KR100302522B1 - 고양이장코로나바이러스로부터의개코로나바이러스왁찐 - Google Patents

고양이장코로나바이러스로부터의개코로나바이러스왁찐 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단위투약량당 유효면역량의 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 적당한 담체를 함유하는 왁찐을 제공한다. 또한 본 발명의 왁찐은 보조제, 유효면역량의 2차 변형 바이러스와 유효면역량의 변형 박테리아를 함유할 수 있다. 부가적으로 본 발명은 단위투약량의 본 발명의 왁찐을 개에 투여하여서 하는 개 코로나바이러스에 의하여 발생한 질병에 대한 개의 면역방법을 제공한다. 또한 본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 부가적 단위투약량의 왁찐을 개에 투여하고, 2차 바이러스에 의하여 발생한 질병에 대하여 개가 면역을 갖게 하고, 박테리아에 의하여 발생한 질병에 대하여 개가 면역을 갖게하는 방법을 포함한다.

Description

고양이 장 코로나바이러스로부터의 개 코로나바이러스 왁찐
제1도는 배설물 시료에서 CCV S-단백질 수준에 대한 점막 IgA 항체의 요약도.
코로나 바이러스는 여러가지 포유동물과 닭류를 감염시키는 크고 외막을 갖는 바이러스의 단일속으로 구성되는 코로나바이러스과에 속한다. 바이러스는 열에 불안정하나 위 통과시 생존하는 능력을 부여하는 산에는 안정하다. 대부분의 코로나바이러스의 비리온은 다음 세가지 단백질을 함유한다 : 인산화 누클레오캡시드 단백질, N; 소막 포매 당단백질, M; 큰 꽃잎상 페플로머 당단백질, S; M 단백질은 거친 소포체에 결합된 리보솜에서 합성하여 골기장치에 축적하고 감염된 세포에서 출아한 바이러스 부위를 결정하는 것이다. S 단백질은 세포수용체에 부착, 침투, 세포융합과 같은 바이러스의 여러가지 생물학적 성질을 조정하고 바이러스-중화 항체의 주요표적을 이룬다.
비리온에 병합되지 않는 S 당단백질부분은 세포의 표면에 결합되는 남아있는 세포의 원형질에 운반된다.
개 코로나바이러스(CCV)는 빈 등(1)에 의하여 보고되었다. 분리주는 독일의 유행성 설사로 고통받는 개에서 회복되었다. 키난 등(2)은 분리된 바이러스가 감수성 신생강아지의 소장 손상을 유도할 수 있음을 보고했다.
개에서 CCV 위장염은 전염성이 높고, 노출에 따라서 바이러스는 전체 소장에 급속히 퍼진다. 잠복기간은 일반적으로 24∼48시간이나 키난 등(2)의 보고에 따르면 1∼4일의 장기간도 있다. 구강 노출에 따라서, 바이러스는 상부 십이지장에 들어가서 정착한다. 바이러스 복제가 일어난 다음 감염은 며칠내에 전체소장에 전체적으로 꼬리마다 진행한다. 또한 장염에 따라 CCV는 국부성 장간막 림프절에 국부적으로 퍼질 수 있다.
CCV의 복제는 장 융모의 상부 3분의 2에 위치하는 소화 및 흡수 세포내에 국한된다. 바이러스 복제는 장 융모의 단축을 가져오는 장 상피세포의 박리와 치사를 일으킨다. 감염성 바이러스를 함유하는 박리세포는 장의 여러 꼬리마디 감염과 배설물의 원천이다. 소화효소의 손실과, 흡수용량은 설사와 강아지의 탈수를 가져온다. 치사는 양호한 지지치료에 불구하고 임상신호의 발현후 짧은 24∼36시간 내에 일어난다.
대부분의 개는 무열성이고 병리적 변화는 통상 검출되지 않았다. 강아지는 대체로 심하게 영향을 받았고 신생아에 있어 치사의 대부분의 통상적 원인은 심한 탈수때문 이었다. 치사의 피해도는 다른 개 장의 병원군(3)과 결합될때 강화될 수 있다. 스트레스, 품종과 환경조건은 질병의 피해도에 영향을 미치는 부가적 요인이다. CCV에 노출된 동물은 혈청에서 검출될 수 있는 VN 항체를 발생시킨다. 그러나 CCV 감염은 전신에 일어나지 않는다. 그러므로, 혈청 VN(SVN)항 체역가는 노출되나 예방되지는 않는다. 이는 CCV 장염의 항바이러스 치료에 효과는 없다. 유체치환과 전해질요법으로 치료를 효과적으로 하여 구토증과 설사를 억제하고 동시감염을 예방한다.
점막 면역은 CCV장면에 대한 예방에서 중요한 역할을 나타낸다. 아펠 등(4)은 장에서 IgA 항체에 의하여 조정될 수 있는 국부면역으로, 돼지의 전염성 위장 염 바이러스(TGEV)와 유사한 방법에 따라서 CCV 감염에 대한 예방을 이룰 수 있음을 보고했다.
1983년 이후, 왁찐의 두형은 CCV 감염과 연관되는 질병증상을 억제하는데 사용되어 왔다(5,6) CCV에 대하여 개를 보호하기 위하여 의도된, 아이오와 포트 돗지 연구소에 의하여 1983년에 도입된 변형 생왁찐은 불안전함이 즉시 입증되었고, 따라서 부작용으로 인하여 철회되었다. 1985년에 CCV에 대하여 개를 보호하기 위한 비활성 왁찐을 포트 돗지 연구소에서 소개하였으며, 이는 안전과 효능을 나타내었다. 이후, 다른 비활성 CCV 제품이 CCV 장염에 대한 개를 보호하기 위하여 스미스 클린 비참에 의하여 소개되었다.
1978년에 CCV, TGEV, 고양이 감면성 복막염 바이러스(FIPV)와 사람 코로나 바이러스 229E의 항원 유사성이 보고되었다(7,8). 근접항원 성질은 혈청학적 분석과 실험적 왁찐에 허용되는 이들 바이러스에 의하여 구분된다. 다른 고양이 코로나바이러스, 고양이 장 코로나바이러스(FECV)는, 최근 이 그룹에 항원적으로 관련됨을 나타내었다. S 단백질의 우성 항원 결정체는 이들 바이러스 사이에서 교차 반응성을 갖고 먼 관계를 갖는 동물종(9)에서 왁찐으로서 사용하는 기회를 부여한다. 그러나 이들 바이러스로 한 몇몇 간섭효과는 이질종(1,10,11)에서는 거의 효과를 제공하지 못한다.
본 발명은 CCV에 대한 보호용 신규 왁찐 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 FECV에서 제조한 왁찐을 개에 투여하여서하는 CCV 감염예방 방법을 제공한다. FECV의 S 단백질의 면역우성 부분은 CCV 비리온에서 해당성분과 항원적으로 유사하다. FECV의 S 단백질은 CCV 감염에 대한 예방의 면역 기억 메카니즘을 제공하여, 장의 점막 표면에서 면역담당 세포의 생장을 촉진하므로서 개에서 CCV의 예방방법을제공한다. 더불어, FECV와 CCV의 S 단백질 사이의 이질성은 동질의 CCV 왁찐을 중화할 수 있는 CCV 모체 하체의 수준을 FECV 왁찐이 극복하는 기회를 제공한다.
본 발명은 단위 투약량당 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 적당한 담체의 유효면역양을 함유하는 고양이 장 코로나바이러스 왁찐을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구성에 있어, 변형된 고양이 장 코로나바이러스는 비활성 고양이 장 코로나바이러스이다. 본 발명에 의하여 제공되는 왁찐은 변형된 바이러스의 면역성을 강화하는데 유효한 양으로 보조제를 더 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 이차 면형 바이러스를 함유하는 왁찐을 제공한다.
더우기, 본 발명은 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 변형된 박테리아를 함유하는 왁찐을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 왁찐을 단위투약량으로 개에 투여하여서 하는 개 코로나바이러스에 의하여 발생되는 질병에 대한 개의 면역방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 선행 단위투약량을 투여한 후 적당한 시간간격으로 1 회 또는 그 이상의 부가적 단위양의 왁찐을 개에 투여하여서 하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 개 코로나바이러스에 의하여 발생하는 질병과 이차 바이러스에 의하여 발생하는 질병에 대하여 개를 면역시키는 방법인 것이다. 또한 본 발명은 개 코로나바이러스에 의하여 발생되는 질병과 박테리아에 의하여 발생되는 지병에 대하여 개를 면역시키는 방법으로 이루어진다.
제1도에 있어서, 세로축은 IgA 항체의 배증가를 나타내고, 가로축은 공격 후의 일수를 나타내며, 빗금의 막대는 예방접종을 나타내고 빗금이 없는 막대는 비교물을 나타낸다.
본 발명은 단위투약량당 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 적당한 담체의 유효면역량을 함유하는 고양이 장 코로나바이러스 왁찐을 제공한다.
본 발명에 있어서, 변형된 고양이 장 코로나바이러스의 “유효면역량”이란 독성 바이러스에 의하여 일어나는 질병에 대하여 예방접종된 동물을 면역시키는데 효과적인 변형된 바이러스의 양을 뜻한다. 대표적으로, 변형된 고양이 장 코로나바이러스의 유효면역양은 약 5 마이크로그람 이상의 S 바이러스성 항원을 함유하는 양을 뜻한다. 바람직하기로는 변형된 고양이 장 코로나바이러스의 유효면역량이 약 5 마이크로그람 내지 약 7.5 마이크로그람의 S 바이러스성 항원을 함유하는 양일때이다. 하기, 실시예 1D에서는 왁찐 조성물의 S 바이러스성 항원을 계산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “변형된” 고양이 장 코로나바이러스는 변형된 생 바이러스, 비활성 바이러스, 재조합 바이러스 또는 바이러스성 서브유니트일 수 있다. “변형된 생” 바이러스는 예방접종된 동물로부터 면역반응을 유도할 수 있는 독성 또는 독성약화된 바이러스를 뜻한다. 여기에 사용된 바와같이, “비활성” 바이러스란 동물의 세포를 감염시킬 수 없으나, 바이러스로 예방접종된 동물로부터 면 역반응을 유도할 수 있는 바이러스를 뜻한다. “재조합” 바이러스란 동물의 세포를 감염시킬 수 없는 유전적으로 계획된 면역성 바이러스를 뜻한다. 본 발명의 바이러스성 서브유니트 왁찐은 항원형태로 고양이 장 코로나바이러스 S 당단백질을 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명은 원 바이러스 또는 항원성 바이러스 서브유니트를 함유하는 왁찐으로 생각된다. 원 바이러스의 유효면역량은 약 5 마이크로그람의 S 바이러스성 단백질의 양을 함유하는 바이러스 입자의 수를 뜻한다. 서브유니트 왁찐의 유효면역량은 약 5 마이크로그람이상의 바이러스성 S 당단백질의 양을 뜻한다.
본 발명의 바람직한 구성에 있어서, 변형된 고양이 장 코로나바이러스는 비활성 고양이 장 코로나바이러스이다. 고양이 장 코로나바이러스는 하술한 바와 같이, 바이러스를 이성분 에틸렌이민, 포르마린 또는 β-프로프리오락톤중에서 선택한 화학제와 접촉시켜서 비활성화 시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구성에 있어서, 고양이 장 코로나바이러스는 바이러스를 이성분 에틸렌이민과 접촉시켜서 비활성화 시킨다.
본 발명의 실시예에 따라서 왁찐에 변형된 고양이 장 코로나바이러스를 사용하기 위한 “적당한 담체”는 변형된 생 바이러스를 현탁시키고 동물에 투여하는데 적합한 용액이다. 이와같은 적합한 담체는 본 분야의 전문가들에게 잘알려져 있으며, 한정되어 있는 것은 아니나, 수성완충제, 예를 들어 인삼염 완층제가 있다.
본 발명의 왁찐은 변형된 고양이 장 코로나바이러스의 면역성을 강화시키는데 효과적인 양으로 보조제를 더 함유할수 있다. 본 발명에 있어 “보조제”란 항원을 보조제와 함께 투여할 때 바이러스성 항원에 동물의 면역계의 반응을 강화시키는 물질의 조성물이다.
본 발명의 왁찐은 수산화 알루미늄, 사포닌 또는 인산 알루미늄에서 선택한 보조제를 함유할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구성으로는 보조제가 수산화 알루미늄 일때이다.
본 발명에 있어서, 보조제의 “유효량”은 이를 항원과 함께 동물에 투여할때, 항원에 대한 동물의 면역반응을 강화하는데 유효한 보조제의 효과적인 양을 뜻한다.
대표적으로, 보조제의 유효량은 약 3체적%의 단위량 내지 약 10체적%의 단위량의 왁찐일때이다. 바람직하기로는, 왁찐의 양이 약 5 체적%의 단위량일때이다.
또한 본 발명은 유효면역량의 2차 변형 바이러스를 함유하는 왁찐을 제공한다. 2차 변형 바이러스는 상술한 바와같이 변형된 생 바이러스, 비활성 바이러스, 독성 약화된 바이러스 또는 바이러스성 서브유니트이다. 본 발명의 왁찐은 변형된 개 디스쳄퍼 바이러스, 변형된 개 아데노바이러스, 변형된 개 파르보바이러스, 변형된 개 파라인플루엔자 바이러스 또는 변형된 개 헤르페스바이러스에서 선택한 2차 변형 바이러스를 함유할 수 있다.
본 발명의 왁찐은 유효면역량의 변형된 박테리아, 예를들어 변형된 렙토스피라를 더 함유할 수 있다. 여기서 사용된 “변형된” 박테리아란 동물에 변형된 박테리아를 투여하여 면역반응을 유도할 수 있으나 동물의 질병은 발생시키지 않는 원 박테리아를 뜻한다. 변형된 박테리아는 변형된 생 박테리아, 비활성 박테리아, 또는 박테리아 서브유니트, 즉 박테리아에서 유도된 항원성 단백질을 뜻한다. 본 발명에 있어서, 변형된 박테리아의 “유효면역량”은 동물에 변형된 박테리아를 투여하여 면역반응을 유도하는데 효과적인 변형된 박테리아의 양을 뜻한다. 변형된 박테리아의 유효면역량은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있거나, 부적당한 실험없이 이들에 의하여 쉽게 측정될 수 있다. 대표적으로 변형된 생 또는 비활성 박테리아의 유효면역량은 약 107세포/ml 이상의 양, 바람직하기로는 약 107세포/ml 내지 약 1012세포/ml의 양이다. 대표적으로, 박테리아성 서브유니트의 유효면역량은 약 10 마이크로그람이상의 박테리아성 서브유니트, 바람직하기로는 약 10 마이크로그람 내지 약 1,000 마이크로그람의 서브유니트의 양일때이다.
본 발명은 본 발명의 왁찐을 단위투여량으로 개에 투여하여서하는 개 코로나바이러스에 의하여 발생되는 질병에 대한 개의 면역방법을 제공한다. 대표적으로 개에 왁찐을 투여할때 나이는 최소한 약 6주이다. 바람직하기로는 개에 왁찐을 투여할때 나이가 약 6주 내지 약 9주일때이다. 본 발명의 왁찐은 왁찐을 개에 투여하는 분야의 전문가에게 일반적으로 수용되는 수단에 의하여 개에 투여될 수 있다. 이와같은 왁찐 투여수단의 예를들면, 한정되어 있는 것은 아니나, 피하주사 또는 근육내주사가 있다.
본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 부가적 단위량의 왁찐을 개에 투여하는 방법을 더 포함할 수 있으며, 각 부가적 단위량의 왁찐은 선행단위량을 투여한 후 적당한 시간간격으로 투여한다. 따라서 본 발명에 의하여 제공된 방법은 수회단위량의 고양이 개 코로나바이러스 왁찐을 개에 투여하여서 하는 것이다. 1회 이상의 단위량의 왁찐투여는 바이러스성 항원에 대한 예방접종된 동물의 면역반응을 강화시키려는 것이다. 각 단위량의 투여는 면역반응을 강화시키는데 적합한 시간간격에 따라 분리되어야 한다. 그러므로, 동물에 수회 단위량의 왁찐 투여 사이의 “적당한” 시간간격이란 동물이 일회단위량 투여때 보다 더 큰 면역반응을 일으키는데 충분한 단위량의 왁찐 투여 사이의 시간간격을 뜻한다. 대표적으로 수회 단위량의 본 발명의 고양이 장 코로나바이러스 왁찐 투여사이의 적당한 시간간격은 약 2주 내지 약 5주이다. 바람직하기로는 시간간격이 약 2 주 내지 약 3 주일때이다.
본 발명은 추가 단위량의 변형된 고양이 장 코로나바이러스 왁찐을 투여하는 것이다. 바람직하기로는 추가단위량을 왁찐의 선투여 약 일년후에 투여하는 것이다.
개에 대한 추가단위량의 왁찐투여는 일반적으로 수의약계에서 수용되고 있으며, 개가 그의 전 생애동안 바이러스성 감염에 면역반응을 일으킬 수 있도륵 설계되었다.
또한, 본 발명의 왁찐을 개에 투여하여서하는 개 코로나바이러스에 의하여 발생되는 질병과 2차 바이러스에 의하여 발생되는 질병에 대한 개의 면역방법을 제공하며, 여기서 왁찐은 본 발명의 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 2차 변형 바이러스를 함유한다. 2차 변형 바이러스 변형된 개 디스템퍼 바이러스, 변형된 개 아데노바이러스, 변형된 개 파르보바이러스, 변형된 개 파라인플루엔자 바이러스 또는 변형된 개 헤르페스바이러스에서 선택한다.
본 발명은 본 발명의 단위량의 왁찐을 개에 투여하여서 하는 개 코로나바이러스에 의하여 발생되는 질병과 박테리아에 의하여 발생되는 질병에 대한 개의 면역방법을 제공하며, 여기서 왁찐은 유효면역량의 변형된 고양이 장 코로나바이러스와 유효면역량의 변형된 박테리아를 함유한다. 변형된 박테리아는 필수적인 것은 아니나, 변형된 렙토스피라가 좋다.
본 발명은 다음 실시예에서 더 잘 이해할 것이다. 그러나 상세히 설명된 실시예는 다음 특허청구의 범위에서 더 완전하게 설명한 바와같이 본 발명을 예시한 것에 지나지않음을 본 분야의 전문가는 쉽게 이해할 것이다.
[실시예 1]
[A 왁찐제조]
전술한 바와같이 각각 개 코로나바이러스에 대하여 동물을 보호하는데 효과적인, 변형된 생 고양이 장 코로나바이러스, 비활성 고양이 장 코로나바이러스, 재조합 고양이 장 코로나바이러스 또는 고양이 장 코로나바이러스인 변형된 고양이 장 코로나바이러스를 사용하여 본 발명의 왁찐을 제조한다. 이 실시예에서는 비활성 고양이 장 코로나바이러스를 사용하여 왁찐을 제조하는 것을 토의한다.
아메리칸형 배양물 기탁소, ATCC No. CCL 94에서 이용할 수 있는 크랜달 고양이 신장(CRFK) 세포, 또는 FK-Cu로서 확인되는 클론화 개체군을 비타민으로 보충된 둘베코의 최소필수배지(DMEM), 필수아미노산, 2mg/ml 중탄산 나트륨과 0.584 mg/ml L-글루타민으로 플라스틱 세포배양 용기에서 단층으로 펼친다. [바이러스학 8권 : P396(1959)DHK QKDLFJTMGKR 12RNJS : P185(1960)]. 방부제로서, 30㎍/ml의 겐타미신을 첨가한다. 표준 세포배양법을 사용하여 성장 표면적당 약 2 X 105세포로 100% 합류되게 배양용기에서 세포를 성장시킨다. 일반적으로 5% 태아성 소 혈청으로 보충된 200ml의 DMEM과 1.5 X 108의 세포를 함유하는, 850㎠의 성장표면을 갖는 플라스틱 로울러병을 왁찐제조에 사용한다. 세포배양은 35℃∼38℃에서 로울러병 회전기가 0.25∼2rpm으로 회전하는 로울러병에서 약 1.5 X 107세포를 200ml의 성장배지에서 접종시켜서 시작한다.
[B 고양이 장 코로나바이러스로 세포배양물의 접종과 배양물 수확]
아메리칸형 배양물 기탁소 ATCC No. VR-789에서 이용할 수 있는 WSV 79-1683 균주와 고양이 장 코로나바이러스 또는 다른 적합한 고양이 장 코로나바이러스를 비활성 CCV 왁찐을 제조하는데 사용할 수 있다. 아홉번째 세포배양물 통과에서 ATCC로부터 수용된 고양이 장 코로나바이러스는 일련의 두 통과에 의하여 고양이 신장세포선에서 성장시키는데 적합하다. 그리므로, 주종자 바이러스 MSV X는 11번째 통과한다. 순도를 이루기 위하여, 주종자 바이러스를 P C.F.R. 113.27, 113.28과 113.55에 따라서 시험한다. 왁찐의 통과수준은 주종자 바이러스에서 다섯번째 이하로 통과한다.
CRFK 원종세포는 -70℃ 또는 그 이하에서 저장한다. 바이러스 주종자는 -70℃에서 저장한다. 작업종자와 생성종자 바이러스는 -40℃에서 저장한다.
로울러 병에 바이러스를 접종시키기 위하여, 95∼100% 함유하는 단층에서 성장배지를 기울여 따른다. 배지를 소혈청 없이 충분한 종자 바이러스를 함유하는 100ml의 DMEM으로 대치하여. 0.01의 최소의 감염중복도(MOI)를 성취한다. 850㎠ 로울러병은 1 X 108내지 4 X 108세포를 함유한다. 0.01의 MOI에서 2 X 108곱하기 0.01은 2 X106이 되는데. 이는 종자역가의 역로그로 나눈것이다.
바이러스 종자와 생성물 수확은 ml 당 103.0내지108.0TCOD50이 산출된다. 따라서 1 X 106(108.0의 역로그)로 나눈 2 X 106은 850㎠ 로울러병에서 세포를 커버하는 987ml의 보존배지에 첨가하는데 사용되는 2ml의 종자를 산출한다. 이와 같은 로울러병 40에 있어서, 80ml의 바이러스 종자를 함유하는 4000ml의 DMEM을 접종원으로 사용한다.
로울러에시 성장배지를 기울여 따르기를 한 후, 100ml의 희석된 바이러스를 각 로울러병에 가한다. 접종된 배양물을 35℃∼38℃에서 배양한다. 세포단층에서 대표적 세포변성효과(CPE)에 의하여 감염이 나타난다. CPE는 둥근세포의 패치를 구성한다. 수확전에 배양물을 미시적 및 거시적으로 검사할 수 있으며 단지 오염의 표시를 나타내지 않은 물질만 수확한다. 세포성 물질에 따라 바이러스를 함유하는 유체를 더 이상 정제하지 않고 감염 48∼72시간후에 수확하고 용기들에 분배하고 -50℃ 또는 그 이하에서 저장한다. 이 실시예에서, 4000ml의 바이러스성 유체를 냉동저장한다.
[C 바이러스의 비활성]
비활성하에 있어서, 바이러스성 유체를 37℃의 물중탕에 용해시키고, 보통 용기에서 조합하고 이성분 에틸렌이민(BEI)으로 비활성화시킨다. 100ml의 물에 0.8g의 수산화나트륨과 2.05g의 2-브로모에틸 하이드로브로마이드를 가하고 1시간동안 37℃의 물중탕에 배양하여 고리화시키고 BEI를 시켜서 BEI 용액을 제조한다. BEI 용액을 1체적%의 농도로 바이러스성 유체에 가한다. 이 실시예에서, 4000ml의 냉동바이러스성 유체를 용해시키고 37℃로 가열하고 40ml의 BEI를 바이러스성 유체에 가한다.
바이러스성 유체와 BEI를 완전하게 혼합하고 24∼48 시간동안 37℃에서 배양한다. 완전한 바이러스성 비활성화를 확인하기 위하여, 2ml의 비활성화 바이러스성 유체를 잔유 생 바이러스 없이 고양이 세포의 단층에 접종시켜서 시험한다. 접종된 세포를 7일동안 37℃±2℃에서 배양한 다음, 하부로 통과시킨다.
하부통과된 세포를 형광표시된 다클론성 또는 단클론성 항혈청을 FECV로 오염시키고 FECV 형광체 없이 자외선 현미경하에서 검사한다. 비활성화 기간 종료시에, 냉각(4℃±2℃) 살균된 삼황산 나트륨의 1몰 용액은 최종농도가 0.25중량%가 되도록 반응혼합물에 가하여 BEI를 중화시킨다. 이 실시예에서 10.1ml의 삼황산 나트륨의 1몰 용액을 반응혼합물에 가한다.
[D 왁찐의 정량화]
효소결합 면역분석(ELISA)법을 표준방법에 따라 전개하여 FECV 왁찐의 유효면역량을 계산하는데 사용한다. 개 코로나바이러스의 페플로머(S) 항원에 특이한 단클론성 항체와 CCV에 대한 다클론성 항체를 공지된 방법에 따라서 제조한다(12,13). 개 코로나바이러스의 페플로머(S) 항원에 특이한 단클론성 항체로 피복된 ELISA 판웰을 희석된 FECV 시험시료와 반응시킨 다음, 탈지분유를 함유하는 보호완충제로 처리한다.
세척후, CCV에 대한 희석된 다클론성 항체를 웰에 가하고, 웰을 다시 세척한 다음 염소 항-고양이 IgG 말 무우 과산화효소(메릴랜드, 개이더스버그, 커크가아드 앤드 페리 연구소 제품)을 가한다. 세번 세척후, 2,2′-아지도-디-[3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트(6)}를 웰에 가하고, 황산 도데실 나트륨을 첨가하여 반응을 중지시킨다. 광학적 단위의 유색반응의 흡수도를 ELISA 판독기로 405nm에서 판독한다. 시험에서 FECV 항원의 농도를 FECV의 공지농도를 희석시키는 유사한 시험에 의하여 발생되는 표준곡선으로 계산한다. 본 발명의 비활성화 FECV 왁찐을 본 ELISA 법으로 표준화하면 최소한 5 마이크로그람의 S 항원함량을 함유한다.
[E 보조제와 방부제의 첨가]
이러한 표준화된 왁찐제제를 비활성화 바이러스성 유체와 수산화 알루미늄을 혼합하여 보충하면, 5체적%의 최종 보조제 농도를 얻는다. 이 실시예에 있어 표준화 생성물은 5 마이크로그람의 S 항원 함량을 갖는 4000ml의 비활성화 FECV 유체에 34,000ml의 생리적 식염수를 첨가하는 것이 필요하다. 이의 전체체적은 38,000이고, 이에 2000ml의 수산화 알루미늄을 첨가하여 최종농도가 5체적%가 되게한다. 방부제로서 머티올레이트를 최종농도가 체적으로 1:10,000 되게 보조 비활성화 왁찐에 가한다.
[실시예 2]
[간섭연구]
고양이 장 코로나바이러스를 함유하는 개 코로나바이러스 왁찐이 다른 개 항원에 대한 항체반응에 간섭하지 않음을 입증하기 위하여, 변경된 생 바이러스와 비활성화 헵토스피라 항원을 함유왁찐과 조합한 CCV 왁찐을 강아지에 예방접종한다. 모든 왁찐은 최소의 방출 단위량으로 제제한다.
[표 1]
a. 렙토스피라 박테리아와 개 바이러스에 대하여 관련되는 항체 : CVD-개 디스템퍼 바이러스, CAV2-개 아데노바이러스형 2, CPI-개 파라인플루엔자 바이러스, CPV-개 파르보바이러스, CCV-개 코로나바이러스.
b. 항체반응은 각각 HI와 미세응집역가로서 표현되는 CPV와 렙토스피라를 제외하고 바이러스 중화역가로서 표현된다.
c. 1ml 단위량으로 3주일 간격으로 2회 동물의 피하에 예방 접종한다. 혈청은 2차 예방접종 2주후에 수집한다.
d. 동결 건조된 왁찐 성분과 재수회에 사용된 희석제를 나타낸다 : D-디스템퍼바이러스, A2-아데노바이러스 형 2, P-파라인플루엔자 바이러스, PV-파르보바이러스, L-렙토스피라, CV-코로나 바이러스.
표 1에 나타란 결과는 DA2PPVL 왁찐, 즉, 디스템퍼 바이러스(D), 아데노바이러스형 2(A2), 파라인플루엔자 바이러스(P), 파르보바이러스(PV)와 렙토스피랄 박테리아(L)을 함유하는 왁찐을 재수화하는데 사용했을때 코로나바이러스 왁찐이 어떠한 바이러스성 또는 렙토스피라성 성분에 대한 항체의 발육에 간섭하지 않음을 나타낸다.
더우기. 코로나바이러스 왁찐으로 재수화된 DA2PPVL으로 예방접종된 강아지에서 또는 물이나 보조제를 희석제로서 사용했을때 어떠한 유분에 대한 항체역가에서 현저한 차이가 관찰되지 않았다.
[실시예 3]
[기니아피그에서 왁찐평가]
실험 동물 모델에서 표준화된 왁찐의 희석물을 평가하여 항원흡광 효능에 대하여 FECV 왁찐제제를 평가한다. 비희석되거나 다섯배 희석(1:5, 1:25와, 1:125, 체적으로)의 왁찐을 소 혈청없이 DMEM에서 제조한다. 최종농도가 5체적%가 되게 왁찐제제에 수산화 알루미늄을 가한다.
각 350g 크기의 여섯마리 기니아피그의 네그룹에 1ml단위량의 왁찐 제제를 21일의 간격으로 근육아래에 각각 2회 투여한다. 기니아피그를 예방접종시에, 2차 예방접종시에와 14일후 2차 예방접종시에 사육한다. 표 2는 다른 사육시에 기니아 피그의 CCV 혈청-바이러스 중화(SVN) 항체역가를 예시한 것이다.
[표 2]
[표 2a]
모든 기니아피그는 1차 예방접종시에 SVN 혈청음성을 나타냈다. 2차 예방접종시에 비희석된 왁찐은 모든 기니아피그에서 항체 반응을 유도했다.
14일후 2차 예방접종에서 비희석된 왁찐으로 예방접종된 기니아피그의 기하적 평균 항체는 64로 증가했다. 대조적으로 다른 왁찐 희석물과 비교물로 예방접종된 기니아피그는 음성을 나타냈다. 이러한 데이타는 기니아피그를 FECV 왁찐을 시험하는데 실험모델로 사용할 수 있음과 왁찐단위량에서 면역항원의 양을 면역 반응을 자극하는 점 이상으로 희석시킬 수 있음을 나타냈다. 또한 이들 데이타는 FECV가 OCV 항원을 중화시키는 기니아피그의 항체반응을 유도함을 나타낸다.
[실시예 4]
[강아지의 왁찐평가]
예방측정으로서 장관예방시험을 사용하여 어린 강아지에서 동일한 항원 흡광 FECV 왁찐제제를 평가한다. CCV에 대한 감수성을 측정할 어린 건강한 강아지를 실험시험의 모든 기간동안 분리가 용이하게 가둬놓는다.
12마리의 강아지 모두에 21일 간격으로 왁찐제제를 2회 각각 피하에 예방 접종한다. 14일후 2차 예방접종에서, 세 비예방접종된 비교물과 함께 예방접종물을 독성 CCV로 자극한다.
[표 3]
예방접종시에, 모든 강아지는 CCV에 대하여 혈청음성 이었다. 2차 예방접종시에 비희석, 1:5와 1:75 희석 왁찐은 모든예방 접종된 강아지에서 CCV에 대한 면역반응을 유도했다. 강아지 번호 80은 CCV에 대한 항체역가를 갖는 1:125 희석물로 예방접종된 강아지뿐이다. 자극시에 비희석 1:5와 1:25 희석의 FECV 왁찐으로 예방접종된 모든 강아지는 CCV 항체역가의 증가로 나타나는 바와같이 기왕성 면역반응을 갖는다. 1:125 예방 접종된 그룹에서 세마리 강아지중 두마리는 자극시에 항체역가를 갖는다. 이들 데이타는 FECV 왁찐이 CCV를 중화할 수 있는 강아지에서 면역반응 유도함을 나타낸다. 또한, 이들 데이타는 왁찐에서 FECV 면역원의 항원흡광을 예시한다.
[실시예 5]
[자극실험]
자극하기 위하여 세 비예방접종된 비교물과 함께, 각 예방접종물에 독성 바이러스 제제를 1ml는 경구로, 1ml는 코내로 투여한다. 5일후 자극에서 15마리의 강아지를 안락사시키고, 시체부검하고 소장을 제거했다. 소장을 동일한 간격으로 10마디로 나누고 각 마디에서 작은 시료를 수집하고 평가할때까지 -70℃에서 저장한다. 평가하기 위하여 소장시료를 저온유지장치에서 분할한 다음(6㎛ 두께), 37℃에서 30분 동안 유리 슬라이드에서 공기 건조한 후 오염될때까지 4℃에서 저장한다.
면역형광체에 있어서, 분할을 10분동안 냉 아세톤에서 고정시킨 다음 20℃에서 30분 동안 공기건조 시킨후 습윤실에서 37℃하에 20분동안 항 혈청과 접합된 희석형광 이소티오시안네이트로 오염시킨다. 오염후, pH 7.0의 인산염 완충 식염수(PBS)로 슬라이드를 2회(각각 5분) 세척하고 증류수로 1회 5분동안 세척한다. 슬라이드를 공기 건조하고 즉시 자외선 현미경으로 검사하여 장 융모의 흡수세포에서 CCV 항원의 정도(1+내지 4+의 규모)를 측정한다. 표 4는 장관 예방시험의 결과를 예시한 것이다.
[표 4]
이들 데이타는 충분한 FECV면역원이 소장의 점막을 채운 면역담당 세포의 생장을 촉진시키는 비희석 및 1:5 희석왁찐에 존재함을 나타낸다. CCV 자극 바이러스는 장관에 주입되고 제한된 복제를 일으킨다. 시체부검시에, 자극 5일후, 자극바이러스의 잔유물은 장의 융모를 채우는 흡수세포에 존재하는 특이성 CCV 형광체에 의하여 관찰되었다. 1:25 희석의 왁찐은 예방 접종된 강아지에서 나온 하나 및 둘의 분절에서 관찰된 낮은 양의 형광체에 의하여 표시되는 장관의 생장을 촉진시키는데 불충분한 항원을 갖는다. 장관의 생장촉진에 실패한 1:25 왁찐 희석물과 음성형광체를 비교강아지에서 관찰된 것과 비교한다. 이들 데이타는 FECV 면역원이 장 점막을 채우는 면역담당세포의 생장을 촉진시킬 수 있고 CCV에 의하여 발생되는 위장염에 대하여 강아지를 보호함을 나타낸다. 왁찐에서 FECV 면역원은 예방이상으로 희석될 수 있고 CCV 감염에 대하여 개를 보호하기 위하여 충분한 효능을 갖도록 표준화되어야 한다.
[실시예 6]
[면역성 시험]
A) 물질과 방법
1. 개들. 비글 강아지는 하란 스프라그 도우리 회사에서 얻는다. 강아지는 예방접종시에 6주의 나이이고 개 코로나바이러스(CCV), 개 디스템퍼 바이러스(CDV), 개 아데노바이러스 형 2(CAV-2), 캐 파르보바이러스(CPV), 개 파라인플루엔자 바이러스(CPI)에 대하여 혈청음성(SVN 항체역가 ≤2)을 갖고 렙토스피라 카니콜라와 엘. 익테로헤모르하지에 대하여 ≤10의 미세응집 역가를 갖는다. 강아지를 예방접종과 자극시험 기간동안 분리가 용이하게 위치시킨다.
2. 왁찐/예방접종. 상기 실시예 1에 서술된 방법에 따라 FK-CU 세포에서 주 종자 바이러스로부터 5차 통과시에 FECV에서 바이러스 유체를 제조한다. 바이러스 유체를 화학적으로 비활성화 한후, 코로나바이러스 왁찐을 최소면역단위량의 FECV 항원으로 제제한다. 각각 ml의 단위량에 1:10 희석의 비활성화 FECV 유체를 함유시킨다. 코로나바이러스 왁찐에 5% 수산화 알루미늄을 보충시킨다. 실험그룹에는 3주일 간격으로 코로나바이러스 왁찐으로 1ml 단위량으로 2회 피하 또는 근육하에 예방 접종한 강아지가 포함된다. 개 디스켄퍼 바이러스(CDV), 개 아데노바이러스형 2(CAV-2), 개 파라인플루엔자 바이러스(CPI), 개 파르보바이러스(CPV)의 동결 건조된 변형 생 바이러스 성분과 동결건조된 치사 렙토스피라 박테린의 최소 방출 단위량을 함유하는 DA2PPVL로 표시되는 왁찐 조성물과 조합한 코로나바이러스 왁찐을 부가적 강아지 그룹에 수여한다. 비예방 접종된 강아지의 그룹은 비교물로서 사용한다.
3. 혈청학. SVM 항체역가의 혈청학적 평가를 위한 혈액시료를 예방접종 전후와 독성 CCV로 자극시킨 후 수집한다. CCV 및 CDV와 CVA-2에 대한 SVN 항체의 측정은 평편한 바닥의 96-웰 마이크로타이터 판으로 미세적정법에 의하여 행한다. 혈청시료의 일련의 2배 희석물을 둘베코의 변형 이글스 배지(DMEM) 보존배지에서 제조하고 100∼300log10과 TCID50을 함유하는 동일 체적(50μl)의 적당한 바이러스균주를 각 웰에 가한다. 37℃에서 배양한 90분후 DMEM + 5% FBS에 현탁시킨 동일체적의 적당한 세포현탁액을 각 웰에 가한다. 판을 습도있는 이산화탄소 배양기에서 37℃하에 7일 동안 배양하고 도립현미경으로 바이러스성 세포 변성효과(CPE)를 측정한다. CPI에 대한 SVN 항체를 적혈구 흡착억제법으로 측정한다. CPV에 대한 SVN 항체는 8-웰실 슬라이드에서 행하는 형광항체 분석에 의하여 평가한다. 항체역가는 바이러스를 완전히 중화시킨 혈청의 상호간 최고의 희석으로 표현된다. 미세응집 시험에 의하여 렙토스피라 분획에 대한 항체역가를 평가하기 위하여 미네소타 대학의 수의 진단연구소에 혈청시료를 보냈다.
4. 독성 CCV로 강아지 자극. 아이오와 아메스의 국립 수의 서비스 연구소(NVSL)에서 CCV-6를 얻는다. 7.1log10TCID50/ml를 함유하는 바이러스의 작업원종을 증명된 FK-CU 세포선에 바이러스를 통과시켜서 제조하고 -70℃에서 냉동 저장한다. 동물을 NVSL의 지시에 따라서 자극한다. 2주일후 2차 예방접종에서 강아지를 DMEM에서 1:100으로 희석된 자극 바이러스로 자극한다. 5-4log10TCID50의 이론적 단위량을 함유하는 2ml의 전체 자극 체적양에서 각 강아지에 1ml는 코내에, 1ml는 경구로 투여한다. 희석된 자극바이러스의 적정으로 5.1log10TCID50의 실제 자극단위량을 가져온다. 자극기간 21일후에 매일 배설물 시료를 수집한다.
5. 장관보호분석. 장간-보호분석은 필히 미국특허 제 4,567,042 호와 미국 특허 제 4,567,043 호에서의 액리 등에 의하여 서술한 바와같이 행한다. 자극 21일 후에 강아지를 치사시키고 시체를 부검하여 장관을 수확한다. 설치한 고정액에 절개부를 넣고 -70℃에서 냉동시킨다. 엷은 절개부를 마이크로톰에서 제조하고, 유리 슬라이드에 공기건조시키고 고정시켜서 형광-표지된 염소 항-고양이 IgG(H+L) 항체로 오염시킨다. 절개부를 자외선 현미경으로 검사한다. 각 절개부에서 형광정도는 CCV 항원의 양을 나타낸다. 형광농도는 음성에서는 -로 기록되고 양성에서는 ± 내지 4+로 기록되며 음성에서는 0의 값으로 표시되고 양성에서는 0.5∼4로 표시된다. 전체점수는 보호지수를 계산하는데 사용된다.
6. 자극후 배설물에서 CCV 분리. 각 배설물 시료의 30% 현탁액을 PBS에서 제조한다. 응집물이 분쇄되도록 물질을 강하게 교반하고, 4℃에서 15분동안 1200xg으로 원심분리하여 찌꺼기를 펠릿화 한다. 상청액을 0.2㎛ 필터를 통하여 여과하고 20μl의 각 시료를 24-시간 단층의 고양이 세포를 함유하는 24-웰 판의 웰에 가한다. 배양물을 7일동안 CO2배양기에서 37℃하에 배양한다. 배설물과 관련되는 독성문제를 피하고 바이러스를 분리하는 기회를 증가시키기 위하여 4일간 배양후 각 웰에서 100μl를 제거하고, 고양이 세포의 새로운 24-시간 배양물을 함유하는 24-웰판에 2차 배양한다. 24-웰 배양물의 2차세트를 CO2배양기에서 37℃하에 배양한다. 배양물의 두 세트를 4일 및 7일 배양후 CCV-특성 CPE를 검사한다. 최초 24-웰 배양물에서 또는 2차 배양물에서 CPE를 나타내는 배양물은 양성으로 나타났다. 양성 배양물은 면역형광법에 의하여 개 코로나바이러스로서 확인되었다. 최초 및 2차 배양판에서 시험한 시료의 전체수는 배설물(%양성)에서 CCV를 나타내는 강아지의 퍼센트를 계산하는데 사용한다.
7. ELISA에 의한 CCV의 S-단백질에 특이한 점막항체의 검출. CCV의 S-단백질에 대한 100μl의 최적농도의 단결정성 항체 또는 100μl의 비감염된 세포 비교항원으로 96-웰 마이크로타이터판의 웰을 4℃에서 18시간동안 피복한다. 웰을 PBS-0.05% 투윈 20(PBS-Tw)으로 세척하고, 2% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS(PBS-BSA)로 후-피복한다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 50μl의 CCV분취량을 웰에 가하고 37℃에서 1시간동안 배양한다. 가공되고 정제된 배설물 시료의 50μl 분취량을 CCV와 세포억제 항원을 함유하는 웰에 첨가한다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 50μl의 과산화효소-표지 염소 항-개 IgA, α-연쇄 특이성 물질(베릴연구소)을 가한다. 판을 1시간동안 37℃에서 배양하고, 세척하고 100μl의 ABTS 기질(커크가드 앤드 페리 연구소)을 웰에 가한다. 15∼30분 동안 실온에서 배양한 후, 흡수기를 405nm에서 ELISA 판독기로 측정한다. 세포억제 항원웰에서 나온 흡수가를 CCV 항원웰의 흡수가에서 감하고 바탕흡수가로 나눈다. 결과는 항체수준에서 배-증가로 표현했다.
8. 배설물 시료에서 CCV SVN 활성도. 바이러스를 분리하기 위하여 가공한 배설물 시료를 CCV에 대한 SVN 활성도에 대하여 시험한다. 시험에 사용하기전에, 여과된 배설물 시료를 이성분 에틸렌이민(BEI)으로 처리하여 잔유 CCV를 비활성화시킨다. 티오황산나트륨을 가하여 BEI를 중화시키고 시료를 CCV SVN 분석으로 시험한다.
B. 결과
예방접종과 자극후 혈청 SVN 항체역가
코로나바이러스 왁찐의 면역성은 예방접종된 강아지에서 CCV에 대한 SVN의 발생에 의하여 입증되었다.
최소면역 단위량에서 조성된 두 단위량의 코로나바이러스 왁찐으로 6주의 나이때 예방접종한 강아지는 CCV에 대한 SVN 항체를 생성했다(표 5). 피하 아니면 근육하 방법으로 예방접종한 강아지에서 CCV에 대한 SVN 항체역가의 차이는 없었다. 완전 항원 단위량의 CDV, CAV-2, CPI, CPV와 엘. 카니콜라 및 엘. 익테로헤모파기에를 함유하는 왁찐과 조합한 코로나바이러스 왁찐으로 예방접종된 강아지는 코로나바이러스 왁찐만 수여한 강아지와 유사한 CCV에 대한 SVN 항체 역가를 나타냈다. 모든 비예방접종된 비교강아지는 실험예비 접종전기간 동안 CCV에 대하여 혈청음성을 가졌다. 강아지를 독성 CCV로 자극했을때, 추가반응 CCV SVN 역가는 모든 예방접종된 강아지에서 관찰되었다. 2차 예방접종후 혈청음성을 갖는 에방접종체는 자극후 다른 예방접종체와 유사한 SVN 역가를 가졌다. 모든 비예방접종된 강아지에서 CCV SVN 역가는 자극후 8 이상을 증가하지 않았다.
[표 5]
1. CCV 자극후 2주
2. CDV, CAV-2, CPI, CPV와 엘. 카니콜라 및 엘. 익테로헤모파기에의 전체항원방출단위량이 함유된 왁찐.
장관보호분석
2차 단위량의 왁찐 다음 2주후에 독성 CCV로 강아지를 자극한다. 21일후 장관 마디를 수거하여 장관보호분석 평가를 진행한다. 장관 절개부의 형광정도는 장의 CCV 감염양에 비례했다. 독성 CCV에 대한 예방접종된 강아지의 보호는 장관 절개부에서 관찰된 형광농도의 감소에 의하여 측정했다. 코로나바이러스 왁찐의 효능은 비예방접종된 비교물과 비교되는 예방접종체에서 나온 장관 절개부의 형광농도의 감소에 의하여 평가했다. 형광체는 비예방접종된 비교물에서 나온 절개부에서 보다 예방접종된 강아지에서 나온 장관에서 거의 관찰되지 않았다(표 6). 형광농도의 감소는 14 내지 15(93%)의 예방접종된 강아지에서 나온 장관절개부에서 관찰되었다. 형광농도가를 형광체 점수를 계산하는데 사용했을 때, 예방면역체는 비예방접종된 비교물의 점수가 24.3 임에 비하여 평균점수가 2.7 이었다. 형광체 점수는 예방접종된 강아지의 89%의 보호지수를 계산하는데 사용했다. 코로나바이러스 왁찐의 효능은 투여방법에 의하여 또는 DA2PPVL 왁찐에서 바이러스와 박테린성분에 의하여 영향을 받지 않는다.
[표 6]
CCV 자극후 배설물에서 CCV 분리
CCV 자극기간 21일후에 매일 수집된 배설물시료로 고양이 세포에서 배양에 의하여 CCV의 존재를 시험한다. 배양물을 고양이 세포에 통과시켜서 배설물 시료에 존재하는 CCV를 증폭시키고 배설물과 연관되는 독성의 근본문제를 감소시킨다. CCV 자극후 3일하 동안, 거의 동일한 퍼센트의 예방접종 되거나 비예방접종된 강아지에서 CCV를 재분리한다(표 7).
자극 다음 3일후, 예방접종된 강아지는 비교물보다 CCV가 거의 발생되지 않았다. 자극후 5 내지 20일에 예방접종된 강아지의 13∼33%에서만 CCV를 분리했다. 대조적으로, 비예방접종된 강아지의 80∼100%는 자극기간후 3∼11일에 바이러스를 발생했다. 자극후 13 내지 20일에 40∼100%의 강아지에서 CCV의 재분리를 계속했다. CCV의 발생은 피하 및 근육하에 예방접종한 강아지에서와 코로나바이러스를 DA2PPVL 왁찐과 조합하여 사용했을때 감소했다.
[표 7]
배설물시료에서 S-단백질 특이성 점막 IgA 항체
CCV에 대한 점막항체의 수준을 대치하기 위하여, CCV의 S-단백질에 특이한 IgA 항체를 측정하는 ELISA로 배설물 시료를 시험한다. 개개의 예방 접종되고 비교된 강아지의 IgA 수준은 표 8에 표시했고, IgA 수준의 요약은 제1도에 표시했다. CCV 자극후 5일에 예방접종된 강아지의 배설물 시료에서 4∼13배의 S-단백질 특이성 IgA의 증가가 검출되었다. 동시에, 비예방접종된 비교강아지는 최대로 2배의 IgA 증가를 나타내었다. 남은 S-단백질 특이성 IgA의 수준은 자극후 13일 동안 예방접종된 동물에서 상승했다. IgA 수준은 14일 후 예방접종된 강아지에서 점진적으로 감소되었으나 비교강아지보다 더 높게 남았다. 비록 몇몇 미예방접종된 비교강아지에서 IgA 수준이 5배만큼 증가하더라도, 이들 동물에서 평균 IgA 수준은 낮게 남는다. 코로나바이러스 왁찐만으로나 DA2PPVL 왁찐과 조합한 왁찐으로 피하와 근육하에 예방접종한 강아지 사이에 IgA 수준차이는 거의 없었다.
[표 8]
[표 8a]
점막시료에서 CCV SVN 활성도
점막 CCV-중화활성도의 존재를 측정하기 위하여 배설물 시료를 시험했다. 여과된 배설물 시료에 존재하는 CCV는 SVN 분석에 사용된 CCV를 간섭할 수 있기 때문에, 배설물 시료를 BEI로 처리하여 바이러스를 비활성화한다. CCV SVN 항체분석에서 기술한 바와같이 CCV에 대한 SVN 활성도의 존재에 대하여 시료를 시험했다. ≥64의 점막 CCN SVN 역가가 몇몇 예방접종된 강아지의 배설물에서 검출되었고 1일이상 동안 지속되었다(표 9). 점막 SVN 역가는 모든 세 예방면역 그룹의 배설물 시료와 유사했다. 점막항체 ELISA로 CCV 자극후 비예방접종된 강아지의 배설물 시료에서 점막 CCV SVN 활성도를 검출했다. 그러나 비교물에서 점막 SVN 역가는 일반적으로 낮았으며 낮마다, 동물마다 더 변했다.
[표 9]
[표 9a]
C. 토의
CCV 장염은 개의 중요한 질병으로 계속한다. 질병과정을 순화시킬 수 있더라도, 스트레스, 품종과 기타 개 병원균과 같은 인자는 질병(3)의 심도를 강화시킬 수 있다. 따라서, CCV 왁찐은 개의 건강을 유지하는데 필요하다.
FECV의 균주는 바이러스의 항원성과 성장특성 때문에 더욱 더 왁찐을 생성하는데 후보로서 선택된다. 이와같은 특성은 비활성화되고 보충된 FECV 유체에서 제조된 유능한 왁찐을 경제적으로 생성시키는데 용이하다. 코로나바이러스 왁찐의 면역성은 CCV SVN 항체의 개량에 의하여 나이가 6주만큼 어린 강아지에서 입증되었다.
왁찐을 나타내는 피하 또는 근육하 방법으로 예방 접종한 강아지에서 관찰된 유사한 SVN 항체역가를 나타내는 결과는 어느 한쪽의 방법으로 투여하여 나타낼 수 있다. 더불어 코로나바이러스 왁찐과 DA2PPVL 왁찐의 조합물은 CCV SVN 항체의 생성에 간섭하지 않는다. 그러므로, 코로나바이러스 왁찐은 바이러스왁찐과 박테린 성분의 일상적 개 예방접종 식이요법으로 사용될 수 있다.
독성분야 CCV에 자연적으로 노출한 후 심한 임상적 질병이 비 보호된 개에서 관찰될 수 있더라도, NVSL에 의하여 공급된 CCV 자극 바이러스는 정상 강아지에 임상적 증상을 나타내지 않는다. 그러므로, 코로나바이러스 왁찐의 효능은 미국 특허 제 4,567,042 호와 미국특허 제 4,567,043 호에서 악리등이 기술한 장관보호분석에 의하여 평가했다. 장관절개부의 형광체 농도는 독성 CCV 자극후 보호 반응의 표시기로서 사용했다. 장관 절개부에서 관찰된 형광정도는 장관마디에 존재하는 CCV 감염수준에 비례한다. 따라서, 예방접종된 강아지에서 나온 장관절개부의 형광농도의 감소는 독성 CCV로 자극한 후 바이러스 감염의 감소로서 인식된다. 감소된 형광체는 비예방접종된 비교물과 비교하여 14∼15(93%)의 예방 접종된 강아지에서 나온 절개부에서 관찰되었다. 이러한 결과는 독성 CCV로 자극한 후 바이러스 감염을 감소시키는 코로나바이러스 왁찐의 보호력을 입증하는 것이다. 89%의 전체 보호지수는 코로나바이러스 왁찐 단독으로 또는 DA2PPVL 왁찐과 조합한 것으로 예방접종된 강아지에서 입증되었다.
장관-보호분석에서 나온 결과는 자극기간 말기에 예방접종체의 CCV 감염이 감소됨을 나타낸다. 그러나, 예방접종체에서 독성 CCV의 클리어런스는 점진적으로 일어나거나 아니면 자극후 명확한 시간포인트에서는 알려지지 않았다. 바이러스 분리 연구결과로 CCV를 발생시키는 예방접종체수의 감소는 CCV자극후 3일 내지 5일 사이에 일어남을 알았다.
예방접종된 강아지로부터 독성 CCV의 강화된 클리어런스는 21일의 자극기간동안 지속되었다. 비예방접종된 강아지가 자극후 어떠한 심한 임상적 증상을 나타내지 않을지라도. 전체 후자극기간동안 대부분의 비예방접종된 강아지로부터 CCV가 발생했다. 이와같은 연장된 기간동안 비예방접종된 강아지로부터 바이러스의 발생은 다른 더 심한 개 병원균에 의하여 강아지를 감염시킬 경향이 있다.
점막면역반응은 장 바이러스에 의하여 발생되는 질병에 보호에 있어 중요한 역할을 한다. 조사자는 장관과 연관된 림프성 조직의 자극과 점박 IgA 항체의 생성은 TGE 바이러스감염(14,15,16)에 대한 주 보호반응에 있음을 보고했다. CCV 감염은 전신에 일어나는 것은 아니기 때문에, 점막면역반응은 장에서 나온 CCV의 클리어런스의 우세한 메카니즘이다. 코로나바이러스의 S-단백질은 SVN 항체의 주요표적이기 때문에, S-단백질에 특이한 점막 IgA의 수준을 측정하는 ELISA가 개발되었다. ELISA의 결과는 예방접종된 강아지에서 특이성 점막 IgA의 수준이 CCV 자극후 5일까지 바탕위에서 7배 이상으로 증가함을 입증했다. 예방접종된 강아지에서 점막 IgA의 양은 점막항체의 보호면역반응과 관계했다. CCV의 S-단백질에 대한 점막 IgA 항체는 비예방접종된 강아지에서 검출되었다. 그러나, 강아지에서 점막면역반응은 자극기간후 21일 동안 CCV의 발생을 감소시키는데 충분하지 못했다. 점막면역반응의 보호적 역할에 관한 부가적 증거는 배설물 시료에 CCV SVN 활성이 있음을 나타내는 결과에 의하여 제공된다. 배설물 시료에서 CCV SVN 역가가 변하더라도, 일반적으로 SVN 역가는 더 높고 비교물 보다 예방접종체에서 CCV 자극후 더 오래동안 지속되었다. 이와같은 결과는 안전하고 유효한 코로나바이러스 왁찐이 생성됨을 입증한다. 코로나바이러스 왁찐은 표준바이러스와 박테린 항원성분을 함유하는 왁찐과 조합하여 피하와 근육하에 투여했을때 6주 나이의 강아지에 유효했다. 독성 CCV 자극에 대한 예방접종된 강아지의 보호는 장관-보호분석에 의하여 평가했다. 효능은 에방접종된 강아지에서 나온 장관마디의 CCV 감염의 감소에 의하여 입증되었다. 예방접종된 강아지에서, 장에서의 바이러스 감염의 감소는 감소된 바이러스 발생과 상승된 수준의 S-단백질 특이성 IgA와 관계되었다.
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Claims (23)

  1. 단위 투약량당 유효 면역량의 변형 고양이 장 코로나 바이러스와 적당한 담체를 함유하는 개 코로나 바이러스에 감염된 개의 면역 왁찐.
  2. 제1항에 있어서, 변성 고양이 장 코로나 바이러스의 유효 면역량이 약 5 마이크로그램 이상의 S 바이러스성 항원을 함유하는 양임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  3. 제2항에 있어서, 비활성화 고양이 장 코로나 바이러스의 유효 면역량이 약 5 마이크로그램 내지 약 7.5 마이크로그램의 S 바이러스성 항원을 함유하는 양임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  4. 제1항에 있어서, 변형 고양이 장 코로나 바이러스가 비활성화 고양이 장 코로나 바이러스임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  5. 제4항에 있어서, 바이러스를 이성분 에틸레이민, 포트마린 또는 β-프로프리오락톤에서 선택한 화학제와 접촉시켜서 비활성화 고양이 장 코로나 바이러스를 비활성화함을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  6. 제5항에 있어서, 비활성화 고양이 장 코로나 바이러스가 바이러스와 이성분 에틸렌이민을 접촉시켜서 비활성화함을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  7. 제1항에 있어서, 변현 고양이 장 코로나 바이러스의 면역성을 강화시키는데 효과적인 양으로 보조제를 더 함유함을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  8. 제7항에 있어서, 보조제를 수산화알루미늄, 사포닌 또는 인산 알루미늄에서 선택함을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  9. 제8항에 있어서, 보조제가 수산화알루미늄임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  10. 제7항에 있어서, 보조제의 유효량이 약 3 체적%의 단위 투약량 내지 약 10 체적%의 단위 투약량임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  11. 제10항에 있어서, 왁찐의 유효량이 약 5 체적%의 단위 투약량임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  12. 제1항에 있어서, 유효 면역량의 2차 변형 바이러스를 더 함유함을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  13. 제12항에 있어서, 2차 변형 바이러스가 변형된 개 아데노 바이러스, 변형된 개 파르보 바이러스, 변형된 개 파라인플루엔자 바이러스 또는 변형된 개 헤르페스 바이러스임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  14. 제1항에 있어서, 유효 면역량의 변형된 박테리아를 더 함유함을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  15. 제14항에 있어서, 변형된 박테리아가 변형된 렙토스피라임을 특징으로 하는 개의 면역 왁찐.
  16. 제1항의 왁찐의 단위량을 개에 투여하여서 함을 특징으로 하는 개 코로나 바이러스에 의하여 발생한 질병에 대한 개의 면역방법.
  17. 제16항에 있어서, 개의 나이가 약 6 주 이상임을 특징으로 하는 면역방법.
  18. 제17항에 있어서, 개의 나이가 약 6 주 내지 약 9 주임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 각 부가적 단위량의 왁찐을 선행 단위량을 투여한 후 투여하는 하나 또는 그 이상의 부가적 단위량의 왁찐을 개에 더 투여함을 특징으로 하는 면역 방법.
  20. 제19항에 있어서, 적당한 시간간격이 약 2 주 내지 약 5 주임을 특징으로 하는 면역 방법.
  21. 제20항에 있어서, 적당한 시간간격이 약 2 주 내지 약 3 주임을 특징으로 하는 면역 방법.
  22. 단위 투약량의 제12항의 왁찐을 개에 투여하여서 함을 특징으로 하는 개 코로나 바이러스에 의하여 발생된 질병과 2차 바이러스에 의하여 발생되는 질병에 대한 개 면역방법.
  23. 단위 투약량의 제14항의 왁찐을 개에 투여하여서 함을 특징으로 하는 개 코로나 바이러스에 의하여 발생한 질병과 박테리아에 의하여 발생된 질병에 대한 개의 면역 방법.
KR1019940003539A 1993-02-26 1994-02-26 고양이장코로나바이러스로부터의개코로나바이러스왁찐 KR100302522B1 (ko)

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