PT764446E

PT764446E - Vacina adjuvada que está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro

Info

Publication number: PT764446E
Application number: PT96114505T
Authority: PT
Inventors: Jennifer K Lane; Kristina J Hennessy; Karen K Brown; Sandra L Trump
Original assignee: Bayer Corp
Priority date: 1995-09-21
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 2006-12-29
Also published as: AU716702B2; ES2270433T3; JPH09110719A; CA2184132A1; ATE335508T1; DE69636427D1; EP0764446B1; AU6569196A; US20050232948A1; EP0764446A2; DK0764446T3; NZ299405A; DE69636427T2; EP0764446A3; US7482020B2; CA2184132C; MX9604185A

Description

ΡΕ0764446 1

DESCRIÇÃO "VACINA ADJUVADA QUE ESTÁ SUBSTANCIALMENTE ISENTA DE ALBUMINA NÃO DO HOSPEDEIRO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Area da Invenção: A presente invenção relaciona-se com vacinas à base de soro que contêm albumina do hospedeiro estão substancialmente isentas de albumina não do hospedeiro e com processos para a sua preparação e utilização. Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com o conceito inventivo de vacinas que impedem ou reduzem substancialmente as reacções sistémicas adversas pós-vacinação associadas a regimes de vacinação com vacinas adjuvadas.

Breve Descrição do Estado da Técnica: É conhecido na técnica que a vacinação de animais com regimes de vacinação envolvendo a utilização de adjuvantes pode causar reacções sistémicas adversas. 0 regime de vacinação pode compreender a administração de vacina inactivada contendo um adjuvante. Alternativamente, o regime de vacinação pode compreender a administração de 2 ΡΕ0764446 uma vacina viva modificada e de uma vacina inactivada contendo um adjuvante. A titulo ilustrativo, a maioria dos regimes de vacinação de felinos compreendem administração de uma vacina contendo um organismo vivo modificado concomitantemente com uma vacina contendo um organismo inacti-vado e um adjuvante. A estes regimes de vacinação estão associadas reacções sistémicas adversas pós-vacinação. Por exemplo, a utilização de vacinas da leucemia felina (FeLVj pode provocar reacções pós-vacinação incluindo excesso de salivação, vómitos e diarreia. Ver a monografia sobre a vacina FEL-O-VAX Lv-K em Compendium of Veterinary Products, página 486, Third Edition, 1995-1996. As reacções sistémicas adversas incluem anafilaxia, hipersensibilidade e reacções atípicas como vómitos e diarreia.

Ao contrário do presente conceito inventivo, o estado da técnica atribuiu as reacções sistémicas acima referidas à presença de adjuvantes, endotoxinas, resíduos de detritos celulares, concentração elevada de vírus vivos modificados ou massa antigénica elevada. Dodds, Vaccine Safety and Efficacy Revisited: Autoimmune and Allergic

Diseases on the Rise, Vet. Forum, páginas 68-71, May, 1993 observou um aumento de reacções auto-imunes e alérgicas pós-vacinação. Dodds postulou que o aumento é devido à sobrecarga imunológica em animais susceptíveis expostos a uma vacina de associação contendo organismos vivos modificados e adjuvada, e bacterinas mortas administrada ao mesmo tempo (como o diluente). Dodds também postulou que a sobrecarga imunológica é produzida pelo efeito dos organismos vivos modificados. 3 ΡΕ0764446 A pesquisa de vacinas seguras e eficazes foi limitada pela exiguidade de informação relativa à fonte do problema das reacções pós-vacinação. Não há indicação na literatura ou outras fontes que afirme que estas reacções sistémicas podem ser causadas por uma interacção de albumina não do hospedeiro com um adjuvante. Indicando o contrário está a utilização prevalecente de albumina não do hospedeiro na presença de adjuvantes. Os cães recebem vacina da raiva adjuvada ao mesmo tempo que recebem vacinas de combinação vivas modificadas contendo albumina não do hospedeiro. Os gatos recebem vacina FeLV adjuvada num regime de vacinação compreendendo a administração concomitante de uma vacina viva modificada contendo albumina não do hospedeiro. Além disso, as combinações de albumina e adjuvantes são vulgarmente utilizadas na técnica para avaliar a eficácia de adjuvantes. A albumina, geralmente na forma de albumina de soro de bovino (BSA), é formulada com vários adjuvantes e cada formulação é injectada em animais não bovinos. Os animais são sangrados numa data posterior e os seus soros são medidos quanto a respostas de anticorpos a BSA. Considera-se que os animais que apresentam as melhores respostas de anticorpos são os que receberam os adjuvantes mais eficazes. Prince et al., patente U.S. n° 4 164 565 descreve a utilização de albumina não do hospedeiro como um estabilizador em vacinas. Wiedmeier et al. , Pediatric Research, Vol. 3, páginas 262-267, Setembro, 1987 descreve reactividade em murganhos produzida por imunização com Bordetella pertussis combinada 4 ΡΕ0764446 com albumina bovina. 0 que é de realçar, Wiedmeier et ai. afirmam que a causa de reactividade é a toxina pertussis em associação com albumina.

Para ajudar a reduzir as reacções sistémicas, pode purificar-se vacinas para retirar os seus componentes que se presume causam as reacções sistémicas. As preparações de vacinas para animais são tipicamente purificadas por métodos convencionais tais como filtração, diafiltração ou centrifugação para retirar componentes como células e detritos celulares. Outros métodos de purificação que dão antigénios altamente purificados raramente são utilizados porque têm custos proibitivos na preparação de vacinas para animais. Ilustrativa de outros métodos de purificação é a cromatografia em coluna, incluindo a cromatografia de permuta iónica, a cromatografia em peneiros moleculares e a cromatografia de interacção hidrófoba. Além disso, os antigénios altamente purificados são difíceis de adjuvantar com os adjuvantes vulgarmente utilizados porque não são suficientemente eficazes para estimular uma resposta pro-tectora com antigénios purificados. Em qualquer caso, estes métodos de purificação não foram eficazes para remoção de albumina não do hospedeiro de vacinas ou de precursores seus. A técnica não atribuiu a causa de reacções sistémicas à presença de adjuvantes e albumina não do hospedeiro. Definitivamente, a técnica não atribuiu a causa de reacções sistémicas à presença de albumina não do 5 ΡΕ0764446 hospedeiro no regime de vacinaçao envolvendo a utilização de adjuvantes. A EP 327 305 descreve um método para preparação de uma subdose de vacina recombinante contra infecção por pseudorraiva, em que o vírus é cultivado em soro fetal de bovino e a subdose de vacina é purificada numa coluna de lectina.

Pela presente invenção, constatou-se que a presença de albumina não do hospedeiro numa vacina ou regime de vacinação adjuvados pode provocar reacções sistémicas. Pela presente invenção, é proporcionada uma nova vacina ou regime de vacinação à base de soro que está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro e um método para a sua preparação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com o que foi descrito, a presente invenção abrange uma vacina à base de soro compreendendo uma quantidade imunogenicamente eficaz de um antigénio e um adjuvante em que a referida vacina contém menos do que 1,0 mg/mL de albumina do hospedeiro e está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro. O termo "à base de soro" é aqui utilizado para significar que as vacinas da invenção ou os seus precursores utilizam soro incluindo soro de não hospedeiro. Tipicamente, o soro é utilizado em meio de cultura para aumentar o desenvolvimento dos 6 ΡΕ0764446 organismos que são utilizados na preparação da vacina. Pelo termo "precursor da vacina" significa-se componentes da vacina, particularmente antigénio, proteínas que não o antigénio, organismos inteiros e material de colheita. Pelo termo "quantidade imunogenicamente eficaz" significa-se que o antigénio contém um componente protector numa concentração que é suficiente para proteger animais de uma doença alvo quando uma vacina adjuvada contendo o antigénio é administrada a animais. Pelo termo "antigénio" significa-se um material biológico (natural, recombinante ou sintético) que estimula uma resposta imune protectora em animais. Pelo termo "vacina adjuvada" significa-se uma vacina contendo um adjuvante, ou uma pluralidade de vacinas administradas como parte de um regime de vacinação em que pelo menos uma das vacinas contém um adjuvante. Pelo termo albumina não do hospedeiro significa-se albumina do soro de uma espécie de animal que não a espécie de animal que está a ser vacinada. Albumina é uma proteína simples que se encontra no soro e tem um peso molecular de cerca de 66.000 dalton. Uma vacina que está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro contém menos do que 1,0 mg/mL de albumina não do hospedeiro.

Também está abrangido pela invenção um método de preparação da vacina à base de soro de acordo com as reivindicações que está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro compreendendo a remoção da albumina não do hospedeiro da vacina ou de um seu precursor. Um método de preparação alternativo da vacina à base de soro que está 7 ΡΕ0764446 substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro compreende proporcionar um soro de hospedeiro contendo albumina do hospedeiro na preparação da vacina.

De acordo com a invenção é preparada uma vacina por adição de soro ou albumina do hospedeiro ao antigénio da vacina após colheita ou purificação do antigénio de uma cultura de um organismo a partir do qual deriva o antigénio, mas antes da adjuvantação do antigénio. Adicionalmente, o soro ou albumina do hospedeiro pode ser adicionado ao antigénio após a colheita mas antes da liofilização do antigénio se o antigénio for um organismo vivo modificado. Quando se utiliza soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro desta forma, actua como estabilizador. 0 termo "estabilizador" significa qualquer aditivo que é adicionado a uma vacina para impedir a degradação do antigénio e a perda consequente de imunogenicidade da vacina.

De acordo com as reivindicações, o método de preparação de uma vacina à base de soro contendo uma quantidade imunogenicamente eficaz de um antigénio e um adjuvante em que a referida vacina está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro compreende: (a) cultura de um organismo que produz o antigénio numa cultura contendo albumina não do hospedeiro; (b) colheita da cultura; ΡΕ0764446 (c) clarificação da colheita; (d) separação do antigénio e albumina não do hospedeiro da colheita clarificada; (e) separação da albumina não do hospedeiro do antigénio; (f) colheita do antigénio e adição de soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro; e (g) formulação do antigénio com um adjuvante.

De acordo com as reivindicações, o método de preparação de uma vacina à base de soro contendo uma quantidade imunogenicamente eficaz de um antigénio e um adjuvante em que a referida vacina está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro pode compreender: (a) cultura de um organismo que produz o antigénio numa cultura contendo albumina não do hospedeiro; (b) colheita da cultura; (c) clarificação da colheita; (d) separação do antigénio da albumina não do hospedeiro por passagem da colheita clarificada através de uma coluna com uma matriz que liga selectivamente o antigénio; 9 ΡΕ0764446 (e) lavagem da matriz da coluna para eliminar o excesso de albumina não do hospedeiro; (f) eliminação da solução de lavagem; (g) lavagem da matriz da coluna com uma solução que elui o antigénio da matriz da coluna; (h) recolha do antigénio e adição de soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro; e (i) formulação do antigénio com um adjuvante.

De acordo com as reivindicações, o método de preparação de uma vacina à base de soro contendo uma quantidade imunogenicamente eficaz de um antigénio e um adjuvante em que a referida vacina está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro pode compreender: (a) cultura de um organismo que produz o antigénio numa cultura contendo albumina não do hospedeiro; (b) colheita da cultura; (c) clarificação da colheita; (d) separação do antigénio da albumina não do hospedeiro por passagem da colheita clarificada através de uma 10 ΡΕ0764446 coluna com uma matriz que liga selectivamente a albumina não do hospedeiro; (e) colheita do antigénio, adição de soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro; e (f) formulação do antigénio com um adjuvante.

Também está abrangido pela invenção um processo para estabilização de um antigénio como definido nas reivindicações compreendendo a adição de soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro ao referido antigénio antes da adjuvantação do antigénio. Esse processo para estabilização de um antigénio também pode compreender a adição de soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro ao referido antigénio antes da liofilização do antigénio.

As vacinas da invenção são aplicáveis para utilização na prevenção ou tratamento de doenças de todas as espécies de animais. São particularmente adequadas para utilização na prevenção ou tratamento de doenças de animais de companhia como gatos, cães e cavalos que são particularmente sensíveis a regimes de vacinação adjuvados compreendendo albumina não do hospedeiro. Em particular, as vacinas da invenção são adequadas para utilização na prevenção de leucemia felina (FeLVj e raiva porque estão isentas de problemas que tipicamente estão associados a essas vacinas. As vacinas contra FeLV são notórias por causarem reacções adversas como hipersalivação, vómitos, 11 ΡΕ0764446 diarreia e por vezes a morte. Frequentemente, estas reac-ções ocorrem minutos após a administração da vacina.

Surpreendentemente, verificou-se que animais aos quais foram administradas as vacinas da invenção não têm virtualmente reacções sistémicas adversas. A constatação de que a albumina não do hospedeiro numa vacina contendo um adjuvante ou administrada num regime de vacinação com uma vacina contendo um adjuvante pode provocar reacções sistémicas é por isso uma parte da invenção. Este e outros aspectos da invenção são aqui mais completamente descritos a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um gráfico que apresenta uma compa ração da reactividade de uma vacina contendo um adjuvante combinada com albumina não do hospedeiro com a falta de reactividade de uma vacina contendo um adjuvante em combinação com albumina de hospedeiro. A FIG. 2 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE que compara 9 vacinas felinas diferentes em que está indicado o teor de albumina não do hospedeiro.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Como indicado acima, a presente invenção abrange a preparação de uma vacina à base de soro compreendendo uma 12 ΡΕ0764446 quantidade imunogenicamente eficaz de um antigénio e um adjuvante em que a vacina está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro e métodos para a sua preparação e utilização. Além disso, abrange um processo para estabilização de um antigénio compreendendo a adição de soro de hospedeiro ou albumina de hospedeiro ao referido antigénio antes da adjuvantação do antigénio. Esse processo para estabilização de um antigénio também pode compreender a adição de soro de hospedeiro ou albumina de hospedeiro ao referido antigénio antes da liofilização do antigénio. A albumina não de hospedeiro é derivada de soro não do hospedeiro que é tipicamente utilizado na cultura de organismos a partir dos quais são derivados os antigénios. Exemplos típicos de soro não do hospedeiro (contendo albumina não do hospedeiro) podem ser seleccionados do grupo que consiste em soro de bovino, soro fetal de bovino, soro equino, soro fetal de equino, soro de carneiro e soro de cabra. Por outro lado, se albumina equina estiver presente numa vacina equina, considera-se que a vacina contém albumina do hospedeiro. 0 antigénio é obtido a partir de um organismo seleccionado do grupo que consiste em bactérias, vírus, parasitas, rickettsias e protozoários. Exemplos das bactérias podem ser seleccionados do grupo que consiste em

Bordetella spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Clostridium spp. , Leptospira spp., Escherichia spp. Salmonella spp. , Pasteurella spp. , Mycobacteria spp. 13 ΡΕ0764446

Mycoplasma spp., Moraxella spp., Haemophilus spp., Borrelia spp., Fusobacteria spp., Bacteriodes spp. e Rhodococcus spp.

Exemplos dos vírus podem ser seleccionados do grupo que consiste em vírus do herpes, vírus da para-influenza, reovírus, rotavírus, morbillivírus, retrovírus, coronavírus, adenovírus, togavírus, parvovírus, vírus parapox, paramixovírus, citomegalovírus, arbovírus e hantavírus. Mais especificamente, esses vírus incluiriam mas não estariam limitados a vírus da leucemia felina, rinotraqueíte felina, calicivírus felino, vírus da panleucopenia felina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da peritonite infecciosa felina, hepatite canina, adenovírus tipo 2 canino, parvovírus canino, vírus da raiva, vírus da parainfluenza canina, coronavírus canino, vírus do herpes equino, vírus da influenza equina e vírus da encefalomielite equina. Exemplos de parasitas e protozoários podem ser seleccionados do grupo que consiste em Neospora spp., Toxoplasma spp., Dirofilaria spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp., Babesia spp. e Coccidia spp. . Um exemplo de rickettsias pode ser seleccionado do grupo que consiste em Chlamydia spp., febre do cavalo de Potomac, Ehrlichia canis, e outras Ehrlichia spp..

Os antigénios podem ser obtidos a partir de um membro seleccionado do grupo que consiste em: uma cultura inteira de um organismo como uma colheita de uma cultura inteira, uma colheita de uma cultura inteira parcialmente 14 ΡΕ0764446 purificada, uma subunidade obtida por tecnologia recombi-nante e expressa num organismo homólogo ou heterólogo, um mutante de deleção do organismo inteiro (mutantes convencionais ou com remoção de genes de ADNr), péptidos, ADN nú, antigénios sintetizados quimicamente, ADNc nú transcrito inverso ou combinações destes.

Genericamente, o antigénio pode ser produzido por técnicas conhecidas na técnica de cultura e colheita de organismos, concentração e/ou purificação convencional de antigénios desses organismos. Por exemplo, o antigénio pode ser produzido por: cultura do organismo seleccionado numa cultura com meio de cultura contendo um soro de não hospedeiro (cultura à base de soro). Mais especificamente, o organismo pode ser cultivado numa cultura de tecidos preparada a partir de células de mamíferos ou de plantas em que se adiciona soro de não hospedeiro ao meio para aumentar o crescimento do organismo. 0 organismo também pode ser cultivado em meios de fermentação em que o organismo se desenvolve sem cultura de tecidos mas a que se adicionou um meio de cultura contendo um soro não do hospedeiro. Tipicamente, o soro não do hospedeiro pode ser seleccionado do grupo que consiste em soro fetal de bovino, soro de bovino, soro de vitelo, soro fetal de equino, soro de cavalo, soro de cabra, soro de cordeiro e soro de ovelha. Uma vez completado o desenvolvimento, a cultura é colhida e, se necessário, purificada convencionalmente por exemplo por filtração e/ou ultrafiltração para retirar células, detritos celulares e contaminantes externos. 15 ΡΕ0764446

Contudo, estas técnicas não retiram a albumina não do hospedeiro. Nesta altura, a colheita da cultura ainda contém albumina não do hospedeiro e não seria aceitável se fosse combinada com adjuvante e/ou administrada num regime com uma vacina adjuvada. Por isso, a colheita da cultura resultante é adicionalmente purificada de acordo com esta invenção para retirar a albumina não do hospedeiro antes da sua formulação numa vacina adjuvada.

De acordo com a invenção, a albumina não do hospedeiro pode ser retirada por um processo de purificação da vacina ou de um precursor da vacina de modo a remover a albumina não do hospedeiro. 0 processo de purificação do precursor da vacina pode ser realizado por uma técnica cromatográfica seleccionada do grupo que consiste em cromatografia de perfusão (Perfusion chromatography™, PerSeptive Biosystems), cromatografia de permuta iónica, cromatografia em peneiros moleculares, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade e combinações destas. Preferencialmente, o processo de purificação é por cromatografia de perfusão utilizando matrizes de cromatografia de interacção hidrófoba ou uma combinação de cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de permuta iónica. A seguinte é uma descrição ilustrativa mas não limitativa da cromatografia de interacção hidrófoba com uma matriz de cromatografia de perfusão utilizando meio POROS (Perfusion chromatography™, PerSeptive Biosystems). 16 ΡΕ0764446 A cromatografia de perfusão (Perfusion Chroma-tography™) é realizada utilizando uma matriz (meio POROS) com poros grandes em canais gue transportam moléculas rapidamente para o interior de cada pérola por fluxo convectivo bem como poros de difusão que se ramificam dos poros em canais fornecendo uma área superficial interna grande para ligação. Esta combinação de poros confere grande capacidade, alta resolução e grande velocidade de purificação. A cromatografia de interacção hidrófoba envolve a utilização de grupos polares numa matriz não carregada para interactuar com resíduos polares (e.g. fenilalanina) em proteínas, provocando retardação e separação de proteínas com base nas suas hidrofobias relativas. A utilização da matriz de meio POROS permite caudais muito maiores a pressões mais altas pelo que o tempo de purificação é reduzido, reduzindo assim os custos e permitindo que a cromatografia seja rentável para produtos veterinários . A cromatografia de interacção hidrófoba é realizada por adição de um tampão com força iónica alta a fluidos da colheita da cultura contendo a albumina não do hospedeiro antes da adição desses fluidos à coluna hidrófoba. A coluna é lavada várias vezes com um tampão de força iónica alta como fosfato de sódio 20 milimolar (Mm)/sulfato de sódio 650 Mm antes da adição dos fluidos tamponados com força iónica alta da colheita da cultura contendo a albumina não do hospedeiro (material de alimentação à coluna) . Faz-se passar através da coluna 17 ΡΕ0764446 múltiplos volumes de coluna de material de alimentação à coluna. A matriz da coluna fixa ambos a albumina não do hospedeiro e o antigénio (contidos nos fluidos tamponados da colheita da cultura). Para eluir da coluna a albumina não do hospedeiro, a coluna é lavada múltiplas vezes com um tampão de força iónica alta como fosfato de sódio 20 Mm/sulfato de sódio 650 Mm ou até que a leitura da densidade óptica a um comprimento de onda de 280 nanometros (nm) do eluído seja inferior a 0,03. O antigénio (purificado) é eluído da coluna por lavagem da matriz da coluna com múltiplos volumes de uma solução com baixa força iónica que pode ser água estéril. O antigénio purificado é recolhido num recipiente de recolha separado quando a densidade óptica do eluído aumentar acima de 0,15. A colheita do eluído cessa quando a densidade óptica do eluído cair abaixo de 0,10.

Outro método para remoção da albumina não do hospedeiro de acordo com esta invenção abrange a utilização de cromatografia de afinidade para fixação ou do antigénio ou da albumina não do hospedeiro. Por exemplo, o antigénio pode ser produzido por técnicas conhecidas na técnica de cultura e colheita de organismos e clarificação, concentração e/ou purificação convencional de antigénios desses organismos como descrito anteriormente. Para remoção da albumina não do hospedeiro a colheita clarificada pode ser adicionada a uma coluna contendo uma matriz que fixa o antigénio ou que fixa a albumina não do hospedeiro. Essa matriz pode ser uma lectina como CibaCron™ Blue (Pharmacia) 18 ΡΕ0764446 ou Mimetic Blue (Affinity Chromatography Ltd.), de que ambas fixam a albumina não do hospedeiro, ou uma matriz que contém um anticorpo policlonal ou monoclonal especifico para o antigénio ou albumina não do hospedeiro, consoante o que é para ser fixado à matriz. A colheita clarificada torna-se o material de alimentação à coluna e é adicionado à coluna. Se a coluna contiver uma matriz como uma lectina, um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal especifico para albumina não do hospedeiro, a albumina não do hospedeiro é ligada à coluna e o antigénio passa através da coluna e é recolhido. 0 antigénio recolhido é então formulado com adjuvante para preparar uma vacina. Se a coluna contiver uma matriz como um anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal especifico para o antigénio, o material da colheita clarificado é adicionado à coluna e o antigénio liga-se à matriz. A albumina não do hospedeiro passa através da coluna e é eliminada. 0 excesso de albumina não do hospedeiro é removido da matriz da coluna por lavagem com um tampão que não remove o antigénio. Depois a matriz é lavada com uma solução que elui o antigénio da matriz da coluna. Esses tampões de lavagem e eluição podem basear-se em diferenças de pH, força iónica ou polaridade do antigénio a ser eluido. 0 antigénio é então recolhido e formulado com um adjuvante para produzir a vacina. Se se utilizar uma lectina para ligar albumina não do hospedeiro, o antigénio que é recolhido terá de ser adicionalmente purificado através de uma segunda coluna de lectina ou por utilização de outro tipo de cromatografia para eliminar toda a albumina não do hospedeiro. 19 ΡΕ0764446

Se se tiver um organismo inteiro como um virus ou bactéria ou um antigénio muito grande, por exemplo, um com um peso molecular maior que 100.000 dalton, pode utilizar-se cromatografia em peneiros moleculares para separar o antigénio da albumina não do hospedeiro que tem um peso molecular de apenas cerca de 66.000 dalton. A cromatografia em peneiros moleculares separa as moléculas com base no peso molecular. A matriz é seleccionada de modo que as moléculas de baixo peso molecular como albumina não do hospedeiro passem através da coluna a uma velocidade maior do que moléculas de peso molecular elevado como antigénios grandes. Utilizando está técnica, o organismo é cultivado numa cultura contendo albumina não do hospedeiro e colhida, clarificada e/ou concentrada e purificada por técnicas convencionais como descrito anteriormente. Para separar a albumina não do hospedeiro de, por exemplo, um virus inteiro, o virus é cultivado em cultura de tecidos, colhido por recolha dos fluidos da cultura de tecidos e clarificado para eliminar os detritos celulares. Esta colheita clarificada é o material de alimentação da coluna e é adicionado à coluna. O primeiro fluido a passar através da coluna é recolhido e eliminado uma vez que contém a albumina não do hospedeiro. O virus passa através da coluna mais lentamente e pode ser lavado para um reactor de colheita utilizando tampões que não lesam o virus. O virus que foi colhido desta maneira pode ser formulado com um adjuvante para preparar uma vacina. 20 ΡΕ0764446

Um método alternativo para preparação da vacina à base de soro contendo um quantidade imunogenicamente eficaz de um antigénio e de um adjuvante em que a referida vacina está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro compreende a cultura do organismo em soro de hospedeiro em que não há albumina não do hospedeiro. Por este método, cultiva-se o organismo em cultura de tecidos ou meio de fermentação contendo soro do hospedeiro em vez de soro não do hospedeiro. Pode utilizar-se colheita, concentração e purificação convencionais se se deseja um produto puro. Não é necessária purificação adicional para remover albumina não do hospedeiro porque a preparação não contém albumina não do hospedeiro. Por este método, o material colhido em bruto também pode ser utilizado para formular a vacina. Utilizando este método o material da colheita pode ser simplesmente combinado com adjuvante para formular a vacina.

Após a purificação e/ou remoção da albumina não do hospedeiro ou cultura do organismo em soro do hospedeiro, o antigénio é inactivado e adjuvado por técnicas convencionais. De modo genérico, o antigénio pode ser inactivado pelo seu tratamento com um agente inactivante que não desnature o componente protector do antigénio. Especificamente, o antigénio pode ser inactivado pelo seu tratamento quimicamente, por irradiação, por aquecimento ou por congelação-descongelação. A titulo ilustrativo, pode utilizar-se agentes inactivantes químicos seleccionados do grupo que consiste em formol, beta-propiolactona, tenso- 21 ΡΕ0764446 activos e etilenoimina binária. Destes agentes inactivantes químicos são preferidos agentes diferentes para diferentes organismos. 0 antigénio inactivado também pode ser concentrado ou combinado com outro antigénio colhido antes da adjuvantação. A quantidade de concentração seria tal que a quantidade média de antigénio ou valor da potência relativa (Relative Potency, RP) cumpre ou excede o valor aceitável mínimo para uma vacina. 0 antigénio inactivado pode ser concentrado até 100 vezes, se necessário, por ultrafiltra-ção com um corte de peso molecular que vai manter adequadamente o antigénio e vai permitir a passagem dos contami-nantes e a sua eliminação por centrifugação diferencial. Depois da inactivação, o valor do antigénio tem de estar acima do nivel mínimo aceitável ou RP. Depois é armazenado a temperaturas desde -70°C a +10°C até ser misturado ou microfluidisado com um adjuvante. O antigénio inactivado é formulado ou combinado com um adjuvante. Os adjuvantes são componentes químicos ou derivados de bactérias ou vírus adicionados às vacinas para aumentar a produção de uma resposta imune pelo animal que recebe a vacina. Os adjuvantes classificam-se nas categorias gerais de polímeros, copolímeros de blocos, óleos, óleo-em-água, sais de alumínio, e extractos bacterianos e virais. A maioria dos adjuvantes actua por produção de uma irritação no sítio de injecção fazendo com que os leucócitos (células imunes) infiltrem a área e/ou por 22 ΡΕ0764446 produção de um efeito de depósito (mantendo os antigénios no sitio da injecção durante tanto tempo quanto possível). Alguns dos adjuvantes mais novos actuam como mecanismos de libertação lenta, libertando antigénios encapsulados por eles a uma taxa relativamente lenta. Mesmo os adjuvantes mais novos afectam directamente as células B ou células T do sistema imune e são chamados estimuladores imunes, reguladores imunes, moduladores imunes ou intensificadores imunes. Se um adjuvante causa infiltração extensa de leucócitos no sítio da injecção, ocorrerão inchaço e reacções no sítio da injecção. A resposta imune a adjuvantes também pode aumentar a reactividade a contaminantes como endotoxi-nas, aumentando assim a probabilidade de reacções sistémicas como anafilaxia. Portanto, embora os adjuvantes sejam necessários para estimulação da resposta imune por vacinas inactivadas, podem produzir efeitos secundários nocivos. 0 adjuvante é seleccionado do grupo que consiste em polímeros, copolímeros de blocos, óleos, óleo-em-água, água-em-óleo, sais de alumínio, imunomoduladores e as suas combinações. Preferencialmente, o adjuvante é um polímero ou um copolímero de blocos. 0 adjuvante pode ser utilizado numa quantidade desde 0,01% a 50%. A quantidade de adjuvante está estritamente correlacionada com o tipo de adjuvante utilizado. Contudo, é importante que o adjuvante seja utilizado numa quantidade eficaz para estimular imuno-genicamente os antigénios inactivados. Quando utilizados nessa quantidade, os adjuvantes podem estimular reacções adversas a albumina não do hospedeiro. 23 ΡΕ0764446

Após a inactivação e adjuvantação do antigénio, a potência ou potência relativa (RP) do antigénio pode ser ajustada para um nivel apropriado que cumpre ou excede a quantidade aceitável mínima para produzir uma vacina imunogenicamente eficaz. Os ensaios utilizados para ensaiar essa potência ou potência relativa estão aqui descritos adiante. 0(s) antigénio(s) pode(m) ser formulado(s) com outros antigénios. Por exemplo, vírus de leucemia felina inactivado e adjuvado preparado de acordo com a invenção pode ser formulado com calicivírus felino, vírus da panleucopenia felina, vírus da rinotraqueíte felina e clamídia felina. Além disso, o vírus da raiva inactivado e adjuvado preparado de acordo com a invenção pode ser formulado com parvovírus canino, vírus da esgana canina, vírus da parainfluenza canina, adenovírus de tipo 2 canino e vários Leptospira spp. Além disso, vírus equinos e antigénios bacterianos inactivados e adjuvados podem ser preparados de acordo com a invenção. Alguns ou todos estes antigénios adicionais podem ser preparados de acordo com a presente invenção. Alguns dos antigénios adicionais podem ser modificados vivos. Contudo, as vacinas da combinação final estarão substancialmente isentas de albumina não do hospedeiro se a vacina de combinação ou regime de vacinação em que é administrada a vacina de combinação contiver um adjuvante. A vacina adjuvada resultante que está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro é segura e eficaz e pode ser administrada a animais essencialmente sem reacções sistémicas adversas pós-vacinação. 24 ΡΕ0764446

Como medida da potência da vacina que equaciona com a protecção da vacina no animal hospedeiro, cada lote individual de antiqénio (em bruto ou purificado) e série da vacina é submetido a ensaios. A determinação pode envolver a vacinação de animais de laboratório ou animais hospedeiros seguida por um desafio dos animais, vacinação de animais de laboratório ou animais hospedeiros seguida por avaliação de uma resposta serológica ou a realização de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para determinas a quantidade de antigénios da vacina. É preferido um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) porque elimina os ensaios com animais. Neste último método, a concentração de antigénios na vacina de teste é determinada em relação ao teor de antigénio numa vacina de referência que de demonstrou ser protectora no animal hospedeiro. Considera-se que uma vacina de teste que dá 1,0 em comparação com a vacina de referência é potente e diz-se que tem uma potência relativa (RP) de 1,0. A RP pode ser determinada antes ou depois de o antigénio ter sido colhido, purificado, inacti-vado ou adjuvado. Antes da inactivação e adjuvantação, a RP tem de ser superior 1 1,0 para que após a inactivação e adjuvantação não baixa para um valor inferior a 1,0. 0 antigénio purificado pode ser concentrado ou combinado com outro antigénio colhido purificado de tal modo que a quantidade média de antigénio cumpra ou exceda o valor aceitável mínimo para uma colheita. O antigénio purificado pode ser concentrado até 100 vezes, se necessário, por ultrafiltração com um corte de peso molecular 25 ΡΕ0764446 que vai manter adequadamente o antigénio e vai permitir a passagem dos contaminantes e a sua eliminação por centrifugação diferencial. É importante notar que mesmo que se utilize níveis muito baixos de soro para aumento do desenvolvimento, é virtualmente impossível remover o seu teor de albumina de culturas do organismo ou vacinas por processos de purificação convencionais, especialmente se se utilizar concentração. Por exemplo, se o antigénio for concentrado 100 vezes, um nível de albumina não do hospedeiro de 0,1% (1 mg/mL) de antigénio antes da concentração seria concentrado para 10% ou 100 mg/mL após concentração. Esse nível seria totalmente inaceitável na vacina final.

Como se depreenderia do que foi referido ante-riormente, uma clara característica da invenção é a constatação da fonte do problema de reacções sistémicas adversas pós-vacinação e as soluções para o problema. Sem ficar limitado por qualquer teoria particular, crê-se que as reacções sistémicas adversas pós-vacinação resultam da presença de adjuvantes e albumina não do hospedeiro em vacinas ou regimes de vacinação. É assim encontrada e descrita uma solução que inclui a remoção da albumina não do hospedeiro de vacinas que contêm um adjuvante ou que são administradas em regimes de vacinação que contêm vacinas adjuvadas ou que utilizam soro de hospedeiro para preparação de antigénios em vez de soro não do hospedeiro e a administração de vacinas e regimes de vacinação que estão substancialmente isentos de albumina não do hospedeiro. 26 ΡΕ0764446

Estes e outros aspectos da invenção são adicionalmente ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos. Nos exemplos e ao longo da especificação, as partes são em peso salvo indicação em contrário.

EXEMPLOS EXEMPLO 1:

Para avaliar se havia uma diferença de reacti-vidade em vacinas equinas preparadas com soro não do hospedeiro (soro fetal de bovino como abordagem convenc-onal) ou vacinas equinas preparadas com soro de hospedeiro (soro fetal de equino) preparou-se duas vacinas simuladas. Uma vacina continha meio adjuvado com 15% de soro fetal de bovino (abordagem do soro não do hospedeiro) enquanto que a segunda vacina continha 15% de soro fetal de equino (soro do hospedeiro). Utilizou-se vinte cavalos neste estudo. 0 adjuvante nas duas abordagens era do mesmo lote de material e era um adjuvante à base de "Carbopol". Dez cavalos receberam cada um uma dose de 2,0 mL da vacina simulada contendo soro fetal de bovino injectada intramuscularmente no pescoço e cada um de dez cavalos adicionais recebeu uma dose de 2,0 mL da vacina simulada contendo soro fetal de equino injectada intramuscularmente no pescoço. Administrou-se uma injecção de reforço das vacinas respectivas de 28 em 28 dias durante aproximadamente 8 meses. Os cavalos foram observados quanto às reacções aos dias 1, 2, 3, 4, 7 e 14 após cada injecção. Imediatamente antes da segunda 27 ΡΕ0764446 injecção, um dos cavalos que estava a receber a preparação com soro fetal de bovino morreu devido a contorção do intestino. Os 9 cavalos restantes receberam uma injecção de reforço e foram observados após as doses de reforço da vacina simulada contendo soro fetal de bovino. Os resultados destas observações estão apresentados na Figura 1.

Após a administração de todas as injecções da vacina simulada contendo soro fetal de equino, não houve reacções sistémicas (0 em 480 observações possíveis). Só se observou 2 em 480 casos possíveis de inchaço com 4" ou mais de diâmetro. O inchaço ocorreu em 2 observações consecutivas do mesmo cavalo depois de receber 4 injecções. Obser-vou-se inchaço com 1-3" de diâmetro em 3 de 480 observações possíveis . Observou-se trinta e uma (31) reacções de qualquer tipo em 480 observações possíveis. Todas as reacções ocorreram só em 1 dos 10 cavalos (10%) até à vacinação # 8 após o que 2 dos 10 cavalos apresentaram uma reacção local. Comparativamente, depois da administração de todas as injecções da vacina simulada com soro fetal de bovino, havia uma possível reacção sistémica (a morte do cavalo #606). Observou-se inchaço grave (maior do que 4" de diâmetro) em 22 de 432 observações possíveis. Observou-se inchaço visível (1-3" de diâmetro) em 34 de 432 observações possíveis. Observou-se cento e quarenta e seis 146) reacções em 432 observações possíveis. Oito dos restantes 9 cavalos (89%) apresentaram reactividade por vacinação #8 com 5 de 9 cavalos a reagir rotineiramente depois de cada vacinação. Estes dados indicam que na repetição de injecções com vacinas adjuvadas, a presença de soro não do 28 ΡΕ0764446 hospedeiro (soro fetal de bovino em vacinas equinas) provoca consideravelmente mais reacção do que a presença de soro de hospedeiro (soro fetal de equino). EXEMPLO 2A:

Cultivou-se células CRFK (Crandell Feline Kidney) infectadas persistentemente com FeLV a 95% da confluência como se segue. As células foram cultivadas em frascos rolantes de 850 cm^ incubados com rotação a 37°C. Como meio de cultura utilizou-se meio essencial mínimo de Dulbecco com teores elevados de glucose (DMEM-Hi) contendo 10% de soro fetal de bovino e 30 pg/mL de neomicina. Depois de as células atingirem a confluência, o meio foi mudado para meio de manutenção (meio DMEM-Hi contendo 5% de soro fetal de bovino) . Após quatro dias este meio foi decantado e os fluidos virais foram colhidos. As células foram realimen-tadas com meio de manutenção e os fluidos virais foram recolhidos a intervalos de três a quatro dias para um total de sete colheitas. Os fluidos virais decantados de cada colheita foram testados quanto a esterilidade, aliquotados em recipientes de plásticos estéreis e armazenados congelados a -70°C. Após teste de esterilidade satisfatório, os fluidos virais foram descongelados à temperatura ambiente e combinados num mesmo recipiente de colheita estéril. Os fluidos virais foram clarificados através de uma filtro de polipropileno de 3 micrometros para eliminar os detritos celulares e depois concentrados 10 vezes utilizando um dispositivo de ultrafiltração de fluxo tangencial com um corte de peso molecular de 30.000 dalton. Os fluidos foram 29 ΡΕ0764446 então lavados em Na2HPC>4 50 Mm até um factor de concentração final de 9 vezes. O concentrado combinado tinha um teor de proteínas totais de 16,59 mg/mL.

Utilizou-se inicialmente uma coluna de cromato-grafia de permuta catiónica para purificar o vírus e as suas subunidades a partir do remanescente dos fluidos. Uma coluna de um litro, 14 cm x 10 cm foi empacotada com resina cromatográfica Q Sepharose Pharmacia) e limpa com dois volumes de coluna de NaOH 1 M. Além disso, os acessórias da coluna, como bombas, tubos e adaptadores da coluna foram limpos com NaOH 1 Μ. A coluna e todos os acessórios foram depois lavados com um tampão de Na2HP04 50 mM (pH 7,0) até o efluente da coluna estar a pH 7,0. Todos os tampões foram esterilizados com um filtro de 0,2 pm antes da utilização. Como equipamento utilizou-se um sistema de cromatografia BioPilot (Pharmacia) para todo este processo.

Uma amostra de 1500 mL dos fluidos virais concentrados de FeLV (material de alimentação da coluna) foi injectada na coluna. A coluna foi lavada com 9 volumes de coluna de Tampão A (Na2HPC>4 50 mM) a 80 mL/min antes da eluição do vírus com um gradiente linear de Tampão B (Na2HPC>4 50 mM, NaCl 1 M) desde 0% a 50% de Tampão B em 10 volumes de coluna. Realizou-se uma eluição final de vírus residual com 5 volumes de coluna de 100% de Tampão B. As fracções eluídas da coluna foram colhidas e examinadas quanto ao teor de proteínas totais. O teor de proteínas totais era de 3,12 mg/mL. Aproximadamente metade deste seria albumina não do hospedeiro. As fracções contendo o 30 ΡΕ0764446 vírus foram então combinadas e recromatografadas numa coluna de interacção hidrófoba para eliminar o teor remanescente da albumina não do hospedeiro.

Adicionou-se sulfato de amónio às fracções de vírus eluídas da coluna de Q Sepharose (que ainda continha > 1 mg/mL de albumina não do hospedeiro) para dar uma concentração final de 0,5 M. Este material de alimentação da coluna da fracção de vírus foi carregado numa coluna de interacção hidrófoba com 1 litro de fenil sepharose com baixo grau de substituição que tinha sido previamente equilibrada com Na2HP04 50 mM. A coluna foi lavada com uma combinação de Na2HPC>4 50 mM e (NH4)2S04 0,5 M para 5 volumes de coluna. O vírus foi então eluído da coluna com um tampão de Na2HPC>4 50 mM. As fracções de vírus eluídas da coluna foram testadas quanto a esterilidade, teor de proteínas totais e de albumina não do hospedeiro. Todas as fracções de vírus eram estéreis, o teor de proteínas totais estava entre 0,9 e 1,2 mg/mL e o teor de albumina não do hospedeiro era inferior a 0,5 mg/mL. A fracção virai (fluidos) foi inactivada com 0,03% de formol e formulada em vacinas por combinação com 5% de adjuvante POLYGEN™ (obtido de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), 0,25% de glicerol/estabilizador EDTA e 30 pg/mL de nistatina (FLV011) ou 0,125% de adjuvante carbopol, 0,25% de glicerol/estabilizador EDTA e 30 pg/mL de nistatina (FLV009).

Gatos com dez a doze semanas de idade foram imunizados com uma dose de um mL de vacina subcutaneamente. Três semanas depois administrou-se aos gatos uma imunização 31 ΡΕ0764446 de reforço de um mL. Os gatos foram desafiados dez dias após o reforço com vírus de leucemia felina virulenta. Este desafio foi realizado como se segue: 1) os gatos foram imunossuprimidos com 10 mg/kg de peso corporal de acetato de metilprednisolona intramuscularmente durante dois dias sucessivos; e 2) os gatos foram desafiados com aproximada-mente 1,5 x 10^ unidades formadoras de focos (UFF) de vírus de leucemia felina virulenta intranasalmente em cada dia de imunossupressão. Os gatos foram verificados ao dia 15 e dia 1 antes da exposição ao desafio para assegurar que não estavam já infectados com FeLV ou que não eram portadores. Com início três semanas após o desafio, recolheu-se sangue dos gatos durante nove semanas sucessivas e examinou-se quanto a antigénio "p27e" por um ensaio de imunofluores-cência indirecto. Todos os resultados dos gatos vacinados e de controlo estão apresentados na Tabela 1. Um resultado de teste positivo para um gato foi definido como três semanas consecutivas de viremia ou cinco semanas de viremia durante o período de doze semanas. Os resultados indicam que 100% dos gatos vacinados com vacina "FLV011" e setenta por cento dos gatos vacinados com vacina "FLV009" estavam protegidos do desafio, enquanto que 81 por cento dos gatos de controlo foram infectados pela dose de desafio. Esta é igual ou melhor do que a protecção oferecida por vacinas FeLV comerciais produzidas convencionalmente mas reactivas que protegem desde 15 a 80 por cento dos gatos vacinados num desafio de intensidade semelhante. Esta série de vacinas FLV009 tornou-se o padrão de referência para ensaios por ELISA futuros e, por definição, contém um RP de 1,0. 32 ΡΕ0764446 TABELA 1: ESTUDO DE VACINAÇÃO CONTRA VÍRUS DA LEUCEMIA FELINA/DESAFIO - DETECÇÃO DE VIREMIA PERSISTENTE POR DETERMINAÇÃO DE p27

Grupo de teste N° Cat. D-15 D-l D-34 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 S 10 S 11 S 12 VL-2 — — — — — — _ — _ _ — — — VM3 VQ2 W$ FVL VX2 — — — + + + + + + + + + + 009 WC1 WE3 — — — + + + + + + + + + + WF6 WH5 WK3 - - - + + + + + + + - - - VL5 VN1 VW3 VY4 FLV WD2 011 WF1 WG3 WJ4 WL5 VT5 33 ΡΕ0764446

TABELA 1-CONTINUAÇÃO

Grupo de teste N° Cat. D-15 D-l D-34 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 S 10 S 11 S 12 Cont VL1 _ VM2 _ — + + + + + + + + + + VQ1 _ W3 _ + + + + + + + + + + VX1 _ _ + + + + + + + + + + WB _ _ + + + + + + + + + + WE2 _ — + + + + + + + + + + WF3 _ _ + + + + + + + + + + WH4 _ _ + + + + + + + + + + WJ6 _ _ _ + + + + + + + + + + Wl - - - + + + + + + + + + +

Cont = CONTROLOS, D = DIA, S = SEMANA PÓS-DESAFIO D 34 = Dia do desafio

Dados expressos como resultados de Anticorpos por Fluorescência Indirecta (IFA). EXEMPLO 2B: A vacina do EXEMPLO 2A foi avaliada quanto à segurança por 21 veterinários em ensaios clínicos de campo realizados em cinco estados. Foi administrado um total de 913 doses de vacina a 850 gatos com idades entre 8 semanas e 15 anos. Foi pedido aos veterinários especificamente que registassem quaisquer reacções sistémicas e as circunstân- 34 ΡΕ0764446 cias em torno dessas incidências caso ocorressem. Só foi registada uma reacção sistémica. Esta reacção ocorreu num gato gue recebeu uma vacina de combinação felina viva modificada concomitante que continha albumina não do hospedeiro. Consequentemente, concluiu-se que a vacina FeLV vacina era segura e que a reactividade sistémica da vacina pode ser eliminada por administração de vacinas que não contêm uma combinação de albumina não do hospedeiro e um adjuvante quer administrados na mesma vacina ou quer administrados numa vacina concomitante como parte de um regime de vacinação. EXEMPLO 3:

Cultivou-se células CRFK infectadas persistentemente com FeLV a 95% da confluência em DMEM-Hi contendo 10% de soro fetal de bovino e 30 pg/mL de neomicina utilizando frascos rolantes de 850 cm^ incubados com rotação a 37°C como no EXEMPLO 2A. Depois de as células terem atingido a confluência, o meio foi mudado para meio de manutenção (meio DMEM-Hi contendo 5% de soro fetal de bovino). Após quatro dias, este meio foi decantado e os fluidos virais foram recolhidos. As células foram realimentadas com meio de manutenção e os fluidos virais foram recolhidos a intervalos de três a quatro dias para um total de sete colheitas. Os fluidos virais decantados de cada colheita foram testados quanto a esterilidade. Verificou-se que todos os fluidos virais eram estéreis. Os fluidos virais de cada colheita foram aliquotados em recipientes de plásticos 35 ΡΕ0764446 estéreis e armazenados congelados a -70°C. Após teste de esterilidade satisfatório, os fluidos virais foram descongelados à temperatura ambiente e combinados num mesmo recipiente de colheita estéril. 0 teor de proteínas totais desta FeLV combinada era de 2,5 mg/mL. Os fluidos virais foram clarificados através de uma filtro de polipropileno de 5 micrometros e de 1 micrometro para eliminar os detritos celulares.

Os fluidos virais clarificados (material de alimentação à coluna fluidos da colheita) foram purificados para remover a albumina não do hospedeiro por utilização de uma técnica de purificação compreendendo Cromatografia de Perfusão™ utilizando uma matriz de cromatografia de interacção hidrófoba. A matriz utilizada foi obtida de PerSeptive Biosystems e foi o seu meio POROS PE 50. Esta técnica utiliza grupos polares numa matriz não carregada para interactuar com resíduos polares (e.g. fenilalanina) em proteínas, provocando a retardação e separação de proteínas com base nas suas hidrofobias relativas. Esta interacção foi aumentada por adição de sulfato de sódio/fosfato de sódio de alta força iónica aos fluidos virais antes da sua adição à coluna hidrófoba. A coluna foi lavada com três volumes de coluna de um tampão contendo 20 mM de fosfato de sódio, 650 mM de sulfato de sódio antes da adição do material de alimentação da coluna fluido da colheita. Foi então passado através da coluna o equivalente a cinco volumes de coluna de material de alimentação da coluna fluido da colheita (antes da diluição com sulfato de 36 ΡΕ0764446 sódio/fosfato de sódio). Para eluir da coluna a albumina não do hospedeiro, a coluna foi lavada com cinco volumes de coluna de fosfato de sódio 20 mM/sulfato de sódio 650 mM ou até a leitura da densidade óptica do eluido ser < 0,03 a um comprimento de onda de 280 nm. Os componentes virais purificados resultantes foram eluidos da coluna por lavagem da resina da coluna com cinco volumes de coluna de água estéril. As fracçóes virais purificadas foram recolhidas num recipiente de recolha separado quando a densidade óptica (a 280 nm) do eluido aumentou acima de 0,15 e a recolha do eluido cessou quando a densidade óptica do eluido caiu abaixo de 0,10.

Os fluidos virais purificados foram testados quantitativamente quanto ao teor de proteínas totais e qualitativamente por SDS-PAGE quanto ao teor de albumina não do hospedeiro. O teor de proteínas totais era 1,35 mg/mL e o teor de albumina não do hospedeiro era inferior a 0,5 mg/mL. Para eliminar os sais em excesso que são retidos pelos fluidos virais purificados, estes fluidos foram diafiltrados com dez volumes de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco utilizando dispositivo de ultrafil-tração de fluxo tangencial com um corte de pesos moleculares de 30.000 dalton. Os fluidos foram concentrados nesta altura para se obter uma concentração final de FeLV gp7 0 suficiente para os lotes de vacina. Os fluidos virais foram inactivados com 0,03% de formalina durante 72 horas a 4°C. A vacina da leucemia felina foi produzida a 37 ΡΕ0764446 partir de fluidos virais inactivados, purificados, por adição de 0,125 mg/mL de Carbopol, 0,25% de glicerol/EDTA e 30 pg/mL de nistatina aos fluidos virais inactivados a uma concentração suficiente para ser imunogenicamente eficaz quando combinada com o adjuvante. Esta vacina foi comparada com a vacina do EXEMPLO 2A utilizando um ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática) para medir a potência (eficácia imunogénica). Este ELISA determina a quantidade de componente antigénico na vacina de FeLV em comparação com um padrão de referência. O padrão de referência é a vacina descrita nos EXEMPLOS 2A e 2B (FLV 009), que se demonstrou que protege gatos num estudo de vacinação/desafio. Um resultado de 1,00 no ELISA indica que a quantidade de componente antigénio protector de FeLV na vacina a ser testada é equivalente ao da vacina dos EXEMPLOS 2A e 2B e protegerá igualmente bem os gatos. A vacina deste exemplo demonstrou uma potência de 1,32. Continha um teor de proteínas de 1,1 mg/mL com albumina não do hospedeiro não detectável.

Fica assim demonstrado que a passagem de material de colheita de FeLV contendo albumina não do hospedeiro através de apenas uma matriz hidrófoba pode retirar a albumina e ser utilizada para produzir uma vacina imunogenicamente eficaz. EXEMPLO 4:

Foram formuladas seis vacinas simuladas contendo só 5% de fracção V de albumina de bovino (albumina nao do 38 ΡΕ0764446 hospedeiro) diluída em soro fisiológico tamponado com fosfato e combinadas com diferentes adjuvantes. As formulações de vacina foram administradas a cinquenta e oito (58) gatos com aproximadamente 22-26 semanas de idade que tinha pre-viamente recebido duas doses de uma vacina combinada de vírus de rinotraqueíte-vírus de panleucopenia mortos que continha proteínas do soro de componentes da cultura de tecidos. Os gatos também tinham sido vacinados com uma vacina purificada da leucemia felina contendo albumina não do hospedeiro não detectável. Os gatos foram aleatoriamente atribuídos aos grupos de vacina com albumina não do hospedeiro/adjuvante e foram imunizados com uma dose de 1,0 mL dose de vacina semanalmente durante 3 semanas consecutivas. Foram efectuadas observações diárias para avaliação da reactividade. Os resultados destas observações estão apresentados na TABELA 2. Aproximadamente seis horas após a vacinação da primeira semana, dois gatos apresentaram sinais clínicos de reacções sistémicas. As vacinações administradas a estes gatos eram de duas formulações diferentes de albumina não do hospedeiro/adjuvante. Os sinais clínicos incluíam fraqueza e descoordenação, vocalização, vómitos com espuma manchada de sangue, extremidades com cianose, membranas mucosas pálidas com tempo de reenchimento dos capilares atrasado (3,5 segundos), hipersalivação e hipe-rapneia. O tratamento com dexametasona e líquidos subcutâneos pouco aliviou os sintomas. Estes dois gatos foram subsequentemente eutanizados. 39 ΡΕ0764446

Aproximadamente quatro horas depois da segunda injecção semanal, mais um gato demonstrou sinais mais moderados de uma reacção sistémica à vacinação. Os sinais clínicos associados a este animal incluíram letargia, membranas mucosas vermelhas, pavilhão auditivo cianó-tico/avermelhado e olhos inchados. Esta experiência prova que a reactividade invulgar usualmente associada a vacinas FeLV (vómitos e diarreia) pode ser reproduzida por uma combinação de albumina não do hospedeiro com um adjuvante. A taxa de reacção que foi demonstrada nesta experiência parece baixa. Contudo, na situação clínica, essas reacções só são observadas em menos do que 1,0% dos gatos. Esta experiência demonstrou uma taxa de reacção de 2,0% se todos os gatos forem incluídos nos cálculos.

TABELA 2: DEMONSTRAÇÃO DE QUE ALBUMINA NÃO DO HOSPEDEIRO EM COMBINAÇÃO COM ADJUVANTES PRODUZ REACÇÕES SISTÉMICAS EM ANIMAIS VACINA ADJUVANTE QUANTIDADE DE N° DE REACÇÕES DOS GATOS NÚMERO ADJUVANTE S 1 S 2 S 3 1 NENHUM N/A 0/8 0/8 0/8 2 ADJUVANTE B 50% 0/12 1/12 0/12 3 CARBOPOL 0,125 mg/mL 1/8* 0/7 0/7 4 CARBOPOL 0,25 mg/mL 0/6 0/6 0/6 5 HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO 10% 0/8 0/8 0/8 6 EMULSIGEN 5% 0/8 0/8 0/8 7 POLYGEN 5% 1/8* 0/7 0/7 40 ΡΕ0764446 EXEMPLO 5:

As vacinas felinas de combinação pentavalentes preparadas a partir de vírus vivos modificados ou inacti-vados de rinotraqueíte felina, calicivírus felino, panleu-copenia felina, clamídia felina e leucemia felina são conhecidas na técnica e também estão associadas à reacti-vidade descrita anteriormente. Preparou-se uma vacina de combinação inactivada de rinotraqueíte felina, calicivírus felino, panleucopenia felina, clamídia felina e leucemia felina de acordo com esta invenção. Os componentes antigénicos protectores do vírus da rinotraqueíte felina, calicivírus felino, vírus da panleucopenia felina e vírus da clamídia felina foram cultivados individualmente em cultura de tecidos sem a utilização de soro ou albumina. Os componentes antigénicos protectores foram colhidos e todos continham detritos celulares. Os fluidos das colheitas individuais foram clarificados através de filtros de 3 pm, inactivados individualmente com etilenoimina binária 0,1 M e adjuvados individualmente com 5% de Polygen™. A leucemia felina utilizada nesta combinação foi a preparada no EXEMPLO 3. Os componentes individualmente inactivados e adjuvados foram combinados em proporções adequadas para produzir uma dose com volume de 1,0 mL. Demonstrou-se que os cinco componentes antigénicos protectores eram imunoge-nicamente eficazes testando em testes ELISA específicos como descrito no EXEMPLO 3. O componente da rinotraqueíte felina tinha uma RP de 1,12 em comparação com uma vacina com um valor de 1,0 que protegeu 100% dos gatos num teste 41 ΡΕ0764446 de vacinação/desafio grave. 0 componente do calicivírus felino demonstrou uma RP de 1,6 9 em comparação com uma vacina com um valor de 1,0 que protegeu 100% dos gatos num teste de vacinação/desafio grave. O vírus da panleucopenia felina apresentou uma RP de 1,26 em comparação com uma vacina com um valor de 1,0 que protegeu 100% dos gatos num teste de vacinação/desafio grave. O componente da clamídia foi testado quanto à sua capacidade protectora num teste de vacinação/desafio em gatos. Protegeu 100% dos gatos vacinados . A combinação felina pentavalente desta invenção foi comparada com produtos da competição que se sabe que provocam reactividade do tipo descrito utilizando SDS-PAGE. A Figura 2 é uma fotografia deste gel que demonstra as quantidades de albumina não do hospedeiro e outras proteínas nos vários produtos. Deve notar-se que se demonstrou que estas técnicas electroforéticas detectam albumina a níveis de 0,5 mg/mL em vacinas. As pistas de gel estão numeradas da esquerda para a direita em que #1 é a pista mais afastada do lado esquerdo e #10 a pista mais afastado do lado direito. Na Figura 2, as pistas 1, 2 e 4 são vacinas FeLV monovalentes que se verificou serem altamente reactivas no campo. Contêm uma quantidade significativa (> 1,0 mg/mL) de albumina não do hospedeiro que é detectável por uma banda a aproximadamente 66.000 dalton. Estas vacinas provocaram reacções sistémicas do tipo descrito ante-riormente, bem como a morte num número significativo de animais quando testadas em ensaios de campo de segurança 42 ΡΕ0764446 semelhantes ao ensaio descrito no EXEMPLO 2B. A pista 3 é um marcador de peso molecular que contém bandas de 14,3, 20, 29, 34,8, 58,1 e 97 quilodalton. A pista 5 é a vacina preparada de acordo com o EXEMPLO 2A que não produziu reacções sistémicas quanto testada quanto à segurança no ensaio de campo descrito no EXEMPLO 2B. Contém um nível não detectável de albumina não do hospedeiro. A banda que aparece a 70 quilodalton é indicadora da presença do componente antigénico gp70. A pista 6 é 5% de albumina de soro de bovino (BSA) que serve como um controlo de albumina não do hospedeiro. Note-se que a banda de gp70 na pista 5 está ligeiramente acima do ponto médio desta banda de albumina não do hospedeiro. A pista 7 é uma vacina felina de combinação inactivada pentavalente com os mesmos componentes que os referidos acima que está comercializada por Fort Dodge Laboratories com o nome FEL-O-VAX® Lv-K IV. Como referido anteriormente, o Compendium of Veterinary Products indica que foram associadas a esta vacina reacções sistémicas. A pista 8 é uma vacina felina de combinação pentavalente modificada/inactivada com os mesmos componentes que os referidos acima que é comercializada por Solvay com o nome Eclipse® 4 + FeLV. Também se sabe que esta vacina é reactiva em gatos. A pista 9 contém uma vacina felina de combinação trivalente modificada contendo só rinotra-queíte felina, calicivírus felino e panleucopenia felina que é comercializada por Intervet com o nome PROTEX™-3. Esta vacina não contém FeLV pelo que não deve estar presente gp70. Consequentemente, a banda a 66 quilodalton é albumina não do hospedeiro. Esta vacina, quando combinada 43 ΡΕ0764446 com uma vacina FeLV inactivada e adjuvada no mesmo regime de vacinação, causou reacções sistémicas num estudo realizado em colaboração com os inventores. A pista 10 é uma vacina felina de combinação viva modificada trivalente contendo rinotraqueite felina, calicivirus felino e panleu-copenia felina que não contém adjuvante e é comercializado pela Solvay com o nome Eclipse®-3. Não contém FeLV pelo que não apresenta bandas entre 60 e 70 quilodalton. Contudo, há uma banda fraca a aproximadamente 66 quilodalton indicando que esta vacina contém albumina não do hospedeiro. Seria de esperar que este produto, quando utilizado num regime de vacinação com uma vacina adjuvada produzisse reacções sistémicas. É evidente desta Figura que a vacina de combinação pentavalente FeLV preparada de acordo com esta invenção contém a menor quantidade de albumina não do hospedeiro de qualquer vacina contendo os cinco componentes. Também é evidente que todas as vacinas reactivas contêm uma banda acentuada que representa albumina não do hospedeiro a uma concentração superior a 0,5 mg/mL.

Lisboa, 30 de Outubro de 2006

Claims

ΡΕ0764446 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição contendo um antigénio e um adjuvante para a preparação de uma vacina em que a composição está substancialmente isenta de albumina não do hospedeiro e contém menos do que 1,0 mg/mL de albumina do não hospedeiro e a composição é obtida por: (a) cultura de um organismo que produz o antigénio numa cultura contendo albumina não do hospedeiro; (b) colheita da cultura; (c) clarificação da colheita; (d) separação do antigénio e albumina não do hospedeiro da colheita clarificada; (e) separação da albumina não do hospedeiro do antigénio; (f) colheita do antigénio e adição de soro do hospedeiro ou albumina do hospedeiro; e (g) formulação do antigénio com um adjuvante.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o antigénio é seleccionado do grupo que consiste em 2 ΡΕ0764446 vírus, bactérias, rickettsias, parasitas, protozoários, as suas subunidades e as suas combinações.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o antigénio do vírus é seleccionado do grupo que consiste em Exemplos dos vírus podem ser seleccionados do grupo que consiste em retrovírus, vírus do herpes, adeno-vírus, paramixovírus, coronavírus, morbillivírus, hanta-vírus, reovírus, rotavírus, togavírus, parvovírus, vírus parapox, citomegalovírus, arbovírus, vírus da parain-fluenza, as suas subunidades e as suas combinações.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o antigénio é uma bactéria seleccionada do grupo que consiste em Clostridium spp., Streptococcus spp., Staphy-lococcus spp., Bordetella spp., Pasteurella spp., Salmo-nella spp., Mycobacteria spp., Mycoplasma spp., Leptospira spp., Borrelia spp., Fusobacteria spp., Bacteriodes spp., Rhodococcus spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Moraxella spp., Haemophilus spp., as suas subunidades e as suas combinações.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o antigénio é uma rickettsia seleccionada do grupo que consiste em Chlamydia spp., Ehrlichia spp. ou subunidades suas e combinações suas.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o antigénio é um parasita seleccionado do grupo que 3 ΡΕ0764446 consiste em Toxoplasma spp., Dirofilaria spp., Cryptos-poridium spp., Coccidia spp., Babesia spp., Neospora spp., ou subunidades suas e combinações suas.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o adjuvante é seleccionado do grupo que consiste em polímeros, copolímeros de blocos, óleos, óleo-em-água, sais de alumínio e imunoestimulantes não específicos.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o adjuvante está presente numa quantidade desde 0,01 a 50%. Lisboa, 30 de Outubro de 2006 ΡΕ0764446 1/2

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