MXPA00003785A - Vacunas de neospora - Google Patents

Abstract

Una vacuna de Neospora caninum consistente en Neospora crecida en cultivo de tejidos y métodos de preparación y utilización de dichas vacunas. Las vacunas de Neospora caninum descritas incluyen las que contienen taquizoítos completos de Neospora, extractos de taquizoítos de Neospora y subunidades de antígenos protectores de taquizoítos de Neospora. Las vacunas de esta invención pueden ser inactivadas o vivas modificadas y contienen adyuvantes y /o estabilizantes. Las vacunas de esta invención pueden estar en forma líquida o liofilizada.

Description

VA C UNA S D E N E O S P O R A ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención: La presente invención se relaciona con una vacuna para la protección de mamíferos frente a la enfermedad causada por Neospora caninum. Más concretamente, la invención se relaciona con vacunas seguras e inmunogénica- mente efectivas para la protección de bóvidos y cánidos frente al aborto causado por Neospora caninum .

Breve descripción de la técnica anterior: Neospora caninum fue primeramente descrita por Dubey y col. (JAVMA, Vol. 192, N° 9, 1 de Mayo de 1988) como una enfermedad de tipo toxoplasmosis que afecta a perros. Se vio que Neospora caninum era estructuralmente distinta de Toxoplasma gondii y no reaccionaba con antisuero anti- T. Gondii en una prueba de inmunoperoxidasa . Dubey y col. describieron las lesiones mayores asociadas al organismo como meningoencefalomielitis y miositis. En los últimos años, la neosporosis ha sido reconocida como una enfermedad mayor de la reproducción en ganado vacuno (Anderson y col., 1994, Food Animal Practice, 10: 439-461), con casos descritos en América del Norte y del Sur, Europa, África, los países del cinturón del Pacífico y también en los Estados Unidos. La manifestación clínica mayor de la neosporosis bovina es el aborto fetal, con encefalitis focal necrotizante no supurativa, miocarditis no supurativa y miositis en el feto (Anderson y "col., 1991, Journal of the American Veterinary Medical Association, 198: 241- 244) . Según Anderson y col., 1997 (Journal of the Veteri-jiary Medical Association, 210: 1169-1172), estudios re-trospectivos de ganado vacuno en California indican que la neosporosis ha sido endémica al menos desde 1985. Estos autores afirman que un 18 a un 19% de todos los fetos abortados de bóvidos remitidos al Sistema de Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de California tienen infección por Neospora sp . En un estudio de_ prospección de granjas lecheras en California, el número de abortos atribuidos a infecciones por Neospora sp era incluso mayor (42,5%) . Ho y col. (J. Parasitol., 1997, 83(3)) han descrito recientemente el éxito en la reproducción del aborto bovino y de la infección fetal infectando a vacas gestantes con taquizoítos de Neospora caninum . Esta publicación sugiere que puede haber una correlación entre el título se-rológico medido por medio de ensayos de anticuerpos fluo-rescentes indirectos ("IFA") y protección del aborto causado por Neospora caninum en vacas. Las vacas con títulos IFA de 320 y 640 no abortaron tras la infección con ta-quizoítos de este organismo. Como se ha indicado anteriormente, también se ha descrito la neosporosis en cachorros y perros de hasta 15 años de edad. Se desconoce el porcentaje de perros infectados que muestran signos clínicos. En perros, Neospora caninum puede infectar cualquier tejido, aunque se encuentra más comúnmente en el sistema nervioso central y en las raíces de los nervios espinales. Las infecciones más graves se observan en cachorros que resultaron infectados en el útero. Estos cachorros exhiben parálisis ascendente. Se puede reproducir el aborto en infección experimental de perras gestantes durante la primera parte de la gestación. Se han usado sulfonamidas, pirimetamina y clindamicina para tratar la neosporosis en perros. Neospora caninum puede producir también una infección fatal en gatos inoculados experimentalmente . Sin embargo, la enfermedad no ha sido aún descrita como de apa-rición natural en gatos.

Se ha visto que la neosporosis produce aborto en ovejas y cabras, pero en menor grado que lo observado en ganado vacuno. La infección experimental es fácilmente inducida en ovejas y cabras por inyección subcutánea de taquizoitos . Aunque la neosporosis, especialmente en vacuno, parece plantear un problema cada vez más grave y existe, ciertamente, desde hace mucho tiempo una gran necesidad de resolver este problema protegiendo a los mamíferos mediante la utilización de una vacuna, no existen descripciones de vacunas, desarrollo de vacunas ni sugerencias de métodos de preparación de vacunas para proteger al ganado vacuno y a otros animales de la enfermedad causada por Neospora caninum .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de esta invención describir una composición vacunal para la protección de mamíferos frente a la enfermedad causada por Neospora caninum, consistente en taquizoítos de Neospora caninum crecidos en cultivo de tejidos como cultivo completo o en forma de extracto o como antígenos subunitarios obtenidos de los mismos. Además, es un objeto de esta invención describir un método de producción de una vacuna para la protección de mamíferos frente a la enfermedad causada por Neospora caninum, consistente en las siguientes etapas: hacer crecer Neos-pora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produzca un efecto citopático ("CPE"), recoger di-cha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos y formular dicho material recogido en una vacuna. Se puede administrar una vacuna viva modificada producida de este modo a mamíferos sin inactivar la Neospora sp . Sin embargo, dicha Neospora sp no inactivada necesitaría ser ate-nuada por técnicas conocidas en este campo antes de hacerla crecer en cultivo de tejidos. Otro método de producción de una vacuna para la protección de mamíferos frente a la enfermedad causada por Neospora caninum consiste en las siguientes etapas: 1*) hacer crecer Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produzca un CPE, 2) recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, 3) inactivar dicha Neospora ca ninum crecida en cultivo de tejidos y recogida y 4) adyu-var la Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, recogida e inactivada para producir una vacuna. Aún otro método de producción de una vacuna para la protección de mamíferos frente a la enfermedad causada por Neospora ca ninum consiste en las siguientes etapas: 1) hacer crecer Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produzca un CPE, 2) recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, 3) extraer los an-tígenos protectores de la Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos y recogida para producir subunidades, 4) inactivar las subunidades si es necesario y 5) adyuvar las subunidades para producir una "vacuna. Está dentro del alcance de esta invención inactivar la Neospora caninum antes de la extracción de las subunidades de los antíge-nos protectores .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención se dirige a composiciones vacunales que consisten en una Neospora caninum viva modificada crecida en un cultivo de tejidos susceptible, o una Neospora caninum adyuvada inactivada crecida en un cultivo de tejidos susceptible, o subunidades derivadas de Neospora caninum . El método de producción de las anteriores composiciones vacunales consiste en hacer crecer Neospora caninum en con-diciones artificiales, en cultivo de tejidos, con el fin de obtener antígenos parasitarios para uso en vacunas. La Neospora caninum puede ser obtenida de cualquier fuente . Se prefiere que una vacuna para bóvidos contenga una Neospora caninum aislada de un feto bovino abortado. Adi-cionalmente, se prefiere que una vacuna para pretendido uso en cánidos contenga una Neospora caninum aislada de un cánido. De modo ilustrativo, el cerebro de un feto infectado es recogido, homogeneizado en un medio de crecimiento, tal como Medio Esencial Mínimo (MEM) , o un dilu-yente, tal como solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") suplementado con antibióticos para minimizar el potencial de contaminación. Dicho homogeneizado es centrifugado para eliminar la materia particulada de gran tamaño y se inocula el sobrenadante en varios cultivos de tejidos y se hacen pases en cultivo de tejidos, si es necesario, hasta que se produce un efecto citopático ("CPE") en al menos un cultivo de tejidos. El cultivo de tejidos es preferiblemente una línea celular en la que crece el parásito hasta un elevado título, de tal forma que se pueda preparar una Semilla Maestra. Un título alto significa que los taquizoítos del parásito crecen para producir un recuento, visualizado al microscopio, o un título cuando se devuelven al cultivo de tejidos, de al menos IxlO4 dosis infectivas de cultivo de tej idos50/ml (x*TCID50/ml) . Preferiblemente, se producen lxlO5 TC D50/ml y, más preferiblemente, se producen lxlO6 TCID50/ml . Una Semilla Maestra significa que la . Neospora sp crecida en cultivo de tejidos crece hasta un elevado título, se alícuota en volúmenes equivalentes en viales de congelación y se congela, después de lo cual se comprueba que esté libre de contaminantes (bacterias, hongos y virus) y se usa luego para preparar Semillas de Trabajo y Semillas de Producción. Las Semillas de Trabajo y las Semillas de Producción significan mayores pases de la Semilla Maestra en un cultivo de tejidos susceptible, alicuotando, conge-lando y repitiendo las pruebas de tal modo que se puedan producir vacunas con las Semillas^ de Producción en lugar de usar la Semilla Maestra y todas las vacunas son preparadas con el mismo material original. Un cultivo de teji-dos susceptible significa un cultivo de tejidos que, cuando se inocula con Neospora sp, es capaz de dejar crecer a los taquizoítos del parásito y de producir un CPE.

Se pueden hacer al menos tres tipos de vacunas según esta invención: una vacuna viva modificada, una vacuna inactivada o una vacuna subunitaria. Si se ha de hacer una vacuna viva modificada, la Neospora sp debe ser muta-da o genéticamente modificada para que el parásito pierda su virulencia, mediante técnicas conocidas en este campo, incluyendo, aunque sin limitación, la mutagénesis química y la ingeniería genética, antes de preparar la Semilla Maestra. Una vez se ha preparado el mutante no virulento (avirulento) , se prepara una Semilla Maestra haciendo crecer a la Neospora sp mutada en un cultivo de tejidos susceptible y se congela como se ha descrito antes. La preparación de una vacuna viva modificada consiste en las etapas de hacer crecer a la Neospora caninum mutada en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un CPE, recoger la Neospora sp crecida en cultivo de tejidos y formular dicho material recogido en una vacuna. La for-mulación puede incluir la adición de estabilizantes y/o adyuvantes o inmunomoduladores . La vacuna puede permanecer en forma líquida o ser liofilizada. El método para la preparación de una vacuna de Neos-pora caninum inactivada requiere que el organismo crezca hasta un título más alto y consiste en las etapas de hacer crecer a la Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un CPE, recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, inactivar dicha Neospora caninum crecida en cultivo de teji-dos y recogida y adyuvar la Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, recogida e inactivada para producir una vacuna . El método para la preparación de una vacuna subuni-taria de Neospora caninum consiste en las etapas de hacer crecer Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un CPE, recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, extraer los antí-genos protectores de la Neospora caninum crecida en cultivo de tej idos y recogida para producir subunidades de los antígenos protectores, inactivar las subunidades si es necesario y adyuvar las subunidades para producir una vacuna. Está dentro del alcance de esta invención inactivar la Neospora caninum antes de la extracción de las subunidades de los antígenos protectores para preparar una vacuna subunitaria. Se pueden seleccionar agentes inactivantes entre el grupo consistente en formalina, beta-propiolactona (BPL) , calor, etilenimina binaria ("BEI"), detergentes y congelación/descongelación, siendo los agentes inactivantes preferidos BEI y BPL. Los adyuvantes usados para aumentar la inmunogenici-dad de las vacunas de Neospora de esta invención pueden ser seleccionados entre el grupo consistente en polímeros, tales como Carbopol , HAVLOGEN® y POLYGEN®; aceite en agua, tales como EMULSIGEN® Y EMULSIGEN PLUS®, agua-en-aceite-en-agua; hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; sulfato de aluminio; inmunomoduladores, tales como BAYPAMUN®; adyuvantes basados en lípidos, tales como Bay R-1005, y liposomas y combinaciones de éstos. Las vacunas de Neospora inactivadas de esta invención pueden incluir estabilizantes, que son añadidos antes o después de adyuvar con objeto de mantener el contenido antigénico a lo largo de períodos prolongados de tiempo y en condiciones adversas de altas o bajas tempe-raturas . Los estabilizantes son seleccionados entre el grupo consistente en inhibidores de las proteasas, azúcares tales como sacarosa y glicerol, polímeros encapsulan-tes, agentes quelantes tales como ácido etilendiaminate-tracético ("EDTA"), proteínas y polipéptidos tales como gelatina y poliglicina y combinaciones de éstos. Los ejemplos que se dan a continuación representan composiciones de vacunas de Neospora caninum y describen sus métodos de producción, incluyendo el crecimiento de los taquizoítos de este organismo en diversas líneas ce-lulares, tales como una línea de células Dérmicas de É-quido (ATCC N" CCL-57) , una línea de células Vero y una línea de células de riñon de Mono Verde Africano (BIO -HITTAKER N° 75-104) , que fue clonada en Bayer Corporation para producir una línea celular denominada MA 104 Clon B, describiendo también su uso en la vacunación de bóvidos para producir títulos de anticuerpos fluorescentes indirectos ("IFA") protectores. La invención es además ilustrada, pero sin pretender limitarla, mediante los siguientes ejemplos, en los que todas las partes y porcentajes son en peso, a menos que se indique algo diferente. EJEMPLOS EJEMPLO 1: - Con objeto de determinar si las vacunas de Neospora caninum pueden producir protección frente al aborto en vacas gestantes en un modelo conocido en la técnica (Ho y col., 1997), los inventores produjeron vacunas de Neospora caninum haciendo crecer a Neospora caninum en una línea de células Vero en botellas rodantes de 850 cm2. Se retiró un vial de Células de Trabajo de la línea de células Vero del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongelaron rápidamente, se diluyeron y se pusieron en botellas rodantes de 850 cm2 que contenían 250 mi de DMEM (de alta concentración en glucosa) , al que se hará refe-rencia de aquí en adelante como DMEMH, en una proporción de 4x10 células por botella. Se suplemento el medio con Sulfato de Neomicina a 1 ml/L y Suero de Caballo a un 5% v/v. Las células fueron incubadas a 36 a 38°C durante 5 a 7 días, hasta que las células tenían una confluencia de entre un 95 y un 100%. Se extrajeron las Células de Trabajo de las botellas rodantes lavando la capa de células con Solución Salina Tamponada con Fosfatos ("PBS") y añadiendo luego 10 mi de una solución de Tripsina, sal disó-dica del ácido etilendiaminatetracético (EDTA) (2,5 g/L de Tripsina + 1 g/L de EDTA) a cada botella rodante, agitando las botellas suavemente durante al menos 10 minutos hasta que las células se desprendieron de la superficie, y lavando luego la superficie de la botella con DMEMH y juntando los contenidos de todas las botellas. Las célu-las de estas botellas (Células de Producción) fueron inoculadas de nuevo en nuevas botellas rodantes de 850 cm2 a 4,5xl07 células por botella rodante. Se incubaron las Células de Producción durante 24 horas a 36 a 38 °C, después de lo cual fueron infectadas con taquizoítos recién pasa-dos de Neospora caninum de la Cepa BPA-1 (3x108 a 4, 5xl08/botella rodante de 850 cm2) . En el momento de la infección, las células de producción tenían una confluencia de al menos el 50%. Las botellas rodantes infectadas fueron incubadas a 36 a 38°C durante 120 a 168 horas en soportes rotatorios de botellas rodantes fijados a entre 0,2 y 0,4 rpm. En ese momento, la capa de células exhibía un típico CPE, que afectaba a al menos un 80% de la capa de células. Al final del período de incubación, se recogieron los fluidos de Neospora juntando los contenidos de todas las botellas rodantes en un recipiente estéril y se retiró una muestra para la titulación de Neospora viva. Los fluidos de recogida aceptables deben tener un título de al menos 3xl05/ml. El título de recogida para el presente lote era 3xl05/ml. Los fluidos de recogida fueron congelados y descongelados dos veces, manteniendo los fluidos de recogida a -70 °C y descongelándolos rápidamente a temperaturas no superiores a 3 °C. Después de este tratamiento, se inactivaron los fluidos de recogida durante un período de 48 horas a 4°C con Etilenimina bina-ria ("BEI") 0,2 M. Después de la inactivación, se neutralizó la BEI con tiosulfato de sodio 3,16 M. Los fluidos de recogida inactivados fueron concentrados por centrifugación a 3.500 rpm durante 15 minutos y la pella fue re-suspendida en PBS a una concentración de 3,0xl07, en base al recuento microscópico. Se adyuvaron alícuotas de estos fluidos de recogida inactivados y concentrados con dos tipos diferentes de adyuvantes para preparar dos formulaciones vacunales diferentes. Se adyuvó la mitad-de los fluidos de recogida inactivados y concentrados con un 10% de HAVLOGEN® (v/v) , mientras que -el resto del fluido de recogida inactivado y concentrado fue adyuvado con un 15% (v/v) de EMULSIGEN®. HAVLOGEN® es un adyuvante basado en polímero que contiene Carbopol, mientras que EMULSIGEN® es un adyuvante basado en aceite-en-agua . Las dos formulaciones de vacuna fueron usadas para vacunar novillas de dos a dos años y medio de edad. Todas las novillas fueron cruzadas y, cuando se confirmó la gestación a los 30+5 días, se dividió a estos animales en cuatro grupos, los cuales fueron tratados como sigue: Se inyectó a las novillas del Grupo 1 (N° 21, , 39 y 20) subcutáneamente dos veces a intervalos de 4 semanas una vacuna de Neospora que contenía un 10% de adyuvante HAVLOGEN®. Se inyectó a las novillas del Grupo 2 (N° 18, 37, 40 y 431) subcutáneamente dos veces a intervalos de 4 semanas - una vacuna de Neospora que contenía un 15% de EMULSIGEN®. Las novillas del Grupo 3 (N° 429, 25, 28 y 2) sirvieron como controles y se las inyectó subcutáneamente dos veces a intervalos de 4 semanas una preparación control que contenía sólo cultivos de células Vero no infectadas con un 15% de EMULSIGEN®. Las novillas del Grupo 4 (19, 10, 4 y 14) sirvieron como controles de contacto y no fueron vacunadas ni inoculadas . Se tomaron muestras de suero de todas las novillas al menos una semana antes de la vacunación (A.V.) , el día de la primera vacunación (día 0) y en las Semanas 5, 6 y 7 post-vacunación, el día de la dosis de refuerzo (refuerzo) , el día de la inoculación (entre la Semana 11 y la 12 y semanalmente a continuación hasta la Semana 16 post-vacunación. Todas las novillas comenzaron el estudio como seronegativas . Sólo los títulos medidos el día de la inoculación aparecen en la Tabla 1, ya que éstos son la mayoría de los títulos para este estudio. Las novillas de los Grupos 1-3 fueron inoculadas con 8xl07 taquizoítos virulentos de Neospora caninum, de la cepa BPA-1, crecidos en células Vero. La inoculación se produjo a los 85±5 días de la gestación. Los fetos fueron extraídos por sección cesárea de las novillas a los 40±6 días (114 a 120 días) de gestación y fueron evaluados por examen macroscópico. Se interpretó la presencia de fetos muertos como indicativa de que la vacuna no protegía a los fetos y el resultado habría sido aborto de los fetos. Se interpretó la presencia de fetos vivos como demostrativa de la protección de los fetos y de que no se habría producido el aborto. La Tabla 1 muestra los resultados de la evaluación fetal y enumera los títulos serológicos de las novillas el día de la inoculación. Los resultados mostrados en esta tabla indican que las novillas del Grupo 1 contenían dos fetos vivos y dos fetos muertos, lo que sugiere que la vacuna de Neospora adyuvada con HAVLOGEN® producía un 50% de protección frente al aborto. Habría que hacer no- tar que las dos novillas protegidas tenían títulos en el momento de la inoculación de 320 y 640, respectivamente. Las novillas del Grupo 2 vacunadas con vacuna de Neospora adyuvada con EMULSIGEN® contenían un feto vivo de una no- villa con un título serológico de 320. Las novillas restantes de este grupo de vacunación tenían fetos muertos y títulos inferiores a 320 en el momento de la inoculación. Las dos primeras novillas del Grupo 3 (Grupo Control que recibió células Vero adyuvadas sin Neospora) tenían fetos muertos y títulos <80. Las dos novillas restantes de este grupo fueron inoculadas en un momento posterior al resto de las novillas y se propone que no recibieron una dosis de inoculación suficientemente alta y que, por lo tanto, tenían fetos vivos. Sus títulos eran <80 el día de la inoculación y, en un examen histológico posterior, se vio que estas novillas no estaban infectadas. Las novillas del Grupo 4 no desarrollaron títulos de anticuerpos durante el estudio, lo que indica que los otros grupos no eliminaban organismos de Neospora. Este último grupo no fue inoculado, ya que sólo sirvió como controles de contacto. Este experimento apoya la interpretación del inventor de los datos de Ho y col . , donde los inventores proponían que un título IFA de 320 podría ser indicativo de protección frente al aborto fetal.

Tabla 1: Resultados de la evaluación fetal postinoculación con Neospora virulenta BPA-1 HAV = HAVLOGEN®. EMUL = EMULSIGEN®. *NI = no infectado, determinado después por histopatología .

EJEMPLO 2 : Se llevó a cabo este experimento con objeto de determinar si un organismo de Neospora caninum podría crecer en otra línea celular de cultivo de tejidos, ser inactivada y formulada para preparar una vacuna que pudiera producir títulos de anticuerpos en ganado vacuno que pudieran ser similares a los observados en el EJEMPLO 1 con vacunas de Neospora producidas en una línea de células Vero . Se diluyó una Línea Celular Dérmica Equina, el Pase 11 de Células Maestras, derivadas de ATCC N° CCL-57, a un recuento celular de 2x?07 células por botella rodante, en un Medio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de Suero de Caballo y se inocularon en botellas rodantes de 850 cm2 a un volumen de 250 mi por botella rodante. Las células crecieron hasta su confluencia, después de lo cual fuero infectadas con 2,4xl07 taquizoítos de Neospora caninum en 14,1 mi de DMEM. Cada botella rodante contenía 264 mi de DMEM más un 10% de Suero de Caballo. Los cultivos de tejido infectados con Neospora fueron incubados a 37°C hasta que al menos un 50% de las células demostraron CPE (aproximadamente 7 a 9 días) . Los fluidos fueron recogidos y los taquizoítos centrifugados durante 30 minutos a 3.500 rpm para concentrar el antíge-no recogido. Se resuspendió la pella de antígeno concentrado de Neospora caninum en 200 mi de sobrenadante de DMEM decantado de los taquizoítos centrifugados. Se congeló esta preparación concentrada, que contenía 8xl06 ta-quizoítos por mi, durante 16 horas a una temperatura de -70 °C y se descongeló después a temperatura ambiente. Se inactivo entonces la preparación usando etilenimina binaria (BEI) 0,05M incubada a 4°C durante 48 horas. Se neutralizó la preparación inactivada usando tiosulfato de sodio 3,16 M. Se adyuvaron entonces dos alícuotas iguales de la preparación de antígeno de Neospora caninum neutralizada e inactivada con diferentes adyuvantes, como en el EJEMPLO 1. Se adyuvó la mitad de la preparación con HAV-- LOGEN®, un adyuvante polimérico basado en Carbopol, aña-diendo el adyuvante a una concentración del 10% (v/v) . Se adyuvó la otra mitad de la preparación con EMULSIGEN®, un adyuvante basado en aceite, añadiendo el adyuvante a una concentración del 15% (v/v) . Las vacunas adyuvadas de Neospora caninum producidas en Células Dérmicas Equinas fueron inyectadas subcutáneamente en terneras de una edad entre los 9 y los 12 meses . Una ternera (#954) recibió una dosis de 5,0 mi de la vacuna adyuvada con HAVLOGEN®, mientras que una segunda ternera (#955) recibió una dosis de 5,0 mi de vacuna ad-yuvada con EMULSIGEN®. Se reforzó a cada ternera con la vacuna homologa 10 días después. Las terneras fueron sangradas en cada vacunación y 10 días después de la vacunación de refuerzo. Se analizó el suero en cuanto al título usando un ensayo de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) . En la Tabla 2 se muestran los títulos serológicos de estas terneras. Estos resultados indican que la vacuna de Neospora adyuvada con EMULSIGEN® producía títulos protectores, mientras que la vacuna de Neospora adyuvada con HAVLOGEN® producía un título más bajo, que resultaba casi protector . TABLA 2: Títulos de anticuerpos de terneras vacunadas con vacunas adyuvadas e inactivadas de Neospora caninum crecidas en Células Dérmicas Equinas EJEMPLO 3 : Después de observar por los EJEMPLOS 1 y 2 que una vacuna de Neospora caninum producida en una línea celular continua podría producir títulos de anticuerpos protectores en vacuno que tuvieran correlación con la protección frente al aborto, el objeto de este experimento era evaluar el efecto del crecimiento de la Neospora caninum en una línea celular clonada totalmente diferente derivada de Ríñones de Monos Verdes Africanos (MA-104 Clon B) y evaluar los efectos de varios tipos diferentes de adyuvantes sobre la producción de títulos de anticuerpos en vacuno . Se produjo una vacuna de Neospora caninum como sigue. Se retiró un vial de Células de Trabajo (MA-104 Clon B suero de caballo) del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongeló rápidamente, se diluyó y se inoculó en botellas rodantes de 850 cm2 que contenían "250 mi de DMEM (de alto contenido en glucosa) , a partir de aquí denominado DMEMH, a una concentración de 4xl07 células por botella rodante. Se suplemento el medio con Sulfato de Neomicina a 1 ml/L y Suero de Caballo a un 5% v/v. Se in-cubaron las células a 36 a 38 °C durante 5 a 7 días, hasta que las células tuvieron una confluencia de entre un 95 y un 100%. Las Células de Trabajo fueron retiradas de las botellas rodantes lavando la capa celular con Solución Salina Tamponada con Fosfatos (PBS) y añadiendo después 10 mi de una solución de Tripsina-EDTA (2,5 g/L de Tripsina + 1 g/L de EDTA) a cada botella rodante, agitando las botellas suavemente durante al menos 10 minutos hasta que las células se desprendieron de la superficie y la-vando luego la superficie de la botella con DMEMH y juntando los contenidos de todas las botellas. Las células de estas botellas (Células de Producción) fueron reinoculadas en nuevas botellas rodantes de 850 cm2 a 4,5xl07 células por botella rodante. Las Células de Producción fueron incubadas durante 24 horas a 36 a 38°C, después de lo cual fueron infectadas con taquizoítos de Neospora caninum recién pasados (1, 2xl07/botella rodante de 850 cm2) . En el momento de la infección, las células de producción tenían una confluencia de al menos el 50%. Las botellas rodantes infectadas fueron incubadas a 36-38 °C durante 120 a 168 horas en soportes rotatorios de botellas rodantes fijados a entre 0,2 y 0,4 rpm. En ese momento, la capa de células mostraba un CPE típico que afectaba a al menos el 50% de la capa celular. Al finali-zar el período de incubación, los fluidos de Neospora fueron recogidos juntando los contenidos de todas las botellas rodantes en un recipiente estéril, del que se retiró una muestra para la titulación de taquizoítos vivos de Neospora. Los fluidos de recogida aceptables deben te-ner un título de al menos 3xl05/ml . El título de recogida para el presente lote era 2,3xl06. En este caso, los fluidos de recogida fueron concentrados por centrifugación para obtener 2,4xl07 taquizoítos/ml . Otros métodos de concentración incluyen, aunque sin limitación, la ul-trafiltración y la cromatografía en columna. Los fluidos de recogida fueron inactivados por adición de etilenimina binaria (BEI) 0,2 M a una concentración final de 0,01 M e incubación a 2 a 7°C durante al menos 96 horas. Después de esta incubación, se neutralizó la BEI por adición de tiosulfato de sodio 3,16 M. Después de la incubación y de la neutralización, los fluidos fueron divididos en cuatro alícuotas. Cada alícuota fue adyuvada con un adyuvante diferente, como se indica a continuación: Fórmula A: 1,0 mi de fluidos de recogida inactivados, más 3,5 mi de PBS, más 0,5 mi de un adyuvante polimérico basado en Carbopol denominado HAVLOGEN® . Fórmula B: 1,0 mi de fluidos de recogida inactivados, más 3,25 mi de PBS, más 0,75 mi de un adyuvante basado en polímero denominado POLYGEN® . Fórmula C: 1,0 mi de fluidos de recogida inactivados, más 0,5 mi de HAVLOGEN®, más 3,5 mi de adyuvante basado en lípidos denominado Bay R- 1005. — Fórmula D: 1,0 mi de fluidos de recogida inactivados, más 0,5 mi de PBS , más 3,5 mi de MONTADINE® 773. Se separó aleatoriamente a dieciocho novillas de en-tre 1,5 y 2,0 años de edad en seis grupos. Las novillas del Grupo 1 (N° U148, S85 y A184) no recibieron una vacuna de Neospora caninum . Sirvieron como controles de contacto y recibieron células MA 104 Clon B no infectadas. Las novillas del Grupo 2 (N° A29, 13 y Z55) sirvieron co-mo controles positivos y recibieron taquizoítos vivos de Neospora (3xl07 intravenosamente y 8xl07 intramusculármente) . Las novillas del Grupo 3 (N° 40, 1851 y A71) fueron vacunadas con tres dosis de 5,0 mi de la Fórmula A, administradas subcutáneamente a intervalos de 4 semanas. Las novillas del Grupo 4 (N° 237, Y21 y U93) fueron vacu-nadas con tres dosis de 5,0 mi de la Fórmula B, administradas subcutáneamente a intervalos de 4 semanas. Las novillas del Grupo 5 (N° Y6 , X7 y 800) fueron vacunadas con tres dosis de 5,0 mi de la Fórmula C, administradas sub-cutáneamente a intervalos de 4 semanas . Las novillas del Grupo 6 (N° A144, S74 y 5212) fueron vacunadas con tres dosis de 5,0 mi de la Fórmula D administradas subcutáneamente a intervalos de 4 semanas. Todos los animales fueron sangrados el día 0 y bisemanalmente a partir de en-tonces . Las muestras de suero fueron analizadas en cuanto a la conversión a títulos específicos de Neospora usando un ensayo de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) . La Tabla 3 muestra los resultados serológicos. Todas las preparaciones vacunales producían niveles de títulos protectores (>320) en las novillas. Sin embargo, los adyuvantes basados en polímero parecen producir una mejor respuesta de título que las formulaciones de adyuvantes basadas en aceite. Dado que las vacas control de contacto seguían siendo serológicamente negativas (dentro de la variación del ensayo) durante la duración del experimento, está claro que los títulos producidos en los animales vacunados no eran producidos por eliminación de las novillas infectadas con taquizoítos vivos de. Neospora, sino que eran un resultado de la vacunación.

Tabla 3 : Títulos IFA de novillas vacunadas con vacuna de Neospora caninum que contiene cuatro adyuvantes diferentes Tabla 3 (cont.) : Títulos IFA de novillas vacunadas con vacuna de Neospora caninum que contiene cuatro adyuvantes diferentes TMG = Título medio geométrico. Vac. = Vacunación.

EJEMPLO 4 : Este experimento fue llevado a cabo para determinar el impacto de la cantidad de antígeno de JVeospora caninum en las vacunas y para evaluar una vacuna de Neospora consistente en antígenos subunitarios . También se incorporó en este procedimiento de producción de vacunas el uso de una técnica de "muerte suave" , que se define como un procedimiento de inactivación que utiliza cantidades reducidas de agentes inactivantes y temperaturas menores de incubación y tiempos de inactivación más cortos. Para este experimento, la Neospora caninum creció y se procesó de un modo similar al descrito en el EJEMPLO 3. Se modificó el procedimiento de inactivación como sigue. Se añadió etilenimina binaria a la Neospora caninum recogida a una concentración final de 0,01 M, pero se incubó a tempera-tura ambiente durante sólo 24 horas, después de lo cual se neutralizó por adición de tiosulfato de sodio a una concentración final de 0,01 M. Se obtuvieron subunidades retirando alícuotas de los fluidos de taquizoítos inactivados, centrifugándolas a 3.500 rpm durante 15 minutos y decantando los fluidos sobrenadantes. Se resuspendieron las pellas de taquizoítos de Neospora en Solución Salina Tamponada con Fosfatos de Dulbecco ("DPBS") para producir una vacuna subunitaria que contenía sólo los antígenos de taquizoítos y no los exoantígenos excretados por los taquizoítos al medio. Se preparó una segunda vacuna de Neospora resuspendiendo la pella de taquizoítos de Neos-pora en los fluidos sobrenadantes que habían sido retirados y guardados. Se formularon tres lotes de Neospora caninum subunitaria resuspendida en DPBS de forma que con-tuvieran l,2xl07, 2,4xl07 y 3,6xl07 taquizoítos por dosis, respectivamente. Se formularon tres lotes de Neospora ca ninum resuspendida en sobrenadante de forma que contuvieran números equivalentes de taquizoítos (l,2xl07, 2,4xl07 y 3,6xl07) por dosis. Todas las formulaciones fueron ad-yuvadas con HAVLOGEN® y llevadas a una concentración final de 5,0 ml/dosis por adición de DPBS (a la vacuna subunitaria) o de fluido sobrenadante, respectivamente. Estas formulaciones fueron administradas a novillas seronegativas para Neospora de edades entre" los 7 y los 9 meses. Seis grupos de vacuna consistían en cinco novillas cada uno (n=5) y dos grupos control consistían en tres novillas cada uno (n=3) . Las novillas de los grupos experimentales de vacuna fueron inyectadas cada una subcutáneamente (SC) con 5,0 mi de una de las preparaciones va-cuñales de taquizoítos de Neospora y revacunadas cuatro semanas después. Los grupos de vacuna recibieron las siguientes vacunas: Grupo 1 Vacuna subunitaria de Neospora que contenía l,2xl07 taquizoítos de Neospora con un 10% de HAVLOGEN® . Grupo 2 Vacuna subunitaria de Neospora que contenía 2,4xl07 taquizoítos de Neospora con un 10% de HAVLOGEN® . Grupo 3 Vacuna subunitaria de Neospora que contenía 3,6xl07 taquizoítos de Neospora con un 10% de HAVLOGEN® . Grupo 4 Vacuna de Neospora que contenía l,2xl07 ta- quizoítos de Neospora con un 10% de HAVLOGEN® y diluyente sobrenadante. Grupo 5 Vacuna de Neospora que contenía 2,4xl07 taquizoítos de Neospora con un 10% de HAVLOGEN® y diluyente sobrenadante. Grupo 6 Vacuna de Neospora que contenía 3,6xl07 taquizoítos de Neospora con un 10% de HAVLOGEN® y diluyente sobrenadante. Grupo 7 Controles de contacto - Estas novillas no recibieron vacuna . Grupo 8 Controles positivos - Estas novillas recibieron una inoculación que contenía 5xl06 taquizoítos vivos de Neospora, administrados intravenosamente en una dosis de 5,0 mi y 3xl06 taquizoítos vivos de Neospora administrados intramuscularmente en una dosis de 5,0 mi. Todas las novillas fueron albergadas en el mismo lote y sangradas semanalmente durante 7 semanas y todas las muestras de suero fueron estudiadas en cuanto al título de anticuerpos específicos para Neospora caninum usando IFA. Adicionalmente, las vacunas fueron evaluadas en cuanto a la reactividad local observando los sitios de vacunación. Se midió cualquier reacción local y se regis-tro en centímetros. En la Tabla 4 se muestran las respuestas de los títulos serológicos de las novillas. Los resultados indicados en la Tabla 4 indican que las vacunas que contienen los fluidos sobrenadantes añadidos de nuevo a la pella de Neospora producen una respuesta de anticuerpos ligeramente mayor que las vacunas subunitarias de Neospora. Las respuestas de anticuerpos producidas por las vacunas de Neospora caninum que contienen . el sobrenadante añadido de nuevo también parecen estar algo relacionadas con la dosis. Sin embargo, todas las vacunas eran efectivas en cuanto a la producción de niveles protectores de anticuerpo en ganado vacuno. Ninguna de las vacunas produjo reacciones locales significativas post-vacunación. Por lo tanto, todas las formulaciones podrían ser consideradas como candidatos aceptables a vacunas comerciales.

Tabla : Títulos IFA medios geométricos de novillas vacunadas con diferentes tipos de vacunas de Neospora que contienen concentraciones crecientes de taquizoítos de Neospora 2S TMG = Título medio geométrico. Aunque la invención ha sido descrita con detalle en lo que antecede con fines de ilustración, hay que entender que dicho detalle tiene únicamente ese fin y que los expertos en la técnica pueden hacer variaciones en ella sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, excepto en lo que pueda estar limitado por las reivindicaciones .

Claims (14)

Reivindicaciones

1. Una vacuna de Neospora caninum consistente en Neospora crecida en cultivo de tej idos .

2. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 1, donde la Neospora crecida en cultivo de tejidos contiene un antígeno seleccionado entre el grupo consistente en un cultivo completo de taquizoítos de Neospora, un cultivo de tejidos inactivado de taquizoítos de Neos-pora, un cultivo de tejidos vivo modificado de taquizoítos de Neospora, un extracto de taquizoítos de Neospora y una o más subunidades obtenidas de taquizoítos de Neospora.

3. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 1, que además contiene un agente inactivante y un adyuvante .

4. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 3, donde el agente inactivante es seleccionado entre el grupo consistente en formalina, beta-propiolactona, calor, etílenimina binaria, detergentes y medios para congelar/descongelar.

5. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 3 , donde el adyuvante es seleccionado entre el grupo consistente en polímeros, aceite en agua, agua-en-aceite-en-agua, lípidos, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, inmunomoduladores y sus combinaciones .

6. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 5, donde el adyuvante polimérico es seleccionado entre el grupo consistente en Carbopol, HAVLOGEN® y POLY-GEN®.

7. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 5, donde el adyuvante aceite-en-agua es seleccionado entre el grupo consistente en EMULSIGEN® y EMULSIGEN PLUS® .

8. La vacuna de Neospora caninum según la Reivindicación 1, donde la Neospora es viva modificada.

9. Un método para hacer crecer a una Neospora cani -num en un cultivo de tejidos susceptible hasta conseguir una cantidad suficiente para proteger a los mamíferos frente a la infección o el aborto causados por dicha Neospora caninum, consistente en inocular la Neospora ca ninum en dicho cultivo de tejidos y recoger la Neospora caninum replicada.

10. Un método de producción de una vacuna de Neospo-ra consistente en las siguientes etapas: a. hacer crecer a Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un efecto citopático, b. recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos y c. formular dicho material recogido en una vacuna.

11. Un método de producción de una vacuna de Neospo-ra consistente en las siguientes etapas: a. hacer crecer a Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un efecto citopático, b . recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, c . inactivar dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos y recogida y d. adyuvar la Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, recogida e inactivada para producir una vacuna.

12. Un método de producción de una vacuna subunitae Neospora consistente en las siguientes etapas: a. hacer crecer a Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un efecto citopático, b. recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, c. extraer uno o más antígenos protectores de la Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos recogida para producir una subuni- dad, d. inactivar la(s) subunidad (es) eventualmente y e. adyuvar la(s) subunidad (es) para producir una va- cuna .

13. Un método para producir una vacuna sub-unitaria ospora consistente en las siguientes etapas: a. hacer crecer a Neospora caninum en un cultivo de tejidos susceptible hasta que se produce un efecto citopático, b. recoger dicha Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos y c. inactivar la recogida de Neospora caninum, d. extraer uno o más antígenos protectores de la Neospora caninum crecida en cultivo de tejidos, recogida e inactivada para producir una subunidad (es) y e. adyuvar la(s) subunidad (es) para producir una vacuna.

14. Un método de protección de mamíferos frente a la enfermedad causada por Neospora caninum, consistente en administrar a dichos mamíferos la vacuna según las Reivindicaciones 1-8.