KR101144994B1 - 소 네오스포라병 백신，이의 제조방법 및 이를 이용한 소네오스포라병 예방방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소 네오스포라병 백신과 이의 제조 방법, 및 소 네오스포라병의 예방방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 백신은 연속배양된 네오스포라 캐니눔 항원을 포함하여 이루어지는 소 네오스포라병 백신으로서, 네오스포라 원충을 세포내 배양하고 그 원충을 수거하여, 수거된 원충을 항원처리하여 제조된 네오스포라 캐니눔 항원을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 본 발명의 백신에 의하여 낮은 수준의 감염을 유도하여 면역성을 유지시킴으로써 소 네오스포라병을 효과적으로 예방할 수 있다.

소 네오스포라병, 백신, 항원, 네오스포라 캐니늄

Description

소 네오스포라병 백신，이의 제조방법 및 이를 이용한 소 네오스포라병 예방방법{NEOSPOROSIS VACCINE，METHODS OF MAKING AND PREVENTION METHOD FOR NESPOROSIS USING THE SAME}

본 발명은 소 네오스포라병 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소에서 유산을 일으키는 네오스포라 원충을 대량 연속 배양 및 조항원을 분리하여 제조된 소 네오스포라병 백신과 그 제조방법, 및 상기 백신을 이용한 소 네오스포라병의 예방방법에 관한 것이다.

네오스포라병 (Neosporosis)은 최근에 알려진 질병으로 기생성 원생동물인 네오스포라 (Neospora caninum)의 감염에 의해 발생한다. 이 원충의 종숙주는 개로 밝혀졌으며 중간숙주로는 소를 비롯한 염소, 양, 말 등이 있다. 이 병에 감염된 동물에서는 유산 및 신경증상을 일어난다.

현재까지 네오스포라병은 미국을 비롯하여 영국, 오스트레일리아, 캐나다, 덴마크, 아일랜드, 이스라엘, 이탈리아, 멕시코, 네델란드, 뉴질랜드, 남아프라카 등에서 발생 하고 있음이 보고되어 전세계적인 분포를 가질 것으로 생각되며, 동양에서는 일본(1992년)과 한국(1997년)에서 네오스포라병의 발생이 입증되었다. 특히 미국의 캘리포니아주에서는 젖소의 유산을 일으키는 질병 중 상기 기생충이 약 12%를 차지하여 가장 중요한 유산 원인체라는 것이 밝혀졌으며, 년간 3천 5백만달러 상당의 경제적 손실을 초래하고 있다.

네오스포라에 걸린 성우에서 유일하게 관찰되는 임상증상은 유사산으로 태아는 미이라화, 허약자우, 뇌수두증 등이 나타날 수 있다. 대체로 임신 3개월부터 말기까지 다양한 임신기간에 유산이 발생하고, 태아는 자궁내에서 죽어서 흡수, 미이라화, 부패, 사산되기도 하고 살아서 태어난다 해도 감염되어 있기 때문에 임상적으로는 정상이라 할지라도 만성적인 감염을 나타낸다. 또한, 상기 질병은 젖소 뿐 만 아니라 비육우에서도 발생하는 것으로 알려져 있다. 유산의 양상은 산발적이거나, 수 주 이내에 집단적으로 또는 한 집단에서 계속적으로 일어난다. 또한 본 질병에 의한 유산은 연중 일어나지만, 나라에 따라 조금씩 다른 양상을 나타내고 있다. 캘리포니아에서는 여름이나 이른 가을보다 겨울에, 네델란드에서는 늦여름부터 이른 가을에 많이 발생한다고 보고되었다. 유산된 태아조직의 붕괴 및 염증병변은 주로 중추신경계, 심장, 근육 및 간에서 발견된다. 육안적 병변은 심장과 근육에 유백색 반점 또는 뇌의 백색 또는 담적색의 반점이 있거나, 때로 아무런 병변이 나타나지 않을 때도 있다. 병리조직학적 병변으로는 뇌척수염, 심근염, 근염, 부신염, 신장염, 간염, 태반염, 폐렴 등이 관찰되고, 때로 뇌, 심장, 태반 등에서 원충이 관찰되기도 한다.

개의 경우 네오스포라에 감염되면 나이가 어릴수록, 선천적으로 감염된 강아지일수록 심한 임상증상을 나타낸다. 주로 후지마비를 시작으로 점차 전신적인 마비로 진행된다. 원충이 감염부위에 따라 신경증상은 다르게 나타나는데 앞다리보다는 뒷다리가 더 많이 영향을 받는다. 기타 증상으로 음식물을 넘기는데 어려움을 호소하고, 턱의 마비, 근육무력증과 위축 및 때로 심장마비가 오는 경우도 있다.

한편, 소 유, 사산의 주요 원인인 네오스포라병의 조기 치료 및 예방을 위하여 신속 정확한 진단을 통한 조기 치료 및 예방을 취함으로써 축산업의 경제적 손실(연간 52억)을 방지할 수 있다. 이러한 네오스포라병에 대한 진단은 현재 IFA, ELISA, PCR 법이 사용되고 있다. 네오스포라병은 거의 모든 포유동물에 감염 될 수 있기 때문에 요즈음 많이 사용하고 있는 ELISA(효소면역 진단법)진단법이나 IFA법을 사용 할 경우 진단 대상동물 마다 고가의 2차 항체를 구입해야하며 결과를 판정하기 위해서는 분광계라는 고가의 장비가 필요하다. 또한, PCR 법의 경우 민감도 및 특이도는 높으나 시험에 따른 경비가 많이 들고 한번에 많은 양의 시료를 처리하기 어렵다는 단점이 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 소 네오스포라병은 소에서 유산을 일으켜 농가에 막대한 경제적 피해를 주고 있으므로, 이에 대한 백신의 필요성이 증대되고 있는 실정이다. 이에 본 발명자는 소 네오스포라병을 효과적으로 예방할 수 있는 새로운 백신을 개발하기 위하여, 국내 소에서 분리한 국내분리주 NC-kr2를 연속 대량 배양하여 원충 조항원으로 백신을 제조 하고, 상기 백신이 소에서 낮은 수준의 감염을 유도하여 면역성을 유지시킴으로써 네오스포라병을 효과적으로 예방할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 소 네오스포라 국내분리주로부터 제조된 소 네오스포라병의 백신 및 상기 백신의 제조방법을 제공할 뿐만 아니라, 상기 백신을 이용하여 소 네오스포라병을 예방하는 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소 네오스포라병 백신과 그 제조방법, 및 소 네오스포라병 예방방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 제 1 견지에 의하면, 본 발명은 연속배양된 소 네오스포라 캐니눔 (Neospora caninum) 항원을 포함하여 이루어지는 소 네오스포라병 백신에 관한 것이다. 상기 연속 배양은 숙주세포를 선택하고, 상기 선택된 숙주세포에 소 네오스포라 캐니눔 원충을 배양하는 것이다. 상기 숙주세포에 오염 가능성을 최소화시키기 위하여 항생제를 첨가한 인산염 완충액과 같은 희석제에서 균질화시킬 수 있다. 상기 네오스포라 캐니눔은 어떠한 출처로부터 얻을 수 있으나 바람직하게는 유산된 소 태아로부터 분리된 네오스포라 캐니눔을 이용할 수 있다. 바람직하게는 국내분 리된 네오스포라 캐니눔 Kr2 (Neospora caninum Kr2) 균주를 항원으로 사용한 것을 특징으로 한다. 상기 균주는 면역학적으로 뛰어난 항원성을 가지며 국립수의과학검역원에서 분리되었다.

본 발명에 있어서, 상기 소 네오스포라 캐니눔 항원은 네오스포라 캐니눔 원충을 세포내 배양하고, 상기 세포내 배양된 원충을 수거하여, 수거된 원충을 항원처리하여 제조된 항원일 수 있다. 항원처리(antigen processing)란 항원제시 세포 내에서 항원 단백질을 분해하여 MHC나 MHC 유사 분자에 결합하도록 하는 과정을 의미하고 상기 항원처리로 상기 배양된 원충을 불활성화시키는 것이다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 백신은 보좌제 (Adjuvant)를 더 포함하여 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 보좌제는 안전성이 확인된 것을 사용하여야 한다. 보좌제로는 Polygen, IMS1313, 또는 PBS를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Polygen과 IMS1313을 사용하였다. 또한 본 발명에 있어서, 상기 백신은 주사제로 제형화된 것이 바람직하다.

본 발명의 제 2 견지에 의하면, 본 발명은 (a) 네오스포라 원충을 세포내 배양하는 단계; (b) 세포내 배양된 원충을 수거하는 단계; 및 (c) 수거된 원충을 항원처리하는 단계;를 포함하여 이루어지는 소 네오스포라병 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 (a)단계의 세포내 배양은 숙주세포를 배양하는 단계;, 상기 배양된 숙주세포에 네오스포라 원충을 접종하는 단계; 및 상기 원충주를 배양하는 단계;를 포함하여 이루어지는 세포내 연속배양방법으로 배양됨을 특징으로 한다. 상기 세포내 연속배양방법에 의하여 배양하는 경우 다량의 백신을 손쉽 게 얻을 수 있다.

본 발명의 제 3 견지에 의하면, 본 발명은 상기 소 네오스포라병 백신을 소에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 소 네오스포라병의 예방방법에 관한 것이다. 하기 실시예를 참고하면 상기 소 네오스포라병 백신을 종부전에 접종하는 경우 네오스포라 원충에 의한 네오스포라병의 예방율이 매우 높은 것을 알 수 있으므로 효과적인 발명이다.

이상에서 상술한 바와 같이 상기와 같은 본 발명에 따른 네오스포라증 백신에 따르면, 네오스포라증을 효과적으로 예방하는 효과가 있으며, 상기 예방으로 인하여 네오스포라 캐니넘에 의해 유발되는 포유동물의 유산으로부터 안전하게 보호할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신을 제조하는 방법에 의하면 백신을 대량으로 생산할 수 있으므로 비용효율적인 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 자세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 원충세포배양법 개선 및 백신후보 원충주 선발

<1-1> 원충세포배양법 개선

상기 네오스포라 캐니눔의 세포배양은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 네오스포라 캐니늄을 키우기 위한 숙주세포인 Vero cell(American green monkey kidney cell)을 10% 말혈청과 100units/ml penicillin G sodium, 100ug/ml streptomycin sulfate, 0.25ug/ml amphotericin B가 첨가된 Duldecco minimum essential medium(GIBCO)에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양한다.

네오스포라 캐니늄 원충을 1:1로 vero cell에 접종한다. 이때 사용되는 배양액은 10% 말 혈청(GIBCO BRL, USA), 100ug/ml streptomycin sulfate, 100units/ml penicillin G sodium, 0.25ug/ml amphotericin B 가 첨가된 RPMI-1640(GIBCO) 배지인데 37℃, 5% CO₂ 의 조건에서 cell culture flask내에서 배양한다. 도 1을 참고하면 상기 배양 방법에 의하여 숙주세포를 깨고 나온 네오스포라 원충의 모습이다.

<1-2> 백신후보 원충주 선발

대량 생산 원충 Batch 에 대한 gerbil LD₅₀를 조사하기 위해 원충주 NC-1과 NC-kr2의 양을 각각 5x10⁵, 5x10⁶, 5x10⁷별로 8마리씩 접종하여 일자별 폐사수를 알아본 결과 5x10⁶원충/gerbil로 나왔고, NC-1과 NC-kr2 동일했다.

도 2 및 도 3을 참고하면, 백신후보 원충주를 선발하기 위해 NC-1과 NC-kr2 1D와 2D SDS-PAGE와 Western blot을 수행한 결과, 30~50kDa 사이에 진한 항원대와 면역원대를 보였다.

백신후보 원충주를 선발하기 위해 NC-1과 NC-kr2 토기 항혈청을 생산한 후 IFA로 항체역가를 검사해본 결과 NC-1은 x6400, NC-kr2는 x12800에서 항체가 검출되었다.

백신후보 원충주를 선발하기 위해 NC-kr2를 개 항혈청을 생산한 후 IFA로 항체역가를 검사한 결과 x3200까지 항체가 검출되었다.

실시예 2 - 백신제조 및 제조백신에 대한 안정성 및 안전성 실험

<2-1> 백신제조방법에 따른 실험실적 효능효과실험

상기 실시예 1에서 선발한 원충주를 처리방법에 따라 단백질량을 조사하였다. 1x10⁸ tachyzoite를 tachyzoite lysate sup(Freeze + Thaw), tachyzoite lysate sup(Freeze + Thaw + sonication), Formalin treatment + sonication, 그리고 BEI treatment 방법으로 처리한 결과 각각 0.7mg, 1mg, 2mg, 45mg 의 단백질량이 측정되었다.

<2-2> 보좌제 안전성 조사

보좌제 Polygen 과 IMS1313의 안정성 조사 실험을 수행하였다. Polygen 5%, 15%, 50%, 100%의 농도와 IMS1313 50%, 100%의 농도를 저빌에 피하로 주사하여 안전성 조사를 한 결과 모든 보좌제의 안전성이 확인하였다.

<2-3> 제조백신의 안전성 조사

제조된 백신의 안전성 조사실험을 수행하였다. 보좌제 PBS로 만든 백신과 보좌제 Polygen 15%, IMS 1313 50%로 만든 백신을 각각 400ug씩 저빌 8마리에 피하 주사한 결과 제조백신 3종 모두 안전성 확보되었음을 확인하였다.

실시예 3 - 제조백신 효과시험

<3-1> 염소에 대한 제조백신 효과시험

상기 실시예 2에서 제조한 백신을 염소에 접종하여 백신 효과시험을 수행하였다. 실험설계는 종부 전 백신 투여군과 종부 후 백신 투여군으로 나눠서 진행하였고 실험설계는 도 4a 및 도 4b와 같다.

종부 전 백신투여군 6마리, 종부 후 백신투여군 6마리, 그리고 대조군 6마리로 실험을 수행하였고, 원충주 NC-kr2의 원충을 Tachyzoite-lysate (Freeze + Thaw)방법으로 만든 단백질 625ug과 보좌제 50%의 IMS 1313를 사용하여 만든 백신을 투여하였다.

종부 전 백신 투여군에 1차 백신을 투여한 다음 일주일 후에 2차 백신을 투여하였다. 10일 후 발정동기화를 유도하기 위해 CIDR을 삽입하고 일주일 후 CIDR을 제거한 다음 PG(10mg) 1.5ml을 접종하였다. 이틀 후 HCG 1000IU를 접종한 다음 이틀 후 3일 동안 종부시켰다.

종부 후 백신 투여군은 종부 전 백신투여군에서 수행한 방법과 동일하게 발정유도를 하였으며 종부 후 20일 후에 1차 백신과 종부 후 2차 백신을 투여하였다.

종부 전 백신투여군, 종부 후 백신투여군, 대조군 모두 종부 후 50일에 Neospora caninum 공격접종을 하였다. 하기 표 5 및 6은 염소에 대한 제조 백신 효과실험의 설계에 대해 나타내었다. 하기 표 5는 종부전 백신투여군 시험 진도표이다.

그리고, 하기 표 6은 종부후 백신투여군 실험 진도표이다.

<3-2> 염소에 대한 제조백신 효과시험 결과

염소백신군에 대한 Neospora 항체형성검사를 위하여 ELISA와 세포성 면역유발 확인을 위한 LPC 증식실험(BrdU)를 실시한 결과 Neospora의 항체형성을 확인하였다. 하기 표 7을 참고하면, 염소에 대한 제조백신 효과실험에서 종부전 백신군은 7마리 중 2마리가 유산하여 71.4%의 방어율을 보였고, 종부후 백신군은 7마리중 3마리가 유산하여 57.1%의 방어율을 보였다. 비백신공격군(대조군)은 5두중 3두가 유산하여 40%의 방어율을 보였다. 위 결과로 보아 본 발명된 소 네오스포라 예방용 백신의 효과를 인정할 수 있다. 도 5 및 도 6을 참고하면 항체가 형성되어 그대로 유지함으로써 네오스포라증이 예방될 수 있는 걸 알 수 있다. 또한, 도 7을 참고하면, 염소 백신군에 대한 세포성 면역유발 확인을 위한 LPC 증식실험결과 시간이 지남에 따라 면역력이 증가함을 알 수 있다.

<3-3> 목적동물 소에 대한 제조백신 효과 실험

상기 실시예 2에서 제조한 백신을 목적동물 소에 접종하여 백신 효과시험을 수행하였다. 실험설계는 종부 전 백신 투여군과 종부 후 백신 투여군으로 나눠서 진행하였고 실험설계는 하기 표 8과 같다. 종부 전 백신투여군 16마리, 종부 후 백신투여군 10마리, 그리고 대조군 5마리로 실험을 수행하였고, 원충주 NC-kr2의 원충을 Tachyzoite-lysate(Freeze + Thaw)방법으로 만든 단백질 625ug과 보좌제 50% IMS 1313과 Polygen을 사용하여 만든 백신을 투여하였다. 종부 전 백신 투여군에 1차 백신을 투여한 다음 한달 후에 2차 백신을 투여하였다. 20일 후 발정동기화를 유도하였고 10일 후 종부시킨 다음 종부 10주 후에 공격접종을 하였다. 종부 후 백신투여군은 종부시 1주일 후에 1차 백신을 투여하였고, 종부시 3주 후에 2차 백신을 투여하였다. 그리고 종부시 15주에 공격접종을 실시하였다. 대조군은 종부 후 15주에 공격접종을 실시하였다.

<3-3> 목적동물 소에 대한 제조백신 효과 시험 결과

목적동물 소 백신군에 대한 Neospora 항체형성검사를 위하여 IFA로 항체역가를 검사해본 결과 x25600 에서 항체가 검출되었다. 도 8을 참고하면, 백신후보 원충주를 선발하기 위해 NC-kr2를 개 항혈청을 생산한 후 IFA로 항체역가를 검사한 결과 x3200까지 항체가 검출되었다. 표 9를 참고하면, 목적동물 소에 대한 제조백신 효과실험에서 보좌제 Polygen을 사용한 종부전 백신군은 5마리 중 4마리가 임신이 확인되었고 2마리가 유산하여 50%의 방어율을 보였고, 보좌제 IMS1313을 사용한 종부전 백신군은 마리 중 4마리의 임신을 확인하였고 그중 4마리 모두 유산을 하지 않아 100의 방어율을 보였다. 보좌제 Polygen을 사용한 종부후 백신군은 5마리에서 4마리가 임신이 확인되었고 그중 2마리가 유산하여 50%의 방어율을 보였고, 보좌제 IMS1313을 사용한 종부후 백신군은 5마리 중 4마리의 임신을 확인하였고 그중 3마리가 정상분만하여 75%의 방어율을 보였다. 비백신공격군(대조군)은 5마리 모두 임신을 확인하였고 1마리만이 정상분만하여 20%의 방어율을 보였다. 위 결과로 보아 본 발명된 소 네오스포라 예방용 백신의 효과를 인정할 수 있었다.

한편, 국내에 상재해있는 네오스포라병은 만성소모성 질병으로서 양축 농가도 모르는 사이에 이 질병에 의한 막대한 경제적인 피해를 입히고 있다. 그러나 현재까지의 진단법은 혈액도말법이나 PCR법을 이용하여 진단함으로써 정확한 진단이 어렵거나 고가의 검사비용이 필요한 실정이었는데, 본 발명에 따라 제조된 대량연속 배양된 소 네오스포라 백신은 소에서 낮은 수준의 감염을 유도하여 면역성을 유지시킴으로써 네오스포라병을 효과적으로 예방할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명은 소 네오스포라병의 예방에 효과적으로 상용될 수 있다.

본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

상기한 바와 같이 본 발명에 의하여 국내 소에서 분리한 국내분리주 NC-kr2를 연속 대량 배양하여 원충 조항원으로 제조한 소 네오스포라 백신을 제조하고, 상기 백신이 소에서 낮은 수준의 감염을 유도하여 면역성을 유지시킴으로써 소 네오스포라병을 효과적으로 예방할 수 있다.

도 1은 vero cell을 깨고 나온 네오스포라 원충의 세포 배양 후 그람 염색을 나타낸 도면(배율 - a: ×200, b:×400, c:×400)

도 2는 네오스포라 항원(Nc)에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면;

도 3은 네오스포라 표준양성혈청(NcP)에 대한 웨스턴 블롯에 대한 결과를 나타낸 도면 (화살표는 각각 31kDa과 46kDa에 해당하는 단백질을 표시);

도 4는 염소에 대한 제조 백신 효과실험 설계를 나타낸 도면;

도 5는 염소 백신군에 대한 네오스포라 항체 형성 검사한 것을 나타낸 그래프;

도 6은 상기 도 5의 그래프를 입체적으로 나타낸 그래프;

도 7은 염소 백신군에 대한 세포성 면역유발 확인을 위한 LPC 증식 실험을 나타낸 그래프; 및

도 8은 목적 동물 소 백신군에 대한 네오스포라 항체 형성 검사를 한 것을 나타내는 그래프이다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 연속배양된 소 네오스포라 캐니눔 Kr2 (Neospora caninum Kr2) 균주 항원과 IMS1313™ 보좌제(Adjuvant)를 포함하는 백신을 종부 전의 소에게 투여하는 것을 특징으로 하는 소 네오스포라병의 예방방법.
8. 삭제

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