JPH06505964A

JPH06505964A - ヒトロタウイルス，ワクチンおよび方法

Info

Publication number: JPH06505964A
Application number: JP4501860A
Authority: JP
Inventors: ワード，リチャード　エル．
Original assignee: チルドレンズホスピタルメディカルセンター
Priority date: 1990-11-16
Filing date: 1991-11-04
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2013-05-20
Also published as: DE69130068D1; GR3027744T3; ATE170081T1; KR0171434B1; EP0557427A4; BR9106982A; US5474773A; US5695767A; JP2753393B2; AU702044B2; DK0557427T3; CA2096315A1; AU9060391A; DE69130068T2; ES2121841T3; EP0557427A1; AU3787795A; CA2096315C; WO1992008786A1; EP0557427B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】見上Ｐノご竺←引ん工”）’）ｆ”、りしＬ鳩左迭発明の分野本発明は、分離ヒトロタウィルス、多様なヒトロタウィルス血清型に対する中和抗体を刺戟するロタウィルスワクチンに関連しており、さらに異なる血清型のヒトロタウィルスによって引き起こされたロタウィルス疾患に対してヒトにワクチン注射するための方法ならびに既存の中和抗体の力価およびロタウィルス疾患に対する初回ワクチン注射後に作られる抗体を産生ずる細胞の記憶を強化するための方法に関連する。

背景急性の感染性下痢は世界の多くの地域における疾患と死亡の主要な原因になっている。開発途上国においては、下痢性疾患の影響は極めて大きい、アジア、アフリカおよびラテンアメリカでは、毎年３０〜５０億の下痢患者がおり、これらの症例のうち約５００−１０００万人が１９７３年に発見されて以来、ロタウィルスは小児及び幼児における重症の下痢の最も重要な原因の一つとみなされてきた。ロタウィルス疾患は毎年１００万以上の死亡の原因になっていると推定されている。ロタウィルス−誘発疾患は最も一般的には６ケ月から２年以内の子供がかかり、一般に熱帯地域で毎年、より涼しい月に流行のピークがある。ロタウィルスは典型的に約１日から約３日の潜伏期で糞−口腔ルートによりヒトからヒトに伝播する。６ケ月から２歳児群における感染と異なり、新生児は一般に無症状かあるいは軽症である。幼児に通常みられる重症とは異なり、大部分の大人のロタウィルス感染は軽症か無症状である。というのは、このような感染は一般にはロタウィルスを分泌することが知られている子供との接触の結果起こる再感染だからである。

０ｆｆｉｔ、Ｐ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｃｐｍｐ、Ｔｈｅｒ、、８　（８）　：　２１−２６（１９８２）。

ロタウィルスは一般に球形で、その名前はこれらが外面と内面にはつき分かれた、二重殻キャップシト構造をもっていることに由来している。外面キャプシドが約７０ｎｍの直径に対して、内面キャプシドの直径は約５５ｎｍである。Ｆｌｅｗｅｔｔ、Ｔ、Ｈ，ｅｌ　ａｌ：Ｊ、ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ、、　２７　：６０３ −６１４　（１９７４）。典型的に、ロタウィルスの二重殻キャプシド構造はゲノムを含む内部蛋白質殻すなわちコアを取り囲んでいる。ロタウィルスのゲノムは少なくとも１１個の別々のウィルス蛋白質をコードする二重鎖ＲＮＡの２個のセグメントを含んでいる。これらのウィルス蛋白質のうちのＶＦ６およびＶＦ６と命名されている２つは二重殻キャップシト構造の外面に配列していると考えられている。ロタウィルスの内面コアにはＶＦ６と命名されている１つのロタウィルス蛋白質がある。ロタウィルス感染に引き続く免疫反応を引き起こす上でのこれら３つの特別なロタウィルス蛋白質の相対的重要性はまだ明らかではない。それでも、ＶＰ６蛋白質は群抗原および亜群抗原を構成し、ＶＦ６およびＶＰ７蛋白質は血清型特異性の決定基である。

ＶＰ７蛋白質はゲノムセグメント７．８または９の錬成産物である分子量３８，０００の糖蛋白質と考えられている。この蛋白質はロタウィルス感染後の主要な中和抗体の生成を刺戟すると考えられている。ＶＰ４蛋白質はゲノムセグメント４の錬成産物である分子量約８８゜０００の非−糖化蛋白質であると考えられている。この蛋白質もロタウィルス感染後の中和抗体を刺戟すると考えられている。

ＶＦ６およびＶＰ７蛋白質はそれに対して中和抗体が作られるウィルス蛋白質であるため、ロタウィルス疾患に対する予防を可能にするロタウィルスワクチンの開発のための最良の候補になり得ると考えられている。しかしなから、ロタウィルスに感染した細胞はＶＦ６およびＶＰ７蛋白質を分泌せず、したかって、免疫系は細胞が溶解してロタウィルスか放出されたときだけこれらの蛋白質を見るようである。

ヒトロタウィルスはＶＦ６およびＶＰ７蛋白質における差異をもとにして６つの血清型、すなわち血清型１−４および８−９の６個の血清型に分けられる。ヒトロタウィルスはまた内部キャップシトＶＰ６蛋白質の抗原差を基にして亜群Ｉおよび■という２つの亜群に別けられるかもしれない。ヒトロタウィルスの血清型２株と８株は通常亜群Ｉに属し、ヒトロタウィルス株の血清型ｌ、３．４および９は通常亜群■に属する。現在大半の疾患は血清型１−４株に属するロタウィルスによって引き起こされると考えられており、多くの地理学上の地域では血清型１株が圧倒的に見出されている。

亜群分けおよび血清型分けに加えてヒトロタウィルスはさらに２つの群に大まかに分類されている。すなわちゲル電気泳動中のＲＮＡゲノムセグメントの移動度をもとに“ショート′または“ロング”　ＲＮＡパターンである。亜群Ｉヒトロタウィルス株は典型的に特徴的な“ショート”電気泳動パターンをもっているのに対して、亜群■ヒトロタウィルス株は典型的に特徴的な“ロング電気泳動パターンをもっている。ロタウィルスＲＮＡの“ショート１パターンは遺伝子セグメントＩＯおよびｌｌの泳動順序における逆数と相関している。しかしながら、現在までに分離されているロタウィルス株の大部分は特徴的な“ロングパターンをもった株である。

重症の下痢を引き起こすヒトロタウィルスは１１個のゲノムセグメントすべての間の遺伝的連鎖をもとに２つの“ゲノグループにもともと分けられていた。しかし、１９８２年に、この連鎖が破壊されたようにみえる最初の天然ヒトロタウィルス株が分離された。このヒトロタウィルス株はＡＵ−１と命名された。それ以来、ＡＵ−１ヒトロタウィルス株に似た特性をもついくつかのヒトロタウィルスが以下に示すように報告されてきた。

２４　：　３２１−３２７　（１９８８）。これらのヒトロタウィルスは亜群Ｉに属するが、しかし血清型３と同定され、多くの動物ロタウィルス株に共通の特性である“ロング′電気泳動的パターンをもっている。こうして、従＃コ＝；Ａ　Ｕ　−１（亜群Ｉ、“ロング電気泳動タイプ）と命名された原型株の遺伝的相同をもとにして３つのヒトロタウイルスゲノグループが定義されていた。

Ｗａヒトロタウィルス血清型１亜群■株と親類と考えられている米国特許Ｎ１１４，８５３，３３３および４，３４１．８７０参照。

ヒトロタウィルスは分画化ゲノムて作られるので、２つの区別されたロタウィルスの株による細胞の同時感染により双方の親株から遺伝的に受けついだ遺伝子セグメントを有するロタウィルスの子孫の生成が結果として起こり得る。亜群■株間の推定上の自然再構築は何年か前に報告されたが、亜群■および■ヒトロタウィルス間の自然再構築はまだ分離されず同定もされていない：Ｈｏ５ｈｉｎｏ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、　：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２　：　８７０１−８７０４　（１９８５）。しかし最近、亜群、血清型および電気泳動望の間に異型の相関を有するヒトロー２８３３　（１９８９）　；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓｊ、Ｄ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、　：２４　：３２１−３２７　（１９８８）。ヒトロタウィルス株Ｄ、血清型１および牛ロタウィルスＵＫ株から由来した再構築ロタウィルスを明白に開示している米国特許番号４，５７１，３８５も参照のこと。

ロタウィルス疾患の深刻さおよび現在の治療が体液や電解質の置換というような、非特異的な支持手段に限定されていることから、ヒトロタウィルスのすべての血清型に対して完全な予防効果を発揮する効果的なロタウィルスワクチンの開発は、米国および開発途上国におけるヘルスケアのために重要な優先課題である。

ロタウィルスワクチンの開発に向けていくつかの試みがなされた。

ヒトについて評価を行なった２つのアプローチは肝、弱毒化ヒトロタウィルス株を使用し、さらに動物起源のロタウィルス株を用いている。

る程度に存在しなくても、異型ヒトロタウィルスに対して小児に部分的予防力を与えることが示唆された。

７　：１８９−１９４　（１９８５）；およびＣ１ａｒｋ、　Ｈ，Ｆ。

ｅｔａｌ、：Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１５８　：　５７０−５８７　（１９８８）参照。しかし、引き続いての効能治験から、これらの牛ロタウィルスワクチンはせいぜい僅かな予防効果しかないことがわかったｏ　Ｈａｎｌｏｎ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｌａｎｃｅｔ。

１　：１３４２−１３４５　（１９８７）　；ＤｅＭｏｌ、Ｐ、ｅｔａｌ。

８９）参照。たとえば、ＲＩＴ４２３７牛株ロタウィ小株ロタウィルスはＦｉｎｉｓｈ幼児におけるロタウィルス感染にもとずく顕著な下痢を臨床的に予防するのに成功した１　：　９７７−９８１　（１９８４）参照。しかしながら、開発途上国においてそのあと評価したところ、同じような効果はなかった。Ｈａｎｌｏｎ、Ｐ、ｅｔ　ａｔ、　：Ｌａｎｃｅｔ、　１　：　１３４２−１３４５　（１９８７）；およびＤｅＭｏｌ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｌａｎｃｅｔ、２　：　１０８　（１９８６）参照。さらに米国特許番号４，６３６．３８５；４．３４１，７６３．および４．１９０．６４５も参照のこと。

アカゲザルロタウイルス（ＲＲＶ）ワクチン株ＭＭＵ１８００６　（血清型３）はいくつかの研究において免疫抗原性となることが示された：　Ｌｏｓｏｎｋｙ、Ｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、　ニア　５７　（１９８９）　；ａｎｄ　Ｗｒｉｇｈｔ、Ｐ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、：Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、８０　：　４７３−４８０　（１９８７）、Ｌかし軽い発熱および水性便を含む軽症の副作用を伴った。

１５３　：　８３２−８３９　（１９８６）　；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｂ、Ｌ。

９　：　７５３−７５７　（１９８９）。ＲＲＶワクチンを含む臨床評価はベネズエラで実施された研礎で重度の下痢に対する予防効果を明らかにした：　Ｆｌｏｒｅｓ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｌａｎｃｅｔ、Ｉ　：　８８２−８８４　（１９８７）およびＳｗｅｄｅｎ。

Ｇｏｔｈｅｆｏｒｓ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、：　Ｊ、［ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１　５　９　：　７　５　３　−７５７（１９８９）、しかしＮａｖａｊｏのインドの子供の研究では予防効果はなかった。Ｓａｎｔｏｓｈａｍ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　：　２　ツの候補ロタウィルスワクチンの研究の分野、プログラムと抄録：第２７回抗菌剤および化学療法学会にューヨーク）、９９　（１９８７）参照。

こうして、ＲＲＶ　ｉ：：よる効能治験からこのワクチン株は同型血清型３ヒトロタウイルスに対して予防するが異型ヒト株に対しては予防効果がないことが示された：　Ｐｌｏｒｅｓｊ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２７　：　５１２−５１８　（１９８９）　、さらに、このアカゲザルロタウイルスワクチンを含めて実施された他の諸研究の結果は異なっていた：　Ｃｈｒｉｓｔｙ、　Ｃ，ｅｔａｌ、：Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｒｅｓ、、２５　：　ｌ　５７Ａ　（１９８９）参照。

また米国特許番号４，７５１．０８０および４，７０４゜２７５も参照のこと。

ロタウィルス自然感染後の血清型−特異的予防効果も報告されており、以前に感染したヒトに存在する中和抗体の力価と関連する：　Ｃｈｉｂａ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、　：　Ｌａｎｃｅｔ、２　：　４１７−４２１　（１９８６）。こうして、血清型−特異的中和抗体はロタウィルス疾患に対する予防の一次決定因子かもしれない。したがって、少くとも６個のヒトロタウィルスがあるために、単一血清型または異型（動物）ワクチンはヒトロタウィルス疾患に関連したすべての血清型に対して完全な予防効果を与えるのには不十分かちしれない。

ヒトおよび動物両方にロタウィルスが一次感染すると、通常１つの優勢なロタウィルス血清型に対する中和抗体の産生が起こることが報告されている。ただしこの場合他の血清型に属するロタウィルスに対するいくつかの中和抗体もしばしば検出される：　Ｓｅｅ　Ｇａｒｎａ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、　：ｔｎｆｅｃｔ、［ｍｍｕｎ、、４３　：　７２２−７２９　（１９８４）　；Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ、Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２０　：　３４２　−　３　４　６　（１９８４）　；Ｃ１ａｒｋ、Ｈ，Ｆ、ｅｔ　ａｌ、：Ｐｅｄ、Ｉｎｆｅｃｔ。

７　）　＋Ｚｈｅｎｇ、Ｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２６　：　ｌ　５０６−１５１２　（１９８８）　；ａｎｄＢｒｕｓｓｏｗ、Ｈ，ｅｔａｌ、：Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１５８　：　５８８ −５９５　（１９８８）。

ひき続いてのロタウィルス感染または異なる血清型の接種によって、新しいウィルス株に対する中和抗体産生および、おそらく記憶消失反応により以前に感染に関与した他のロタウィルス血清型に対する既存抗体力価の増加がもたらされた：　Ｓｅｅ　Ｃ１ａｒｋ、Ｈ，Ｆ、ｅｔ　ａｌ、　：　Ｐｅｄ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

３）　；　Ｕｒａｓａｗａ、Ｓ、ｅｔ　ａｔ、　：Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、、８１　：　１−１２　（１９８４）　；　Ｗａｄ、Ｒ，Ｌ、ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊ、１ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、　ｌ　５４　：　８７１−８８０　（１９８６）　；Ｗｏｏｄｅ、Ｇ、Ｎ、ｅｔａｌ、ニア　）　；　Ｂｒｕｓｓｏｗ、）（、ｅｔ　ａｔ、：　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６　９　：　１　６　４７−１　６５８　（１９８８）　；ａｎｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｄ、１．ｅｔ　ａｌ。

：Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ、、１２　：　２９３−３００　（１９８９）　。

しかしながら、これらの研究は以前の感染により既存抗体をもつ小児におけるヒトロタウィルスの異型株に対する中和抗体力価を増強させるロタウィルスのワクチン株の能力を評価していない。それらの研究はまた、異型株による以前のワクチン注射が、ひきつづいての自然感染の間にヒトロタウィルスに対する中和抗体研究を広げたり増大させることができるかを明確にさせていない。それにもかかわらず、自然感染をひきおこす株と同じロタウィルス血清型で子供らにワクチン注射を施すと、感染後に生成した中和抗体は再度のワクチン注射のときにワクチンが“つく“ことを阻害する：　Ｔａｊｍａ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　：Ｖａｃｃｌｎｅ、８　：　７０−７４　（１９９０）参照。

したかって、少くとも血清型１−４、と（にヒトロタウィルスの最も優勢な血清型と信じられている血清型ｌに属するヒトロタウィルスに対する効果的な免疫を与えるヒトロタウィルスワクチンに対する切実な要求がある。

発明の要約手短かに言えば、本発明は新しいヒトロタウィルスの発見を通じてロタウィルス技術の現状における短所および上述の諸問題のいくつかを改善する。本発明のヒトロタウィルスは一般にロタウィルス疾患と診断された小児および幼児が分泌した糞材料から分離される。本発明と合致するロタウィルス株の例にはＨＲＶ２４８、ＨＲＶＢ２−１２Ｃ２およびＨＲＶ４０８が含まれる。

ＨＲＶ２４８と命名されたヒトロタウィルス株はユニークなヒト天然遺伝早開再構築ロタウィルスである。ＨＲＶ２４８株はヒトロタウィルスの血清型２および４に対する超免疫モルモット血清によって中和されるが、血清型４に対する血清型決定モノクローナル抗体によってのみ認識される。ＨＲＶ２４８株は亜群■に属し７ゲル電気泳動上でのＲＮＡゲノムセグメントの移動度に基ずくロング電気泳動ＲＮＡパターンをもっている。ＨＲＶ　２４８株のＲＮＡのハイブリッド形成によってわかったことは、それが天然遺伝早開再構築ロタウィルスであるということであり、その中のＶＰ４遺伝子は血清型２ヒトロタウイルスから導かれ、ＶＰ７遺伝子は血清型４ヒトロタウイルスから導かれたということである。ＨＲＶ　２４８株の１１個のＲＮＡセグメントのうちの７個は、原型Ｗａヒトロタウィルス株に属するヒト株とハイブリッドを作る。ＨＲＶ２４８株のその他の４個のＲＡＮセグメントは基本型ＤＳ−１ヒトロタウイルス株に属する株とハイブリッド形成する。

ＨＲＶ８９−１２Ｃ２と命名されたヒトロタウィルス株もまた亜群■に属するユニークなヒトロタウィルスであり、血清型決定モノクローナル抗体を用いて血清型ｌと決められた。ＨＲＶ８９−１２Ｃ２株はロング電気泳動ＲＮＡパターンを有し、この株に対して作られた超免疫モルモット血清は主として血清型ヒトロタウィルスを中和するが、より少ない程度ながら、血清型２−４．８および９に属するヒトロタウィルスも中和する。

ＨＲＶ４０８株については、ヒトロタウィルスの血清型ｌ、２および３に対する超免疫モルモット血清によってそれは中和されるが、血清型３だけに対する血清型決定モノクローナル抗体によって認識される。ＨＲＶ４０８株は亜群■に属し、典型的に亜群■ロタウィルスと関連する特徴的なロング電気泳動ＲＮＡパターンを有する。

ＣＪＮと命名されたロタウィルス株は亜群■に属しゲル電気泳動中でのＲＮＡゲノムセグメントの移動度によるロング電気泳動ＲＮＡパターンを有する。ＣＪＮ株は血清型ｌ、２および４に対する超免疫モルモット抗血清によって容易に中和され、ＨＲＶ　ＣＪＮ株に対する超免疫抗血清は主としてヒトロタウィルスの血清型ｌおよび３を中和する。ＣＪＮ株は血清型ｌに対する血清型決定モノクローナル抗体によってのみ認識される。

ＨＲＶ８９−１２Ｃ２、ＨＲＶ４０８、ＨＲＶ２４８およびＣＪＮと命名されたヒトロタウィルスは、それぞれ閲覧利用番号ＶＲ２２７２、ＶＲ２２７３、ＶＲ２２７４およびＶＲ２２７５のもとにＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）、１２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｎ２０８５２に供託されている。ここで示された公開の一般利用可能性は即時発明のヒトロタウィルスを得る最も簡単な方法であるが、本発明の教えにかんがみたあれこれの方法によって類似のそして機能的に実質上同様のロタウィルスが作られるかもしれないということはあり得ないことではないし、また不可能なことでもない。このような機能的、そして実質的に同一のロタウィルスは本発明のヒトロタウィルスと生物学的に同等と考えられ、したがって本発明の一般的範囲内にある。また、技法に熟練した人達がここに記載のロタウィルスの生物学的ならびに機能的特性を実質的に変えることなく、即時発明により得られるような、実質的に同一のロタウィルスも本発明の範囲内にある。さらになお、本発明のヒトロタウィルスから由来する生きて弱毒化された、あるいは不活化したロタウィルスもまた即時発明の範囲内にある。

本発明のヒトロタウィルスは適当な組合せに配列すると、ワクチンとしてヒトに投与したとき、ヒトロタウィルスの少くとも血清型ｌ、２．３および４、そしておそら（８および９によって誘発されるロタウィルス疾患を効果的に予防する、ヒトロタウィルスの多様な血清型に対する中和抗体の生成を刺戟すると考えられている。たとえば、ＨＲＶ２４８　（ＶＨ２２７４）株は、ヒトロタウィルスの少くとも血清型２および４に対する中和抗体を刺戟する能力を有すると考えられているのに対して、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２（ＶＨ２２７２）株は、６個ノヒトロタウイルス血清型、すなわち１−４および８−９、およびとくに血清型ｌのすべてに対する中和抗体を刺戟スル能力ヲ存スル。ＨＲＶ４０８　（ＶＨ２２７３）株は主として血清型３に対する中和抗体を作ると考えられているが、それにもかかわらずＨＲＶ４０８　（ＶＲ２２７３）株はヒトロタウィルスのｌおよび２のような、他の血清型に対する中和抗体生成を誘起する能力をもっている。ＣＪＮ　（ＶＨ２２７５）株に関しては、この株はヒトロタウィルスの血清型１−４に対する中和抗体生成を刺戟する能力をもつと考えられている。

さらに本発明は部分的には、ヒトロタウィルスの少くとも血清型１−４に対するヒト中和抗体生成を刺戟する能力を存する新しいワクチンの発現も含んでいる。

即時発明の新しいワクチンは、ワクチン注射後ヒトロタウィルスの少くとも血清型１−４に対する中和抗体の生成を刺戟するための適当な薬剤学的担体と混合した単一ロタウィルスまたはロタウィルスの組合せを含んでいる。即時発明のワクチンを生成するために選択されたロタウィルスは生きた、弱毒化法の形かもしれないが、その代わりとして不活化法の形のこともある。生きて弱毒化され、または不活化法が選択されると、ワクチンは経口または鼻内へ投与されるだろう。しかし、好ましいのは生きた、弱毒化法は経口または鼻経路で、そして不活化法はでき得れば筋肉内注射のような非経口的接種がよい。即時発明と一致するワクチンの例には適当な薬剤学的担体と混合したＨＲＶ８９−１２Ｃ２株、または最初のワクチン注射後のヒトロタウィルスの血清型１−４に対する中和抗体を生ずる能力を存するワクチンを生成する適当な薬剤学的担体と混合し°たＨＲＶ２４８またはＨＲＶ８９−１２Ｃ２株を含むワクチンが含まれる。他の例には、ａ、）ＨＲＶ２４８、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２および４０８、ｂ、）ＨＲＶ２４８、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２、ＨＲＶ４０８およびＣＪＨ，ｃ、）ＨＲＶ２４８およびＣＪＮ、ｄ、　）ＨＲＶ２４８およびＨＲＶ４０８、またはｅ、）ＨＲＶ２４８、ＣＪＮおよびＨＲＶ４０８（７）組合せから成る適当な薬剤学的賦形剤との混合を含むワクチンが含まれる。

誘発はまた初回のワクチン注射ののちヒトにおける既存の中和抗体力価を増強するための新しい方法の発見も企図している。これは即時発明と一致して、ＶＦ６およびＶＰ７蛋白質をコードする遺伝子が適当な薬剤学的担体と混合したヒト以外の動物から得たものであるようなロタウィルスを含むワクチンでヒトを再ワクチン注射することによって達成される。驚くべきことに最初のワクチン注射のあとに誘発された既存の中和抗体の力価だけが増大し、中和抗体を発現する細胞の記憶だけが、ヒト血清型のいずれかによって引き起こされるヒトロタウィルス疾患に対して効果的な予防効果を与えるようなロタウィルスで再ワクチン注射することによって拡大されることが見出された。

こうして、即時発明の増強ワクチンで再ワクチン注射することによって最初の免疫を行ったのちに現れる抗体を産生ずる細胞の記憶を拡大し、中和抗体力価を一貫して増強することがいまや可能である。即時発明と一致すイルス株のような、生きた自然に弱毒化された異型のヒト以外の動物ロタウィルス株の形での異型ロタウィルス株を含んでいる。即位発明の増強ワクチンを生成するのに用いられるかもしれないその他の異型のヒト以外の動物ロタウィルス株の例には、ＮＣＤＶ牛、ＵＫ牛、ＣＰ−１牛、Ｃ５−１６０牛、ＰＰ−１牛、ＴＣ牛、Ｂ２２３牛、ＫＫａ牛、Ｖ６Ｏ１３牛、Ｔ５１牛、Ｔｅ３牛、含まれる。

即時発明の新しいワクチンを作るにあたっては、作られるワクチンの型、たとえば経口、鼻または非経口的に応じて賦形剤は消毒水、通常の生理食塩水または類似のものになるだろう。

上記本発明の特性および利点は、即時発明の好ましい態様の例証である以外の付図、詳細な記述および例を参照することによってより良く理解されるであろう。

図の説明この発明の範囲内での体系化を図示している、添付の図について：図１には、ＨＲＶ２４８（ＡＴＣＣＶＲ２２７４）およびＨＲＶ４５６のヒトロタウィルス株のゲノムのＲＮＡセグメントの電気泳動分析を基本型ＷａおよびＤＳ−ｉのヒトロタウィルス株について示す。

図２には、ＣＪＮ（ＡＴＣＣＶＲ２２７５）ヒトロタウィルスのゲノムのＲＮＡセグメントの電気泳動分析を基本型アカゲザルロタウイルスとこれら２つの株の間のリアソータントについて示す。

図３には、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２（ＡＴＣＣＶＲ２２７２）ヒトロタウィルス株のゲノムのＲＮＡセグメントの電気泳動分析を、長い電気泳動パターンを呈し、同じ培養法を適応させた株と共に示す。

図４には、ＨＲＶ４０８（ＡＴＣＣＶＲ２２７３）ヒトロタウィルスのゲノムのＲＮＡセグメントの電気泳動分析を、長い電気泳動パターンを呈するその他のロタウィルス株と共に示す。

図５Ａ−５８＋、：は、ＨＲＶ４５６、ＨＲＶ２４８　（ＡＴＣＣＶＲ２２７４）、Ｗａ、ＫＵＮ、およびＡＵ−１などのヒトロタウィルス株より採取したゲノムのＲＮＡと、Ｗａ、ＫＵＮ、およびＡＵ−１株より調製した３２Ｐ−標識鎖状ＲＮＡプローブとの間で得たハイブリダイゼーションパターンを示す。図５ＡにはＵＶ先光照明下臭化エチジウム染色ゲルの写真を示す。図５Ｂには図５Ａに対応するオートラジオグラムの写真を示す。

Ｗａロタウィルス株のＲＮＡセグメントのおおよその位置を左側に示す。

図６Ａ−６Ｂには、図６Ａ−６Ｂの上部にコース別に示されているヒトロタウィルス株より採取したゲノムのＲＮＡと、ＨＲＶ４５６ヒトロタウイルス株より調製した。３２Ｐ−標識鎖状ＲＮＡプローブとの間で得たハイブリダイゼーションパターンを示す。図６ＡにはＵＶ先光照明下臭化エチジウム染色ゲルの写真を示す。図６Ｂには図６Ａに対応するオートラジオグラムの写真を示す。

ＨＲＶ２４８（ＡＴＣＣＶＲ２２７４）ｔニドロタウィルス株のＲＮＡセグメントのおおよその位置を左側に示す。

Ｕ！Ｊ７Ａ−７Ｂには、図７Ａ−７Ｂの上部にコース別に示されているヒトロタウィルス株より採取したゲノムのＲＮＡと、ＨＲＶ２４８（ＡＴＣＣＶＲ２２７４）　ヒトロタウィルス株より調製した３２Ｐ−標識鎖状ＲＮＡプローブとの間で得たハイブリダイゼーションパターンを示す。図７ＡにはＵＶ先光照明下臭化エチジウム染色ゲルの写真を示す。図７Ｂには図７Ａに対応するオートラジオグラムの写真を示す。ＨＲＶ４５６ヒトロタウイルス株のＲＮＡセグメントのおおよその位置を左側に示す。

詳細な説明今回の発明およびそれに付随する利点の多くのより徹底的な評価を例証し、規定するため、ヒトロタウィルス、ヒトロタウィルスの多数の血清型に対する中和抗体を刺激するロタウィルスワクチン、さらに、異なる血清型のロタウィルスによって引き起こされるロタウィルス疾患に対するワクチンをヒトに接種するための方法およびロタウィルス疾患に対する一部ワクチン接種後に生ずる既存の中和抗体を表現する細胞の力価と記憶を拡大させるための方法に関して、以下の詳細な説明を行う。

ヒトロタウィルスＨＲＶ８９−１２ｃ２０タウイルスはオハイオ州シンシナティの生後１４か月の被験者の便から分離される。

ＨＲＶ８９−１２Ｃ２０タウイルスハそ（７）ＲＮＡゲノムのゲル電気泳動によれば亜群■に属し、モノクローナル抗体の血清型の決定に対するその反応によれば血清型ｌである。血清型ｌの基本型ヒトロタウィルスを検出することに加え、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２０タウイルスに対する抗血清により血清型２−４および８ −９の基本型ヒトロタウィルスを検出する。ＨＲＶ８９−１２Ｃ２ヒトロタウイルスは、Ｗａｒｄ、　Ｒ，Ｌ、ら：　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９ニア４８−７５３　（１９８４）に述べられているとおり、アフリカミドリザルの腎臓（ＡＧＭＫ）の−次細胞の２回の継代とＭＡ−１０４細胞の４回の継代によって培養・順応された。その後ＭＡ−１０４細胞内でプラークを３回精製し、これらの細胞内でさらに２回継代させた。ＨＲＶ８９−１２Ｃ２ヒトロタウイルス株は少なくとも１１回の組織培養による継代を経ている。アメリカ型培養採取法で沈殿させるためにさらに１回継代した。

上で指摘したとおり、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２ヒトロタウイルスをＡＴＣＣで沈殿させ、ＡＴＣＣＶＲ２２７２の受入れ番号をつけた。ＨＲＶ８９−１２ｃ２ヒトロタウイルスの細胞の１１代口の継代培養基の長い電気泳動パターンを図３に示す。細胞のこの１１代口の継代培養基は、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　１．ら：　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ、、ｌ　２　：　２９３−３００　（１９８９）に述べられている、蛍光病巣検定法によって測定したところによると、４Ｘ１０７病巣形成単位／−を含有した。このロタウィルスに生まれつき感染している乳児は血清型ｌに対する大半の中和抗体を産生ずるのみならず、血清型に対してはほぼ５０％、血清型２．４．８および９に対してはさらに低いが検出てきるほどの中和抗体も産生じた。Ｗａｒｄ、　Ｒ，Ｌ、ら：Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、印刷中（１９９０年１２月）を参照すること。これらの中和抗体反応を引き起こすロタウィルスによる生まれつきの感染症を以前に経験した被験者のワクチン接種により、６種類のヒトロタウィルスのすべての血清型に対する中和抗体の大発生を経験した。

表　ＨＲＶ８９−１　２Ｃ２基本型ヒトロタウィルスに対する８９−１２ｃ２に対して生ずる抗血清の中和力価株　血清型　中和力価８９−１２ｃ２　１　２５６．０００Ｗａ　１　３００．０００ＤＳ−１２１，０００Ｐ　３　５．０００ＳＴ−３４１，４００６９Ｍ　８　１．０００Ｗ１６１　９　３．０００ＨＲＶ−２４８ヒトロタウイルスの遺伝子群間リアソータントロタウイルスをバングラブシュの感染症を起こしている生後１７か月の乳児の便から分離した。これをＨＲＶ８９−１２Ｃ２０タウイルスについて述べたように培養・順応させた。−次ＡＧＭＫ細胞の２回の継代とＭＡ−１０４細胞の９回の継代の後、ＨＲＶ −２４８ヒトロタウイルスのプラークをＭＡ−１０４細胞内で３回精製し、合計１５代の継代細胞培養基とするためにこの細胞内てさらにもう１回継代した。この最終的な力価は２ＸＩ０７病巣形成単位／ｒｎｌであった。標本をＡＴＣＣに送付するため、さらにもう１回継代した。上記で指摘したように、ＡＴＣＣではＨＲＶ−２４８ヒトロタウイルスにＡＴＣＣＶＲ２２７４の受入れ番号をつけた。

培養基の原液はいくつかに分けて一７０°Ｃで保存した。

プラークを精製したＨＲＶ−２４８０タウイルスのゲノムＲＮＡの長い電気泳動パターンを図１に示す。ＨＲＶ２４８ヒトロタウィルスは亜群■に属し、高度免疫モルモット血清によって中和されて主に血清型２および４となるが、血清型４に対するモノクローナル抗体によってのみ認識される。Ｗａｒｄ、　Ｒ，Ｌ、ら：　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６４　：　３２１９−３２２５　（＋９９０）。さらにＲＮＡ−ＲＮＡ交雑による特性確認により、ＨＲＶ２４８ヒトロタウィルスは血清型２のヒトロタウィルスからそのＶＰ４遺伝子を誘導し、血清型４のヒトロタウィルスからそのＶＰ７遺伝子を誘導する天然のリアソータントであることが明らかになる。Ｗａｒｄ、　Ｒ，Ｌ、ら：　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６４　：　３２１９−３２２５　（１９９０）。より特徴的なこととして、ＲＮＡ−ＲＮＡ交雑により、ＨＲＶ２４８ヒトロタウィルスはＷａおよびＤＳ−１の双方の遺伝子群に属するヒトロタウィルスと遺伝的に関係がある天然の遺伝子群間リアソータントであることが明らかになる。ＨＲＶ２４８株は、Ｗａ遺伝子群より得られるウィルスの７つのセグメントとＤＳ−１遺伝子群に属するウィルスの４つのセグメントと共にＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成した。

したがって、図５−７に示したように、オートラジオグラムにおけるこれらのハイブリッドバンドの相対密度によれば、ＨＲＶ２４８分離株はＷａおよびＤＳ− １遺伝子群から発生したリアソータントであると確信する。さらに、ＨＲＶ２４８ヒトロタウィルスはワクチン接種後のヒトロタウィルスの血清型２と４の少な（とも２種類に対する中和抗体を刺激するであろうと確信する。ＨＲＶ４０８ヒトロタウィルスをバングラブシュの生後９か月齢の乳児の便から分離した。これをＨＲＶ２４８（ＡＴＣＣＶＲ２２７４）ヒトロタウィルスについて述べたように培養・順応させ、１２代の継代後にプラークを４回精製した。その後ＨＲＶ４０８０タウイルスをＭＡ−１０４細胞内でさらに２回継代した。ＨＲＶ４０８ヒトロタウイルスをＡＴＣＣで沈殿させ、受入れ番号ＶＲ２２７３を付けた。ＨＲＶ４０８ヒトロタウイルスはそのＲＮ　Ａ、ゲノムのゲル電気泳動によれば亜群 ■に属し、血清型を決定するモノクローナル抗体に対するその反応によれば血清型３である。それにもかかわらず、ＨＲＶ４０８ヒトロタウィルスは高度免疫モルモット血清によって中和されて血清型ｌ、２および３となる。

ＨＲＶ４０８ヒトロタウィルスに関する最後の継代の力価は３Ｘ１０７病巣形成単位／ｌｔ’であった。ＨＲＶ　４０８ヒトロタウイルスのＲＮＡゲノムに関する長い電気泳動パターンを図４に示す。ＨＲＶ４０８ヒトロタウイルスは、ワクチンとして投与される場合には主に血清型３に対する中和抗体を生ずると同時に、少なくともヒト血清型ｌおよび２に対する中和抗体を生ずるとも確信する。ＣＪＮヒトロタウィルスをオハイオ州シンシナティの小児病院医療センターにいる生後８か月の乳児の便から分離した。これを−次ＡＧＭＫ細胞内での２回の継代によって培養・順応させ、さらに４回継代し、プラークを３回精製し、さらに２００回継培養し、プラークを３回精製し、さらに４回継代培養したが、これはすべてＭＡ−１０４細胞内で行った。今のところ継代は合計３６代で、最後の継代の力価は３Ｘ１０７病巣形成単位／ｒｎｌである。ＣＪＮゲノムＲＮＡの長い電気泳動パターンを図２に示す。ＣＪＮヒトロタウィルスをＡＴＣＣで沈殿させ、ＶＲ２２７５の受入れ番号を付けた。ＣＪＮ（ＡＴＣＣＶＲ２２７５）ヒトロタウィルスは高度免疫抗血清によって中和されて血清型ｌ、２および４となり、ＣＪＮに対する高度免疫抗血清は主に血清型１および３を中和した。それにもかかわらず、ＣＪＮは亜群■に属し、血清型１のヒトロタウィルスとしての特性を有する。

非継代（非減弱化）ＣＪＮの投与を受けた成人は、試験した４種類すべてのヒト血清型、すなわちヒトロタウィルスの血清型１−４に対する中和抗体を大量に生じた。

弱毒化や不活化を受けた場合のＣＪＮは、−次ワクチンとして乳児や幼若児に投与された場合には多数のヒトロタウィルス血清型に対する中和抗体を刺激するのが当然であると予想される。

ヒトロタウィルスのＲＮＡの電気泳動による類別、ヒトロタウィルス株から抽出したゲノムのＲＮＡセグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動をＷａｒｄ、　Ｒ，Ｌ、ら：Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６９　：１４９−１６２　（１９８８）に従って行う。

ロタウィルスの亜群および血清型の分析ヒトロタウィルス分離株の亜群の決定は、例えば、カリフォルニア州パロアルトのＨ，Ｂ、　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによって提供された亜群特異的モノクローナル抗体（２５５／６０／１２５／ｌ　４および６３１／９／ｌ　０４１５６）を用いて行う。この分析は以下のＥＬＩＳＡ検定法を用いて行うこともある。

マイクロタイタープレートの孔をウサギの抗ヒトロタウィルス抗体（１：５０希釈：ダコパッツＡ／Ｓ　（コペンハーゲン）〕でココーチインする。４℃で一夜培養した後、孔を洗浄し、５％脱脂粉乳入りのリン酸塩緩衝生理食塩液（Ｐ−ＮＤＭ）に１＝１で希釈したＥＤＴＡ処理ウィルスを加え、室温で１時間放置する。孔を洗浄した後、細胞培養基中で生産し、Ｐ−ＮＤＭ中でｌ：２０に希釈した亜群特異的モノクローナル抗体を加え、室温で３０分間放置する。孔をもう一度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｐ−ＮＤＭ中で１：２００に希釈、ダコパッツＡ／Ｓ）を加え、３０分間放置する。最後に、孔を洗浄し、基質（Ｈ２Ｏ２）と指示薬（オルトフェニレンジアミン）を加えて１５分間培養する。反応をＩＭのＨ２ＳＯ４で止め、呈色を分光光度法により測定する。今回の発明のヒトロタウィルスの血清型の分析は、例えば基本型Ｗａ、ＤＳ−１、Ｐおよび５Ｔ−３など、それぞれ血清型１−４を代表するヒトロタウィルスの精製調製物で高度免疫化したモルモットの血清を用いて行う。各ロタウィルスに対する抗体化は、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　１．ら：Ａｎｔｉ −Ｖｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２：２９３−３００　（１９８９）に述べられているような病巣減少中和検定法によって測定する。用いられる最低希釈度（カットオフ値）は各抗血清について１０００倍である。力価は病巣形成単位数を６０％減少させるのに要する希釈度の逆数として表す。

ＨＲＶ２４８およびＨＲＶ４５６に関する交雑分析のための二重鎖ＲＮＡ　（ｄ　５ＲＮＡ）の調製ゲノムのｄ　５ＲＮＡは、Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰ４２０−ター内４０．ＯＯＯｒｐｍで約１．５時間ペレット状にした後、Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰＳ４０Ｔローター内３８．００Ｏｒｐｍで２時間３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ショ糖液中を沈降させることによって、感染したＭＡ−１０４細胞から調製される部分精製ピリオンからフェノール・クロロホルム混液て抽出する。

ＨＲＶ２４８およびＨＲＶ４５６に関する一重鎖ＲＡＮ（ｓｓＲＮＡ）転写物の調製一重鎖ＲＮＡプローブ（ｍＲＡＮ）は、酢酸マグネシウム２０ｍＭ、酢酸ナトリウム１００ｍＭ、ＡＴＰ３ｍＭ、ＧＴＰｏ、５ｍＭ、ＧＴＰ２．５ｍＭ、ＵＴＰ２゜５ｍＭ、Ｓ−アデノシルメチオニン０．５ｍＭ、０．　１％ベントナイトおよび（３２Ｐ）ＧＴＰ　（１反応当たり２５μＣｉ）を含有している７０ｍＭトリス−酢酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）２５０μβ中のロタウィルスの単膜粒子のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写によって調製する。４２°Ｃで６時間培養した後、５ｓＲＮＡをフェノール・クロロホルム混液による抽出と塩化リチウムによる沈殿によって精製する。

ＨＲＶ２４８およびＨＲＶ４５６ｉ：関す６ＲＮＡ−ＲＮＡ交雑基本型Ｗａ、ＫＵＮ、およびＡＵ−１などのヒトロタウィルス株より得られる３２Ｐ−標識５ｓＲＮＡプローブはＨＲＶ２４８およびＨＲＶ４５６株より得られる変性ゲノムＲＮＡ５と交雑する。同様に、ＨＲＶ　２４８およびＨＲＶ４５６ヒトロタウイルス株から調製した５ｓＲＮＡプローブは基本型Ｗａ（亜群■、血清型１）、ＭＯ（亜群■、血清型３）　、ＤＳ−１（亜群１１血清型２）　、ＫＵＮ　（亜群Ｉ、血清型２）、およびＡＵ−１（亜群Ｉ、血清型３）なとのヒトロタウィルス株より得られる変性ゲノムＲＮＡ５と交雑する。ｄ　ｓ　ＲＮＡ（約ｌμｇ）を、約１００°Ｃで２分間培養した後氷上に２分間冷却して変性させ、これに３２Ｐ −標識プローブ（各変性ｄ　５ＲＮＡについて１０．０００ｃｐｍ）を加える。

交雑は、トリス−酢酸塩５ｍＭ、ＮａＣｆ　１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ｍＭ、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有している緩衝液（ｐＨ７，５）中６５℃で１６時間培養して起こさせる。交雑後、ＲＮＡ５をエタノールで沈殿させ、トリスＨＣ１（ｐＨ６，８）６２゜５ｍＭ、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ’／ｖ）　ドデシル硫酸ナトリウム、および０．０００１％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルーを含有しているサンプル緩衝液に溶かす。その結果得られる、鎖状陰性ゲノムＲＮＡおよび鎖状陽性プローブよりなるハイブリッドを１０％ポリアクリルアミドゲル上で４％スタッキングゲルで分離した後、臭化エチジウムで染色する。オートラジオグラフは、乾燥ゲルを約−８０℃でＸ−ＯｍａｔＡＲフィルム（イーストマン・コダックＣＯ０、ロチニスター、ニューヨーク州）に露光させて作製する。

ＨＲＶ２４８０タウイルス上に列挙したとおり、ＨＲＶ２４８株の血清型はそれぞれ血清型１−４を代表する基本型のＷａ、ＤＳ−１、Ｐおよび５Ｔ−３ヒトロタウイルス株に対する抗血清を用いる中和によって決まる。交差中和解析により、これらの抗血清は高度に血清型特異的であることが明らかになっている。表１を参照すること。ＨＲＶ２４８株は上で指摘したとおりこのように高度に血清型特異的な１個以上の抗血清によって中和される。図１に示すように、ＨＲＶ２４８ヒトロタウィルスより得られるウィルスのＲＮＡセグメントの“ロング電気泳動パターンに基づいて、分離株より得られるセグメント１１がＷａ遺伝子群のウィルスと遺伝的に最も関係があると確信する。ＨＲＶ２４８ウィルスの亜群から、分離株のセグメント６もＷａ遺伝子群と遺伝的に最も関係があることが示唆される。表２を参照すること。血清型の解析により、Ｈ，ＲＶ２４８０タウイルスはＤＳ−１と５Ｔ−３の双方に対する抗血清によって弱（中和されることが認められる。

表２を参照すること。そのため、ＨＲＶ２４８０タウイルスのＶＦ６とＶＦ６をコード化するセグメントは別の群、すなわちＤＳ−１とＷａの遺伝子群に属するウィルスに由来すると確信する。

ロタウィルスの分離株ＨＲＶ２４８が異なる遺伝子群のロタウィルスと遺伝的に関係があるＲＮＡセグメントを有するかどうかを明らかにするため、この分離株のＲＮＡセグメントと、定義されている３つのヒトロタウィルスの遺伝子群を代表するもののＲＮＡセグメントとの間で交雑試験を実施する。これが明らかになれば、部分精製ピリオンより得られるゲノムのｄｓＲＮＡは同型株と異型株の３２Ｐ−標識５ｓＲＮＡプローブにアニール化される。その結果得られるハイブリッドをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分別し、ＲＮＡバンドを臭化エチジウムによる染色後にＵＶ光照射下で明視化する。

ゲルを乾燥した後、標識したプローブで形成されるバンドを図５−７に示すようにオートラジオグラフで確認する。同型ＲＮＡ−ＲＮＡ反応は、オートラジオグラフ上でゲルの臭化エチジウム染色によって明視化されるゲノムのｄｓＲＮＡセグメントと共に移動するバンドによって確認され、関係はあるが完全に同型ではないゲノムセグメントの間のハイブリッドは、通常は同型セグメントの間で形成されるバンドと共には移動しないバンドを形成する。

３２Ｐ−標識Ｗａプローブ（Ｗａ遺伝子群を代表するもの）を用いると、図５Ａと５Ｂに示すようにＨＲＶ　２４８より得られるゲノムＲＮＡ５により７つのハイブリッドが確認されるＫＵＮプローブ（ＤＳ−１遺伝子群を代表するもの）はＨＲＶ２４８０タウイルスより得られるゲノムＲＮＡ５と共に４つのハイブリッドを形成する。

これらの結果から、ＨＲＶ２４８株の１１個の遺伝子セグメントはＷａプローブがＫＵＮプローブのいずれかと交雑するが、両方とは交雑しない。反対に、ＡＵ −１プローブはＨＲＶ２４８０タウイルスより得られるゲノムＲＮＡ５とはほとんど同種性を示さないが、ｌないし２個のセグメントについて少量のハイブリッドバンドが認められる。これらの結果に基づいて、ＨＲＶ２４８ヒトロタウイルスは２つの異なる遺伝子群、すなわちＷａとＤＳ−１の遺伝子群に属するロタウィルスに由来する遺伝子群間リアソータントであると確信する。遺伝子セグメントの起源の正確な確認をＨＲＶ２４８０タウイルスについて行うことはできなかったが、ハイブリッドの相対移動速度により大半のセグメントの同一性が示唆される。図５Ａ−５８で明らかなように、ＨＲＶ２４８０タウイルスのセグメント１．２．６．７．９、ＩＯおよび１１はＷａプローブと交雑すると思われる。表３を参照すること。ＨＲＶ２４８０タウイルスの残りのセグメントはＫＵＮプローブと交雑すると思われる。表３を参照すること。遺伝子セグメントとして提唱されているこの起源は、図１に示し、表２で指摘したとおり、電気泳動、亜群、および血清型などの解析の結果として示唆される遺伝的な関係と一致する。

ＨＲＶ２４８０タウイルスの３２Ｐ−標識５ｓＲＮＡをプローブとして用いている、相互交雑検定法は、ＨＲｖ２４８０タウイルスに関して示唆されるゲノムセグメントの起源をさらに支持するものである。ＨＲＶ２４８プローブは、７Ａ− ７Ｂに示すようにＷａとＭＯの株の７個のセグメントとＤＳ−１とＫＵＮの株４個のセグメントと交雑する。しかし、ＡＵ−１の１個のセグメントはＨＲＶ２４８プローブと少量のハイブリッドを形成した。したがって、これはＨＲＶ２４８ヒトロタウィルスかＷａとＤＳ−１の遺伝子群に由来する遺伝子群間リアソータントであるという確信をさらに支持するものである。

表１ロタウィルス分離株の血清型を決定するために用し１られる参照抗血清の同型と異型の中和抗体の力価免疫化している抗血清抗血清の力価数　ウィルス　血清型　Ｗａ　ＤＳ−Ｉ　Ｐ　５Ｔ−３７８６Ｗａ　１　８０，０００ａ　５０　３００　３００２９３ＤＳ−１２６００４０，０００８００３００２８５Ｐ　３　７５　５０　７５．０００　３００２９８　５Ｔ−３４３００１００２００４００，０００ａ下線を引いた値は同型ウィルスに対する力価を示す。

表２ロタウィルス分離株ＨＲＶ２４８に関する亜群と血１ｎ型の分析結果参照抗血清を用いる中和力価ウィルス株　亜群７８６（Ｗａ）　２９３（ＤＳ−１）　２８５（Ｐ）　２９８（ＳＴ− １）ｔ（ＲＶ　２４８　Ｉｆ　１．０００　１．２００　＜５００　３．０００表３ＨＲＶ２４８株の１１個のセグメントのそれぞれについて示唆される起源の遺伝子群セグメントの遺伝子群ウィルス株　１２　３　４　５　６７　８　９１０１１２４８　Ｗａ　Ｗａ　ＤＳ−Ｉ　ＤＳ−Ｉ　ＤＳ−Ｉ　Ｗａ　Ｗａ　ＤＳ−Ｉ　Ｗａ　Ｗａ　Ｗａワクチンの調製及び接種方法一次あるいは初回感作に使用する簡便な発明のヒトロタウィルス株は、生ウイルスワクチンとして投与する場合には弱毒化する必要かある。経口、経鼻あるいは非経口的ルートで不活化ワクチンあるいはサブユニットワクチンを投与する場合には、もちろん弱毒化は必要ない。

以下の方法か一次免疫原を弱毒化するのに用いられる。

簡便な発明からワクチンを調製する一方法は、Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ＷＨＯＥｘｐｅｒｔＣｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、　３３　ｒｄＲｅｐｏｒｔ、（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ　６８７　）　ｐｐ、１０７−１７４　、ＷＨＯ；Ｇｅｎｅｖａ（１９８３）に記述されている生ウイルスワクチン（経口）に関する現在のＷＨＯの基準及び適切な修正に従うものであり、完全な形で本文に参考文献として引用しである。ワクチンを調製するもう一つの方法は、同様に完全な形で本文に参考文献として引用したか、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎａ４．　６３６．　’３８５に明示されているように、ヒトに使用するウィルス株を弱毒化する標識操作にしたかって、細胞培養で何回もパッセージすることである。たとえば、ブタでは１５回細胞培養でパッセージすねは強毒性のブタロタウィルスか弱毒化法に変わることが報告されている、Ｔｚｉｐｏｒｉ、　Ｓ、　、　Ｌ、　Ｕｎｉｃｏｍｂ。

Ｒ，Ｂ１５ｈｏｐ、Ｊ、Ｍｏｎｔｅｎａｒｏ、ａｎｄ　Ｌ、Ｍ、Ｖａｅｌｉｏｊａ　：　ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、１０９　：１９７−２０５　（１９８９）。

さらに別の方法では、低温で成育する変異株、すなわち低温適合変異株、これは弱毒化しているか、これを選択することが行われる。しかし用いる一次免疫原を弱毒化する別の方法として、２種の中和蛋白質、すなわちウィルスＶＰ４及びＶＰ７ヒト蛋白質をコードするヒトロタウィルス遺伝子を、ペテロタイプの動物ウィルス株からとった１１種のロタウィルス遺伝子セグメントの中、少なくとも１つを含む再集合体に組み込むことが行われている。この目的に使用するペテロタイプ株には、マウスロタウィルス（ＥＤＩ〜丁）、あるいはＷＣ３の様なウシロタウィルスの培養適合法か含まれる。この方法は、たとえば、完全な形で本文に参考文献として引用しであるＵ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎａ４．　５７１．　３８５に明示されている操作にしたがって実行することかできる。

弱毒化あるいは不活化した簡便な発明のウィルス調製品はおそらく凍結乾燥した形てあろう。凍結乾燥調製品は無菌水、通常の生理食塩水あるいは同等のちに溶解し、最終ワクチン調製品とする。本発明の典型的な生、弱毒化ワクチンは、無菌水、通常の生理食塩水あるいはそれらと同等の適切なキャリアーの１から２ｄで混合した生、弱毒化ロタウィルス約１ｘｌｏ４ｐｆｕから約１×１０７ｐｆｕ、好ましくは約１ｘｌＯ’ｐｆｕの用量を、経口的にあるいは鼻腔内に投与する。経口、経鼻あるいは非経口的投与、望ましくは筋肉内投与に適する典型的な不活化ワクチンは、上述した様な適切なキャリアーとの混合物中に約０．１マイクログラムの不活化ロタウィルスを含有する。簡便な発明の新しいワクチン接種では、たとえばｌあるいは２ｍｌ用量を投与する。

−次あるいは初回βワクチン接種は３力月齢前に、より好ましくは生後すぐに行うことが望ましいけれども、−次ワクチン接種は生後６力月から２才に、あるいはもっと後で行うことができる。もちろん、ワクチン接種が後になれはなるほど、幼児及び小児は重度のロタウィルス症になりやすいことを認識する必要かある。ワクチンに必要なロタウィルス株の数は厳密ではないけれども、簡便な発明のワクチンは、適切な形であれば、少なくともヒトロタウィルスの血清型１−４に対する、もっと特別な場合には血清型１−４及び８−９に対する中和抗体を誘導し、これは十分に、ワクチン後、全ての血清型ヒトロタウィルス感染による重度の症状に対する防御となる。

簡便な発明のロタウィルス株の各組合せは、ワクチンとしてヒトに投与すれば、少なくともヒトロタウィルスの血清型１−４に対する、またおそらく血清型１− ４及び８−９に対する交叉中和抗体を誘導する能力をもっと考えられている。たとえば、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２あるいはＣＪＮの自然感染後に、血清型１−４に対する力価が産生されることが示された。たとえば、血清型２及び４に対する力価が低い場合には、−次ワクチンを、たとえば、ＨＲＶ２４８とＨＲＶ８９−１２Ｃ２及び／あるいはＣＪＮの混合物で調製すればよい。特別な血清型に対する中和抗体をほとんど誘導しない簡便な発明の場合には、培養適合及びプラーク純化によって、その中のロタウィルスの一つの変異株を選択することもできる。たとえば、ワクチンとして投与しても、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２が血清型３に対する中和抗体をほとんど誘導しない場合には、ワクチン中にＨＲＶ４０８を含存させればこの血清型に対する力価が増大するはずである。したがって、少なくともヒトロタウィルスの血清型１−４に対する中和抗体を誘導する様に、公表されているヒトロタウィルスの任意に組合せでワクチンを調製することができることを理解すべきである。

ワクチン接種によって誘導された中和抗体を増幅させるためのへテロタイプ動物ワクチンの再接種すでに上述した様に、本発明は、ロタウィルス病に対するワクチン接種で形成されすでに存在する中和抗体を発現する細胞の力価を増大させ、かつ細胞の記憶を拡張することに関する新しい方法を意図している。一般的に言って、この方法は、非ヒト動物ロタウィルス由来のＶＦ６及びＶＰ７遺伝子を含むロタウィルスを用いる一次感作後に、中和抗体力価を増幅することを意図している。

より詳細には、これは、ヒトロタウィルスワクチンで一次接種後、好ましくは約２から４力月以内にヘテロタイプの非ヒト動物ロタウィルスワクチンでヒトを再接種することによって達成できる。増幅免疫は、ＷＣ３ウシロタウィルスワクチンの様な上剥毒化へテロタイプ動物ウィルス調製品を、経口あるいは経鼻で投与することが好ましいけれども、増幅ワクチンは不活化ロタウィルスワクチンの形で、あるいは不活化ワクチンを非経口的接種によって投与してもよい。この簡便な発明の増幅ワクチンを調製するのに使用される他のへテロタイプの非ヒト動物ロタウィルスの例としては、ＮＣＤＶウシ、ＣＰ−１ウシ、Ｃ３−ウシ、ＰＰ− ウシ、ＴＣウシ、Ｂ２２３ウシ、ＫＫ３ウシ、ｖｌＯ０５ウシ、Ｔ５１ウシ、Ｔ６７ウシ、Ｔ８２ウシ、Ｏ３Ｕブタ、ＥＥブタ、Ａ−５８０ブタ、Ｇブタ、５Ｂ −５ブタ、ＵＫウシ、ＥＤ　ＩＭネズミロタウイルス及びこれらと同様のものが含まれる。

本発明にしたがって使用される増幅ワクチンの一例は、本文での記述にしたがって、あるいはＢｅｒｎｓｔｅｉｎ、　ｅｔＯ：　３５０−３５６　（１９８６）；及びＵ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎａ４．６３６，３８５、これら全て完全な形で参考文献として本文に引用しであるが、これらにしたがって一定用量を調製し投与される。

簡便な発明の特徴的な方法は、他のワクチンと同様に、ロタウィルスに対する免疫は一次感作後しばらくして増幅する必要があるという現在の実状に部分的に基づいている。また、Ｔａｊｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、　：　Ｖａｃｃｉｎｅ、８　：　７０−７４　（＋９９０）によって報告された様に、おそらく最初の自然感染後形成された血清型特異的中和抗体のために、２度目の同じ血清型のロタウィルス自然感染は部分的に防がれるという現在の考え方にも部分的に基づいている。また、簡便な発明のこの新しい方法は、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊ、［ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１　６　２　：　Ｉ　０　５　５　−＋０６２　（１９９０）によって報告された様に、ＷＣ３ウシワクチンの接種前に血清型１ヒトロタウイルス株に一度自然感染しても、ヘテロタイプＷＣ３ウシ株の再感染を防げないという発見にも基づいている。表５．６及び８参照。さらに、簡便な発明の特徴的な方法は、Ｗａｒｄ。

ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊ、　［ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ（Ｄｃ、　１９９０　）によって報告された様に、ＷＣ３ウシの様なワクチンは、接種前に血清型ｌの自然感染を受けた幼児では、多種のヒトロタウィルス血清型に対する交叉反応性の中和抗体を誘導するという発見に基づいている。表５−８参照。

さらに、ＷＣ３ウシワクチンの接種では、それが−次免疫原である場合にはヒトロタウィルス株に対する中和抗体を誘導しないけれども、増幅させるための免疫原である場合には、驚くべきことに、ヒト血清型１−４に対する中和抗体の非常な増大（平均：１２倍）を引き起こすことが発見された。表４−８参照。実際に、驚くべきことに、ヒト血清型に対する最終の中和抗体力価は、患者が引き続いて血清型１０タウイルスに自然感染した場合と同じくらい高くなることが見いだされた。表４−８参照。これらの結果は、ＷＣ３Ｃ３ウシ天然のヒトロタウィルス株は異なる血清型であるけれども、これらの株のエピトープは十分に類似しており、ＷＣ３Ｃ３ウシの再接種によって、すでに−次ヒトロタウイルスワクチンの接種を受けている患者ではヒト血清型に対する中和抗体力価を増幅させ、全ての血清型ヒトロタウィルスの中和に有効な抗体を発現する記憶細胞を増殖させることを、示している。

この様に、今や、この簡便な発明は、ヘテロタイプ動物ロタウィルス株の再接種によって、十分に力価を増幅させ、−次感作後誘導された中和抗体を発現する記憶細胞を増殖させることかできると考えられる。言い換えると、簡便な発明の方法を実行することによって、力価と一次ヒトロタウイルスワクチン接種によって誘導されすでに存在する中和抗体を産生ずる記憶細胞は、増幅させたり、あるいは増殖させることが可能であり、全ての血清型ヒトロタウィルスに原因する疾病に対する防御が可能となる。

ヘテロタイプの非ヒト動物ロタウィルスによる再ワクチン接種によって、力価の増幅及び−次ワクチン接種で誘導されすてに存在する中和抗体を産生ずる記憶細胞の増殖に関する本発明は、以下の例でよりよく例示される。

培地に適応させＷＣ３仔牛ロタウィルス（血清型６）ワクチンを調製するために使用する変遷層は、Ｃ１ａｒｋ、　Ｈ。

Ｆ、ｅｔ　ａｌ、が既に述べた：　Ａｍ、Ｊ、Ｄｉｓ、Ｃｈｉｌｄ、ｌ　４０　：　３５０−３５６　（１９８６）。ＷＣ３の基礎実験用ストックはワクチン製剤と同時に直接接種したのちＭＡ−１０４細胞内で成長する。このストックウィルスの一部を一７０℃で保存する。本試験で使用するヒトロタウィルスは、原型株としてはＷａ、ＤＳ−１，Ｐ、及び５Ｔ−３てあり、それぞれ血清型１−４の典型的なものである。

試験計画生後２〜１２ケ月の健康児にブラセボ（対象者１０３名）又はワクチン（同１０３名）を投与する。対象者はその後の”ロタウィルス流行期”中、免疫原性、反応原性及びワクチンの有効性を測定するために追跡する。血液標本（０，５ｍ１）を、ワクチン接種時、接種の２５〜３１目後、及びロタウィルス流行期の終了直前に採取する。これらはロタウィルス抗体測定を行う。便は下痢性疾患の場合に採取し、症候性ロタウィルス感染症検出のためＥＬＩＳＡによりロタウィルス抗体を分析する。この方法で検出されたロタウィルスは、電気泳動タイプ（ウィルスＲＮＡの電気泳動分析）及び血清型（ＶＦ６に特異的なモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ）を測定して特徴を調べる。無症候性感染は血清ロタウィルスＩｇＡ及びＩｇＧの上昇により検出され、血清中和性抗体価の上昇により血清型ＩＷａ株であることを確認血清型−特異的中和性抗体は、ｆｏｃｕｓ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙで調べる。この詳細についてはＢｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｄ、［、ｅｔ　ａｌ、　：　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ、、１２　＋　２９３−３００　（１９８９）に記されている。

統計解析幾何平均価（ＧＭＴ）の比較は、特に記載のあるもの以外は、両側５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓｔ検定を用いて行った。

自然症候性ロタウィルス感染後の血清型−特異的抗体価：過去のＷＣ３ワクチン接種の影響ＷＣ３ウシワクチン治験に参加した２０６名の乳児中４６名か観察期間中に症候性ロタウィルス感染を経験した。これらはプラセボ群２５／１０３及びワクチン群２１／１０３てあり、後者は全員かワクチン接種によるＷＣ３ウシ中和性抗体を産生じていた。これらの４６名の対象者は、参加時以前にロタウィルスに感染していなかった。このことは血清中ロタウィルスＩｇＡの不在により確認されている。血清標本はこれらの症候性−感染を起こした対象者からロタウィルス流行期終了時に採取し、血清型−特異的抗体価に対する過去のＷＣ３ウシワクチン接種の影響を測定するために検査を行った。２９名の対象者の血清は、１５／２５感染ブラセボ投与者及び１４／２１感染ワクチン投与者のうちから無作為に抽出して分析が行われた。これらの２９名の対象者に感染したヒトロタウィルス株は、ＥＬＩＳＡによって全てが血清型ｌであると同定されている。さらに、電気泳動型は検査を行った全２１同定例か同様であった。したがって、これらの感染は明らかに非常に近似した株のヒトロタウィルスによるものである。

検査した２９血清のそれぞれは血清型ＩＷａ株に対する中和性抗体価が最も高かった（表４）。これらの対象者は血清型３株（Ｐ）の中和抗体も相当な量産生しているか、血清型２（ＤＳ−１）及び４　（ＳＴ−３）株は比較的少量である。

したがって、感染した血清型１株は、−次感染の間に異型ヒトロタウィルスに対する抗体増加を引き起こしたのである。さらに、ワクチン及びブラセポ投与者におけるＷａ株に対するＧＭＴは基本的に同一である。症候性−感染を起こしたワクチン投与者では、ワクチン接種後Ｗａ株に対する中和抗体が全く検出できなかったのでこの結果は期待されないものではない。ＤＳ−１株に対するＧＭＴはブラセボ投与者よりもワクチン投与者において有意に大きいが（Ｉ）＝０．００９）、これらの抗体価はＷａに対するＧＭＴよりもまだずつと小さいのである。５Ｔ−３及びＰ株に対するＧＭＴは、ブラセポ投与群及びワクチン投与群間で有意差はない（ｐ＝０．０５）。したがって、血清型ｌのロタウィルスに症候性感染を起こした後、血清型ｌの株であるＷａに対する中和性抗体価には、過去のＷＣ３ワクチン接種の影響は検出不能であり、検査したヘテロ型ヒトロタウィルス血清型に属する３株のうちの１株に対する中和抗体価に非常に小さい影響か認められたのみである。

後の自然ロタウィルス感染によるＷＣ３に対する中和性抗体の変化もまた調べられている。血清型ｌのロタウィルス感染を経験したワクチン接種者から無作為に抽出した７名の血清では、ＷＣ３に対する中和性抗体価か有意な（ｐ＝０．０２）上昇を示しているが（表５）、これらの７名で生じた抗体価は血清型１ＯＷａ株に比較すると有意に（ｐ＝０．００３）小さい（ＧＭＴ＝　１３０９：範囲＝２４０〜５１００）。後に自然ロタウィルス感染を経験しなかったワクチン接種者７名の血清は、この期間中のＷＣ３に対する中和性抗体が有意に減少している（ｐ＝０．００３）。ヒトロタウィルスに感染したプラセボ投与者から無作為に抽出した７名からはＷＣ３に対する中和性抗体は全く検出できなかった（２０）。

したがって、過去のＷＣ３ワクチン接種は、血清型１のロタウィルス自然感染期間中このウィルスに対する記憶応答を生じる。

無症候性ロタウィルス自然感染後の血清型−特異的抗体価：過去のＷＣ３ワクチン接種の影響ＷＣ３ワクチン治験中、無症候性ロタウィルス自然感染もまた血清ロタウィルスＩｇＡ及びＩｇＧの上昇で決定しＷａ株に対する中和抗体の上昇で確認することにより検出した。これらは、ブラセボ接種者１６名及びワクチン接種者１３名からなる２９名の対象者で発症した。

各群の１３名を抽出して血清型−特異的抗体価に及ぼす過去のＷＣ３ウシ感染の影響を調べる。ブラセポ接種者のうち３名は過去に自然感染を経験しているので（血清型１〜４に対する相対的中和抗体価に基づいて血清型１株２名、血清型３株１名）、後の自然再感染による自然感染が血清型−特異的対抗価に及はす影響もこの少数の対象者において調べることができた。

検査した２６名の無症状感染を起こした対象者のうち１名を除く全員が、過去にＷＣ３又は血清型１株に自然感染しているかどうかに関わらずＷａ株に対する抗体価か最高値を示した（表６）。例外の１名は過去に血清型３種に感染したことがあり、血清型ｌと思われる株に再感染したことで血清型３に対する抗体価が最高値を示した。１名を除く全員の血清型１〜４に対する中和性抗体の相対量は症候性感染対象者において認められたものと非常によく似ていた（表２参照）。ブラセポ接種者に比へてワクチン接種者においてＤＳ−１に対する抗体の軽度であるか存意な増加（ｐ＝Ｑ、ｏｏｔ＞が再び認められた。しかし、この場合、５Ｔ −３に対する抗体の軽度であるか有意な増加（ｐ＝ｏ、００５）も又、ブラセボ接種者に比べてワクチン接種者において認められている。

これらの結果から、同−又は非常に近似した株のロタウィルスが、治験期間中に症候性及び無症候性の自然感染を引き起こしたことが明らかにされた。

血清型ＩＷａ株に対して生じる中和性抗体の実際の抗体価は、過去に自然感染の経験がなく無症候性感染を起こしたワクチン接種者及びブラセポ接種者においてほぼ同等てあり（表６）、このことは症候性感染対象者でも認められている（表４参照）。しかし、これらの抗体価は症候性感染を起こした対象者で認められたものと比較すると有意に小さい（ｐ＝Ｑ、０３；片側５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓｔ検したことにより免疫応答の大きさは症状スコアに関連していることか明らかになった。

過去のＷＣ３＝ワクチン接種は、その後の自然ロタウィルス感染によるヒト株に対する中和性抗体の大きさにほとんど影響を及ぼさないが、過去の自然感染はその後の自然感染による中和性抗体価に大きな影響を及ぼすことが明かになった。

連続自然感染を起こした３名の対象者では、検査した４種のロタウィルス血清型に対する最終的なＧＭＴが、−回自然感染したプラセボ又はワクチン接種者に比へて平均７倍であった。さらに、４種の血清型についてのＧＭＴの平均増加は、第一回と第二回の感染の間で２５倍であった。

ＷＣ３ワクチン接種後の血清型−特異的抗体価：過去の自然感染の影響ＷＣ３ワクチン治験の幼児２５名は参加時に全員７〜１２ケ月齢であったが、ワクチン接種前に採取した血清中の血清ロタウィルスＩｇＡ及びヒト株に対する中和性抗体の存在に基づいて、既にロタウィルスに自然感染していた。これらのうち２４名、すなわちブラセボ接種者１６名ワクチン接種者８名は血清型１株に感染したことか、血清型ｌから４までの典型的な株に対する相対的中和抗体価によって断定された（表７）。２４名全員は４つのヒ１へ血清型に対する中和抗体の比が類似しており、これらの比はワクチン接種後の観察期間中に自然感染したプラセボ接種者と非常に類似している（表４参照）。

したかって、２回の“ロタウィルス流行期“にわたりこれらの感染を引き起こした血清型１株は抗原として類似していると信じられる。

過去に感染したことのあるワクチン接種者８名中の７名は過去に感染したことのない対象者９５名中９３名に比較してワクチン投与時にＷＣ３に血清転換を起こした（ｐ＝Ｑ、２０）。そのうえ、ワクチン接種により血清転換を起こした対象者のＷＣ３に対する抗体価は、過去に感染したことのあるワクチン接種者７名（ＧＭＴ＝７５）及び過去に感染したことのないワクチン接種者９３名（ＧＭＴ＝１０６）との間に有意差はなかった＞ｐ＝Ｏ１８）。したかつて、ＷＣ３ワクチン接種ののち、ＷＣ３に血清転換した過去に感染したことのある対象者７名は、血清型１〜４に属するヒトロタウィルスに対する中和性抗体価が大きく並びにほぼ等しい倍率（９，７〜１３．７）の上昇を示した（表８）。ワクチン接種前に血清型２又は４に対し検出限度（すなわち、２０）以下の抗体価を示した対象者でさえ、これらの血清型に対し大きな上昇を示した。これらの上昇の平均の大きさく１２倍）は、連続して自然感染を経験した３名の対象者の場合よりも約１．５倍大きかった。７名のこれらの対象者におけるワクチン接種後の４株のロタウィルスに対する最終的なＧＭＴは、ＷＣ３ウシ株に対するよりも有意に太きかッｆ、：、（片側５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓｔ検定による最小の差＝ＷＣ３対ＤＳ−１；　ｐ＝０．０５）。Ｄ、１゜Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　ｅｔａＬ、、Ｊ、（ｎｆ、Ｄｉｓ、、Ｉ　６２　：　ｌ　Ｏ５５〜１０６２（＋９９０）に報告されているように、過去に感染したことがない対象者９３名中２名のみかワクチン接種後にＷＣ３ウシ株に血清転換し、ヒト株に対する抗体上昇を起こした。したがって、以前の血清型１０タウイルス株感染か、異型のＷＣ３ウシ株に再感染したのち４株全ての血清型に対する抗体価を一貫して劇的に急増させる様に準備させるのである。

表４ＷＣ３ワクチン又はブラセポ接種後症候性血清型１０タウイルス感染を起こした者におけるヒトロタウィルスに対する中和性抗体価対象１４　１０３３（１００）”　８８”（９）　２８８（２８）　１２８（１２）（３００−５１００）＋″″　（＜２Ｏ−４８０）　（８０−６４０）　（３５ −１０００）対象者：ブラセボ接種者（２８０−４２６０）　（＜２Ｏ−７５）　（１９０−１７００）　（３０−３００）０　血清型 ”Ｗａに対するＧＭＴパーセント０°　プラセポ接種者よりも有意に大きい（ｐ　＝　０．００９）″“　抗体価の範囲数値く２０は計算上ＩＯと見なす表５ワクチン又はブラセボ接種者におけるその後の血清型１０タウイルス感染の前後のＷＣ３に対する中和性抗体価７　５１（２０−１２０）”２２７”（４０−１１５０）対象者：自然感染を起こしたプラセボ接種者７　Ｎ、Ｄ、　＜２０　（＜２０）対象者：その後自然感染を起こさなかったワクチン接種者７　２６８（１６０−６００）　１１５〜（５０−２２０）０　前：ワクチン接種後２５〜３１日（１９８８年ｌＯ月〜！２月）４　後：１９８９年６月 −抗体価の範囲 ″４　ワクチン接種後２５〜３１日とロタウィルス流行期終了直前との間で有意差がある（＜０．０２）Ｎ、　Ｄ、測定せず表６対象者数　Ｗａ（１）”　ＤＳ−１（２）　Ｐ（３）　５Ｔ−３（４）１３　６８２（１００）“　１４２（２１）　２３９（３５）　７３°（１１）”（６０−５１２０）”（＜２０’−５４０）（＜２Ｏ−３５００）　（＜２Ｏ−２９５）対象者：ブラセボ接種者参加前に未感染（６０−１２００）　（＜２Ｏ−１４０）　（３５−８４０）　（＜２Ｏ−５６）参加前に血清型１株に感染参加前に血清型３株に感染０　血清型 “　Ｗａに対するＧＭＴパーセント °１　前に未感染のブラセボ接種者よりも有意に大きい（ｐ≦０．００５）リ　抗体価の範囲１　数値〈２０は計算上１０と見なす表７前に血清型１０タウイルスに感染したことがある幼児２４名におけるＷＣ３ワクチン接種時のヒトロタウィルスに対する中和性抗体価４１４（１００）”　１８（４）　１８４（４４）　３４（８）（３５−２２４０）”　（＜２０°−９５）　（＜２Ｏ−１２００）　（＜２Ｏ−２１５）０　血清型 ”Ｗａに対するパーセント８８　抗体価 ″１　数値く２０は計算上ＩＯと見なす表８前に血清型ｌの感染したことがあるワクチン接種者７名におけるＷＣ３感染後のＷＣ３及びヒトロタウィルス血清型Ｉ〜４に対する中和性抗体の変化前後　前後　前後　前後前後＜１０　７５　１９９　１９３９　１１　１４４　８５　９７８　２０　２７３（＞７．５）”　（９，７）　（１３，１）　（１１，５）　（１３，７）８　血清型 ″　ＧＭＴの上昇倍率Ｗａ　２４８　４５６　ＤＳ−Ｉ　ＷａＣＪＮ　ＣＪＮ −１−−一・−一−５ＦＩＧ、　２８９−１２Ｃ２ＦＩＧ、３ＦｆＧ、４ｎ　−−− ４５６ｐｒｏｂｅ２４８　ｐｒｏｂｅ補正書の写しく翻訳文）提出書（曲法組８４条）８）平成５年５月１７日

Claims

【特許請求の範囲】

１．本質的には、適当な薬剤担体と混合した生きて弱毒化した、または不活化したロタウイルス株から成るワクチンで、当該ロタウイルス株は、ヒトロタウイルスの血清型１−４に対する中和抗体の生成を刺戟する能力をもつ、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的予防を与えるワクチン。
２．該生きて弱毒化したロタウイルス株は、ＨＲＶ８９−１２Ｃ２と命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７２の下にＡＴＣＣに寄託されている、請求項１に記載のワクチン。
３．該ロタウイルス株は、それぞれ、ヒトＶＰ４及びＶＰ７蛋白質をエンコードする遺伝子セグメントをもつ、請求項１に記載のワクチン。
４．該ロタウイルス株は、さらに、ヒトロタウイルスの血清型８及び９に対する中和抗体の産生を刺戟する能力をもつ、請求項１に記載のワクチン。
５．該ロタウイルス株は、ＣＪＮと命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７５の下にＡＴＣＣに寄託されている、請求項１に記載のワクチン。
６．該ワクチンは、適当な薬剤担体と混合した少なくとも２種類の別個の生きて弱毒化、または不活化した株を含み、各該ロタウイルス株は、それぞれ、ヒトロタウイルスＶＰ４及びＶＰ７蛋白質をエンコードする遺伝子セグメントをもち、該ロタウイルス株は、ヒトロタウイルスの血清型１−４に対する中和抗体の産生を刺戟する能力をもち、そのため、少なくとも血清型１−４のヒトロタウイルスにより誘発され得る、後に発生するロタウイルス病を効果的に予防する、ヒトのロタウイルス病に対し免疫的な予防を与えるワクチン。
７．各該ロタウイルス株は、異なった血清型のヒトロタウイルスをもつ、請求項６に記載のワクチン。
８．少なくとも１つの、該ロタウイルス株は遺伝子群間再構築ロタウイルスであり、該遺伝子群間再構築ロタウイルスの該遺伝子セグメントは、異なった遺伝子群と血清型のヒトロタウイルスに由来する、請求項７に記載のワクチン。
９．各該遺伝子セグメントは、異なった血清型のヒトロタウイルスに由来する、請求項６に記載のワクチン。
１０．該ロタウイルス株は、さらに、ヒトロタウイルスの血清型８及び９に対する中和抗体の産生と刺戟する能力をもつ、請求項６に記載のワクチン。
１１．該ロタウイルス株は、ＨＲＶ２４８及びＨＲＶ８９−１２Ｃ２と命名され、該ＨＲＶ２４８株は受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７４の下にＡＴＣＣに寄託され、また該ＨＲＶ８９−１２Ｃ２は受諾番号ＶＲ２２７２の下にＡＴＣＣに寄託される、請求項６に記載のワクチン。
１２．該ワクチンは、さらに、ＨＲＶ４０８と命名され、受諾番号ＶＲ２２７３の下にＡＴＣＣに寄託されている、生きて弱毒化または不活化したロタウイルス生存株を含む、請求項１１に記載のワクチン。
１３．該ワクチンは、さらに、ＣＪＮと命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７５の下にＡＴＣＣに寄託されている、生きて弱毒化または不活化したロタウイルス株を含む、請求項１２に記載のワクチン。
１４．該ワクチンは、さらに、ＣＪＮと命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７５の下にＡＴＣＣに寄託されている、生きて弱毒化または不活化したロタウイルス株を含む、請求項１１に記載のワクチン。
１５．該ロタウイルス株は、ＨＲＶ２４８及びＣＪＮと命名され、当該ＨＲＶ２４８株は受諾番号ＡＴＣＣＶＲ２２７４の下にＡＴＣＣに寄託され、当該ＣＪＮは受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７５の下にＡＴＣＣに寄託されている、請求項６に記載のワクチン。
１６．該ワクチンは、さらに、ＨＲＶ４０８と命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７３の下にＡＴＣＣに寄託されている、生きて弱毒化または不活化したロタウイルス株を含む、請求項１５に記載のワクチン。
１７．それぞれ、ヒトロタウイルスＶＰ４及びＶＰ７蛋白質をエンコードする遺伝子セグメントをもち、各該ヒトロタウイルス蛋白質は、ヒトロタウイルスの異なった血清型の血清型決定抗体によって認識される、分離されたロタウイルス。
１８．該ロタウイルスは、遺伝子群間再構築ロタウイルスであり、該遺伝子セグメントは、異なった遺伝子型と血清型のヒトロタウイルスに由来する、請求項１７に記載の分離されたロタウイルス。
１９．該ロタウイルスは、ＨＲＶ２４８と命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７４の下に寄託されている、請求項１８に記載の分離されたロタウイルス。
２０．適当な薬剤担体と混合したヒトロタウイルスＶＰ４及びＶＰ７蛋白質を含むワクチンで、該ヒトロタウイルスＶＰ４及びＶＰ７蛋白質は、異なった血清型のヒトロタウイルスに由来する遺伝子セグメントによって発現され、ヒトロタウイルスの血清型１−４に対する中和抗体の産生を刺戟する能力をもち、そのため、少なくとも血清型１−４のヒトロタウイルスにより誘導され得る、その後発生するロタウイルス病を効果的に予防する、ヒトのロタウイルス病に対する免疫的予防を与えるワクチン。
２１．ＨＲＶ２４８と命名され、受諾番号ＡＴＣＣＶＲ２２７４の下にＡＴＣＣに寄託された、分離されたロタウイルス株。
２２．ＨＲＶ４０８と命名され、受諾番号ＡＴＣＣＶＲ２２７３の下にＡＴＣＣに寄託された、分離されたロタウイルス株。
２３．ＨＲＶ８９−１２Ｃ２と命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７２の下に寄託された、分離されたロタウイルス株。
２４．異なった遺伝子群と血清型のヒトロタウイルス由来の遺伝子セグメントをもち、亜群ＩＩ及びヒトロタウイルスの血清型２及び４に属し、さらに、ゲル電気泳動の間、ＲＮＡの移動度に基づいた長い電気泳動ＲＮＡゲノムパターンをもつ、分離されたヒト遺伝子群間再構築ロタウイルス。
２５．該ヒト遺伝子群間ロタウイルスは、ＨＲＶ２４８と命名され、受諾番号ＡＴＣＣ　ＶＲ２２７４の下にＡＴＣＣに寄託されている、請求項２４に記載の分離したヒト遺伝子群間再構築のロタウイルス。
２６．請求項１に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
２７．請求項２に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
２８．請求項４に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
２９．請求項５に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３０．請求項６に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３１．請求項１１に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３２．請求項１２に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３３．請求項１３に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３４．請求項１４に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３５．請求項１５に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３６．請求項１６に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３７．請求項２０に記載したようなワクチンをヒトに投与することを含む、ヒトのロタウイルス病に対して免疫的な予防を与える方法。
３８．ヒトロタウイルスに対する中和抗体の力価を高めるため予防接種後十分な期間以内にヘテロ型の人以外の動物のロタウイルスでヒトに再予防接種することを含む、ヒトロタウイルスに対するヒトの予防接種後形成された中和抗体の力価を高める方法。
３９．該再予防接種は、予防接種後約２から約４ヶ月の期間内に行われる、請求項第３８記載の方法。
４０．ヒトロタウイルス血清型１、２、３及び４から成る群から選ばれるヒトロタウイルス血清型に対する中和抗体の生成を誘発するためワクチンによる該再予防接種の前にヒトに予防接種する段階をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
４１．ヘテロ型の人以外の動物ロタウイルスは、ＷＣ３ウシワクチンである、請求項３８に記載の方法。
４２．ヘテロ型の人以外の動物ロタウイルスは、ＷＣ３ウシワクチンである、請求項４０に記載の方法。
４３．該ヘテロ型で人以外の動物のロタウイルスは、生きて弱毒化または不活性化したロタウイルスである、請求項３８に記載の方法。
４４．ヘテロ型で人以外の動物ロタウイルスは、ＮＣＤＶウシ、ＣＰ−１ウシ、Ｃ３−１６０ウシ、ＰＰ−１ウシ、ＴＣウシ、Ｂ２２３ウシ、ＫＫ３ウシ、Ｖ１００５ウシ、Ｔ５１ウシ、Ｔ６７ウシ、Ｔ８２ウシ、ＵＫウシ、ＯＳＵブタ、ＥＥブタ、Ａ−５８０ブタ、Ｃブタ、ＳＢ−５ブタ及びＥＤＩＭマウスのロタウイルスから成る群から選ばれる、請求項３８に記載の方法。
４５．ヒトロタウイルスに対する中和抗体の力価を高めるために予防接種後十分な期間以内に、ＶＰ４及びＶＰ７遺伝子がそれぞれ人以外の動物のＶＰ４及びＶＰ７蛋白質をエンコードするロタウイルスによって人に再予防接種することを含む、ヒトのロタウイルスに対するヒトの予防接種後産生する中和抗体の力価を高める方法。
４６．該再予防接種は、予防接種後約２ヶ月から約４ヶ月の期間以内に行われる、請求項４５に記載の方法。
４７．ヒトロタウイルス血清型１、２、３及び４から成る群から選ばれるヒトロタウイルス血清型に対する中和抗体の産生を誘発するためワクチンによる当該再予防接種段階の前にヒトに予防接種する段階をさらに含む、請求項４５に記載の方法。