KR20010024245A - 네오스포라 백신 - Google Patents

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KR20010024245A
KR20010024245A KR1020007003074A KR20007003074A KR20010024245A KR 20010024245 A KR20010024245 A KR 20010024245A KR 1020007003074 A KR1020007003074 A KR 1020007003074A KR 20007003074 A KR20007003074 A KR 20007003074A KR 20010024245 A KR20010024245 A KR 20010024245A
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neospora
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neospora caninum
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코로만스키레스젝
브라운카렌케이.
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조지 제이. 리코스
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Abstract

조직 배양으로 증식시킨 네오스포라를 포함하는 네오스포라 캐니넘 백신 및 상기 백신의 제조 및 이용방법. 기재된 네오스포라 캐니넘 백신은 전체 네오스포라 타키조이테스, 네오스포라 타키조이테스의 추출물 및 네오스포라 타키조이테스의 보호 항원 서브유닛을 함유하는 것을 포함한다. 본 발명의 백신은 불활성화되거나 변형되어 살았거나 어쥬번트 및/또는 안정화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 백신은 액체 또는 동결건조된 형태일 수 있다.

Description

네오스포라 백신{Neospora vaccines}
네오스포라 캐니넘(Neospora caninum)은 개에게 영향을 미치는 톡소플라스마병-양(Toxoplasmosis-like) 질병으로서 두베이(Dubey) 등(JAVMA, Vol. 192, No. 9, May 1, 1988)에 의해 최초로 보고되었다. 네오스포라 캐니넘은 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)와 구조적으로 상이한 것으로 확인되었으며 면역퍼옥시다제 시험에서 항-T. 곤디 항혈청과 반응하지 않았다. 두베이 등은 유기체와 관련된 주요 병변이 유막 뇌염과 근내염인 것으로 기재하였다. 지난 몇년간, 네오스포라병은 미합중국 뿐만 아니라, 남북 아메리카, 유럽, 아프리카, 환태평양 국가에서 보고된 사례와 함께, 소의 주요한 번식 질병으로 인식되어 왔다. 소 네오스포라병의 주요 임상 증상은 태아에서 국소 비화농성 괴사 뇌염, 비화농성 심근염 및 근내염을 수반하는 태아 유산이다(앤더슨(Anderson) 등, 1991, Journal of the American Veterinary Medical Association, 198: 241-244). 앤더슨 등, 1997(Journal of the Veterinary Medical Association, 210: 1169-1172)에 따르면, 캘리포니아에서 소를 후향연구한 결과 적어도 1985년 이래 네오스포라병은 풍토성인 것으로 나타났다. 이 저자들은 캘리포니아 가축 진단 연구소 시스템에 제출된 전체 유산된 소 태아의 18 내지 19%가 네오스포라 종에 감염되었다고 진술하고 있다. 캘리포니아에서 선별된 낙농장에서의 전향연구에서, 네오스포라 종의 감염으로 인한 유산 수는 더 많았다(42.5%).
최근 호(Ho) 등(J. Parasitol., 1997, 83(3))은 임신한 소를 네오스포라 캐니넘의 타키조이테스(tachyzoites)로 감염시켜 소 유산 및 태아 감염을 성공적으로 재현하였다고 보고하였다. 이 문헌은 간접 형광 항체(IFA) 시험에 의해 측정된 혈청학적 역가와 소에서 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 유산으로부터의 보호간에 상호연관성이 있음을 제안하였다. IFA 역가가 320 및 640인 소는 이 유기체의 타키조이테스로 감염된후 유산하지 않았다.
이미 언급한 바와 같이, 네오스포라병은 강아지와 15 년령의 개에서도 보고된 바 있다. 임상 징후를 나타낸 감염된 개의 퍼센트는 알려지지 않았다. 개에서, 네오스포라 캐니넘은 중추신경계와 척수신경근에서 가장 일반적으로 발견되지만, 어떤 조직도 감염시킬 수 있다. 가장 심각한 감염은 자궁에 감염된 강아지에서 나타낸다. 이 강아지들은 상행성 마비을 나타낸다. 임신 초기에 있는 임신한 암캐의 실험적 감염에서 유산을 재현할 수 있다. 설폰아미드, 피리메타민 및 클린다마이신이 개에서 네오스포라병을 치료하는데 사용되어 왔다.
네오스포라 캐니넘은 또한 실험적으로 접종된 고양이에서 태아 감염을 일으킬 수 있다. 그러나, 그 질병이 고양이에서 자연적으로 발생한 것은 아직 보고된 바 없다.
네오스포라병은 소에서 발견된 것 보다 덜한 정도이지만 양과 염소에서 유산을 유발하는 것으로 관찰되었다. 타키조이테스를 피하주사하여 양과 염소에서 실험적 감염을 쉽게 유도할 수 있다.
네오스포라병이, 특히 소에서, 점차 심각한 문제를 일으키고 있는 것으로 보이고, 백신을 이용하여 포유동물을 보호함으로써 이 문제를 해결해야 할 오랜 필요성이 분명히 있음에도 불구하고, 네오스포라 캐니넘에 의해 유발되는 질병으로부터 소와 다른 동물을 보호하기 위한 백신, 백신 개발 및 백신을 제조하는 방법의 제안에 관한 기재가 없다.
발명의 요약
전체 배양물로서나 추출물 형태로나 그로부터 얻은 서브유닛 항원으로서, 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘 타키조이테스를 포함하는 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 질병으로부터 포유동물을 보호하기 위한 백신 조성물을 기재하는 것이 본 발명의 초점이다. 또한, 감수성(susceptible) 조직 배양물에서 세포변성 효과(CPE)가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고, 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며 상기 수획물을 백신으로 제제화하는: 단계를 포함하는 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 질병으로부터 포유동물을 보호하기 위한 백신을 제조하는 방법을 기재하는 것이 본 발명의 초점이다. 이 방법으로 제조된 변형된 생백신은 네오스포라 종을 불활성화시키지 않고 포유동물에게 투여될 수 있다. 그러나, 상기 비-불활성화된 네오스포라 종을 조직 배양물에서 증식시키기 전에 공지의 기술에 의해 약독화시키는 것이 필요하다. 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 질병으로부터 포유동물을 보호하기 위한 백신을 제조하는 다른 방법은 1) 감수성 조직 배양물에서 CPE가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고; 2) 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며; 3) 상기 수획한 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 불활성화시키고; 4) 불활성화시킨 수획한 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 어쥬번트시켜(adjuvanting) 백신을 제조하는: 단계를 포함한다. 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 질병으로부터 포유동물을 보호하기 위한 백신을 제조하는 또 다른 방법은 1) 감수성 조직 배양물에서 CPE가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고; 2) 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며; 3) 수획한 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘으로부터 보호 항원을 추출하여 서브유닛을 제조하고; 4) 필요한 경우 서브유닛을 불활성화시키며; 5) 서브유닛을 어쥬번트시켜 백신을 제조하는: 단계를 포함한다. 보호 항원 서브유닛을 추출하기전에 네오스포라 캐니넘을 불활성화시키는 것은 본 발명의 범위내에 속한다.
본 발명은 네오스포라 캐니넘(Neospora caninum)에 의해 유발되는 질병으로부터 포유동물을 보호하기 위한 백신에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 네오스포라 캐니넘에 의해 유발되는 유산(abortion)으로부터 소와 개를 보호하기 위한 안전하고도 면역원적으로 유효한 백신에 관한 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 감수성 조직 배양물에서 증식시킨 변형된 생 네오스포라 캐니넘, 감수성 조직 배양물에서 증식시킨 어쥬번트시킨 네오스포라 또는 네오스포라 캐니넘으로부터 유래된 서브유닛을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 백신 조성물을 제조하는 방법은 백신으로 사용하기 위한 기생 항원을 얻기 위하여, 조직 배양물에서 인공적인 조건하에 네오스포라 캐니넘을 증식시키는 것을 포함한다. 네오스포라 캐니넘을 어떠한 출처로부터도 얻을 수 있다. 소를 위한 백신은 유산된 소 태아로부터 분리된 네오스포라 캐니넘을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 개를 위한 백신은 개로부터 분리된 네오스포라 캐니넘을 함유하는 것이 바람직하다. 예를들어, 감염된 태아의 뇌를 수획하여, 최소 필수 배지(MEM)와 같은 증식배지나 오염 가능성을 최소화시키기 위하여 항생제를 첨가한 인산염 완충액(PBS)과 같은 희석제에서 균질화시킨다. 그러한 균질화물을 원심분리하여 큰 입자 물질을 제거하고 상등액을 다양한 조직 배양물에 접종하여 필요한 경우, 세포변성 효과(CPE)가 적어도 하나의 조직 배양물에서 나타날때까지 조직 배양물에서 계대한다. 바람직하게는 조직 배양물은 모 종균(Master Seed)을 제조할 수 있도록 기생균이 고역가로 증식하는 세포주이다. 고역가는 기생균 타키조이테스가 증식하여 현미경하에서 가시화되는 카운트(count)나, 조직 배양물에 재위치시켰을때 적어도 1×104조직 배양물 감염 용량50/㎖(TCID50/㎖)의 역가를 얻는 것을 의미한다. 바람직하게는, 1×105TCID50/㎖이 얻어지고, 보다 바람직하게는, 1×106TCID50/㎖이 얻어진다. 모 종균은 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘 종을 고역가로 증식시켜, 동결 바이알(vials)에서 동일한 부피로 분액 동결시킨후, 오염원(세균, 곰팡이 및 바이러스)이 없는지에 대해 시험하고 그후 발효 종균(Working Seeds) 및 제조 종균(Production Seeds)을 제조하는데 사용하는 것을 의미한다. 발효 종균 및 제조 종균은 모 종균을 사용하는 대신 제조 종균으로부터 백신을 제조할 수 있고 모든 백신을 동일한 근원 물질로부터 제조하기 위하여, 감수성 조직 배양물에서 모 종균을 추가 계대, 분액, 동결 및 반복 시험하는 것을 의미한다. 감수성 조직 배양물은 네오스포라 종을 접종하였을때 기생균 타키조이테스를 증식시키고 CPE를 나타낼 수 있는 조직 배양물을 의미한다.
적어도 세 가지 형의 백신, 변형된 생백신, 불활성화된 백신 또는 서브 유닛 백신을 본 발명에 따라 제조할 수 있다. 변형된 생백신을 제조하고자 하는 경우, 기생균이 병원성을 상실하도록 모 종균을 제조하기전에, 네오스포라 종을 화학적 돌연변이 유발 및 유전공학에 제한되지는 않지만 그들을 포함하는 공지의 기술에 의해 돌연변이시키거나 유전적으로 변형시켜야만 한다. 일단 비-병원성 (avirulent) 돌연변이를 제조한후, 돌연변이된 네오스포라 종을 감수성 조직 배양물에서 증식시켜 모 종균을 제조하고 상기한 바와 같이 동결시킨다. 변형된 생백신의 제조는 감수성 조직 배양물에서 CPE가 나타날때까지 돌연변이된 네오스포라 캐니넘을 증식시키고, 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 종을 수획하며, 상기 수획물을 백신으로 제제화하는 단계를 포함한다. 제제에는 안정화제 및/또는 어쥬번트 또는 면역조절제가 첨가될 수 있다. 백신은 액체 형태로 남아 있거나 동결건조될 수 있다.
불활성화된 네오스포라 캐니넘 백신을 제조하는 방법은 유기체를 고역가로 증식시키는 것을 필요로 하며 감수성 조직 배양물에서 CPE가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고, 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며, 상기 수획한, 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 불활성화시키고, 불활성화시킨, 수획한 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 어쥬번트시켜 백신을 제조하는 단계를 포함한다.
서브유닛 네오스포라 캐니넘 백신을 제조하는 방법은 감수성 조직 배양물에서 CPE가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고, 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며, 수획한 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘으로부터 보호 항원을 추출하고, 필요한 경우 서브유닛을 불활성화시키며, 서브유닛을 어쥬번트시켜 백신을 제조하는 단계를 포함한다. 서브유닛 백신을 제조하기 위하여 보호 항원 서브유닛을 추출하기전에 네오스포라 캐니넘을 불활성화시키는 것은 본 발명의 범위내에 속한다.
불활성화제는 포르말린, 베타-프로피오락톤(BPL), 열, 이원(binary) 에틸렌이민(BEI), 세정제 및 동결/해동으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 바람직한 불활성화제는 BEI 및 BPL이다.
본 발명의 네오스포라 백신의 면역원성을 증가시키는데 사용되는 어쥬번트는 폴리머(예: 카르보폴(Carbopol), 하블로젠(HAVLOGENR) 및 폴리젠(POLYGENR)), 수중유(oil in water)(예: 에멀시젠(EMULSIGENR) 및 에멀시젠 플러스(EMULSIGEN PLUSR)), 수중유중수(water-in-oil-in-water), 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 면역조절제(예: 바이파문(BAYPAMUNR)), 지질 기제 어쥬번트(예: 바이 R-1005(Bay R-1005)) 및 리포좀 및 그 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 불활성화된 네오스포라 백신은 장기간에 걸친 고온 또는 저온의 가혹한 조건하에서 항원 함량을 유지시키기 위하여, 어쥬번트시키기 전후에 첨가되는 안정화제를 포함할 수 있다. 안정화제는 프로테아제 저해제, 슈가(예: 슈크로스 및 글리세롤), 캡슐화(encapsulating) 폴리머, 킬레이트화제(예: 에틸렌-디아민테트라아세트산(EDTA)), 단백질 및 폴리펩타이드(예: 젤라틴 및 폴리글리신) 및 그 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
이하 실시예는 네오스포라 캐니넘 백신 조성물을 나타내고 말 피부 세포주(ATCC No. CCL-57), 베로 세포주 및 바이엘 코포레이션에서 클로닝하여 MA 104 클론 B로 명명한 세포주를 제조하는 아프리카 그린 몽키 신장 세포주 (BIOWHITTAKER No. 75-104)와 같은 다양한 세포주에서 이 유기체의 타키조이테스를 증식시키는 것을 포함하는 그들의 제조방법을 기재하며 보호 간접 형광 항체(IFA) 역가를 얻기 위하여 소를 예방접종하는데 있어서의 그들의 용도를 기재한다.
본 발명은 이하 실시예에 의해 추가로 설명되나, 그들에 의해 제한되는 것으로 이해되어서는 안되며, 여기서 달리 특정하지 않는 한, 모든 부 및 퍼센트는 중량에 의한 것이다.
실시예 1:
당업계에 공지된 모델(호 등, 1997)에서 네오스포라 캐니넘 백신이 임신한 소를 유산으로부터 보호할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 850 cm2롤러 바틀의 베로 세포주에서 네오스포라 캐니넘을 증식시켜 네오스포라 캐니넘 백신을 제조하였다. 베로 세포주의 발효 세포 1 바이알을 액체 질소 저장물로부터 제거한후, 신속하게 해동시키고 희석하여, 250 ㎖의 DMEM(고 글루코스)(이하, DMEMH라 함)을 함유하는, 850 cm2롤러 바틀에 롤러당 4×107세포의 비율로 위치시켰다. 배지에 1 ㎖/ℓ의 황산네오마이신 및 5% v/v의 말 혈청을 첨가하였다. 세포의 탁도(confluency)가 95 내지 100%가 될때까지 세포를 36 내지 38 ℃에서 5 내지 7 일동안 배양하였다. 세포 쉬트를 인산염 완충용액(PBS)으로 헹구고 각각의 롤러 바틀에 트립신-에틸렌-디아민테트라아세트산 이나트륨염(EDTA) 용액(2.5 g/ℓ의 트립신 + 1 g/ℓ의 EDTA)을 가하고, 세포가 표면으로부터 벗겨질때까지 적어도 10 분동안 바틀을 천천히 진탕한후, 바틀 표면을 DMEMH로 헹구고 모든 바틀의 내용물을 풀링(pooling)시켜 세포를 롤러 바틀로부터 제거하였다. 이 바틀로부터의 세포를 새로운 850 cm2롤러 바틀에 롤러당 4×107세포로 재접종하였다. 제조 세포를 24 시간동안 36 내지 38 ℃에서 배양한후, 새로 계대한 네오스포라 캐니넘 타키조이테스 균주 BPA-1(3×108내지 4.5×108/850cm2롤러 바틀)로 감염시켰다. 감염시, 제조 세포의 탁도는 적어도 50%였다. 감염된 롤러 바틀을 36 내지 38 ℃에서 120 내지 168 시간동안 0.2 내지 0.4 rpm으로 셋팅된 회전 롤러 랙에서 배양하였다. 그때, 세포 쉬트는 적어도 80%의 세포 쉬트에 영향을 미치는 전형적인 CPE를 나타내고 있었다. 배양기간 말기에 모든 롤러 바틀로부터 내용물을 멸균 용기로 풀링시켜 네오스포라 유체를 수획하고 생 네오스포라를 적정하기 위해 샘플을 제거하였다. 허용가능한 수획 유체의 역가는 적어도 3×105/㎖이다. 본 배치의 수획 역가는 3×105/㎖이었다. 수획 유체를 -70 ℃에서 유지시키고 37 ℃ 이하의 온도에서 신속하게 해동시킴으로써 수획 유체를 2 회 동결 및 해동시켰다. 이 처리후, 수획 유체를 48 시간동안 4 ℃에서 0.2 M 이원 에틸렌이민(BEI)으로 불활성화시켰다. 불활성화후, BEI를 3.16 M 티오황산나트륨으로 중화시켰다. 불활성화된 수획 유체를 3500 rpm에서 15 분동안 원심분리하여 농축시키고 농도가 현미경 계수 기준으로 3.0×107이 되도록 침전물을 PBS에 재현탁하였다. 2 가지 다른 백신 제제를 제조하기 위하여, 이 불활성화되고 농축된 수획 유체 분액을 2 가지 다른 형의 어쥬번트로 어쥬번트시켰다. 불활성화되고 농축된 수획 유체의 1/2을 10%(v/v)의 하블로젠R으로 어쥬번트시키고 나머지 불활성화되고 농축된 수획 유체를 15%(v/v)의 에멀시젠R으로 어쥬번트시켰다. 하블로젠R은 카르보폴을 함유하는 폴리머 기제 어쥬번트이고 에멀시젠R은 수중유 기제 어쥬번트이다. 두 가지 백신 제제를 2 내지 2.5 년령 범위의 암송아지를 예방접종하는데 사용하였다. 모든 암송아지를 수정시키고 30±5일에 임신이 확인되었을 때, 이들 동물을 4 그룹으로 나누어 다음과 같이 처리하였다:
그룹 1 암송아지(No. 21, 30, 39 및 20)에게 10% 하블로젠R어쥬번트를 함유하는 네오스포라 백신을 4 주 간격으로 2 회 피하 주사하였다.
그룹 2 암송아지(No. 18, 37, 40 및 431)에게 15% 에멀시젠R을 함유하는 네오스포라 백신을 4 주 간격으로 2 회 피하 주사하였다.
그룹 3 암송아지(No. 429, 25, 28 및 2)를 대조군으로 하여 15% 에멀시젠R을 함유하는 비감염된 베로 세포주만을 함유하는 대조 제제를 4 주 간격으로 2 회 피하 주사하였다.
그룹 4 암송아지(No. 19, 10, 4 및 14)를 접촉 대조군으로 하여 예방접종도 하지 않고 공격도 하지 않았다.
예방접종으로부터 적어도 1 주일전(P.V.), 최초 예방접종일(0 일) 및 예방접종후 5, 6 및 7 주후 및 보강일(보강), 공격일(11 및 12 주사이), 및 그후 예방접종후 16 주에 걸쳐 모든 암송아지로부터 혈청 샘플을 적어도 매주 채취하였다. 모든 암송아지는 혈청학적음성으로 본 연구를 시작하였다. 공격일에 측정된 역가가 본 연구의 대부분의 역가이므로, 그것만을 표 1에 나타내었다.
그룹 1-3의 암송아지를 베로 세포에서 증식시킨 8×107병원성 네오스포라 캐니넘 타키조이테스 균주 BPA-1으로 공격하였다. 임신 85±5 일에 공격하였다. 임신 40±6 일(114 내지 120일)에 태아를 송아지로부터 제왕절개에 의해 제거하고 육안 조사로 평가하였다. 죽은 태아의 존재는 백신이 태아를 보호하지 못하고 태아가 유산된 것으로 해석되었다. 살아있는 태아의 존재는 태아를 보호한 것을 입증하고 유산이 일어나지 않은 것으로 해석되었다.
표 1은 태아 측정의 결과를 나타내고 공격일에 암송아지의 혈청학적 역가를 나타낸다. 이 표에 나타낸 결과가 그룹 1의 암송아지는 두 살아있는 태아와 두 죽은 태아를 포함하는 것으로 나타나 하블로젠R어쥬번트시킨 네오스포라 백신이 유산으로부터 50%를 보호한 것으로 제안되었다. 두 보호된 암송아지의 공격시 역가가 각각 320 및 640임을 주목하여야 한다. 에멀시젠R어쥬번트시킨 네오스포라 백신으로 예방접종된 그룹 2의 암송아지는 혈청학적 역가가 320인 암송아지로부터 하나의 살아있는 태아를 포함하였다. 이 백신 그룹의 나머지 암송아지는 죽은 태아를 갖고 공격시 역가가 320 미만이었다. 그룹 3의 처음 두 암송아지(네오스포라가 없는 어쥬번트된 베로 세포를 받은 대조군)는 죽은 태아를 갖고 역가가 ＜80이었다. 이 그룹의 나머지 두 암송아지는 다른 모든 암송아지 보다 더 늦게 공격당하고 충분히 높은 공격 용량을 받지 않아서 살아있는 태아를 갖는 것으로 제안되었다. 그들의 역가는 공격일에 ＜80이었으며 이후 조직 검사에서 이들 암송아지는 감염되지 않은 것으로 나타났다. 그룹 4 암송아지는 연구중 항체 역가를 나타내지 않아 다른 그룹이 네오스포라 유기체를 탈립(shed)하지 않았음을 나타내었다. 이 후자 그룹은 접촉 대조군으로서만 이용되므로 공격당하지 않았다.
본 실험은 본 발명자들이 320 IFA 역가가 태아 유산으로부터 보호의 지표임을 제안한, 호 등 데이터에 대한 본 발명자들의 해석을 뒷받침한다.
실시예 2:
네오스포라 캐니넘 유기체를 또 다른 조직 배양 세포주에서 증식 및 불활성화시키고 제제화하여 베로 세포주에서 제조된 네오스포라 백신으로 실시예 1에서 관찰된 것과 유사한 소의 항체 역가를 얻을 수 있는 백신을 제조할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 이 실험을 수행하였다.
ATCC No. CCL-57로부터 유래된 말 피부 세포주, 모 세포 계대 11을 10%의 말 혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium; DMEM)에서 세포 계수가 롤러 바틀당 2×107세포가 되도록 희석하고 롤러 바틀당 250 ㎖ 부피로 850 cm2롤러 바틀에 접종하였다. 세포를 일정 탁도로 증식시킨후 14.1 ㎖의 DMEM에서 2.4×107네오스포라 캐니넘 타키조이테스로 감염시켰다. 각각의 롤러 바틀은 264 ㎖의 DMEM 및 10% 말 혈청을 함유하였다. 적어도 50%의 세포가 CPE를 나타낼때까지(약 7 내지 9 일) 네오스포라-감염된 조직 배양물을 37 ℃에서 배양하였다. 유체를 수획하고 수획 항원을 농축시키기 위하여 타키조이테스를 30 분동안 3500 rpm에서 원심분리하였다. 침전된 농축 네오스포라 캐니넘 항원을 원심분리된 타키조이테스로부터 가만히 따른 DMEM 상등액 200 ㎖에 재현탁시켰다. ㎖당 8×106타키조이테스를 함유하는 이 농축된 제제를 16 시간동안 -70 ℃에서 동결시킨후 실온에서 해동시켰다. 그후 제제를 0.05 M 이원 에틸렌디아민 (BEI)을 사용하여 불활성화시키고 4 ℃에서 48 시간동안 배양하였다. 불활성화된 제제를 3.16 M 티오황산나트륨을 사용하여 중화시켰다. 그후 불활성된, 중화 네오스포라 캐니넘 항원 제제의 두 동일 분액을 실시예 1에서와 같이 상이한 어쥬번트로 어쥬번트시켰다. 어쥬번트를 10% 농도(v/v)로 가하여 제제의 1/2을 카르보폴-기제 폴리머 어쥬번트, 하블로젠R으로 어쥬번트시켰다. 어쥬번트를 15% 농도(v/v)로 가하여 제제의 나머지 1/2을 오일-기제 어쥬번트, 에멀시젠R으로 어쥬번트시켰다.
말 피부 세포에서 제조한 어쥬번트시킨 네오스포라 캐니넘 백신을 9 내지 12 월령 범위의 송아지에세 피하 주사하였다. 한 송아지(#955)는 5.0 ㎖ 용량의 하블로젠R어쥬번트된 백신을 받았으며 두 번째 송아지(#955)는 5.0 ㎖ 용량의 에멀시젠R어쥬번트된 백신을 받았다. 10 일후 각각의 송아지를 동일한 백신으로 보강접종하였다. 각각의 예방접종시 및 보강접종 10 일후 송아지를 채혈하였다. 간접 형광 항체(IFA) 시험을 이용하여 혈청 역가를 분석하였다. 이들 송아지의 혈청학적 역가를 표 2에 나타내었다. 이들 결과로부터 에멀시젠R어쥬번트된 네오스포라 백신이 보호 역가를 얻은 반면 하블로젠R어쥬번트된 네오스포라 백신은 보호성에 가까운 낮은 역가를 얻었음을 알 수 있다.
실시예 3:
실시예 1 및 2로부터 연속 세포주에서 제조된 네오스포라 캐니넘 백신이 유산으로부터의 보호와 상호연관되어 있는 소의 보호 항체 역가를 나타낼 수 있음을 확인한후, 아프리카 그린 몽키 신장(MA-104 클론 B)으로부터 유래된 완전히 다른 클로닝된 세포주에서 네오스포라 캐니넘의 증식 효과를 측정하고 소에서 항체 역가를 얻는 것에 대한 몇몇 다른 형의 어쥬번트의 효과를 측정하는 것이 이 실험의 목적이다.
네오스포라 캐니넘을 다음과 같이 제조하였다. 발효 세포(MA-104 클론 B 말 혈청) 1 바이알을 액체 질소 저장물로부터 제거하고 신속하게 해동시켜 희석하고 250 ㎖의 DMEM(고 글루코스)(이하, DMEMH라 함)을 함유하는 850 cm2롤러 바틀에 롤러당 4×107세포 농도로 접종하였다. 배지에 황산네오마이신 1 ㎖/ℓ 및 말 혈청 5% v/v를 첨가하였다. 세포의 탁도가 95 내지 100%가 될때까지 세포를 36 내지 38 ℃에서 5 내지 7 일동안 배양하였다. 세포 쉬트를 인산염 완충액(PBS)으로 헹군후 10 ㎖의 트립신-EDTA 용액(트립신 2.5 g/ℓ + EDTA 1 g/ℓ)을 각각의 롤러 바틀에 가하고, 세포가 표면으로부터 벗겨질때까지 적어도 10 분동안 바틀을 천천히 진탕한후 바틀 표면을 DMEMH로 헹구고 모든 바틀의 내용물을 풀링시켜 발효 세포를 롤러 바틀로부터 제거하였다. 이들 바틀로부터의 세포(제조 세포)를 새로운 850 cm2롤러 바틀에 롤러 바틀당 4.5×107세포로 재접종하였다. 제조 세포를 24 시간동안 36 내지 38 ℃에서 배양한후 새로 계대한 네오스포라 캐니넘 타키조이테스(1.2×107/850 cm2롤러 바틀)로 감염시켰다. 감염시, 제조 세포의 탁도는 적어도 50%였다. 감염된 롤러 바틀을 36-38 ℃에서 120 내지 168 시간동안 0.2 내지 0.4 rpm으로 셋팅된 회전 롤러 랙에서 배양하였다. 그때, 세포 쉬트는 적어도 50%의 세포 쉬트에 영향을 미치는 전형적인 CPE를 나타내고 있었다. 배양기간 말기에, 생 네오스포라 타키조이테스를 적정하기 위해 샘플을 제거한 멸균 용기에 모든 롤러 바틀로부터의 내용물을 풀링시켜 네오스포라 유체를 수획하였다. 허용가능한 수획 유체의 역가는 적어도 3×105/㎖이다. 본 배치의 수획 역가는 2.3×106이었다. 이 경우 2.4×107타키조이테스/㎖을 얻기 위하여 수획 유체를 원심분리로 농축시켰다. 다른 농축 방법은 한외여과 및 칼럼 크로마토그래피를 포함하지만 그들로 한정되는 것은 아니다. 최종 농도 0.01 M로 0.2 M 이원 에틸렌이민(BEI)을 첨가하고 2 내지 7 ℃에서 적어도 96 시간동안 배양하여 수획 유체를 불활성화시켰다. 이 배양후, 3.16 M의 티오황산나트륨을 첨가하여 BEI를 중화시켰다.
불활성화 및 중화후, 유체를 4 분액으로 나누었다. 각각의 분액을 다음과 같은 상이한 어쥬번트로 어쥬번트시켰다.
제제 A: 1.0 ㎖의 불활성화된 수획 유체 및 3.5 ㎖의 PBS 및 0.5 ㎖의 하블로젠R으로 명명된 카르보폴-기제 폴리머 어쥬번트.
제제 B: 1.0 ㎖의 불활성화된 수획 유체 및 3.5 ㎖의 PBS 및 0.75 ㎖의 폴리젠R으로 명명된 폴리머-기제 어쥬번트.
제제 C: 1.0 ㎖의 불활성화된 수획 유체 및 0.5 ㎖의 하블로젠R및 3.5 ㎖의 바이 R-1005로 명명된 지질-기제 어쥬번트.
제제 D: 1.0 ㎖의 불활성화된 수획 유체 및 0.5 ㎖의 PBS 및 3.5 ㎖의 몬타나이드(MONTANIDE)R773.
1.5 내지 2.0 년령 범위인 18 마리의 암송아지를 6 그룹으로 무작위로 분리시켰다. 그룹 1 암송아지(No. U148, S85 및 A184)는 네오스포라 캐니넘 백신을 받지 않았다. 그들은 접촉 대조군으로 사용되었고 감염되지 않은 MA104 클론 B 세포를 받았다. 그룹 2 암송아지(No. A29, 13 및 Z55)는 양성 대조군으로 사용되었고 생 네오스포라 타키조이테스를 받았다(3×107정맥내 및 8×107근육내). 그룹 3 암송아지(No. 40, 1851 및 A71)를 4 주 간격으로 피하 투여되는 세 5.0 ㎖ 용량의 제제 A로 예방접종하였다. 그룹 4 암송아지(No. 237, Y21 및 U93)를 4 주 간격으로 피하 투여되는 세 5.0 ㎖ 용량의 제제 B로 예방접종하였다. 그룹 5 암송아지(No. Y6, X7 및 800)를 4 주 간격으로 피하 투여되는 세 5.0 ㎖ 용량의 제제 C로 예방접종하였다. 그룹 6 암송아지(No. A144, S74 및 5212)를 4 주 간격으로 피하 투여되는 세 5.0 ㎖ 용량의 제제 D로 예방접종하였다. 모든 동물을 0 일 및 그후 격주로 채혈하였다.
간접 형광 항체(IFA) 시험을 이용하여 혈청 샘플의 네오스포라 특이적 역가로의 전환을 분석하였다. 표 3 은 혈청학적 결과를 나타낸다. 모든 백신 제제가 암송아지에서 보호 역가 수준(＞320)을 얻었다. 그러나, 폴리머-기제 어쥬번트가 오일-기제 어쥬번트 제제 보다 더 좋은 역가 반응을 나타낸 것으로 보인다. 접촉 대조군 소는 실험동안 혈청학적 음성(시험 변화이내)으로 남아 있었으므로 예방접종된 동물에서 얻어진 역가가 네오스포라 타키조이테스로 감염된 암송아지로부터의 탈립에 의해 얻어진 것이 아니라 예방접종의 결과임이 분명하다.
실시예 4:
백신에서 네오스포라 캐니넘 항원 량의 영향을 결정하고, 서브유닛 항원을 포함하는 네오스포라 백신을 평가하기 위하여 이 실험을 수행하였다. 또한 감소된 양의 불활성화제 및 낮은 배양 온도 및 짧은 불활성화 시간을 이용하는 불활성화 과정으로 정의된 "소프트 킬(soft kill)" 기술의 사용을 이 백신 제조방법에 도입하였다. 이 실험을 위하여, 실시예 3에 기재된 것과 유사한 방법으로 네오스포라 캐니넘을 증식시키고 가공하였다. 이원 에틸렌이민을 수획된 네오스포라 캐니넘에 최종 농도 0.01 M로 가하되 실온에서 24 시간동안만 배양한후 티오황산나트륨을 최종 농도 0.01 M로 가하여 중화시켰다. 불활성화된 타키조이테스 유체의 분액을 제거하고 3500 rpm에서 15 분동안 원심분리하여 상등 유체를 가만히 따라내어 서브유닛을 얻었다. 네오스포라 타키조이테스 침전물을 둘베코 인산염 완충액(DPBS)에 재현탁시켜 타키조이테스 항원만을 함유하고 타키조이테스가 배지로 분비한 엑소항원은 함유하지 않는 서브유닛 백신을 제조하였다. 제거하여 비축해둔 상등 유체에 네오스포라 타키조이테스 침전물을 재현탁시켜 두 번째 네오스포라 백신을 제조하였다. 세 배치의 서브유닛 DPBS 재현탁된 네오스포라 캐니넘을 각각 용량당 1.2×107, 2.4×107및 3.6×107의 타키조이테스를 함유하도록 제제화하였다. 세 배치의 상등액 재현탁된 네오스포라 캐니넘을 용량당 같은 수의 타키조이테스를 함유하도록 제제화하였다(1.2×107, 2.4×107및 3.6×107). 모든 제제를 하블로젠R으로 어쥬번트시키고 각각 DPBS(서브유닛 백신에 대해) 또는 상등 유체를 첨가하여 최종 5.0 ㎖/용량이 되게 하였다.
이들 제제를 7 내지 9 월령의 네오스포라 혈청음성 암송아지에게 투여하였다. 6 개의 백신 그룹은 각각 5 마리의 암송아지로 구성되고(n=5) 2 개의 대조군은 각각 3 마리의 암송아지로 구성되었다(n=3). 실험 백신 그룹의 암송아지를 각각 하나의 네오스포라 타키조이테스 백신 제제 5.0 ㎖로 피하주사하고(SC) 4 주후 재접종하였다. 백신 그룹은 다음의 백신을 받았다:
그룹 1: 1.2×107네오스포라 타키조이테스 및 10% 하블로젠R을 함유하는 서브유닛 네오스포라 백신.
그룹 2: 2.4×107네오스포라 타키조이테스 및 10% 하블로젠R을 함유하는 서브유닛 네오스포라 백신.
그룹 3: 3.6×107네오스포라 타키조이테스 및 10% 하블로젠R을 함유하는 서브유닛 네오스포라 백신.
그룹 4: 1.2×107네오스포라 타키조이테스 및 10% 하블로젠R및 상등액 희석제를 함유하는 네오스포라 백신.
그룹 5: 2.4×107네오스포라 타키조이테스 및 10% 하블로젠R및 상등액 희석제를 함유하는 네오스포라 백신.
그룹 6: 3.6×107네오스포라 타키조이테스 및 10% 하블로젠R및 상등액 희석제를 함유하는 네오스포라 백신.
그룹 7: 접촉 대조군 - 이들 암송아지는 백신을 받지 않았다.
그룹 8: 양성 대조군 - 이들 암송아지는 5.0 ㎖ 용량으로 정맥내 투여되는 5×106생 네오스포라 타키조이테스 및 5.0 ㎖ 용량으로 근육내 투여되는 3×106생 네오스포라 타키조이테스를 함유하는 공격을 받았다.
모든 암송아지를 동일 구획에 가두어 7 주동안 매주 채혈하고 IFA를 이용하여 모든 혈청 샘플의 네오스포라 캐니넘에 대해 특이적인 항체 역가를 시험하였다. 또한, 예방접종 위치를 관찰하여 백신의 국부 반응성을 측정하였다. 모든 국부 반응을 센티미터로 측정하고 기록하였다. 암송아지의 혈청 역가 반응을 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타낸 결과로부터 네오스포라 침전물에 재첨가한 상등 유체를 함유하는 백신이 네오스포라 서브유닛 백신 보다 약간 더 높은 항체 반응을 나타내었음을 알 수 있다. 재첨가한 상등액을 함유하는 네오스포라 캐니넘 백신에 의해 나타난 항원 반응은 또한 다소 용량과 관련된 것으로 보이는 항체 반응을 나타내었다. 그러나, 모든 백신이 소에서 보호 수준의 항체를 얻는데 효과적이었다.
예방접종후 어떠한 백신도 심각한 국부 반응을 일으키지 않았다. 따라서, 모든 제제가 허용가능한 상업적 백신 후보인 것으로 판단할 수 있었다.
본 발명을 설명 목적으로 이상에서 상세히 기재하였지만, 그러한 상세한 사항은 단지 그 목적을 위한 것이고 변화가 당업자에 의해 청구범위에 의해 제한될 수 있는 것을 제외하고 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 아니하면서 만들어질 수 있다.

Claims (14)

  1. 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라를 포함하는 네오스포라 캐니넘(Neospora caninum) 백신.
  2. 제 1 항에 있어서, 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라가 네오스포라 타키조이테스(Neospora tachyzoites)의 전체 배양물, 네오스포라 타키조이테스의 불활성화된 조직 배양물, 네오스포라 타키조이테스의 변형된 생 조직 배양물, 네오스포라 타키조이테스로부터의 추출물 및 네오스포라 타키조이테스로부터 얻은 하나 이상의 서브유닛으로 구성된 그룹으로부터 선택된 항원을 포함하는 네오스포라 캐니넘 백신.
  3. 제 1 항에 있어서, 불활성화제 및 어쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 네오스포라 캐니넘 백신.
  4. 제 3 항에 있어서, 불활성화제가 포르말린, 베타-프로피오락톤, 열, 이원 에틸렌이민, 세정제 및 동결/해동 수단으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 네오스포라 캐니넘 백신.
  5. 제 3 항에 있어서, 어쥬번트가 폴리머, 수중유(oil in water), 수중유중수 (water-in-oil-in-water), 지질, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 면역조절제 및 그 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 네오스포라 캐니넘 백신.
  6. 제 5 항에 있어서, 폴리머 어쥬번트가 카르보폴, 하블로젠(HAVLOGENR) 및 폴리젠(POLYGENR)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 네오스포라 캐니넘 백신.
  7. 제 5 항에 있어서, 수중유 어쥬번트가 에멀시젠(EMULSIGENR) 및 에멀시젠 플러스(EMUSIGEN PLUSR)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 네오스포라 캐니넘 백신.
  8. 제 1 항에 있어서, 네오스포라가 변형되어 살아있는 네오스포라 백신.
  9. 네오스포라 캐니넘을 조직 배양물에 접종하고 복제된 네오스포라 캐니넘을 수획하는 것을 포함하는, 감수성 조직 배양물에서 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 감염 또는 유산으로부터 포유동물을 보호하기에 충분한 양으로 네오스포라 캐니넘을 증식시키는 방법.
  10. a. 감수성 조직 배양물에서 세포변성 효과가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고;
    b. 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며;
    c. 상기 수획물을 백신으로 제제화하는:
    단계를 포함하는 네오스포라 백신의 제조방법.
  11. a. 감수성 조직 배양물에서 세포변성 효과가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고;
    b. 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며;
    c. 상기 수획한, 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 불활성화시키고,
    d. 불활성화시킨, 수획한 조직배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 어쥬번트시켜(adjuvanting) 백신을 제조하는:
    단계를 포함하는 네오스포라 백신의 제조방법.
  12. a. 감수성 조직 배양물에서 세포변성 효과가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고;
    b. 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며;
    c. 수획한, 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘으로부터 하나 이상의 보호 항원을 추출하여 서브유닛을 제조하고;
    d. 임의로, 서브유닛(들)을 불활성화시키며;
    e. 서브유닛(들)을 어쥬번트시켜 백신을 제조하는:
    단계를 포함하는 네오스포라 서브유닛 백신의 제조방법.
  13. a. 감수성 조직 배양물에서 세포변성 효과가 나타날때까지 네오스포라 캐니넘을 증식시키고;
    b. 상기 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘을 수획하며;
    c. 네오스포라 캐니넘 수획물을 불활성화시키고;
    d. 수획한, 불활성화시킨 조직 배양으로 증식시킨 네오스포라 캐니넘으로부터 하나 이상의 보호 항원을 추출하여 서브유닛(들)을 제조하며;
    e. 서브유닛(들)을 어쥬번트시켜 백신을 제조하는:
    단계를 포함하는 네오스포라 서브유닛 백신의 제조방법.
  14. 제 1 내지 8 항중 어느 한 항에 따른 백신을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 네오스포라 캐니넘에 의해 유발된 질병으로부터 포유동물을 보호하는 방법.
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