CN117402224A - 副猪格拉瑟菌06257和HbpB串联重组蛋白及用途 - Google Patents
副猪格拉瑟菌06257和HbpB串联重组蛋白及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供副猪格拉瑟菌06257和HbpB串联重组蛋白及用途，属于兽用生物制品技术领域。本发明涉及一种串联表达的副猪格拉瑟菌06257和HbpB的重组蛋白06257‑HbpB。试验结果表明，本发明中串联表达的重组蛋白06257‑HbpB具有反应原性强、免疫原性强、保护效力强的明显优势和特点，与佐剂混合后制备亚单位疫苗工艺简单，安全性良好，可以有效地抵抗副猪格拉瑟菌的感染，为工业化生产副猪格拉瑟菌病亚单位疫苗奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种副猪格拉瑟菌06257和HbpB串联重组蛋白及其制备的副猪格拉瑟菌病疫苗及应用，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪副猪格拉瑟菌病是由副猪格拉瑟菌（Glaesserellaparasuis, GPS）感染引起猪的以多发性纤维素浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要症状的疾病，是世界范围内养猪业的重要细菌性传染病之一。各年龄段的猪都能感染副猪格拉瑟菌，其中断奶仔猪和保育仔猪最易感。副猪格拉瑟菌包括至少15种不同的血清型，世界范围内以血清4型和5型为主。在我国最为流行的血清型是4型、5型、13型、12型和17型等。疫苗免疫接种是预防副猪格拉瑟菌病的有效手段，现在市面上的商业化疫苗主要是菌体灭活疫苗，但由于副猪格拉瑟菌血清型众多，各血清型之间缺乏交叉保护力，灭活疫苗对各种血清型的保护效果参差不齐。当前仍然需要研发血清型覆盖面更广的新型副猪格拉瑟菌病疫苗。
06257是副猪格拉瑟菌ABC型抗微生物肽转运系统和ATP酶的组分，是通过细菌TAT途径分泌的一种蛋白，相类蛋白在脑膜炎奈瑟球菌中被认为是最有潜力的保护性抗原。HbpB是副猪格拉瑟菌Hxu（haem–haemopexin utilization）摄铁系统的一种血红素结合外膜蛋白，具有吸收血红素和谷胱甘肽等营养物质的功能，是副猪格拉瑟菌的重要致病因子。国内外已有研究报道表明，06257和HbpB均是副猪格拉瑟菌具有发展潜力的重要保护性抗原蛋白，在小鼠和仔猪的免疫保护试验中均表现出了良好的保护效力；其中，以06257蛋白为抗原成分之一的副猪格拉瑟菌病亚单位疫苗已生产上市。但是，重组的HbpB全长片段蛋白表达量较低，重组蛋白06257作为疫苗抗原成分含量较大（抗原蛋白含量≥500μg/2.0mL/头份），这将导致疫苗生产成本较高，因此仍需提高其免疫保护效力，降低其成分含量和疫苗生产成本。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种具有免疫保护性的副猪格拉瑟菌重组串联表达蛋白，其特征在于是06257和HbpB蛋白的串联蛋白06257-HbpB。所述串联蛋白06257-HbpB的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码该蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
同时，本发明提供了一株含有副猪格拉瑟菌06257和HbpB串联表达蛋白的基因工程菌BL21/pET28a-06257-HbpB。
进一步的，本发明提供了重组串联表达蛋白06257-HbpB在副猪格拉瑟菌病亚单位疫苗中的应用，将串联表达蛋白06257-HbpB和佐剂混合制成疫苗，肌肉免疫仔猪，可以给仔猪提供良好的保护效力。
本发明中一种串联表达的副猪格拉瑟菌06257和HbpB重组蛋白06257-HbpB制备的亚单位疫苗，具有抗原蛋白可以可溶性形式表达、表达量高、保护效力强的特点，适用于大量生产和市场应用。
附图说明
图1为重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳结果图。注：06257 U和06257 I，分别为重组菌株BL21/pET28a-06257未诱导和诱导的表达结果，06257 S和06257 L分别为重组菌株BL21/pET28a-06257经IPTG诱导超声破碎离心后的上清和沉淀；重组蛋白HbpB和06257-HbpB，按相同的方法标注；箭头指向目的蛋白表达位置；pET28a为重组空载体质粒菌株BL21/pET28a经IPTG诱导的表达结果。
图2为重组蛋白的western blot鉴定结果图。注：观察结果表明，在与副猪格拉瑟菌4型和5型猪抗血清发生反应时，串联表达蛋白06257-HbpB的反应原性均表现为最强；其次是06257，也均表现出一定的反应原性；但HbpB与两种抗血清均无明显反应条带。箭头指向目的蛋白与抗血清发生反应的位置。
图3为三种重组蛋白疫苗免疫仔猪的IgG抗体检测结果图。注：**表示差异极显著（P<0.01）；ns表示没有显著性差异（P>0.05）。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。本领域技术人员在权利要求的范围内做所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1 三种抗原蛋白重组表达菌株的构建
1. 重组表达质粒的构建
参考GenBank已公布的副猪格拉瑟菌06257和HbpB基因序列设计引物（见表1）。其中，06257基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；HbpB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重组蛋白06257-HbpB的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
以副猪格拉瑟菌5型H5L3株（保藏编号：CCTCC NO：M2018020）的基因组为模板，PCR扩增06257基因片段，利用DNA凝胶回收试剂盒回收06257，并与pUCm-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒pUCm-06257，将重组质粒用BamHI/XhoI双酶切并回收06257片段，克隆入经同样酶切后回收的pET28a质粒中，构建重组表达质粒pET28a-06257，经测序鉴定正确后保存。按同样方法构建HbpB基因片段的重组表达质粒pET28a-HbpB。
进一步的，使用P2/Q1引物PCR扩增HbpB’基因片段（区别于上述的HbpB），构建重组表达质粒pET28a-HbpB’；使用F1/R2引物PCR扩增06257’基因片段（区别于上述的06257），回收06257’与pUCm-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒pUCm-06257’，用BamHI/SacI双酶切pUCm-06257’后回收06257片段，克隆入经同样酶切后回收的pET28a- HbpB’中，构建串联表达质粒pET28a-06257-HbpB，经测序鉴定正确后保存。
表1 本发明中所使用PCR引物
2. 三种重组蛋白的表达及纯化
将重组质粒pET28a-06257转化大肠杆菌BL21（重组菌命名为BL21/pET28a-06257），挑取单菌落于含50 µg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C、180 r/min摇床培养至对数生长期时（OD600nm=0.6–1.0），加入IPTG（终浓度为1 mmol/L）37 °C诱导培养4 h，将菌液离心收集菌体，用原菌液1/40体积的PBS重悬菌体，在冰浴条件下进行超声裂解菌体，离心分离上清及沉淀，采用His6标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白，利用12%的SDS-PAGE分析其表达特性。按同样的方法，对重组质粒pET28a-HbpB和pET28a-06257-HbpB分别进行操作，构建的重组菌分别命名为BL21/pET28a-HbpB和BL21/pET28a-06257-HbpB。
SDS-PAGE检测结果（见图1）显示，3个重组菌株BL21/pET28a-06257、BL21/pET28a-HbpB和BL21/pET28a-06257-HbpB经IPTG诱导培养后均获得了高效表达，分别在约28 ku、37ku和63 ku处有明显的表达条带，将表达的重组蛋白分别命名为06257、HbpB和06257-HbpB；三种蛋白均以包涵体形式表达（见图1）。
3. 三种重组蛋白的western blot分析
将纯化的三种重组蛋白06257、HbpB和06257-HbpB经12% SDS-PAGE后转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂牛奶的TBST溶液37℃封闭2 h，加入副猪格拉瑟菌4型H4L1株（保藏编号：CCTCC NO：M2018019）的猪抗血清（1:500稀释），37℃摇床孵育且使用TBST洗涤后；加入羊抗猪二抗IgG-HRP（1:5000稀释），摇床孵育且使用TBST洗涤后，采用DAB法显色分析。
结果（见图2）显示，HbpB与副猪格拉瑟菌4型的猪抗血清没有肉眼可见的反应条带，06257出现了一定程度的反应条带，而06257-HbpB出现了较强的反应条带；三种蛋白反应原性由强到弱依次为06257-HbpB、06257、HbpB。按同样的方法，使用副猪格拉瑟菌5型H5L3株（保藏编号：CCTCC NO：M2018020）的猪抗血清进行western blot分析，获得了相似的试验结果（见图2）。这表明，串联表达的重组蛋白06257-HbpB较原来的单个抗原的重组蛋白HbpB或06257具有更强的反应原性。
实施例2 三种重组蛋白疫苗的制备
按照ISA201佐剂说明书，分别制备三种重组蛋白06257、HbpB和06257-HbpB的ISA201佐剂疫苗。以重组蛋白06257为例，制备方法如下。使用0.22 μm孔径的滤膜将纯化的重组蛋白06257过滤除菌，使用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定06257蛋白的浓度，将06257蛋白溶液的浓度调整至500 µg/mL。使用高速匀浆机（10000 r/min）将ISA201佐剂进行搅拌60 s后，在继续搅拌状态下缓慢加入等体积06257蛋白溶液（500 µg/mL），继续搅拌4–6 min成为白色粘稠乳液，疫苗中蛋白含量为250 µg/mL。按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。最后，定量分装，加盖密封，2–8℃保存。按相同的方法，制备其他两个重组蛋白HbpB和06257-HbpB的ISA201佐剂亚单位疫苗。
实施例3 三种重组蛋白疫苗的小鼠免疫保护效力比较试验
将80只小鼠，随机均分为4组，20只/组，第1–3组分别皮下注射实施例2中三种重组蛋白06257、HbpB和06257-HbpB制备的疫苗，第4组注射无菌PBS为空白对照组（见表2）；21日后采用相同的方法进行二免。二免后14日，从4组小鼠中各取10只，每只腹腔注射约5 LD50（半数致死剂量，50% lethal dose）的副猪格拉瑟菌H5L3株（保藏编号：CCTCC NO：M2018020）菌液0.2 mL（含活菌约8.4×108CFU）；将各组剩余10只小鼠各腹腔注射约10 LD50的H5L3株菌液0.2 mL（含活菌约1.7×109CFU）。观察并记录小鼠的发病和死亡情况21日，统计分析各重组蛋白亚单位疫苗的小鼠免疫保护率。
结果（见表2）显示，PBS对照组小鼠攻毒后24小时内均出现发病症状，且在21日的观察期内全部死亡。当使用5 LD50的副猪格拉瑟菌强毒株攻毒后，3个重组蛋白疫苗组小鼠的保护率分别为8/10、6/10、10/10；当使用约10 LD50的副猪格拉瑟菌强毒株攻毒后，3个重组蛋白疫苗组小鼠的保护率分别为0/10、0/10、8/10。这表明，串联表达的重组蛋白06257-HbpB较原来的单个抗原蛋白06257和HbpB对小鼠具有更强的免疫保护效力。
表2 三种重组蛋白疫苗的小鼠免疫保护效力比较试验结果
实施例4 三种重组蛋白疫苗的仔猪免疫保护效力试验
将20头3–4周龄健康仔猪随机均分为4组（5头/组），第1–3组分别颈部肌肉注射制备的06257、HbpB和06257-HbpB蛋白疫苗2 mL，第4组注射无菌PBS为阴性对照组，21日后用相同的方法进行二免。一免前、一免后21日、二免后14日，对每头仔猪前腔静脉采血并分离血清，以纯化的重组蛋白为抗原（100 ng/孔），通过间接ELISA方法测定其抗体水平。二免后15日，所有仔猪腹腔注射1个发病剂量的副猪格拉瑟菌5型H5L3株（保藏编号：CCTCC NO：M2018020）菌液2 mL（含活菌数为1.5×108CFU），观察、记录其发病和死亡情况21日，统计保护率。
采用t检验（Student's t test）和单因素方差分析（one-way ANOVA）对ELISA抗体水平分析，采用Duncan方法进行多重比较分析。结果（见图3）显示，各蛋白免疫组的仔猪在首免后21日的抗体水平均极显著高于首免前（P<0.01），二免后的抗体水平较首免后再次升高且差异极显著（P<0.01）。一免后、二免后各重组蛋白免疫组之间，06257-HbpB疫苗免疫组的抗体水平极显著高于06257疫苗和HbpB疫苗免疫组（P<0.01）。这表明，串联表达的重组蛋白06257-HbpB较原来的单个抗原的重组蛋白06257或HbpB对猪具有更强的免疫原性。
攻毒保护试验结果（见表3）显示，PBS对照组仔猪均出现精神沉郁、食欲减退或废绝、被毛紊乱、跛行和卧地不起等发病症状，且在21日的观察期内死亡3头；06257蛋白疫苗组有1头出现轻微的发病症状，发病周期为攻毒后第2–5日，然后逐渐恢复正常；HbpB蛋白疫苗组有3头发病，且有1头死亡； 06257-HbpB蛋白疫苗组仔猪均没有出现明显的发病症状；06257、HbpB和06257-HbpB三种蛋白疫苗组仔猪的保护率分别为80%（4/5）、60%（3/5）和100%（5/5）。这表明，串联表达的重组蛋白06257-HbpB较原来的单个抗原的重组蛋白06257或HbpB对猪具有更强的免疫保护效力。
表3 三种重组蛋白疫苗的仔猪免疫保护效力比较试验结果
实施例5 三种重组蛋白疫苗的仔猪安全性比较试验
将20头3–4周龄仔猪随机均分为5组（5头/组），第1–4组分别颈部肌肉注射06257、HbpB和06257-HbpB蛋白疫苗（4.0 mL/头），第5组按相同剂量注射无菌PBS为对照组。测定接种前及接种后1–7日的体温变化，并观察、记录其精神、食欲、呕吐、腹泻，以及死亡等临床状况。21日观察期结束后每组剖杀2头，检查接种部位的炎症、组织病变以及疫苗残留情况。
结果显示，仔猪一次超剂量接种重组蛋白06257、HbpB和06257-HbpB制备的疫苗后，均出现了暂时的体温升高，但在接种后24小时体温升高不超过1℃，且在48小时内均恢复正常；接种三种不同蛋白的疫苗后，各疫苗组仔猪的精神、食欲、行为等均正常，无呕吐、腹泻、死亡等不良反应。21日观察期结束后，解剖观察各疫苗组仔猪接种部位，均无明显的疫苗残留、局部炎症和组织病变等现象，与对照组相比无明显差异。上述试验结果表明，重组蛋白06257-HbpB制备的疫苗对靶动物仔猪进行接种是安全的。
06257和HbpB均是副猪格拉瑟菌具有发展潜力的重要保护性抗原蛋白。本发明重组表达了副猪格拉瑟菌06257和HbpB的单个抗原蛋白及其串联表达蛋白06257-HbpB，试验结果显示，与原来的单个抗原蛋白06257和HbpB相比，串联蛋白06257-HbpB具有更强的反应原性、免疫原性和保护效力，与佐剂混合后制备的亚单位疫苗安全性良好，可以有效地抵抗副猪格拉瑟菌的感染，具有较大的应用开发潜力和市场价值。
Claims (8)
1.一种串联表达的副猪格拉瑟菌06257和HbpB重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白为06257-HbpB；所述重组蛋白06257-HbpB的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.表达如权利要求1所述重组蛋白的基因，其特征在于：
表达所述重组蛋白06257-HbpB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3.一种重组表达载体，包含如权利要求2所述的基因。
4.一种工程菌，将权利要求3所述的重组表达载体转化后所得。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为BL21/pET28a-06257-HbpB。
6.一种副猪格拉瑟菌病亚单位疫苗，其特征在于：所述的亚单位疫苗是使用权利要求1所述的重组蛋白作为抗原制备的。
7.根据权利要求6所述的亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗是将所述重组蛋白与佐剂混合后制备所得。
8.根据权利要求6或7所述的亚单位疫苗在制备副猪格拉瑟菌病防控药物中的应用。
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