DK175379B1

DK175379B1 - Anvendelse af transmitterbart svine-gastro-enteritisvirus samt fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine

Info

Publication number: DK175379B1
Application number: DK198805341A
Authority: DK
Inventors: Dale Bordt; Hans Draayer
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1987-09-28
Filing date: 1988-09-26
Publication date: 2004-09-20
Also published as: ATE98680T1; JPH01230532A; DE3886332D1; AU2281488A; DK534288A; IE60950B1; DK534188D0; JP2715114B2; DE3886332T2; IE882909L; NZ226333A; EP0310317A2; EP0310316B1; PT88590B; DE3852918T2; DK175308B1; DE3852918D1; JP2733844B2; DK534288D0; IE66015B1

Description

3>ΒΕ^ί - 1 _. ' ' _ -. ·?:ί*3ίίί8·Μ—_;_ *^1^—B^iæSWt— DK 175379 B1 i

Den foreliggende opfindelsen angår vacciner, især vacciner, der er nyttige til beskyttelse af hunde mod hunde-coronavirus.

Coronavirus blev først erkendt og morfologisk defineret som en gruppe af Tyreil , 5 og medarbejdere. En omfattende oversigt over biologien og patogenesen af coronavirus er blevet publiceret af H. Wege et al., Current Topics in Microbial Immunology, 1982, 99, 165-200.

Hunde-coronavirus (CCV) blev først isoleret i 1971 og er i stigende grad blevet et 10 problem, især blandt hundehvalpe og hos kennel-opdrættede hunde. Det fremkalder en mild til moderat diarré, forud for hvilken der ofte er sløvhed, depression og appetitløshed. Generelt følger dehydrering og efterfølgende vægttab. Selvom sygdommen normalt ikke er dødelig, er indtrykket det, at få hundehvalpe opnår deres fulde vitalitet efter infektionen.

15 Én behandling, der kan anvendes til at overvinde virkningerne af CCV-infektion indebærer, at man giver massive doser af væsker for at erstatte de tabte, samt antibiotika for at hjælpe med at kontrollere en eventuel opportunistisk bakteriel infektion, der kan ramme hunden i dens svækkede tilstand. En sådan behandling 20 er bekostelig og har den ulempe, at den ikke er forebyggende og kun er anvendelig til behandling af infektionen, efter at denne har fundet sted.

En levende vaccine, der blev introduceret i 1983 af Fort Dodge Laboratories, Iowa, og som var beregnet til at beskytte hunde mod CCV, blev snart efter vist at være 25 usikker og blev frivilligt trukket tilbage fra markedet i samme år (se M.L. Martin i The Compendium on Continuing Education, 1985, 12, 1012-1017).

En inaktiveret vaccine til beskyttelse af hunde mod CCV er nu blevet introduceret

‘ I

af Fort Dodge Laboratories under handelsnavnet Duramune Cv-K. U.S.-patenter, 30 der er relevante til dette produkt, er U.S. Patent nr. 4.567.042 og U.S. patent 4.567.043. 1 35 lyset af CCV’s smitsomhed og af sygdommens økonomiske aspekter, er der et presserende behov for nye og forbedrede vacciner.

I DK 175379 B1 I

I 2 I

I Det er kendt, at hunde-coronavirus (CCV), transmitterbart svinegastro- I

I enteritisvirus (TGEV), infektiøst katteperitonitisvirus (FIPV) og humant I

I respiratorisk coronavirus af 229E-gruppen udgør en antigengruppe af virus I

I indenfor familien Coronaviridae (se N.C. Pedersen et al., Arch. Virol., 1978, 58, I

I 5 45-53 og S. Siddell et al., J. Gen. Virol, 1983, 64, 761-76). I

I Krydsbeskyttelsesundersøgelser med disse virus har imidlertid haft lidt eller ingen I

I succes. I fx én undersøgelse dannede svin, der fik virulent CCV, ikke I

I neutraliserende antistoffer mod TGEV (L.N: Binn et al., Proceedings of the Annual I

I 10 Meeting U.S. Animal Health Association, 1974, 78, 359-366), medens det i en I

I anden undersøgelse blev fundet, at katte, der blev inokuleret med et virulent I

I mark-isoleret CCV-præparat, ikke var beskyttet mod en provokationsdosis af FIPV I

I ' (J.E. Barlough et al., Laboratory Animal Science, 1984, 34, 592-597). I

I 15 Andre undersøgelser har vist, at katte, der blev vaccineret med virulent TGEV og I

I bagefter udsat for provokation med virulent FIPV, ikke var beskyttet mod FIPV- I

I infektion (se fx D.J. Reynolds og DJ. Garwes, Arch. Virol., 1979, 60, 161-166; og I

I R.D. Woods og N.C. Pedersen, Vet. Microbiol. 1979, 4, 11-16). I

I 20 Det har nu overraskende vist sig, at vacciner baseret på TGEV beskytter hunde I

I mod CCV-infektion. I

I Vacciner der er baseret på inaktiveret TGEV er kendte i sig selv og er beskrevet i I

I fx GB 1.058.340. Deres anvendelse i forebyggelse af CCV-infektion i hunde er ikke I

I 25 tidligere blevet foreslået. I

I I overensstemmelse hermed tilvejebringer den foreliggende opfindelse I

I anvendelsen af transmitterbart svinegastroenteritisvirus til fremstilling af en I

vaccine til forebyggelse af hunde-coronavirusinfektion hos hunde. I

I 30 I

I TGEV-vaccinen kan være levende eller inaktiveret. I

I Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en I

I vaccinekomposition til forebyggelse af hunde-coronavirusinfektion hos hunde, I

* ."-»-TgSt -j. ~ . · - —»g' t: «Γ — . 1 y:»-wari8——B—»^^ΙΡΜιΜΜΒπϋΙΙ^^ΜΗϋ:: 1MWWM

DK 175379 B1 3 hvilken fremgangsmåde omfatter blanding af transmitterbart svinegastroenteritisvirus med en farmaceutisk acceptabel bærer.

TGEV-vaccinen til anvendelsen i fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan 5 fremstilles ud fra et TGEV-virus-isolat, fx af det cellekultur-tilpassede svækkede TGE-virus, der kendes under navnet Purdue-stamme TGE-virus, der er blevet deponeret hos American Type Culture Collection og som har ATCC-depotnr. VR-763.

10 Svækket levende TGEV, der er egnet til anvendelse ifølge den foreliggende opfindelse, kan fremstilles ved at lade TGE-virus-isolatet passere flere gange i celler af svine- og/eller katteoprindelse, fx mellem 2 og 9 gange, ved en virus-til-celleforhold pi fra 1:1 til 1:10000, fortrinsvis ca. 1:100.

15 Cellerne af svineoprindelse omfatter fortrinsvis svinenyre- (PK)-celler, fx PK TC/115 og PK 15 (ATCC CCL 33) cellelinier.

Cellerne af katteoprindelse omfatter fortrinsvis kattenyreceller, specielt Crandell-kattenyre- (CRFK)-celler (ATCC CCL 94).

20

Det svækkede levende TGE-virus kan opformeres ved cellekultur i et egnet kulturmedium under anvendelse af pattedyrceller. Metoden omfatter følgende trin: inokulering af pattedyr-vævskulturceller med TGEV (idet cellerne normalt er blevet dyrket ind i et 80-100% sammenflydende monolag før inokulering), 25 cellehøst, typisk mellem 1 og 7 dage efter inokulering, fortrinsvis mellem 2 og 5 dage efter inokulering, og opsamling af det opformerede virus fra de høstede celler.

Egnede kulturmedier til anvendelse i den ovennævnte proces omfatter de inden 30 for den kendte teknik kendte kulturmedier. Et foretrukket kulturmedium, i hvilket TGE-viruset kan opformeres, er "Eagle's minimum essential medium" (MEM) med eller uden serum.

Celle- og virusvækst opretholdes under standard betingelser, normalt ved 33-35 39°C, fortrinsvis ved 35-38°C.

DK 175379 B1 I

Virusvæskerne inokuleres hensigtsmæssigt pi pattedyrcellerne ved en virus-til- I

celleforhold på fra 1:1 til 1:10.000, fortrinsvis ca. 1:100. Viruskulturmediet I

tilsættes fortrinsvis efter en periode på fra 1 til 2 timer. I

Pattedyrcellerne er hensigtsmæssigt af svine- eller katteoprindelse, fx svinenyre- I

(PK)-celler, specielt PK 15-cellelinien (ATCC CCL), eller kattenyreceller, specielt I

Crandell-kattenyre- (CRFK)-celler (ATCC CCL 94). I

10 Pattedyrcellerne er fortrinsvis af katteoprindelse, især CRFK-celler. I

Virusvæsker høstes ved nedfrysning-optøning eller enzymatisk indvirkning,

fortrinsvis ca. 3 dage efter inokulering. De høstede virusvæsker kan I

hensigtsmæssigt opbevares nedfrosset.

Virusvæsker, der høstes som beskrevet foroven, indeholder normalt mindst ΙΟ3,5 I

infektiøse virusenheder/ml. I

Nar der er behov for en levende TGEV-vaccine, kan virusvæskerne anvendes uden I

20 yderligere behandling, eller de kan blandes med en egnet stabilisator, fx N-Z- I

amin-gelatine, sucrosephosphatglutamat (SPG) eller sucrosephosphatglutamat- I

albumin (SPGA). Normalt tørres vaccinen. Titeret efter tørring er fortrinsvis I

mindst 104 pr. dosis. I

25 Nar der behøves en inaktiveret (eller "dræbt") vaccine, kan de høstede I

virusvæsker inaktiveres ved de inden for den kendte teknik kendte metoder. I

Egnede metoder omfatter fx behandling med β-propiolacton, formaldehyd eller I

ethylenimin. Efter en inaktiverings- og inkuberingsperiode kan virusvæskerne

testes for fuldstændig inaktivering ved kendte metoder, fx ved, at de udsættes for ' I

30 gentagne passager på svinenyreceller. I

En foretrukken yderligere metode til udførelse af inaktiveringstrinnet er at I

behandle de høstede virusvæsker med ascorbinsyre og/eller et salt deraf i I

nærværelse af oxygen og en tungmetalionkilde. Virale inaktiverings- I

35 fremgangsmåder af denne type er beskrevet i Chem. Abs. 107(5), 36455u (for I

MWWBJktfn—^—tnwwin. Iiy-·. '· ___ - - "· ·_'-· ' J^SZ

DK 175379 B1 5 bakteriofag), i Chem. Abs. 61(11), 13647b (for kokoppevirus) og i vores verserende EP-A-0 310 317 (for vaccinebestanddele).

Egnede former af ascorbinsyre omfatter alkalimetal- eller jordalkalimetalsaltene, 5 fx natrium-, kalium- eller calciumsaltene, eller ascorbinsyre selv.

Et foretrukket salt er natriumsaltet.

En hensigtsmæssig ascorbatkoncentration til anvendelse i inaktiveringstrinnet er i 10 området 1-10 mM, fortrinsvis 2,0 mM-6,0 mM, fx 2,5 mM.

Egnede tungmetalionkilder omfatter salte af kobber, jern og zink samt kviksølvholdige forbindelser.

15 En foretrukken tungmetalion er kobber(II)(Cu2+)-ionen, for hvilken en hensigtsmæssig kilde er kobber(II)sulfat.

En yderligere foretrukken tungmetalion er kviksølv, for hvilken hensigtsmæssige kilder er organokviksølvforbindelser, specielt ethylmercurithiosalicylsyre-20 natriumsalt (thimerosal).

Tungmetalionen er til stede i en katalytisk mængde, idet en hensigtsmæssig koncentration til anvendelse i inaktiveringstrinnet er i området fra 0,01 mM til 0,1 mM, fortrinsvis 0,015 mM til 0,05 mM, fx 0,022 mM.

25

Tilstedeværelsen af oxygen er essentiel og tilvejebringes hensigtsmæssigt ved tilstrækkelig beluftning.

Normalt får inaktiveringstrinnet lov til at forløbe ved mellem 1°C og 54°C, 30 fortrinsvis ved ca. 37°C, indtil en inaktiveringstest viser sig at være tilfredsstillende. Den nødvendige inaktiveringsperiode er typisk i området 10-100 timer, generelt ca. 48-72 timer.

Til inaktivering af visse virus, fx parvovirus og rotavirus, kan en yderligere 35 tilsætning af ascorbinsyre være nødvendig for at fuldende inaktiveringsprocessen.

I DK 175379 B1 I

I 6 I

I Desuden kan andre midler, der vides at inaktivere virus, eventuelt tilsættes for at I

I fuldende inaktiveringsprocessen. Et sådant reagens er saponin. Som beskrevet fx I

I i Vet. Med. Nauki, 1980, 17(3), 45-55 (A. Motovski et al.) er ét sådant reagens I

I 5 saponin, der fx kan tilsættes i en koncentration på 0,5 mg/ml ca. 72 timer efter I

I ascorbinsyretilsætning. En sådan procedure har vist sig at være specielt I

I anvendelig til inaktivering af kappevirus såsom virus af Herpesgruppen, herunder I

I PRV og IBR. I

I 10 Inaktiveringsprocessens fremskridt kan hensigtsmæssigt følges ved maling ved I

I intervaller af viruslevedygtigheden under anvendelse af en hvilken som helst I

I hensigtsmæssig metode, fx ved en indirekte fluorescerende kaninantistof-test, til I

I bestemmelse af resterende virustitre. I

I 15 Til fremstilling af inaktiveret TGEV-vaccine udføres inaktiveringstrinnet normalt I

I ved tilsætning til bulk-viruset af passende mængder natriumascorbat- og I

I kobber(II)sulfat-stamopløsninger og blanding af den resulterende opløsning i I

I nærværelse af luft i ca. 72 timer ved 37°C. Efter nedkøling til 4°C kan en I

I inaktiveringstest hensigtsmæssigt udføres under anvendelse af en egnet I

I 20 cellekultur såsom PK eller CRFK. I

I TGEV-vaccinen til anvendelse i fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan eventuelt I

I indeholde yderligere svækkede modificerede levende virus eller dræbte virus I

I såsom hundesygevirus, hunde-parainfluenza-virus, hunde-adenovirus (I og II), I

I 25 hunde-parvovirus og kan kombineres med forskellige inaktiverede bakterielle I

I vacciner såsom Leptospira canicola-ictero bacterin eller hunde-bordatella bacterin. I

I Den inaktiverede TGEV-vaccinekomposition ifølge opfindelsen kan også eventuelt I

I indeholde adjuvanser omfattende aluminiumhydroxid (fx 2-25 vægtprocent, I

I 30 fortrinsvis 5-25 vægtprocent), saponin (fx 0,5-1,5 mg/dosis) og Freund’s I

I ukomplette adjuvans (typisk vand-i-olie-emulsion). I

I Til forebyggelse af hunde-coronavirusinfektion hos hunde kan TGEV-vaccinen I

I indgives parenteralt (subkutant eller intramuskulært) i en dosis på mindst 1,9 I

I 35 logaritmiske enheder viruspartikler pr. dosis, fortrinsvis mindst 1000 viruspartikler I

......... — —:- DK 175379 B1 7 (3 logaritmiske enheder viruspartikler) pr. dosis. Vaccinen indgives fordelagtigt i mindst 4 logaritmiske enheder viruspartikler pr. dosis.

De følgende eksempler illustrerer opfindelsen.

5

EKSEMPLER

I de nedenfor beskrevne eksempler blev følgende materialer og metoder anvendt.

10 A. TGE-virus Præparationsforskrift A.l 15 TGE-virus af Purdue-stammen (ATCC VR-763) blev udsat for 4 passager på svinenyreceller (betegnet PK0809), hvorved der vandtes et hovedpodningsvirus. De eksperimentelle vacciner blev afledt af hovedpodningsviruset, efter at dette havde været udsat for yderligere 5 passager i svinenyrecellerne.

20

Præparationsforskrift A.2

Hoved-podningsvirus fra præparationsforskrift 1 blev udsat for 3 passager i svinenyreceller og 2 passager i Crandell-kattenyreceller (ATCC CCL 94).

25 B. Cellekultur Præparationsforskrift B.l 30 Hoved-podningsviruset blev opformeret ved 35-38°C i svinenyrecelle- (PK 15)-cellelinien (ATCC CCL 33) i Eagle’s MEM indeholdende højst 10% bovint serum.

Præparationsforskrift B.2 35

I DK 175379 B1 I

I 8 I

I Viruset fra præparationsforskrift A.2 blev opformeret ved 35-38°C i Crandell- I

I kattenyre-cellelinien (ATCC CCL 94) i Eagle's MEM indeholdende højst 10% I

I bovint serum. I

I 5 C. Virusvækst I

I Præparationsforskrift C.l I

I To små rulleflasker indeholdende sammenflydende PK0809-monolag blev I

I 10 inokuleret med 1 ml ufortyndet TGE-hoved-podningsvirus. Efter en 1-2 I

timers adsorptionsperiode blev virusvækstmediet (Eagle's MEM indeholdende I

I højst 2% bovint serum.) tilsat, og viruset blev dyrket ved 35-38°C. I

I Præparationsforskrift C.2 I

I 15 I

I To små rulleflasker indeholdende sammenflydende Crandell-kattenyreceller I

I (ATCC CCL 94)-monolag blev inokuleret med 1 ml ufortyndet TGE- I

hoved-podningsvirus. Efter en 1-2 timers adsorptionsperiode blev I

virusvækstmediet (Eagle's MEM indeholdende højst 2% bovint serum) tilsat, I

20 og viruset blev dyrket ved 35-38°C. I

I EKSEMPEL 1 I

H 25 Modificeret levende TGEV-vaccine I

I Til én rulleflaske indeholdende TGE-virus fremstillet som i Præparationsforskrift I

C.l foroven sættes 17% N-Z-amin-gelatinestabilisator. Der udføres en I

nedfrysnings/optønings-cyklus, og det resulterende materiale tørres i volumener ‘ I

I 30 pi 1 ml og holdes ved 4°C indtil brug. Titeret efter tørring bør være mindst 104 pr. I

I dosis. I

I EKSEMPEL 2 I 35 DK 175379 B1 9

Modificeret levende TGEV-vaccine

En modificeret levende TGEV-vaccine blev fremstillet på samme måde som i eksempel 1 bortset fra, at der blev anvendt TGE-viruset fremstillet som i 5 præparationsforskrift C.2.

EKSEMPEL 3 10 Inaktiverede TGEV-vacciner

En rulleflaske indeholdende TGE-virus fremstillet som i præparationsforskrift C.l foroven blev nedfrosset og optøet (titerprøve udtaget) og inaktiveret som følger (bulk-viruset bør have et præ-inaktiveringstiter på mindst 105,s pr. dosis: 15

Bulk-viruset blev anbragt i en 1-liters glasflaske og justeret til 37°C. Derefter blev natriumascorbat-stamopløsning (1% vægt/volumen) og kobber(II)sulfat-stamopløsning (1,1% vægt/volumen) tilsat for at bringe slutkoncentrationen af ascorbat til 5,05 mM og slutkoncentrationen af kobber(II)ioner til 0,022 mM.

20 Flaskens indhold blev blandet under tilstrækkelig beluftning i 72 timer ved 37°C, hvorefter det blev afkølet til 4°C. En inaktiveringstest blev udført under anvendelse af svinenyreceller.

Efter inaktivering var blevet vist, blev bulk-viruset delt op og tilsat adjuvans for at 25 give to inaktiverede vacciner som følger:

Vaccine A

Den ene halvdel af det inaktiverede bulk-virus blev behandlet med 10% 30 aluminiumhydroxid ved omrøring i 15-20 timer ved 4°C.

Vaccine B

Den anden halvdel af det inaktiverede bulk-virus blev tilsat adjuvans som følger: 35

I DK 175379 B1 I

I 10 I

I Opløsning 1 består af 5 ml emulgeringsmiddel sat til 95 ml Drakoil 6 VR. I

I Opløsning 2 består af 2,5 ml Tween 80 sat til 47,5 ml dræbt TGE-virus. I

I 5 Opløsning 1 (21 ml) sættes til opløsning 2 (7 ml) og blandes inden vaccination I

I under anvendelse af en Perfektum-emulgeringsnål. I

I EKSEMPEL 4 I

I 10 I

I Modificeret levende TGEV-vaccine-dosistitrering og CCV-immunogenici- I

I tetevaluering i hunde I

I a) Eksperimentelt design I

I 15 I

I 4 TGEV-vaccine-permutationer blev evalueret; 2 antigenniveauer, der hvert blev I

I indgivet intramuskulært (IM) eller subkutant (SC). 5 hunde blev henført til hver I

I IM-gruppe og 4 hunde til hver SC-gruppe. 5 hunde blev anvendt som I

I uvaccinerede kontroller. I

I 20 I

I Hundene i hver vaccinegruppe fik 2 doser på 2 ml af en modificeret levende I

I TGEV-vaccine indgivet IM eller SC med et interval på 4 uger. 3 uger efter den I

I anden vaccination blev alle hunde udsat for oral og intratonsilar provokation med I

I CCV. 3 parametre blev evalueret til bestemmelse af hver I

I 25 vaccinepermutationseffektivitet: serologisk respons, rektal CCV-udskillelse og I

I CCV-infektion af tarmepithelceller 5 dage efter provokation. I

I b) Materialer og metoder I

I 30 i) Dyr I

I Der blev anvendt 23 hunde af blandet race, 16-20 uger gamle, der ikke I

I tidligere havde være vaccineret mod CCV. Hundene var modtagelige for I

I CCV, hvilket blev vist ved CCV-IFA-titre på <1:2. I

I 35 I

DK 175379 B1 11 ii) Vaccine og vaccination TGEV-hoved-podningsviruset blev udsat for 3 passager i svinenyreceller og 2 passager i Crandell-kattenyre- (CRFK)-celler som beskrevet i 5 præparationsforskrift A.2. Virushøst-materialet blev holdt ved -70°C før brug.

iii) Serologi 10 Antistoftitre blev bestemt ved tidspunktet for vaccination, ved tidspunktet for provokation og 5 dage efter provokation under anvendelse af en indirekte fluorescerende antistof-test.

iv) Provokation 15

Der blev anvendt et mark-isolat, betegnet CCV-6, der blev udsat for én passage i CRFK. Hundene lodes faste i 24 timer før provokation. 4 ml virushøst-materiale blev givet til hver hund på følgende måde: 2 ml virusmateriale blandet med 1/4 kop Alpo™ blev givet oralt. Hundene blev 20 derefter bedøvet med Prom Ace® (Ayerst Laboratories INC NY, NY 10017) ifølge etikettens anbefalinger, og 1 ml CCV blev derefter injiceret i hver mandel. Hundene blev overvåget på provokationsdagen og i 5 dage efter provokation med hensyn til grove kliniske tegn og rektal virusudskillelse.

25 v) Rektal virusgenfinding efter provokation

Rektale afstrygninger blev taget dagligt og behandlet for virusisolation ved passage i CRFK-celler.

I DK 175379 B1 I

I 12 I

I vi) Tyndtarmsevaluering efter CCV-provokation I

I 5 dage efter CCV-provokation blev alle hunde aflivet, og hele tyndtarmen I

I blev fjernet Tarmaftryk på mikroskopglas blev fremstillet af tarmsegmenter, I

I 5 der blev taget ved regelmæssig afstand. Tilstedeværelsen af CCV-antigen I

I blev bestemt under anvendelse af en indirekte fluorescens antistof-test. I

I Aftryks-glaspræparater fik tildelt point afhængigt af den iagttagne procent I

I specifik CCV-fluorescens. I

I io c) Resultater I

I Der sås ingen kliniske tegn blandt hundene efter vaccination eller I

I provokation. I

I 15 i) Vaccinevirus-titre I

I Antigene niveauer, der blev anvendt i denne undersøgelse var 103,3 og ΙΟ2,3 I

I TCID50/dosis. I

I 20 ii) Serologisk respons I

I De serologiske resultater er opsummeret i tabel 1. I

DK 175379 B1 13

Tabel 1

Reciprokke geometriske middelværdier af CCV-antistoftitre 5

Uger efter 1. vacc.

TGE-vaccine 0 3 7 5D PC

10 103'3IM <2 40 139 422 103'3SC <2 24 113 320 102'3IM <2 46 53 485 102'3SC <2 34 24 190

Ikke-vacc. <2 <10 <10 <10 15

Ingen af hundene havde et måleligt antistoftiter ved vaccinationstidspunktet. Titre for ikke-vaccinerede kontroller forblev mindre end 1:10 under hele undersøgelsen, hvilket viser manglende 20 uvedkommende CCV-infektion.

Hundene i alle 4 vaccinegrupper (103,3 IM, 103,3 SC, ΙΟ2,3 IM og 102,3 SC) udviklede lignende geometriske middelværdier af CCV-antistof titre 25 (GMAT) indenfor 3 uger efter den første vaccination (1:24 til 1:46), hvilket tyder på et primær respons fra virusreplikation. 3 uger efter den 2. vaccination blev der vist et dosisrespons blandt hundene i grupperne 103'3 IM og 103'3 SC (GMAT 1:139 og 1:113) og grupperne 102'3 IM og 102'3 SC (GMAT 1:53 og 1:24). Alle vaccinerede hunde udviste et anamnæstisk 30 respons efter CCV-provokation; responser blandt hundene i grupperne 103’3 IM og ΙΟ3,3 SC var tredobbelte, og responser blandt hundene i grupperne 102,3 IM og 102,3 SC var henholdsvis 9- og 8-dobbelte. Serologiresultaterne tyder på, at hundens immunsystem under påvirkning af den heterologe levende TGEV-vaccine reagerede anamnæstisk over for 35 provokation med homolog virulent CCV.

I DK 175379 B1 I

I 14 I

I 5 dage efter provokation havde ikke-vaccinerede hunde ingen måleligt I

I antistofrespons. I

I 5 Hi) CCV-evalueringer efter provokation I

I Dobbelte titreringer af CCV-provbkationsvirus viste, at hundene var blevet I

I udsat for provokation med 105'4 TCID5o/ml (106,0 TCID50/dosis). I

I 10 CCV-virusisolationer blev overvåget i 5 dage efter provokation. Alle hunde I

I var fri for CCV inden provokation. CCV-virusinklusion i CRFK-cytoplasma I

I sås for alle ikke-vaccinerede kontroller (100% genfinding) under hele I

I perioden på 5 dage. Blandt vaccinerede hunde, sås CCV-virusinklusioner I

I ikke, hvilket tyder på ingen virusgenfinding. Passage af materiale øgede I

I 15 ikke virusgenfinding. I

I Tabel 2 opsummerer gennemsnitlig specifik CCV-tarmfluorescens blandt I

I grupperne og blandt ikke-vaccinerede kontroller. I

I 20 Tabel 2 I

I Gennemsnitligt pointtal (%) for tarm-CCV ved immunfluorescens I

I Tarmaftryks-nummer (Duodenum til Ileum) I

I 25 Gruppe 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 Total I

I 3,3 IM 7,6 9,0 5,0 2,0 5,0 0,0 2,0 0,0 30,6 . I

I 3,3 SC 17,5 5,0 8,8 7,5 2,5 2,5 0,0 12,5 56,3 I

I 2,3 IM 10,0 12,0 2,0 0,4 0,4 6,0 1,4 14,0 46,2 I

I 30 2,3 SC 10,0 1,3 6,3 0,0 0,0 0,0 15,0 10,0 42,5 I

I Kontrol 46,0 82,0 24,0 40,0 35,0 48,0 40,0 12,0 327,0 I

I Der sås specifik fluorescens for CCV, hvilken fluorescens viste sig som stærkt I

I æblegrøn fluorescens, langs hele tyndtarmens længde. Alle hunde viste nogen I

I——1^' · - ~» - - . , "TWWI—»—tf—Μ^Μ*——i:1WMB«>Jga— DK 175379 B1 15 grad af CCV-infektion. En signifikant reduktion i tarmfluorescens, relativt til kontrollerne, sås blandt alle de vaccinerede hunde.

Gennemsnitlige samlede pointtal blandt vaccinegrupper 5 dage efter CCV-5 provokation lignede hinanden (30,6; 56,3; 46,2; 42,5), og det gennemsnitlige samlede pointtal for de ikke-vaccinerede kontrolhunde var betydelig større (327) end for vaccinegrupperne.

d) Konklusion 10 3 uger efter den første vaccination udviklede hunde blandt alle vaccinegrupper lignende antistofresponser. Et antistof-dosisrespons sås blandt hundene i 103,3- og 102,3-vaccinegrupperne 3 uger efter den anden vaccination.

15 Efter CCV-provokation genfandtes virus hos alle ikke-vaccinerede dyr, og CCV-tarminfektion syntes aktiv og udbredt. Vaccinerede hunde i alle vaccinegrupper udviste imidlertid et aktivt cellulært immunrespons uden rektal virusudskillelse og var tilsyneladende beskyttet mod CCV-provokation af TGE-vaccineinducerede antistoffer eller af cellemedieret immunitet.

*

Claims

1. Anvendelse af transmitterbart svinegastroenteritisvirus til fremstilling af en I I vaccine til forebyggelse af hunde-coronavirusinfektion hos hunde. I I 5 I

2. Anvendelsen ifølge krav 1, I I kendetegnet ved, at vaccinen er inaktiveret. I

3. Anvendelsen ifølge krav 1 eller 2, I 10 kendetegnet ved, at vaccinen er fremstillet ud fra TGE-virus af Purdue- I I stammen (ATCC nr. VR-763). I

4. Anvendelsen ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, I I kendetegnet ved, at vaccinen yderligere omfatter et svækket modificeret I I 15 levende virus eller inaktiveret virus valgt blandt gruppen bestående af I I hundesygevirus, hunde-parainfluenzavirus, hunde-adenovirus (I og II), hunde- I I parvovirus og hunde-coronavirus eller kan kombineres med en inaktiveret I I bakteriel vaccine valgt blandt gruppen bestående af Leptospira canicofa-ictero I I bacterin og hunde-Bordatella bacterin. I I 20 I

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en inaktiveret vaccine fremstillet af I I transmitterbart svinegastroenteritisvirus (en TGEV-vaccine), I I kendetegnet ved, at den omfatter: I 25 a) at man udsætter et TGE-virusisolat for passage i celler af svine- og/eller I I katteoprindelse ved et virus-til-celleforhold på fra 1:1 til 1:10000 til opnåelse af et I I svækket levende TGE-virus; I I b) at man opformerer det levende TGE-virus ved cellekultur i pattedyrceller; I I 30 I I c) at man høster de således dannede virusvæsker; og I I d) at man inaktiverer nævnte virusvæsker med ascorbinsyre og/eller et salt deraf I i nærværelse af oxygen og en tungmetalionkilde. I

35 I DK 175379 B1 - -——_~ 1

6. Anvendelse ifølge krav 2, kendetegnet ved at den inaktiverede vaccine er fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge krav 5.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at tungmetalionkilden er valgt blandt gruppen bestående , af kobber-, jern-, zink- og kviksølvholdige forbindelser. k