PT683816E

PT683816E - Processo de cultura do virus do sidroma das funcoes respiratorias e reprodutoras de suinos e seu uso em vacinas

Info

Publication number: PT683816E
Application number: PT94907895T
Authority: PT
Inventors: Thomas Sanderson; Michael J Mcginley; Jeffrey J Zimmerman; Howard T Hill; Michael C Meetz; Eugene C Pirtle; Sabrina L Awenson; George P Shibley
Original assignee: Univ Iowa State Res Found Inc; Bayer Ag
Priority date: 1993-02-08
Filing date: 1994-01-26
Publication date: 2001-03-30
Also published as: HU218430B; NO953091D0; DE69426228T2; FI117513B; EP0683816B1; EP0683816A1; WO1994018311A1; SK98695A3; JP3710095B2; NO317662B1; CN1117742A; PL310126A1; NZ261992A; AU681874B2; CZ289743B6; DE69426228D1; US5510258A; BG99850A; HU9502330D0; PL178609B1

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE CULTURA DO VÍRUS DO SÍNDROMA DAS FUNÇÕES RESPIRATÓRIAS E REPRODUTORAS DE SUÍNOS E SEU USO EM VACINAS"

Campo do invento: O presente invento refere-se a um isolado do vírus do síndroma das funções respiratórias e reprodutoras em suínos (VSRRS). Mais especifícamente, o presente invento refere-se a uma vacina para a doença respiratória e reprodutora de suínos, porcos, e aos processos para a produção da mesma.

Breve Descrição da Técnica Anterior: O síndroma respiratório e reprodutor de suínos está a emergir rapidamente como um problema de uma doença economicamente devastadora para os produtores de suínos Americanos e Europeus. O síndroma foi descrito pela primeira vez nos Estados Unidos em 1987, surgindo descrições semelhantes na Europa e Canadá, dois a três anos mais tarde. O síndroma da doença tem sido referido através de diferentes nomes incluindo doença suína misteriosa, “abortus blau”, doença do porco de orelha azul, aborto epidémico suíno e síndroma respiratório (AESSR), infertilidade suína e síndroma respiratório (1SSR). Daqui em diante passará a utilizar-se o nome síndroma respiratório e reprodutor em suínos (SRRS). O agente etiológico capaz de reproduzir o síndroma da doença foi identificado como um pequeno vírus RNA de invólucro esférico, com um diâmetro médio de virion de 62 nm e um núcleo envolvido num invólucro de 25 a 30 nm. Têm sido feito tentativas de agrupar este vírus como um membro do género Arterivirus dentro da família Togaviridae. O isolado do vírus do síndroma respiratório e reprodutor em suínos (VSRRS), aqui descrito, ajusta-se a esta tentativa de classificação e tem sido mostrado que reproduz o síndroma da doença.

0 síndroma da doença associado a VSRRS é caracterizado pelo insucesso reprodutor agudo e crónico de fêmeas suínas adultas, e crítico para a doença respiratória moderada em porcos jovens. O insucesso reprodutor é caracterizado por abortos em adiantado estado de gestação, resultando numa incidência aumentada de porcos dissecados, nados mortos, e nascimento de porcos fracos, com manifestas reduzidas hipóteses de sobrevivência. Também têm sido descritos problemas crónicos com prolongado retorno ao período fértil em porcas adultas infectadas. As sequelas da doença respiratória vão de febres elevadas e pneumonia intersticial, a moderados sinais respiratórios superiores (isto é, espirros, tosse, ou descargas nasais ou oculares) em porcos jovens. Estudos recentes (1990) serológicos e de varas indicam que, pelo menos 50% das varas de porcos dos Estados Unidos da América foram expostas ao VSRRS ou já foram vítimas de insucesso reprodutor e doenças respiratórias indiciadoras de infecção de VSRRS.

Christianson et al. descrevem no “American Journal of Veterinary Research, Vol. 53 (4), Abril de 1992” um isolado de vírus VSRRS específico (ATCC VR-2332) o qual, no entanto, é antigeneticamente diferente do isolado do vírus, de acordo com o presente invento.

Devido à recente emergência deste síndroma de doença, os estudos sobre a patogésene, epidemiologia e controlo da doença têm sido limitados. Como seria de prever, uma eficaz propagação e processamento dos antigenes que compreendem VSRRS facilitará o desenvolvimento de uma vacina VSRRS como um auxílio na prevenção e controlo do síndroma respiratório e reprodutor em suínos.

RESUMO DO INVENTO

De acordo com o que acima se disse, o presente invento refere-se ao isolado do vírus designado por ISU-P ATCC VR 2402 útil para a preparação de antigenes para o diagnóstico do síndroma respiratório e reprodutor em suínos e para a indução de uma resposta imuno-protectora do vírus do síndroma respiratório e reprodutor em suínos (VSRRS). São também abrangidos pelo presente invento os processos para a produção e utilização dos antigenes.

Na presente forma de realização do invento, o isolado do VSRRS pode ser obtido por um processo que compreende o isolado do VSRRS através da co-cultivação de 10% peso/volume (p/v) de homogenatos de pulmões de porcos infectados com o vírus, com macrófago alveolar suíno primário, ou culturas de linha de células contínua a 35°C. O presente invento abrange ainda a propagação do vírus a um título elevado em determinadas linhas de células tal como as linhas de célula continua .de Fígado de Macaco Verde Africano. São também abrangidos pelo presente invento processos para a preparação e utilização de antigenes de vírus vivo ou de vírus morto (convencionais ou recombinantes) e as vacinas deles resultantes, através da combinação de uma quantidade imunologicamente eficaz do vírus, respectivamente com diluente e/ou adjuvante.

Verificou-se que a imunização experimental directa das porcas adultas com o vírus vivo, ou o contacto de porcas adultas imunizadas com o vírus vivo, evitava o insucesso reprodutor, a seguir a um estímulo intranasal com VSRRS virulento.

Verificou-se também que as vacinas inactivadas, adjuvadas com VSRRS protegiam os porcos da infecção de SRRS após o estímulo, tal como medido pela falta de replicação de vírus, em porcos vacinados, quando comparados com porcos de controlo não vacinados. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO Como acima se referiu, o presente invento refere-se ao isolado do vírus ISU-P de VSRRS, com o objectivo de obter antigenes virais para uso em vacinas e testes de diagnóstico. O isolado do ISU-P foi obtido a partir de tecido de pulmão de um porco recém-nascido de fraca condição física. De modo ilustrativo foram preparados 10% p/v de um homogenato de tecido de pulmão, de bacia, e de nódulo de linfa, em Meios Essenciais Mínimos complementados com antibióticos (MEM+A) de forma a minimizar a potencial contaminação. O homogenato cru foi clarificado por centrifugação a uma temperatura de 4°C durante um período de 15 minutos a 1500 x g. O sobrenadante clarificado foi diluído numa proporção de 1:5 em MEM+A e 1,0 mL foi adsorvido durante um período de 48 horas, num confluente de mono-camada de 104 células MA, ou macrófagos alveolares primários em balões de vidro de 25 cm . Após um período de adsorção de 2 horas a uma temperatura de 35°C, as mono-camadas foram lavadas duas vezes com MEM+A e foram adicionados 5,0 mL de MEM+A complementados com 5,0 % de soro fetal de vitelo irradiado com raios gamma. Os balões de vidro de isolamento do vírus foram incubados a uma temperatura de 35°C numa atmosfera de CO2 a 5% e observados diariamente para a comprovação do efeito citopático (ECP). O efeito citopático do ISU-P de VSRRS teve início com 0 envolvimento de pequenas células foci com cerca de 5 a 10 células e evoluiu à medida que muitas das células se tomaram picnóticas e se separaram do substrato durante um período de 4 a 7 dias após a infecção. O isolado do ISU-P foi confirmado como um isolado do VSRRS, através de uma marcação de anticorpo fluorescente com o anticorpo monoclonal específico do grupo VSRRS, designado no domínio público como SDOW17. Além disso foram examinadas células infectadas com o vírus marcado negativamente através da transmissão microscópica de electrões, quanto à presença de partículas de vírus. As partículas de vírus observadas eram esféricas e involtas com um diâmetro médio de virion de 65 nm e um diâmetro de núcleo de 27nm. Foi utilizado um vírus de cultura de tecido caracterizado desta forma para reproduzir experimentalmente abortos em adiantado estado de gestação e insucesso reprodutor em porcas adultas prenhes (Quadro 1). O Quadro 1 mostra que pequenas porcas jovens prenhes expostas, quer a homogenatos de pulmão infectados com ISU-P (SRRS-hm), quer com culturas de ISU-P numa cultura de célula (SRRS-tc) demonstraram sinais típicos da doença de síndroma respiratório e reprodutor em suínos (SRRS). Nos grupos SRRS-hm não foram paridos porcos normais. Nos grupos SRRS-tc somente 4 de 33 porcos foram partos normais. Em comparação, 29 de 30 (96,7%) dos porcos não expostos eram normais na altura do nascimento. O facto de o ISU-P, mesmo após purificação da cultura de tecido, poder reproduzir a doença de SRRS, confirma que este isolado está correctamente classificado como membro do género Arterivirus, na família Togaviridae. Verificou-se também que este isolado produz uma pneumonia intersticial moderada, em porcos infectados experimentalmente.

Um dos aspectos característicos do invento é o facto de o VSRRS. de acordo com o invento poder ser cultivado em determinadas células de cultura de tecido que replicam eficazmente o vírus a um nível suficiente para proporcionar a massa antigénica necessária para ser incorporada em vacinas que podem proteger porcos e/ou porcas jovens ou adultas prenhes do estímulo do SRRS. De forma ilustrativa, o VSRRS pode ser cultivado numa célula de cultura de tecidos designada MA 104 pela Whittaker BioProducts. As experiências de propagação de vírus, que empregam condições de cultura idênticas, com células MA 104 obtidas de três fontes diferentes indicam que existe um elevado grau de variabilidade entre as céluas MA 104 em termos da capacidade para suportar a replicação de VSRRS a elevado título. Uma cultura de células MA 104 designada por MA 104(M) pela Miles Inc., Divisão de Agricultura, Grupo de Produtos de Saúde Animal, e usada nos estudos aqui descritos, suportou consistentemente a replicação de VSRRS a elevado título. Além disso, um “clone” de linha de célula, gerado na Miles Inc., Divisão de Agricultura, Grupo de Produtos de Saúde Animal, que derivou da MA 104(M), designada 9009B, suporta a replicação do VSRRS a títulos mais elevados do que a linha de célula parental. Por conseguinte, a célula de cultura de tecido preferida para o cultivo de ISU-P é 9009B. O que a seguir se refere ilustra mais completamente a propagação da cultura de célula do ISU-P de VSRRS.

Foram cultivadas células de cultura de tecido [MA 104 (M) e 9009B] e mantidas em meios essenciais mínimos modificados da Dulbeco, alta glucose (DMEM/HG), complementados com de soro fetal de vitelo a 5% e tamponados com l,3g/L de bicarbonato de sódio. As passagens de célula foram realizadas com contagens de célula suficientes para atingir uma mono-camada confluente de 80-100% em 48 horas. Os “stocks” de ISU-P de VSRRS foram diluídos em DMEM/HG + de soro fetal de vitelo a 5% e tamponado para um pH de 6,8 com PIPES. O vírus foi inoculado numa folha de célula com uma baixa multplicidade de infecção (BMI) e incubada a 36°C. As culturas infectadas foram observadas diariamente quanto a ECP durante 4-7 dias. As culturas infectadas foram colhidas quando era evidente 90-100% de ECP. A massa antigénica máxima de vírus foi obtida após um ciclo de congelamento/descongelamento a -70°C. Os títulos de vírus malignos resultantes da propagação em células MA 104(M) variaram

Μ U

desde IO3,0 a 104‘5 de dose infecciosa de anticorpo fluorescente 50/mL (FAID^o/mL). Os títulos de vírus alcançados pela propagação no clone da célula 9009B variam entre os 105’5 e 106'5 de FAID 50/mL. Os títulos desta magnitude tornam possível incorporar massa antigéncia suficiente em escala comercial de formulações de vacinas VSRRS com um volume superior a 50 L.

Como seria reconhecível pelos peritos da técnica, uma vez que 0 VSRRS possa ser propagado a níveis elevados de massa antigénica, podem ser obtidos derivados deste vírus, incluindo as suas sub-unidades que são eficazes de acordo com o invento, por meios conhecidos na técnica, tais como extracção a partir do vírus. Adicionlamente, os antigenes protectores podem ser identificados ao nível molecular e reproduzidos e expressos, utilizando tecnologia recombinante.

Os fluidos virais para a formulação de vacinas foram inactivados por dois processos. Os inactivantes escolhidos foram formalina e etilenoimina binária (EIB). A inactivação foi realizada através de processos padrão, aqui descritos com mais pormenor. A inactivação de formalina foi completada através da mistura de fluidos virais com formaldeído em “stock” a 37% para uma concentração final de formalina de 0,05%. A mistura de vírus-formalina foi mantida à temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) com mistura constante durante 24 horas. Foram retiradas amostras às 0, 8, 12 e 24 horas e ensaiadas quanto à presença de vírus vivo em células 9009B. O efeito citopático e marcação fluorescente com anticorpo monoclonal de grupo específico detectou VSRRS vivo apenas às horas = 0. A inactivação com EIB foi completada combinando 0,1 M EIB em “stock” (20,5 g/L de HBR 2-bromo-etilamina em 0,175 N NaOH) com fluidos virais para uma concentração final de 1,0 nM de EIB. A inactivação foi realizada mantendo a mistura de vírus-EIB à temperatura ambiente com mistura constante durante 48 horas. A inactivação do vírus foi interrompida pela adição de 1,0 M de tiosulfato de sódio para uma concentração final de 0,1 mM com mistura durante 2 horas. Foram retiradas amostras às 0, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 horas e ensaiadas quanto a vírus vivo como acima se descreveu. O VSRRS vivo foi detectado apenas às horas = 0, 2 e 4.

Na preparação de uma vacina viva, modificada ou atenuada do invento, o VSRRS é alterado de modo a poder ainda infectar o hospedeiro de uma forma limitada, mas de modo a não poder provocar sinais de doença no hospedeiro. Normalmente, uma tal alteração do vírus tem lugar fazendo-o passar através de uma célula não hospedeira, tal como as células do Fígado do Macaco Verde Africano. Inicialmente o vírus pode não se desenvolver bem, ou mesmo não se desenvolver de todo. Neste último caso, poderá ser necessário forçar o vírus a adaptar-se ao crescimento em cultura de célula. Isto pode ser efectuado adicionando o vírus à cultura de célula a uma alta ou baixa multiplicidade de infecção (BMI). Em alternativa, o vírus pode ser feito passar forçada ou cegamente juntamente com as células até se ter observado um efeito citopático suficiente, o que indica que o vírus está a ser adaptado. À medida que a adaptação ocorre, o título de vírus irá aumentar, como se observa quando o ISU-P de isolado de VSRRS é feito passar da linha de célula MA 104(M) para a linha de célula 9009B. O Quadro 1 mostra que a cultura de tecido de ISU-P de VSRRS (SRRS-tc) feita passar poderá ser menos virulenta do que a isolada a partir de homogenatos de pulmão, um resultado típico de adaptação. Os dados revelados no Quadro 2 indicam que o processo de produção de vacinas de acordo com o presente invento é especialmente eficaz para conferir protecção contra o VSRRS. O ISU-P de VSRRS inactivado foi adjuvado como a seguir se indica. Os fluidos inactivados foram adjuvados com adjuvantes seleccionados a partir do grupo que consiste no adjuvante completo de Freund (ACF), adjuvante incompleto de Freund (AIF), um adjuvante à base de carbopol, e Adjuvante B da Diamond Scientific (Adj B). Estes adjuvantes representam os principais tipos utilizados no fabrico de vacinas. Os adjuvantes à base de óleo são representados por ACF, AIF e Adj B. Os adjuvantes aquosos são representados por carbopol. O ISU-P de VSRRS inactivado pode conter, opcionalmente, um conservante adequado.

As formulações de vacina com ACF e AIF podem ser preparadas por emulsão de vírus inactivado, tipicamente em volumes iguais de fluido de vírus inactivado e adjuvante utilizando um aparelho de fecho duplo luer de calibre 18 e duas seringas. Os fluidos foram expressos repetidamente através da montagem entre seringas até se formar uma emulsão semi-sólida espessa. As emulsões foram carregadas directamente para o interior das seringas para administração.

As formulações de vacinas com Adj B foram preparadas misturando Adj B em “stock” com um volume igual de fluidos virais ISU-P de VSRRS inactivado. O adjuvante e o vírus foram misturados por agitação à temperatura ambiente durante 1 hora. A vacina adjuvada foi transferida assepticamente para pequenos frascos de vidro de multidose estéril e armazenados a 4°C antes da administração.

As formulações de vacinas à base de carbopol foram preparadas misturando adjuvante carbopol em “stock” com fluidos virais inactivados para uma concentração final de ajuvante de 10% v/v. O adjuvante e o vírus foram misturados por agitação à temperatura ambiente durante um período de 4 horas. A vacina adjuvada foi transferida assepticamente para pequenos frascos de vidro de multidose estéril e armazenados à temperatura de 4°C antes da administração.

Utilizou-se um vírus ISU-P de VSRRS em títulos de pré-inactivação com um valor tão baixo quanto IO5,0 FAIDso/mL nas várias formulações de vacinas descritas.

Tendo em vista mostrar que o ISU-P de isolado de VSRRS podia constituir uma protecção contra o síndroma respiratório e reprodutor em suínos, foram conduzidos dois estudos de vacinação/estímulo. No primeiro estudo, 4 porcas jovens foram imunizadas com o ISU-P de VSRRS vivo por exposição oronasal ao vírus, tanto por via directa, como por contacto com os porcos infectados. Duas porcas jovens, da mesma idade, não foram imunizadas (não foram expostas) e foram guardadas em separado para servirem como controlos. As vacinadas por exposição directa (#57 e # 58) receberam 3,0 mL de vírus por inoculação intranasal. Elas sero-converteram-se passados 14 dias de exposição a um Teste de Anticorpo Indirecto Fluorescente. As porcas jovens expostas por contacto (#476 e #480) foram imunizadas por via oronasal após terem sido colocadas em contacto directo com porcos doentes. Estes porcos sero-converteram-se passados 90 dias de exposição. A sero-conversão é indicada por títulos AFI superior a 1:20.

Após a sero-conversão das porcas jovens imunizadas, o seu período fértil foi sincronizado e foram criadas. A gestação foi confirmada por ultrasom. No 90.° dia de gestação as porcas jovens vacinadas e as porcas jovens de controlo prenhes, receberam por via intranasal 3,0 mL de vírus de estímulo SRRS a um título de 1 X 104 FAID50.

As porcas jovens # 52 e #477 de controlo cedo demonstraram sinais de doença, uma vez que tinham pouco apetite e elevadas tempetauras do corpo (39,44-40°C) durante dois a três dias após o estímulo. Não foram registados sinais clínicos da doença nas porcas jovens (vacinadas) expostas ao ISU-P. Estes resultados demonstram protecção contra o síndroma respiratório e reprodutor clínico.

Todas as porcas jovens foram mantidas até que os porcos tivessem desmamado (4 semanas após o nascimento). O Quadro 2 mostra os resultados de nascimento desta experiência.

Os resultados do nascimento foram registados no que diz respeito ao período de gestação (normalmente o período de gestação é diminuído pela infecção SRRS), nados mortos ou fetos mortos, porcos fracos e dissecados. Estas dificuldades de nascimento são todas indicadoras de infecção de SRRS em porcas jovens ou porcas adultas prenhes. Foi também registado o número porcos.

Nenhuma das porcas jovens de controlo deu à luz porcos normais (0 de 22 porquinhos eram normais). Sete (7) dos 22 porcos nasceram mortos e 15 de 22 eram porcos nascidos com fracas condições físicas. A duração do período de gestação das porcas jovens de controlo foi encurtada em 2,5 dias, 0 que é típico de SRRS em suínos prenhes. No grupo imunizado (n=50) 40 porcos ou 80% foram de nascimento normal. Seis (6) de 50 porcos nasceram mortos e 4 de 50 fetos pareciam dissecados na altura do nascimento. Não houve porcos de fraca condição física no grupo vacinado. É óbvio que as porcas jovens previamente expostas ao ISU-P de VSRRS que foram criadas e posteriormente estimuladas estão protegidas contra o estímulo, tal como se demonstra pela inexistência de sinais clínicos directos de doença nas porcas jovens e pela protecção dos fetos que elas transportam.

Como se viria a verificar, uma vez que os reagentes do teste AIF que foram utilizados para determinar o estado sero das porcas jovens neste estudo eram derivados de ISU-P de VSRRS e uma vez que existe uma correlação directa entre o estado sero das porcas jovens e a protecção de SRRS, o isolado do ISU-P de VSRRS pode ser útil em testes de diagnóstico, tais como testes de Anticorpos Indirectos Fluorescentes, como aqui se demonstrou, ELISAs, ensaios de neutralização de soro, ensaios de Anticorpos Directos Fluorescentes e outras análises de diagnóstico conhecidos da técnica. Por esta razão, pode ser preparado e utilizada de acordo com o invento um ensaio de diagnóstico derivado de um antigene obtido a partir do ISU-P de VSRRS.

No segundo estudo de vacinação/estímulo, os porcos jovens (com 4 a 6 semanas de idade) foram vacinados com várias vacinas adjuvadas com ISU-P de VSRRS inactivado. Preparou-se um reservatório de antigene de vacina por inactivação do ISU-P de VSRRS com EIB, como anteriormente descrito e adjuvou-se, tanto com Carbopol, como com AIF/ACF, ou AdjB. Preparou-se um segundo reservatório de antigene de vacina por inactivação do ISU-P de VSRRS com formalina, como anteriormente descrito, e adjuvado com os mesmos 3 adjuvantes. Foram produzidas três vacinas falsas para se ter a certeza de que os adjuvantes e as células não poderiam estimular uma falsa resposta imunológica. As vacinas falsas foram produzidas adjuvando células de cultura de tecido não infectadas. Dois porcos foram vacinados com cada uma das vacinas. As vacinas foram administradas subcutaneamente aos dias 0, 21, 42 e 64. Sete dias após a última vacinação os porcos foram estimulados intranasalmente, com 103“ FAID5o de VSRRS vivo virulento. Todos os porcos foram observados diariamente após o estímulo quanto a sinais clínicos da doença. Adicionalmente foram recolhidas amostras de sangue e processadas para recuperação de vírus em cultura de tecido. O vírus vivo encontrado na corrente sanguínea após o estímulo significa que ocorreu uma virose.

Os títulos de neutralização do soro foram avaliados no início do estudo, no dia do estímulo e 19 dias após o estímulo. Deverá notar-se que o teste de neutralização de soro 11

é menos sensível do que o teste AIF utilizado no estudo anterior. Por conseguinte, não se podem comparar estes resultados de títulos com os resultados de títulos anteriores. O Quadro 3 contem a lista dos resultados do estímulo. Não foram observados sinais clínicos da doença, nem nos porcos vacinados, nem nos de controlo. Adicionalmente, nem nenhum dos vacinados, nem nenhum dos de controlo desenvolveu títulos de neutralização de soro durante o período de vacinação. Isto indica que não houve exposição ao vírus vivo durante este período de tempo (os controlos continuaram negativos) e indica também que as vacinas não estimularam uma resposta humoral suficientemente alta para ser medida por um teste de neutralização de soro. O facto de a resposta de título de neutralização de soro após o estímulo ter sido significativa indica que todos os porcos foram eficazmente estimulados com o vírus SRRS vivo. Uma verificação desta exposição a estímulo é a percentagem dos porcos de controlo que demonstraram viroses. Com a excepção de um, todos os porcos de controlo (87,5%) ficaram infectados. A resposta imunitária nos porcos vacinados foi tão forte que todos foram capazes de bloquer a virose. Apenas 1 dos 12 porcos vacinados (8,3%) demonstrava virose. Por conseguinte as vacinas protegeram 91,7% dos porcos.

Sem estar ligado a qualquer teoria particular do invento, crê-se que a passagem forçada do isolado de VSRRS original através de um clone especialmente adaptado das células de MA104(M) Macaco Verde Africano (9009B9) pode ter alterado com êxito um ou mais determinantes do vírus, resultando num aumento da capacidade imunitária deste vírus, de modo a permitir a produção de vacina numa área onde outros cientistas falharam.

Quadro 1: Reprodução de aborto em estado adiantado de gestação e insucesso reprodutor em porcas adultas expostas a ISU-P de VSRRS isolado comparardos com porcas adultas de controlo não expostas._

I. Grupo exposto a VSRRS

Porca adulta # Período de gestação(a) Preparação do vírus Nados-mortos Fracos Dissecados Normal 57 112 dias SRRS-hmb 6 8 0 0 54 108 dias SRRS-hm 6 1 0 0 649 112 dias SRRS-hm 3 7 0 0 58 112 dias SRRS-hm 4 4 3 0 166 112 dias SRRS- tcc 0 2 6 1 164 113 dias SRRS- tcd 2 2 5 1 80 110 dias SRRS- tce 2 2 2 2 Totais 23 26 16 4 a = O período normal de gestação de suínos é 114

b = inoculante homogenato de pulmão de porcos de VSRRS gnotobiótico positivo c = Dose infecciosa de 50 por ml (FAID 50/mL) de anticorpo fluorescente IO3,0 de VSRRS derivado de cultura de tecido d = VSRRS derivado de cultura de tecido, IO4,0 FAID 50/mL e = VSRRS derivado de cultura de tecido, IO5 0 FAID 50/mL II. Grupo de Controlo não-exposto

Porca adulta # Período gestação (a) de Preparação do vírus Nados-mortos Fracos Dissecados Normal 52 114 dias na 0 0 0 11 56 115 dias na 0 0 0 12 163 116 dias na 1 0 0 7 Totais 1 0 0 30

Quadro 2: Resultados de nascimento de porcas jovens imunizadas com ISU-P e não imunizadas Porca Título Período de Nados-mortos Porcos fracos Dissecados Normais jovem AFI gestação ou mortos No. 57v + 113 dias 2* 0 0 7 58v + 114 dias 4 0 3 11 476v + 113 dias 0 0 0 10 480v - 111 dias 5 7 0 0 52c - 112 dias 2 8 0 0 Totais 6 vacinados 7 de controlo 0 vac. 15 de controlo 4 vac. 0 de controlo 40 vac. 0 de controlo + indica um título AFI > 20 - indica um título AFI < 20 V indica vacinadas C indica controlos

r

QUADRO 3: Sumário da experiência de vacina inactivada de VSRRS SN Maligno SN Maligno Isolamento Grupo de Vacina Cada estímulo8 Pós-estímulo de V írus EIB, SRRP-Carbopol n = 2 <1:2 1:82 neg/neg EIB, SRRP-ACF/AIF n = 2 <1:2 1:4 neg/neg EIB, SRRP-AdjB n = 2 <1:2 1:5 neg/neg Form., SRRP-Carbopol n = 2 <1:2 1:23 neg/neg Form., SRRP- ACF/AIF n = 2 <1:2 1:2 neg/neg Form., SRRP-AdjB n = 2 1:3 1:8 neg/neg Grupo de Vacina Falsa AG Falsa - carbopol n = 2 <1:2 <1:2 pos/pos AG Falsa - ACF/AIF n = 2 <1:2 <1:2 pos/pos AG Falsa - AdjB n = 2 <1:2 <1:2 pos/pos a = Resposta SN ao 19.° dia após o estímulo, fim da experiência, b = Isolameno de vírus a partir de plasma em qualquer altura durante o período de teste do 19.° dia após estímulo. Isolamento de vírus detectado por EPC em células 9009B e confirmado por marcação AF do mesmo com anticorpo monoclonal SDOW17 específico do grupo VSRRS.

Lisboa,

Dt. Américo da Silva Carvalho $ DEZ. 2000 - Λ Li. \

Ageiiis Oíidci da Pí^.tícÒí!;, !d:;slrral R.C&íSio, £0'í-C- ϊ - 1373-03i Uí2CA Teleis. 213 851 33'3 - 213854 '313

Claims

REIVINDICA ÇÕES 1. Isolado do Vírus do Síndroma Respiratório e Reprodutor em Suínos (VSRRS) designado como ISU-P e que está a ser depositado sob n.° de Acessão N.° ATCC VR 2402.
2. Processo para cultivar o isolado de VSRRS de acordo com a reivindicação 1 numa cultura de tecido susceptível de ser infectada para replicar o vírus numa quantidade suficiente para proteger animais do SRRS ou para ser usado no diagnóstico de SRRS, ou para identificar a estrutura molecular de VSRRS para o desenvolvimento de produtos recombinantes, caracterizado por compreender a inoculação do vírus na cultura de tecido e colheita do vírus replicado.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a cultura de tecido compreender uma linha de célula.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a cultura de tecido ser uma linha de célula de Fígado de Macaco Verde Africano.
5. Cultura de tecido que contem o isolado de VSRRS de acordo com a reivindicação 1.
6. Cultura de tecido de acordo com a reivindicação 5 em escala comercial de <251 de Dose Infecciosa de Anticorpo Fluorescente de 50 por mL de FAIDso a um título de <105,()/ml.
7. Processo para a preparação de uma vacina eficaz na protecção de porcos contra o SRRS que compreende proporcionar-se o isolado de VSRRS de acordo com a reivindicação 1, libertando o vírus de uma cultura de tecido e ajustando a massa antigénica por diluição, concentração ou extracção para produzir uma quantidade imunologicamente eficaz da massa antigénica para uma subunidade ou formulação recombinante viva (atenuada), e inactiva.
8. Vacina que compreende o isolado de VSRRS de acordo com a reivindicação 1.
9. Vacina que é preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o VSRRS ser modificado vivo (atenuado) e ser em forma líquida, congelada ou dissecada.
10. Vacina de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizada por o VSRRS ser inactivado e adjuvado e opcionalmente conter um conservante apropriado.
11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o adjuvante ser, tanto à base de óleo, como à base de água.
12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o adjuvante ser escolhido de Adjuvante Completo de Freund e Adjuvante Incompleto de Freund.
13. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o agente inactivante ser etilenoimina Binária, propioclatona Beta ou formalina.
14. Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a cultura de tecido ser uma linha de célula de Fígado de Macaco Verde Africano. Lisboa, j) 9 DEZ. 2000

Dr. Américo da Silva Carvalho Agente Cfxlc

Teieís. 213 «51333 - 213 854 613