación y 10 días después de la vacunación de refuerzo. Se
analizó el suero para determinar el título usando un ensayo de
anticuerpos de fluorescencia indirecta (IFA). Los títulos
serológicos de estos terneros se muestran en la Tabla 2. Estos
resultados indican que la vacuna de Neospora potenciada con
adyuvante EMULSIGEN® producía títulos protectores mientras que la
vacuna de Neospora potenciada con adyuvante HAVLOGEN® producía un
título inferior que era cercano a protector.
Ejemplo
3
Después de observar a partir de los Ejemplos 1 y
2 que una vacuna de Neospora caninum producida en una línea
celular continua podría producir títulos de anticuerpos protectores
en el ganado que se correlacionan con la protección frente al
aborto, el objeto de este experimento fue evaluar el efecto del
crecimiento de la Neospora caninum en una línea celular
clonada diferente derivada de Riñones de Mono Verde Africano
(MA-104 Clone B) y evaluar los efectos de varios
tipos diferentes de adyuvantes sobre la producción de títulos de
anticuerpos en el ganado.
Se produjo una vacuna de Neospora caninum
del siguiente modo. Se retiró un vial de Células de Trabajo (suero
de caballo MA-104 Clone B) del almacenamiento en
nitrógeno líquido, se descongeló rápidamente, se diluyó y se colocó
en frascos rotatorios de 850 cm^{2} que contenían 250 ml de DMEM
(elevado nivel de glucosa), a partir de ahora denominado DMEMH, a
una concentración de 4 x 10^{7} células por frasco rotatorio. El
medio estaba suplementado con Sulfato de Neomicina a 1 ml/l y Suero
de Caballo al 5% v/v. Las células se incubaron de 36 a 38ºC durante
5 a 7 días hasta que las células estuvieron a una confluencia entre
el 95 y el 100%. Las Células de Trabajo se retiraron de los frascos
rotatorios aclarando la lámina de células con Solución Salina
Tamponada con Fosfato (PBS) y después añadiendo 10 ml de una
solución de EDTA con Tripsina (2,5 g/l de Tripsina + 1 g/l de EDTA)
a cada frasco rotatorio, agitando los frascos suavemente durante al
menos 10 minutos hasta que las células se separaron de la
superficie y después aclarando la superficie del frasco con DMEMH y
combinando los contenidos de todos los frascos. Se volvieron a
inocular las células de estos frascos (Células de Producción) en
nuevos frascos rotatorios de 850 cm^{2} a 4,5 x 10^{7} células
por frasco rotatorio. Las Células de Producción se incubaron
durante 24 horas de 36 a 38ºC después de lo cual se infectaron con
taquizoitos de Neospora caninum de un pase reciente (1,2 x
10^{78}/frasco rotatorio de 850 cm^{2}). En el momento de la
infección, las células de producción estaban a una confluencia de al
menos el 50%. Se incubaron los frascos rotatorios infectados a
36-38ºC durante 120 a 168 horas en bandejas de
frascos rotatorios ajustadas a entre 0,2 y 0,4 rpm. En ese momento,
la lámina de células presentaba un CPE típico que afectaba al menos
al 50% de la lámina de células. Al final del periodo de incubación
se recogieron los fluidos de Neospora combinando los contenidos de
todos los frascos rotatorios en un recipiente estéril del que se
retiró una muestra para la titulación de taquizoitos de Neospora
vivos. Los fluidos recogidos aceptables deben tener un título de al
menos 3 x 10^{5}/ml. El título recogido para el presente lote fue
3 x 10^{5}/ml. En este caso los fluidos recogidos se concentraron
por centrifugación para obtener 2,4 x 10^{7} taquizoitos/ml. Otros
procedimientos de concentración incluyen, aunque sin limitación,
ultrafiltración y cromatografía en columna. Los fluidos recogidos
se inactivaron por adición de etilenimina binaria (BEI) 0,2 M hasta
una concentración final de 0,01 M e incubación de 2 a 7ºC durante
al menos 96 horas. Después de esta incubación, se neutralizó la BEI
por adición de tiosulfato sódico 3,16 M.
Después de la inactivación y la neutralización,
los fluidos se dividieron en cuatro alícuotas. Cada alícuota se
potenció con un adyuvante diferente del siguiente modo:
Fórmula A: 1,0 ml de fluidos recogidos
inactivados más 3,5 ml de PBS más 0,5 ml de un adyuvante polimérico
basado en Carbopol denominado HAVLOGEN®.
Fórmula B: 1,0 ml de fluidos recogidos
inactivados más 3,25 ml de PBS más 0,75 ml de un adyuvante basado
en polímero denominado POLYGEN®.
Fórmula C: 1,0 ml de fluidos recogidos
inactivados más 0,5 ml de HAVLOGEN® más 3,5 ml de un adyuvante
basado en lípidos denominado Bay R-1005.
Fórmula D: 1,0 ml de fluidos recogidos
inactivados más 0,5 ml de PBS más 3,5 ml de MONTANIDE® 773.
Se separaron aleatoriamente en seis grupos
dieciocho vaquillas con una edad de 1,5 a 2,0 años. Las vaquillas
del Grupo 1 (Nº U148, S85 y A84) no recibieron vacuna de Neospora
caninum. Sirvieron como controles de contacto y recibieron
células MA104 Clone B no infectadas. Las vaquillas del Grupo 2 (Nº
A29, 13 y Z55) sirvieron como controles positivos y recibieron
taquizoitos de Neospora vivos (3 x 10^{7} por vía intravenosa y 8
x 10^{7} por vía intramuscular). Las vaquillas del Grupo 3 (Nº
40, 1851 y A71) se vacunaron con tres dosis de 5,0 ml de Fórmula A,
administradas por vía subcutánea a intervalos de 4 semanas. Las
vaquilla del Grupo 4 (Nº 273, Y21, y U93) se vacunaron con tres
dosis de 5,0 ml de Fórmula B, administradas por vía subcutánea a
intervalos de 4 semanas. Las vaquillas del Grupo 5 (Nº Y6, X7, y
800) se vacunaron con tres dosis de 5,0 ml de Fórmula C,
administradas por vía subcutánea a intervalos de 4 semanas. Las
vaquillas del Grupo 6 (Nº A144, S74 y 5212) se vacunaron con tres
dosis de 5,0 ml de Fórmula D administradas por vía subcutánea a
intervalos de 4 semanas. Se extrajo sangre de todos los animales en
el día 0 y después de ello cada dos semanas.
Las muestras de suero se analizaron para la
conversión en títulos específicos de Neospora por el uso de un
ensayo de anticuerpos de fluorescencia indirecta (IFA). La Tabla 3
muestra los resultados serológicos. Todas las preparaciones de
vacuna produjeron niveles de títulos protectores (>320) en las
vaquillas. Sin embargo, los adyuvantes basados en polímero
parecieron producir una mejor respuesta de título que las
formulaciones de adyuvante basado en aceite. Como el ganado de
control de contacto permaneció serológicamente negativo (dentro de
la variación del ensayo) mientras duró el experimento, queda claro
que los títulos producidos en los animales vacunados no se
produjeron por desprendimiento desde las vaquillas inyectadas con
taquizoitos vivos de Neospora sino que fueron un resultado de la
vacunación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Ejemplo
4
Este experimento se realizó para determinar el
impacto de la cantidad de antígeno de Neospora caninum en
las vacunas, y para evaluar una vacuna de Neospora caninum
que comprende antígenos de subunidad. También se incorpora en este
procedimiento de producción de vacunas el uso de una técnica de
"muerte suave" que se define como un procedimiento de
inactivación que utiliza cantidades reducidas de agentes de
inactivación y temperaturas más bajas de incubación y tiempos de
inactivación más cortos. Para este experimento, la Neospora
caninum se hizo crecer y se procesó de un modo similar al
descrito en el Ejemplo 3. El procedimiento de inactivación se
modificó del siguiente modo. Se añadió etilenimina binaria a la
Neospora caninum recogida a una concentración final de 0,01
M pero se incubó a temperatura ambiente durante solamente 24 horas
después de lo cual se neutralizó por adición de tiosulfato sódico a
una concentración final de 0,01 M. Las subunidades se obtuvieron
retirando alícuotas de los fluidos de taquizoitos inactivados,
centrifugándolos a 3500 rpm durante 15 minutos y retirando por
decantado los fluidos sobrenadantes. Los sedimentos de taquizoitos
de Neospora se resuspendieron en Solución Salina Tamponada con
Fosfato de Dulbecco (DPBS) para producir un vacuna de subunidad que
contenía solamente los antígenos de taquizoitos y no los
exoantígenos que se excretan por los taquizoitos en el medio. Se
preparó una segunda vacuna de Neospora resuspendiendo el sedimento
de taquizoitos de Neospora en los fluidos sobrenadantes que se
habían retirado y guardado. Se formularon tres lotes de subunidades
de Neospora caninum resuspendidas en DPBS para que
contuvieran 1,2 x 10^{7}, 2,4 x 10^{7} y 3,6 x 10^{7}
taquizoitos por dosis, respectivamente. Se formularon tres lotes de
Neospora caninum resuspendida en sobrenadante para que
contuvieran cantidades equivalentes de taquizoitos (1,2 x 10^{7},
2,4 x 10^{7} y 3,6 x 10^{7}) por dosis. Todas las formulaciones
se potenciaron con adyuvante HAVLOGEN® y se llevaron a una
concentración final de 5,0 ml/dosis por adición de DPBS (a la vacuna
de subunidad) o el fluido sobrenadante respectivamente.
Se administraron estas formulaciones a vaquillas
seronegativas a Neospora entre las edades de 7 y 9 meses de edad.
Seis grupos de vacunas estaban formados por cinco vaquillas cada uno
(n=5) y dos grupos de control estaban formados por tres vaquillas
cada uno (n=3). Las vaquillas de los grupos de vacuna experimental
se inyectaron cada una por vía subcutánea (SC) con 5,0 ml de una de
las preparaciones de vacuna de taquizoitos de Neospora y se
revacunaron cuatro semanas después. Los grupos de vacuna recibieron
las siguientes vacunas:
Grupo 1 Vacuna de Neospora de subunidad que
contenía 1,2 x 10^{7} taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN® al
10%.
Grupo 2 Vacuna de Neospora de subunidad que
contenía 2,4 x 10^{7} taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN® al
10%.
Grupo 3 Vacuna de Neospora de subunidad que
contenía 3,6 x 10^{7} taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN® al
10%.
Grupo 4 Vacuna de Neospora que contenía 1,2 x
10^{7} taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN® al 10% y diluyente
sobrenadante.
Grupo 5 Vacuna de Neospora que contenía 2,4 x
10^{7} taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN® al 10% y diluyente
sobrenadante.
Grupo 6 Vacuna de Neospora que contenía 3,6 x
10^{7} taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN® al 10% y diluyente
sobrenadante.
Grupo 7 Controles de Contacto - Estas vaquillas
no recibieron vacuna.
Grupo 8 Controles Positivos - Estas vaquillas
recibieron una exposición que contenía 5 x 10^{6} taquizoitos de
Neospora vivos administrados por vía intravenosa en un dosis de 5,0
ml y 3 x 10^{6} taquizoitos de Neospora vivos administrados por
vía intramuscular en una dosis de 5,0 ml.
Todas las vaquillas se alojaron en la misma
parcela, se les extrajo sangre semanalmente durante 7 semanas y se
ensayaron todas las muestras de suero para el título de anticuerpos
específico para Neospora caninum usando IFA. Además, las
vacunas se evaluaron para la reactividad local observando los sitios
de vacunación. Se midió cualquier reacción local y se registró en
centímetros. Las respuestas de título serológico de las vaquillas
se muestran en la
Tabla 4.
Tabla 4.
Los resultados enumerados en la Tabla 4 indican
que las vacunas que contenían los fluidos sobrenadantes añadidos de
nuevo al sedimento de Neospora producen una respuesta de anticuerpos
ligeramente mayor que las vacunas de subunidad de Neospora. Las
respuestas de anticuerpos producidas por vacunas de Neospora
caninum que contenían el sobrenadante añadido de nuevo también
produjeron respuestas de anticuerpos que parecen estar algo
relacionadas con la dosis. Sin embargo, todas las vacunas fueron
eficaces en la producción de niveles protectores de anticuerpos en
el ganado.
Ninguna de las vacunas produjo reacciones
locales significativas después de la vacunación. Por lo tanto, todas
las formulaciones podrían considerarse candidatas de vacunas
comerciales aceptables.
Claims (9)
1. Una vacuna contra Neospora caninum que
comprende una Neospora caninum que ha crecido en cultivo
tisular inactivada o sus subunidades protectoras, un adyuvante, y
como agente de inactivación beta-propiolactona
(BPL) o etilenimina binaria (BEI).
2. La vacuna contra Neospora caninum de
acuerdo con la reivindicación 1 en la que la inactivación se
realiza por congelación/descongelación, seguido por la adición del
agente de inactivación etilenimina binaria (BEI).
3. La vacuna contra Neospora caninum de
acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 en la que la Neospora que ha
crecido en cultivo tisular comprende un antígeno seleccionado entre
el grupo constituido por un cultivo tisular inactivado de
taquizoitos de Neospora, un extracto inactivado de taquizoitos de
Neospora, y una o más subunidades protectoras obtenidas de
taquizoitos de Neospora inactivados.
4. La vacuna contra Neospora caninum de
acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 en la que el adyuvante se
selecciona entre el grupo constituido por polímeros, emulsiones de
aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, lípidos, hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio,
inmunomoduladores y combinaciones de los mismos.
5. La vacuna contra Neospora caninum de
acuerdo con la reivindicación 4 en la que el adyuvante polimérico
se selecciona entre el grupo constituido por Carbopol, HAVLOGEN® y
POLYGEN®.
6. La vacuna contra Neospora caninum de
acuerdo con la reivindicación 4 en la que el adyuvante de aceite en
agua se selecciona entre el grupo constituido por EMULSIGEN® y
EMULSIEN PLUS®.
7. Un procedimiento para producir una vacuna de
Neospora de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las
etapas de:
a. hacer crecer Neospora caninum en un
cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un efecto
citopático;
b. recoger dicha Neospora caninum que ha
crecido en cultivo tisular;
c. inactivar dicha Neospora caninum que
ha crecido en cultivo tisular recogida con un agente de
inactivación que es beta-propiolactona (BPL) o
etilenimina binaria (BEI) y
d. potenciar con adyuvante la Neospora
caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida e inactivada
para producir una vacuna.
8. Un procedimiento para producir una vacuna de
subunidad de Neospora de acuerdo con la reivindicación 1 que
comprende las etapas de:
a. hacer crecer Neospora caninum en un
cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un efecto
citopático;
b. recoger dicha Neospora caninum que ha
crecido en cultivo tisular;
c. extraer uno o más antígenos protectores de la
Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida
para producir una subunidad protectora;
d. inactivar la subunidad o subunidades
protectoras con un agente de inactivación que es
beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria
(BEI) y
e. potenciar con adyuvante la subunidad o
subunidades protectoras para producir una vacuna.
9. Un procedimiento para producir una vacuna de
subunidad de Neospora de acuerdo con la reivindicación 1 que
comprende las etapas de:
a. hacer crecer Neospora caninum en un
cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un efecto
citopático;
b. recoger dicha Neospora caninum que ha
crecido en cultivo tisular;
c. inactivar la Neospora caninum recogida
con un agente de inactivación que es
beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria
(BEI);
d. extraer uno o más antígenos protectores de la
Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular
inactivada y recogida para producir una subunidad o subunidades
protectoras; y
e. potenciar con adyuvante la subunidad o
subunidades protectoras para producir una vacuna.
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