CN102695522B - 新的人轮状病毒株和疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于针对轮状病毒免疫受试者的疫苗组合物和免疫方法。所述疫苗包含轮状病毒株CDC‑9和CDC‑66、其片段、其同源物或它们的结合物。本发明的疫苗可包含CDC‑9、CDC‑66的片段、其同源物、或其结合物。本发明还提供了通过给予本发明的疫苗诱导免疫反应的方法。
Description
政府资助
本发明由美国政府部门疾病控制和预防中心(Centers for Disease Controland Prevention)完成。
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年5月12日提交的美国临时申请No.61/177,393的优先权,所述申请以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本发明主要涉及病毒疫苗株及其相关疫苗组合物和方法。更具体地,本发明涉及引起受试者体内对轮状病毒A的免疫反应的人轮状病毒A疫苗株、疫苗组合物和使用方法。
背景技术
在多种引起儿童严重腹泻的肠道病原性病毒中,轮状病毒是最常见的,它导致每年平均611,000例死亡。几乎所有儿童在5岁前都会被轮状病毒感染。所述病毒被认为是高度传染性的,并被描述为“平等”病毒,因为其感染的影响没有特别的社会经济或地理群的差异。尽管大部分儿童能够得到足够的支持性和缓解性医疗护理,挺过感染而不出现明显的长期后果,然而与严重腹泻、呕吐、脱水和休克有关的死亡数目是不能接受的,并且在可能的情况下需要预防性干预。
轮状病毒A是一种具有特有辐射状形态的呼肠孤病毒科(reoviridae)的二十面体病毒。具体轮状病毒根据病衣壳蛋白的特征按群(group)、亚群(subgroup)和血清型分类。轮状病毒颗粒含有围绕病毒基因组的3个蛋白层,所述病毒基因组由11段双链RNA组成,每段编码一个蛋白。所述病毒蛋白包括称为VP的结构蛋白和称为NSP的非结构蛋白。若干结构蛋白对引发宿主体内的免疫反应特别重要,因为这些蛋白位于所述病毒颗粒的最外层上。具体而言,蛋白VP7和VP4均在很大程度上参与宿主免疫反应,并因此还在轮状病毒疫苗的开发中起中心作用。
VP7和VP4结构蛋白的变体可表征不同的轮状病毒A血清型。具体而言,人VP7的变体被确定为“G”血清型,至少包括血清型G1、G2、G3、G4以及较少见的G5、G6、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。VP4结构蛋白的变体被确定为“P”血清型,包括P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6和P8。由于完整的轮状病毒同时为VP7蛋白和VP4蛋白所表征,因此各个病毒血清型根据具体病毒中包含的这两种蛋白的变体特性而命名。例如,常见的轮状病毒A同时包含G1和P[8]变体,它们分别是VP7和VP4的变体。轮状病毒A的G1,P[8]血清型是在全世界引起疾病的最常见病毒形式之一。轮状病毒A的G1血清型是在全世界与人疾病有关的最常见血清型。已经开发出若干使用轮状病毒A G1株的疫苗,目的是在宿主中形成对轮状病毒A G1株以及具有其他血清型的轮状病毒A株的免疫性。然而,此方法受到G1和G2血清型之间重大不同的限制。具体而言,轮状病毒A G2株来源于与大多数其他轮状病毒株不同的世系。这被核酸杂交实验证明,所述实验显示被称为DS-1遗传组的G2株的11个基因区段的标记转录物不与包括G1、G3、G4和G9的被称为Wa遗传组的轮状病毒A株中的相应核酸杂交。这些同源基因无法杂交表明例如外衣壳蛋白VP4和VP7以及内衣壳蛋白VP6的编码蛋白的差异是显著的。这些遗传差别支持以下观点:使用G1株感染或免疫的个体不太可能表现出对Wa遗传组的其他病毒株那样的对G2株的交叉保护。
除了常见的G1和G2轮状病毒A株以外,人们逐渐认识到人轮状病毒类型的多样性是造成全世界急性严重腹泻疾病的原因。这种多样性突出了对能够对若干株产生免疫性的强效疫苗的要求。最近,美国食品和药物管理局因其制品中有污染物而暂停了ROTARIX疫苗的使用。因此,当轮状病毒感染仍是一个严重的世界性问题的时候,可用的轮状病毒疫苗的数量却减少了。另一种疫苗对于防止中、高收入国家儿童腹泻似乎是安全和有效的,目前已被授权并推荐用于全世界的婴幼儿。然而,此疫苗在亚非低收入国家的功效降低。
因此,仍需要针对常见和不太常见类型的人轮状病毒A的疫苗。
附图说明
图1A是电子显微照片的复本,示出了完整的分离轮状病毒A病毒粒子,该病毒粒子被确定为具有血清型P[8],G1的病毒株CDC-9。
图1B是电子显微照片的复本,示出了完整的分离轮状病毒A病毒粒子,该病毒粒子被确定为具有血清型P[4],G2的病毒株CDC-66。
图2是聚丙烯酰胺凝胶图像的副本,示出了从粪便样本(S)和Vero细胞(V)分离的轮状病毒A株CDC-9的RNA谱,并示出了该轮状病毒株的典型长RNA的电泳型。
图3是聚丙烯酰胺凝胶图像的复本,示出了从粪便样品(S)和Vero细胞(V)分离的轮状病毒A株CDC-66的RNA谱,并示出了该轮状病毒株的典型短RNA的电泳型。
图4A示出了CsCl纯化的轮状病毒A株CDC-9的轮状病毒颗粒的带。
图4B示出了轮状病毒A株CDC-9的确定结构病毒蛋白,通过SDS-PAGE分析,与分子量标记对比。
图5A是柱形图,示出了对照和接种小鼠中对热灭活的轮状病毒的总抗体滴度。
图5B是柱形图,示出了对照和接种小鼠中对热灭活的轮状病毒的中和抗体滴度。
图6是柱形图,示出了在对照和接种小鼠中对与Al(OH)3配制的热灭活的轮状病毒的总血清抗体滴度。
图7A示出了用无抗原的750微克磷酸铝接种的4只小猪的粪便样品中的病毒脱落。
图7B示出了用无佐剂的抗原免疫的小猪的粪便样品中的病毒脱落。
图7C示出了用抗原和佐剂免疫的小猪的粪便样品中的病毒脱落。
图7D示出了在只用缓冲液免疫的小猪的粪便样品中测得的病毒脱落。
图8A是柱形图,示出了在用无抗原的600微克磷酸铝(实心柱)接种的小猪或者用50微克抗原和600微克磷酸铝(阴影柱)接种的小猪的血清中的轮状病毒特异性IgG抗体反应。
图8B是柱形图,示出了在用无抗原的600微克磷酸铝接种的小猪或者用50微克抗原和600微克磷酸铝接种的小猪的血清中的中和抗体反应。
图9A示出了用无抗原的600微克磷酸铝接种的小猪的粪便样品中的病毒脱落。
图9B示出了用50微克抗原和600微克磷酸铝接种的小猪的粪便样品中的病毒脱落。
发明内容
本发明提供一种疫苗组合物,包括一种或多种分离轮状病毒株例如株CDC-9或CDC-66和可药用载体。本发明的疫苗任选包括佐剂。
本发明疫苗中的CDC-9或CDC-66株任选是减毒活轮状病毒或者灭活轮状病毒。
应理解,本发明的疫苗任选包括至少两种分离轮状病毒株。所述至少两种分离轮状病毒株各自独立地具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14的G群血清型。任选地,所述至少两种分离轮状病毒株各自独立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。
本发明的疫苗任选非经肠给药或经口给药。
本发明还提供分离的轮状病毒株,例如CDC-9或CDC-66株。
本发明提供了一种疫苗,其包含与可药用载体混合的特征在于具有G1群血清型的分离轮状病毒株和特征在于具有G2群血清型的轮状病毒株。所述G1或G2群血清型病毒株任选各自独立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。在某些实施方案中,所述特征在于具有G1群血清型的人轮状病毒株是CDC-9,所述特征在于具有G2群血清型的人轮状病毒株是CDC-66。
本发明提供了一种诱导受试者体内对轮状病毒的免疫反应的方法,包括给予疫苗组合物,所述疫苗组合物包含与可药用载体混合的分离人轮状病毒株CDC-9或CDC-66。
本发明提供了一种诱导受试者体内对轮状病毒的免疫反应的方法,其包括给予疫苗组合物,所述疫苗组合物包含与可药用载体混合的特征在于具有G1群血清型的分离人轮状病毒株和特征在于具有G2群血清型的分离人轮状病毒株。
本发明还提供了一种疫苗,所述疫苗包含与可药用载体混合的分离人轮状病毒的一部分。所述分离人轮状病毒的一部分是肽或多肽,所述肽或多肽包括SEQ ID No.2;SEQID No.5;SEQ ID No.8;SEQ ID No.11;SEQ ID No.14;SEQ ID No.17;SEQ ID No.20;SEQID No.23;SEQ ID No.26;SEQ ID No.29;SEQ ID No.32;SEQ ID No.3;SEQ ID No.6;SEQID No.9;SEQ ID No.12;SEQ ID No.15;SEQ ID No.18;SEQ ID No.21;SEQ ID No.24;SEQID No.27;SEQ ID No.30;SEQ ID No.33;SEQ ID No.71;SEQ ID No.77;SEQ ID No.83;SEQID No.89;SEQ ID No.95;SEQ ID No.101;SEQ ID No.107;SEQ ID No.113;SEQ IDNo.119;SEQ ID No.125;SEQ ID No.131;SEQ ID No.72;SEQ ID No.78;SEQ ID No.84;SEQID No.90;SEQ ID No.96;SEQ ID No.102;SEQ ID No.108;SEQ ID No.114;SEQ IDNo.120;SEQ ID No.126;SEQ ID No.132的氨基酸序列;其同源物或其片段。
具体实施方式
根据本发明的实施方案,提供了新的分离人轮状病毒A株、包含人轮状病毒A株的疫苗、包含人轮状病毒A多肽和/或其免疫原性片段的疫苗、抗轮状病毒A抗体和接种人对抗轮状病毒A疾病的方法。
本文使用的科技术语意图具有本领域技术人员通常理解的含义。这些术语在多本教科书/参考书的上下文中有定义并被使用,包括例如,这些J.Sambrook andD.W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press;3rd Ed.,2001;F.M.Ausubel,Ed.,Short Protocols in MolecularBiology,Current Protocols;5th Ed.,2002;B.Alberts et al.,Molecular Biology ofthe Cell,4th Ed.,Garland,2002;D.L.Nelson and M.M.Cox,Lehninger Principles ofBiochemistry,4th Ed.,W.H.Freeman & Company,2004;Wild,D.,The ImmunoassayHandbook,3rd Ed.,Elsevier Science,2005;Gosling,J.P.,Immunoassays:A PracticalApproach,Practical Approach Series,Oxford University Press,2005;AntibodyEngineering,Kontermann,R.and ,S.(Eds.),Springer,2001;Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988;Ausubel,F.et al.,(Eds.),Short Protocols in Molecular Biology,Wiley,2002;J.D.Pound(Ed.)Immunochemical Protocols,Methods in Molecular Biology,HumanaPress;2nd ed.,1998;B.K.C.Lo(Ed.),Antibody Engineering:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2003;和Kohler,G.and Milstein,C,Nature,256:495-497(1975),这些教科书/参考书的内容均以引用的方式纳入本文。
人轮状病毒
本发明的新的人轮状病毒A株例如被确定为CDC-9和CDC-66、其片段或其同源物。
CDC-9轮状病毒A株从Providence,Rhode Island的5月龄男孩的粪便样品中分离。人轮状病毒株CDC-9通过使用G-和P-型特异性引物的RT-PCR表征。RT-PCR分析表明分离的病毒株CDC-9是具有基因型(genotype)P[8],G1的病毒株。Esona,MD,et al.,HumanVaccines,2010;6:1-7描述了CDC-9的具体特征,其鉴定、分离和在Vero细胞中的传代,该文献的全部内容以引用的方式纳入本文。
从粪便样品分离后,使分离轮状病毒株CDC-9适应在MA104细胞中生长,MA104细胞在1980年之前制备和冷冻并有完备的记录。然后,使CDC-9病毒株适应在可用于疫苗生产的Vero细胞中生长。将CDC-9通过进行3轮有限稀释纯化,并且在Vero细胞中扩增后通过进行3轮噬菌斑测定进一步纯化。所分离的病毒株CDC-9分别在MA104和Vero细胞中传7和38代(共45代)。所述适应和全部传代都是使用标准操作方法和合格原材料及试剂并在GoodLaboratory Practice Guidelines指导下完成。与其他参考病毒株或实验室病毒株不同,所分离的病毒株CDC-9具有完整的传代史和记录。
传代的人轮状病毒株CDC-9的滴度为约107ffu/ml。
使用从感染的Vero细胞培养物的培养基分离的CDC-9病毒粒子通过电子显微术研究分离的人轮状病毒株CDC-9。图1A示出了分离CDC-9病毒粒子的电子显微照片。所述显微照片显示所述病毒粒子具有人轮状病毒A病毒粒子的典型形态。
使用从人轮状病毒株CDC-9分离的RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步检测所述分离的人轮状病毒株。如图2所示,CDC-9具有典型的长RNA电泳型,并且来自粪便的原始分离株和Vero传代的轮状病毒的RNA谱是相同的。图2还示出了比较用标准品,包括Wa基因群(genogroup)人轮状病毒的RNA谱。
通过全基因组的序列分析分析了在粪便和Vero细胞(第27代)中的分离的人轮状病毒株CDC-9。
从粪便样品分离的核酸编码的蛋白的CDC9氨基酸序列:CDC9 NSP1 aa-粪便是SEQID No.2;CDC9 NSP2 aa-粪便是SEQ ID No.5;CDC9 NSP3 aa-粪便是SEQ ID No.8;CDC9NSP4 aa-粪便是SEQ ID No.11;CDC9 NSP5 aa-粪便是SEQ ID No.14;CDC9 VP1 aa-粪便是SEQ ID No.17;CDC9 VP2 aa-粪便是SEQ ID No.20;CDC9 VP3 aa-粪便是SEQ ID No.23;CDC9 VP4 aa-粪便是SEQ ID No.26;CDC9 VP6 aa-粪便是SEQ ID No.29;CDC9 VP7 aa-粪便是SEQ ID No.32。
从粪便样品分离的核酸的CDC9核苷酸序列:CDC9 NSP1 nt-粪便是SEQ ID No.35;CDC9 NSP2 nt-粪便是SEQ ID No.38;CDC9 NSP3 nt-粪便是SEQ ID No.41;CDC9 NSP4 nt-粪便是SEQ ID No.44;CDC9 NSP5 nt-粪便是SEQ ID No.47;CDC9 VP1nt-粪便是SEQ IDNo.50;CDC9 VP2 nt-粪便是SEQ ID No.53;CDC9 VP3 nt-粪便是SEQ ID No.56;CDC9 VP4nt-粪便是SEQ ID No.59;CDC9 VP6 nt-粪便是SEQ ID No.62;CDC9 VP7 nt-粪便是SEQ IDNo.65。
从分离自Vero细胞的第27代CDC9轮状病毒分离的核酸编码的蛋白的CDC9氨基酸序列:CDC9 NSP1 aa-Vero是SEQ ID No.3;CDC9 NSP2 aa-Vero是SEQ ID No.6;CDC9 NSP3aa-Vero是SEQ ID No.9;CDC9 NSP4 aa-Vero是SEQ ID No.12;CDC9 NSP5 aa-Vero是SEQID No.15;CDC9 VP1 aa-Vero是SEQ ID No.18;CDC9 VP2 aa-Vero是SEQ ID No.21;CDC9VP3 aa-Vero是SEQ ID No.24;CDC9 VP4 aa-Vero是SEQ ID No.27;CDC9 VP6 aa-Vero是SEQ ID No.30;CDC9 VP7 aa-Vero是SEQ ID No.33。
从分离自Vero细胞的第27代CDC9轮状病毒分离的核酸的CDC9核苷酸序列:CDC9NSP1 nt-Vero是SEQ ID No.36;CDC9NSP2 nt-Vero是SEQ ID No.39;CDC9 NSP3 nt-Vero是SEQ ID No.42;CDC9 NSP4 nt-Vero是SEQ ID No.45;CDC9 NSP5nt-Vero是SEQ ID No.48;CDC9 VP1 nt-Vero是SEQ ID No.51;CDC9 VP2 nt-Vero是SEQ ID No.54;CDC9 VP3 nt-Vero是SEQ ID No.57;CDC9 VP4 nt-Vero是SEQ ID No.60;CDC9VP6 nt-Vero是SEQ IDNo.63;CDC9 VP7 nt-Vero是SEQ ID No.66。
如本文所示的,将从粪便和感染的培养物分离的CDC-9轮状病毒的全基因组的核苷酸和氨基酸序列与从轮状病毒A的参考KU病毒株或其他G1P8病毒株的全基因组的氨基酸和核苷酸序列进行比较。
此外,如表2所示,CDC-9基因(除了区段3)与原型P[8],G1人KU病毒株的相应基因具有高度序列同一性。
表2.轮状病毒株CDC-9基因区段与原型轮状病毒株KU的同族基因序列(cognategene sequence)相比的核苷酸(NT)和推定氨基酸(AA)的同一性百分比
此外,如表3所示,记录了从粪便到Vero细胞中第27代的CDC-9病毒株的全基因组的nt和aa序列变化。
表3.从粪便到Vero细胞中第27代的CDC-9的基因的nt和aa变化
在Vero细胞中分离的轮状病毒CDC-9是具有KU样病毒株的全部基因(除了区段3)的重配株。CDC-9具有来源于DS-1样病毒株的区段3,因为CDC-9 VP3与DS-1病毒株的同族基因具有高度同一性。此重配株可能在自然感染过程中产生,或者在粪便样品中的G1P8和G2P4轮状病毒在细胞培养物中适应和传代时产生。轮状病毒VP3被描述为具有鸟苷转移酶(guanyltransferase),并可参与病毒复制和形态发生。
CDC-66轮状病毒A株从Providence,Rhode Island的11月龄女孩的粪便样品中分离。人轮状病毒株CDC-66使用G-和P-型特异性引物通过RT-PCR表征。RT-PCR分析表明,分离的病毒株CDC-66是具有血清型P[4],G2的病毒株。
从粪便样品分离后,使分离的轮状病毒株CDC-66适应在MA104细胞中生长,MA104细胞在1980年之前制备和冷冻并有完整的传代史和记录。然后使CDC-66病毒株适应在可用于疫苗生产的Vero细胞中生长。将CDC-66通过进行3轮有限稀释纯化,并且在Vero细胞中扩增后通过进行3轮噬菌斑测定进一步纯化。所分离的病毒株CDC-66分别在MA104和Vero细胞中传5和40代(共45代)。所述适应和全部传代都是使用标准操作方法和合格原材料及试剂并在Good Laboratory Practice Guidelines指导下完成。与其他参考病毒株和实验室病毒株不同,所分离的病毒株CDC-66具有完整的传代史和记录。
传代的人轮状病毒株CDC-66的滴度为约107pfu/ml。
使用从感染的Vero细胞培养物的培养基分离的CDC-66病毒粒子通过电子显微术研究了分离的人轮状病毒株CDC-66。图1B示出了分离的CDC-66病毒粒子的电子显微照片。该显微照片显示所述病毒粒子具有人轮状病毒粒子的典型形态。
使用从分离的人轮状病毒株CDC-66分离的RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳对所述病毒株进一步检测。如图3所示,CDC-66具有典型的短RNA电泳型,并且来自粪便的原始分离株的RNA谱和Vero传代的轮状病毒的RNA谱是相同的。图3还显示了用于比较的标准物,包括最左边泳道的DNA分子量标记III(Roche)和恒河猴轮状病毒RRV的RNA谱。
通过全基因组的序列分析分析了在粪便和Vero细胞(27代)中分离的人轮状病毒株CDC-66。
从粪便样品分离的核酸编码的蛋白的CDC66氨基酸序列:CDC66 NSP1 aa-粪便是SEQ ID No.71;CDC66 NSP2 aa-粪便是SEQ ID No.77;CDC66 NSP3 aa-粪便是SEQ IDNo.83;CDC66NSP4 aa-粪便是SEQ ID No.89;CDC66 NSP5 aa-粪便是SEQ ID No.95;CDC66VP1 aa-粪便是SEQ ID No.101;CDC66 VP2 aa-粪便是SEQ ID No.107;CDC66 VP3 aa-粪便是SEQ ID No.113;CDC66 VP4 aa-粪便是SEQ ID No.119;CDC66 VP6 aa-粪便是SEQ IDNo.125;CDC66 VP7 aa-粪便是SEQ ID No.131。
从粪便样品分离的核酸编码的蛋白的CDC66核苷酸序列:CDC66 NSP1 nt-粪便是SEQ ID No.68;CDC66 NSP2 nt-粪便是SEQ ID No.74;CDC66 NSP3 nt-粪便是SEQ IDNo.80;CDC66NSP4 nt-粪便是SEQ ID No.86;CDC66 NSP5 nt-粪便是SEQ ID No.92;CDC66VP1 nt-粪便是SEQ ID No.98;CDC66 VP2 nt-粪便是SEQ ID No.104;CDC66 VP3 nt-粪便是SEQ ID No.110;CDC66 VP4 nt-粪便是SEQ ID No.116;CDC66 VP6 nt-粪便是SEQ IDNo.122;CDC66 VP7 nt-粪便是SEQ ID No.128。
从分离自Vero细胞的第27代CDC66轮状病毒分离的核酸编码的蛋白的CDC-66氨基酸序列:CDC66 NSP1 aa-Vero是SEQ ID No.72;CDC66 NSP2 aa-Vero是SEQ ID No.78;CDC66 NSP3 aa-Vero是SEQ ID No.84;CDC66 NSP4 aa-Vero是SEQ ID No.90;CDC66 NSP5aa-Vero是SEQ ID No.96;CDC66 VP1 aa-Vero是SEQ ID No.102;CDC66 VP2 aa-Vero是SEQID No.108;CDC66 VP3 aa-Vero是SEQ ID No.114;CDC66 VP4 aa-Vero是SEQ ID No.120;CDC66 VP6 aa-Vero是SEQ ID No.126;CDC66 VP7 aa-Vero是SEQ ID No.132。
从分离自Vero细胞的第27代CDC66轮状病毒分离的核酸编码的蛋白的CDC66核苷酸序列:CDC66 NSP1 nt-Vero是SEQ ID No.69;CDC66 NSP2 nt-Vero是SEQ ID No.75;CDC66 NSP3nt-Vero是SEQ ID No.81;CDC66 NSP4 nt-Vero是SEQ ID No.87;CDC66 NSP5nt-Vero是SEQ ID No.93;CDC66 VP1 nt-Vero是SEQ ID No.99;CDC66 VP2 nt-Vero是SEQID No.105;CDC66 VP3 nt-Vero是SEQ ID No.111;CDC66 VP4 nt-Vero是SEQ ID No.117;CDC66 VP6 nt-Vero是SEQ ID No.123;CDC66 VP7 nt-Vero是SEQ ID No.129。
如本文所示的,将从粪便和Vero细胞分离的CDC-66轮状病毒的全氨基酸和核苷酸序列与被认为是最接近的相关已知轮状病毒A——人轮状病毒DS-1病毒株——或其他密切相关病毒株的轮状病毒A株的全氨基酸和核苷酸序列进行对比。
如表4所示,CDC-66基因与原型P[4],G2病毒株DS-1的相应基因具有高度序列同一性。
表4.轮状病毒疫苗株CDC-66基因组与原型轮状病毒株DS-1的基因组序列对比得到的核苷酸(NT)及推定的氨基酸(AA)的同一性百分比。
基因 | nt% | aa% |
VP1 | 90.85 | 97.24 |
VP2 | 94.11 | 98.86 |
VP3 | 92.9 | 95.69 |
VP4 | 94.02 | 96.52 |
VP6 | 87.98 | 98.74 |
VP7 | 93.88 | 96.32 |
NSP1 | 93.12 | 93.21 |
NSP2 | 86.89 | 93.99 |
NSP3 | 95.31 | 97.12 |
NSP4 | 94.76 | 95.43 |
NSP5 | 92.57 | 96.5 |
如表5所示,记录了从粪便到在Vero细胞中传代的CDC-66病毒株的全基因组的nt和aa序列变化。
表5.从粪便到Vero细胞中第27次的CDC-66的基因的nt和aa变化
基因 | nt变化 | aa变化 |
NSP1 | 无 | 无 |
NSP2 | 470C→T | 142H→Y |
NSP3 | 无 | 无 |
NSP4 | 无 | 无 |
NSP5 | 126T→C,199A→G | 60I→V |
VP1 | 440A→G | 141N→S |
VP2 | 无 | 无 |
VP3 | 760T→C,1143T→C,1882A→G | 365L→S |
VP4 | 770C→A,1109T→C,1162G→A,1184A→G | 254T→K,367V→A,385D→N,392E→G |
VP6 | 无 | 无 |
VP7 | 无 | 无 |
疫苗
本发明提供了疫苗及用其诱导患者体内对引起疾病的轮状病毒的活性免疫与防护的方法。
在具体实施方案中,根据本发明提供用于增强受试者体内对轮状病毒介导的疾病的免疫防护的疫苗组合物,其包括与可药用载体混合的人轮状病毒株。
本文所用的术语“疫苗组合物”是指包括生物试剂的组合物,所述生物试剂能够诱导接种所述疫苗组合物的受试者中的免疫反应。在具体实施方案中,所述生物试剂是减毒活轮状病毒和/或灭活轮状病毒。在其他实施方案中,所述生物试剂是轮状病毒的抗原性部分。
在具体实施方案中,本发明的疫苗组合物中包括的人轮状病毒株是CDC-9或CDC-66。本发明的疫苗组合物任选包括这些人轮状病毒株的结合物。此外,本发明的疫苗组合物任选包括CDC-9或CDC-66以外的人轮状病毒株。
在具体实施方案中,本发明的疫苗组合物包括至少两种轮状病毒株。所述两种或多种轮状病毒株各自独立地具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14的G血清型。因此,例如,本发明的疫苗组合物包含CDC-9或CDC-66的至少一种,以及至少一种具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14的G血清型的第二人轮状病毒株。
在具体实施方案中,疫苗组合物包含的所述至少两种分离轮状病毒株各自均具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P血清型。
在本发明的疫苗组合物的具体实施方案中,用于增强受试者体内对轮状病毒介导的疾病的免疫防护的疫苗组合物包含特征在于具有G1血清型的第一人轮状病毒株和特征在于具有G2血清型的第二人轮状病毒株。所述两种轮状病毒株各自独立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。
在某些实施方案中,所述具有G1血清型的人轮状病毒株是CDC-9。
在某些实施方案中,所述具有G2血清型的人轮状病毒株是CDC-66。
在本发明的疫苗组合物的具体实施方案中,人轮状病毒株的结合物包括CDC-9和CDC-66。
本发明的疫苗组合物包含的人轮状病毒株是减毒活轮状病毒或灭活轮状病毒。减毒活轮状病毒或灭活轮状病毒的选择取决于某些因素,例如疫苗组合物的给药途径。
在具体实施方案中,包含人轮状病毒A株CDC-9和/或CDC-66、一种或多种轮状病毒A CDC-9和/或CDC-66多肽、和/或一种或多种轮状病毒A CDC-9和/或CDC-66多肽的免疫原性片段的疫苗组合物刺激对轮状病毒A CDC-9和/或CDC-66病毒株的中和抗体的产生。
本发明的实施方案提供了包括一种或多种轮状病毒A多肽和/或一种或多种轮状病毒A多肽的免疫原性片段的疫苗组合物。在具体实施方案中,本发明疫苗组合物包括CDC-9和/或CDC-66多肽,其同源物,和/或其免疫原性片段。
术语“同源物”是指特征为氨基酸序列与参考CDC-9或CDC-66轮状病毒A多肽同源的多肽。
CDC-9序列
因此,本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:2的NSP1或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:3的NSP1或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:5的NSP2或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:8的NSP3或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:11的NSP4或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:11具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:14的NSP5或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:14具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:15的NSP5或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:15具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
因此,本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:17的VP1或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:20的VP2或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:23的VP3或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:23具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:26的VP4或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:26具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:27的VP4或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:27具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:29的VP6或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:29具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:30的VP6或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:30具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:32的VP7或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:32具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
CDC-66序列
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:71的NSP1或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:71具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:77的NSP2或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:77具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:78的NSP2或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:78具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:83的NSP3或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:83具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:89的NSP4或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:89具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:95的NSP5或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:95具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:96的NSP5或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:96具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
因此,本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:101的VP1或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:101具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:102的VP1或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:102具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:107的VP2或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:107具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:113的VP3或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:113具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:114的VP3或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:114具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:119的VP4或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:119具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。本发明还提供了一种包括具有SEQ ID NO:120的VP4或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:120具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:125的VP6或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:125具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种包括具有SEQ ID NO:131的VP7或其同源物的病毒,所述同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:131具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性。
本发明提供了一种分离或纯化的NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、VP1、VP2、VP3、VP4、VP6或VP7。本文使用的术语“纯化的”或“分离的”意图指可与其他组分分离的组成,其中所述组成相对其天然可获得状态——即,在此案中,相对其在细胞内的纯度,相对其在病毒粒子内的纯度或相对其在感染生物体内的纯度——被纯化至任意程度。因此,分离的组成也指基本与其天然存在的环境脱离的蛋白、肽、核酸或寡核苷酸。
应认识到,多种变体、类似物或同源物也在本发明的范围之内,包括增强、降低或不改变本发明免疫原或疫苗的功能或免疫原特性的氨基酸置换、改变、修饰或其他氨基酸变化。还应理解,本发明的序列任选通过加入一个或多个氨基酸、糖、核苷酸、侧基、荧光团、发光团、放射活性分子、脂质、脂肪酸、它们的衍生物或本领域已知的其他基团而被修饰。例如,本发明免疫原与蛋白缀合。任选地,本发明的免疫原与促进免疫原的免疫原性的蛋白缀合,所述蛋白例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或其修饰物,以及来自ThermoScientific,Rockford,IL的BLUE CARRIER免疫原性蛋白。其他来源的天然或人工免疫原性蛋白缀合物是本领域已知的。任选地,本发明的免疫原与抗体缀合。任选地,本发明的免疫原与可以含有或不含表位的G蛋白的其他区域缀合。
在某些实施方案中,所述NSP1具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:3具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述NSP1具有SEQ ID NO:71,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:71具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的NSP2。在一个实施方案中,所述NSP2具有SEQID NO:5,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述NSP2具有SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的NSP3。在一个实施方案中,所述NSP3具有SEQID NO:8,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述NSP3具有SEQ ID NO:83,或者是氨基酸序列与SEQ IDNO:83具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的NSP4。在一个实施方案中,所述NSP4具有SEQID NO:11,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:11具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述NSP4具有SEQ ID NO:89,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:89具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的NSP5。在一个实施方案中,所述NSP5具有SEQID NO:14或SEQ ID NO:15,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述NSP5具有SEQ IDNO:95或SEQ ID NO:96,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:96具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的VP1。在一个实施方案中,所述VP1具有SEQ IDNO:17,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述VP1具有SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的VP2。在一个实施方案中,所述VP2具有SEQ IDNO:20,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述VP2具有SEQ ID NO:107,或者是氨基酸序列与SEQ IDNO:107具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的VP3。在一个实施方案中,所述VP3具有SEQ IDNO:23,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:23具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述VP3具有SEQ ID NO:113或SEQ ID NO.114,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:113或SEQ ID NO.114具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的VP4。在一个实施方案中,所述VP4具有SEQ IDNO:26或SEQ ID NO.27,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO.27具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述VP4具有SEQ ID NO:119或SEQ ID NO.120,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:119或SEQ ID NO.120具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的VP6。在一个实施方案中,所述VP6具有SEQ IDNO:29或SEQ ID NO.30,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO.30具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述VP6具有SEQ ID NO:125,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:125具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明提供了一种分离的或纯化的VP7。在一个实施方案中,所述VP7具有SEQ IDNO:32,或者是氨基酸序列与SEQ ID NO:32具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。在另一个实施方案中,所述VP7具有SEQ ID NO:131,或者是氨基酸序列与SEQ IDNO:131具有大于97%、大于98%或大于99%的同一性的同源物。
本发明的实施方案提供了一种分离的或纯化的编码上述蛋白或其片段的核酸。任选地,所述分离的或纯化的编码上述蛋白或其片段的核酸被包括在载体中。
编码NSP1的核酸包括SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:68的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码NSP2的核酸包括SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码NSP3的核酸包括SEQID NO:41、SEQ ID NO:80的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码NSP4的核酸包括SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:86的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码NSP5的核酸包括SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码VP1的核酸包括SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码VP2的核酸包括SEQID NO:53、SEQ ID NO:104的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码VP3的核酸包括SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码VP4的核酸包括SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:117的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码VP6的核酸包括SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:122的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。编码VP7的核酸包括SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129的核苷酸序列或其编码至少9个连续氨基酸的片段。
本领域技术人员会理解,由于遗传编码的简并性,具体多肽或其片段可由多于一种核酸序列编码。
可使用标准分子生物学技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入突变。本领域技术人员会认识到,可引入一个或多个氨基酸突变而不改变轮状病毒多肽的功能特性。例如,可进行一个或多个氨基酸置换、加入或缺失而不改变轮状病毒多肽的功能特性。还应理解多种突变任选地增强、降低或不改变本发明多肽的免疫原性。
可在轮状病毒多肽中进行保守氨基酸置换以产生同源物。保守氨基酸置换是本领域承认的一种氨基酸对具有相似特性的另一种氨基酸的置换。例如,每种氨基酸均可被描述为具有一种或多种以下特性:正电性的、负电性的、脂肪族的、芳香族的、极性的、疏水的和亲水的。保守性置换是具有结构或功能特性的一种氨基酸对另一种具有相同特性的氨基酸的置换。酸性氨基酸包括天门冬氨酸、谷氨酸;碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸;脂肪族氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸;芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和色氨酸;极性氨基酸包括天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸;疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸和色氨酸;保守性置换包括各组内的氨基酸之间的置换。氨基酸还可以就相对大小进行描述,丙氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、天门冬酰胺、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸通常被认为是小氨基酸。
在进行这些改变时,可考虑氨基酸的水化指数(hydropathicindex)。本领域通常理解水化氨基酸指数对赋予多肽相互作用的生物功能的重要性。已知某些氨基酸可被具有相似水化指数或分数的其他氨基酸置换,仍形成具有相似生物活性的多肽。每个氨基酸都被基于其疏水性和荷电特性而赋以一个水化指数。这些指数为:异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天门冬氨酸(-3.5)、天门冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)、精氨酸(-4.5)。
所述氨基酸的相对水化特性被认为决定了所形成多肽的二级结构,其进而确定所述多肽与其他分子例如酶、底物、受体、抗体、抗原等的相互作用。本领域已知,氨基酸可被具有相似水化指数的另一氨基酸置换,仍得到功能上等价的多肽。在这种变化中,优选水化指数在±2之内的氨基酸的置换,特别优选水化指数在±1之内的氨基酸的置换,甚至更优选水化指数在±0.5之内的氨基酸的置换。
相似氨基酸的置换还可基于亲水性进行,特别是当这样得到的生物功能等价的蛋白或肽旨在用于免疫学实施方案时。氨基酸残基被如下亲水性值:精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天门冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天门冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、脯氨酸(-0.5±1)、苏氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应理解,一个氨基酸可被另一具有相似亲水性值的氨基酸置换,仍得到生物学上等价(具体而言免疫学上等价)的多肽。在这种变化中,优选亲水性值在±2之内的氨基酸的置换,特别优选亲水性值在±1之内的氨基酸的置换,甚至更优选亲水性值在±0.5之内的氨基酸的置换。
如上所述,氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,例如,它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑多种前述特征的示例性置换在本领域广为技术人员所知,包括(原始残基:示例性置换):(Ala:Gly,Ser)、(Arg:Lys)、(Asn:Gln,His)、(Asp:Glu,Cys,Ser)、(Gln:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala)、(His:Asn,Gln)、(HIle:Leu,Val)、(Leu:Ile,Val)、(Lys:Arg)、(Met:Leu,Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp,Phe)、(Val:HeIle,Leu)。本发明的实施方案因此考虑以上列出的多肽的功能或生物学等价物。具体而言,所述多肽的实施方案可以包括与所关注多肽有约50%、60%、70%、80%、90%和95%序列同一性的变体。
轮状病毒颗粒、核酸、多肽及其片段可使用广为人知的常规技术在重组宿主细胞中生产。在宿主细胞中有效生产所编码的蛋白或其片段的任意核酸构建体均可用于生产轮状病毒颗粒、轮状病毒多肽或其片段。
本领域普通技术人员知晓许多方式可制备用于本发明的疫苗组合物或用于本发明方法的本发明的CDC-9或CDC-66病毒。例如,从粪便或其他生物学样品分离假定存在的轮状病毒是惯常做法,任选包括使用类似于例如Esona,MD,et al.,Human Vaccines,2010;6:1-7中的方法在细胞培养物例如在Vero细胞中传代,所述文献的内容以引用的方式纳入本文。本领域技术人员可以常规方式分离病毒株,通过本领域广为人知的技术表征基因组序列。本领域技术人员对病毒基因组测序并将所得序列与模式序列例如本文公开的CDC-9或CDC-66的序列对比以确定所分离的病毒是否具有所需基因序列,为CDC-9、CDC-66、或其同源物。
本领域技术人员还知晓修饰模式轮状病毒例如KU或DS-1以得到CDC-9或CDC-66病毒的方法。一个这种方法使用Komoto,S.,et al.,PNAS USA,2006;103:4646-4651的反向遗传学方法,所述文献的内容以引用的方式纳入本文。简言之,病毒株KU的每个基因均可通过以下方法分离和扩增:采集感染的MA104细胞的培养液,提取病毒dsRNA并使用起始引物以禽成髓细胞血症病毒反转录酶(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase)(Seikagaku Kogyo,Tokyo,Japan)合成DNA。设计合成cDNA的引物完全在本领域技术人员的水平之内。本领域技术人员知晓多种用于引物合成的免费和市售程序。例如,Komoto,S.,etal.,PNAS USA,2006;103:4646-4651描述了用于KU VP4基因的引物。对KU或任何其他病毒株的序列进行修饰以得到CDC-9或CDC-66的序列是例如通过用序列比对进行序列修饰实现的。一旦弄清核苷酸置换,就可通过使用可从Agilent Technologies,Santa Clara,CA获得的QUICKCHANGE XL定点诱变试剂盒实现对cDNA的修饰。任选地将经修饰的与CDC-9、CDC-66或其同源物的序列一致的基因序列连同辅助病毒例如KU一起插入到细胞系例如COS-7细胞中,所述辅助病毒用作将基因插入新病毒的基础。随后通过已知的技术分离经修饰的病毒。使用一种可选的重复方法,籍此CDC-9或CDC-66的各个基因逐步置换所述辅助病毒的基因,籍此使用分离的由第一基因的置换得到的置换病毒株作为用于置换第二基因的辅助病毒,如此类推,直至从源病毒株获得CDC-9或CDC-66。
辅助病毒或模式轮状病毒的实例可在以下Genbank登录号中找到:(a)VP3病毒株:RV161-00(DQ490547)、RV176-00(DQ490553)、DRC88(DQ005112)、DRC86(DQ005123)、TB-Chen(AY787654)、DS-1(AY277914)、AU-1(DQ490537)、T152(DQ146701)、Hosokawa(DQ870491)、Hochi(AY277915)、Wa(AY267335)、L26(AY277918)、KU(AB022767)、Dhaka25-02(DQ146651)、Dhaka12-03(DQ146662)、B4633-03(DQ146640)、PO-13(AB009631)。
(b)VP7(G1)病毒株:SK417(EU839907)、DH415(EU839906)、MMC82(EU839913)、Dhaka18-02(AY631051)、MMC56(EU839911)、Matlab159-02(AY631055)、ISO-4(AY098670)、Thai-2104(DQ512982)、CMH042/04(EF199713)、417(D16328)、T73(AF450291)、TE1(D17721)、K18(D16319)、Chi-87(DQ512998)、J-4825(DQ512989)、88H249(AB081795)、421(D16326)、RV-4(M64666)、AU007(AB081799)、HOU8697(U88717)、Mvd9607(AF480295)、80(D16325)、DC03(AF183859)、KU(AB222788)、K2(D16323)、K8(D16344)、Egy-8(U26374)、Brz-5(U26367)、Wa(K02033)、D(AB118022)、C95(L24165)、T449(M92651)、DS-1(AB118023)。
(c)VP4P[8]病毒株:ITO(AB008280)、D(EF672570)、Wa(L34161)、Hochi(AB008295)、Odelia(AB008296)、VA70(AJ540229)、CH32(AB008274)、MO(AB008278)、KU(AB222784)、Wi61(EF672619)、F45(U30716)P(EF672598)、AI-39(AB008283)、90-544(AB008304)、B4633-03(DQ146641)、Dhaka25-02(DQ146652)、SK438(EU839955)、DH402(EU839958)、DH415(EU839955)、DS-1(AB118025)。
(d)NSP4病毒株:Dhaka16-03(DQ492678)、1099(AJ236759)、Dhaka12-03(DQ146669)、Dhaka25-02(DQ146658)、KU(AB022772)、Wa(AF093199)、RMC321(AF541921)、OSU(D88831)、AU-1(D89873)、CMH120/04(DQ923799)、B4106(AY740732)、C-11(AF144793)、DRC86(DQ005116)、DRC88(DQ005105)、DS-1(AF174305)、TB-Chen(AY787650)、Ch-1(AB065287)。
上述登录号的每个文件和序列均以引用的方式纳入本文。
其他方法、引物、分离技术、测序技术和表征技术为本领域技术人员所知并在本文中可以同样方式操作。例如,本领域技术人员可从分离的基因从头重构CDC-9或CDC-66病毒,例如通过例如Gonzalez,SA,and Affranchino,JL,J.Gen.Virol.,1995;76:2357-2360的技术或其改进方法以捕获的基因装配病毒粒子,所述文献的内容以引用的方式纳入本文。
表达构建体及其产生方法以及表达所需蛋白的用途为本领域所知,如例如在Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,2001;Ausubel,F.et al.,(Eds.),Short Protocols in MolecularBiology,Wiley,2002;and S.J.Higgins and B.D.Hames(Eds.),Protein Expression:APractical Approach,Oxford University Press,USA,1999中所述。
例如,编码一种或多种轮状病毒多肽和/或轮状病毒多肽片段的核酸分子与控制表达载体中转录表达的调控序列可操作地连接。将所述表达载体引入宿主细胞,然后可分离得到的轮状病毒颗粒、一种或多种轮状病毒多肽和/或轮状病毒多肽片段。示例性构建体包括通过以下方式将轮状病毒核酸分子可操作地连接到质粒pT7中:先使用包括T7启动子序列的引物扩增所述核酸分子,并将所扩增的核酸连接到T7表达载体pX8dT中,如Schnell,MJ,et al.,EMBO J,1994;13:4195-4203所述,所述文献的内容以引用的方式纳入本文。
控制表达载体中转录表达的调控序列的非限制性实例包括例如启动子、增强子、剪接信号、转录起始位点、转录终止信号、多腺苷酸化信号、内部核糖体结合位点(IRES)以及它们的结合或者其他调控序列。
表达载体包括但不限于用于表达所需蛋白的病毒载体和细菌载体。表达载体的非限制性实例包括细菌质粒、噬菌体、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和慢病毒。
用于表达多肽及其片段的宿主细胞可为原核细胞或真核细胞,例如细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
用广为人知的技术例如感染或转染将表达载体引入宿主细胞,其中转染包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、电穿孔和超声波穿孔。
除了重组方法以外,还可使用化学合成技术来生产多肽及其片段。例如,可使用固相合成、溶液相合成、部分固相合成或片段缩合法。
本文使用的术语“分离的”是指已与其他细胞组分分离的物质,所述其他细胞组分在自然条件下与所述物质有联系,或者当以重组方式产生时不意欲与所述物质有联系,并且所述其他细胞组分可干扰所述物质在治疗、预防、诊断、研究或其他用途中的应用。通常,本文所述的分离的物质的纯度为至少约80%、至少约90%、至少约95%或大于约99%。纯化可使用广为人知的标准方法例如分级分离和/或色谱法实现,例如硫酸铵沉淀和洗脱色谱法如尺寸排阻色谱法、置换色谱法、离子交换色谱法和生物亲和色谱法。S.Doonan,ProteinPurification Protocols Humana Press,1996中描述了示例性纯化方法。
同一性百分比可通过比较氨基酸或核酸序列确定,所述氨基酸或核酸序列包括参考轮状病毒A氨基酸或核酸序列以及推定的同源物氨基酸或核酸序列。用于确定同一性百分比的算法包括例如以下文献中的算法:S.Karlin and S.Altshul,PNAS,90:5873-5877,1993;T.Smith and M.Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-489,1981;S.Needleman andC.Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443-453,1970;W.Pearson and D.Lipman,PNAS,85:2444-2448,1988;以及其他纳入计算机执行的算法,例如但不限于GAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA;以及BLAST,例如纳入Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575 Science Drive,Madison的算法,可从National Center for BiotechnologyInformation公开获得。
轮状病毒A CDC-9和/或CDC-66多肽、其同源物和/或其免疫原性片段可通过包括以下方法的多种方法中的任一种制备:从源例如培养细胞或患者样品分离病毒颗粒;从病毒颗粒分离一种或多种多肽和/或一种或多种多肽片段;重组生产病毒多肽、片段和/或病毒颗粒(包括完整颗粒和病毒样颗粒);和/或通过化学合成技术。在本文中、在本文引用的参考文献中详细描述了分离病毒颗粒、病毒多肽和/或一种或多种病毒多肽片段的方法;重组产生病毒多肽、病毒多肽片段和/或病毒颗粒的方法,这些方法为本领域技术人员所知。
如果需要,可通过以下方式使抗原的免疫原性更强:连接于例如牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白的载体分子并且/或者通过使用佐剂。载体连接可通过多种技术中的任一种实现,所述技术例如包括但不限于缀合并表达融合蛋白。
可标记重组表达的多肽或肽以使其可更容易分离。例如,将这些多肽和肽任选进行标记,例如Fc-标记、6xHIS-标记、FLAG标记或用其他适合分离标记的多肽的标签标记。
疫苗制备
在本发明的具体实施方案中,用于纳入本发明的疫苗组合物的轮状病毒A株通过通常用于制备活轮状病毒或灭活轮状病毒的标准方法制备。例如,通常将相容的细胞类型与轮状病毒株一起孵育并将所述细胞保持在允许病毒复制和感染颗粒产生的条件下。
允许轮状病毒感染、复制和颗粒产生的细胞类型的具体实例为哺乳动物细胞系如Vero细胞系。
通常从细胞培养物上清液中采收轮状病毒颗粒,以包括在疫苗组合物中。所述轮状病毒颗粒可从细胞培养上清液中分离,例如通过过滤和/或离心。任选将分离的轮状病毒颗粒冻干,例如用于以后重悬浮于可药用载体中。
术语“可药用载体”是指对受试者基本无毒并且对疫苗组合物中包含的轮状病毒基本无活性的载体。可药用载体为固体、液体或凝胶形式,并通常为无菌和无热原的。
本发明的疫苗组合物可以为适合给予受试者的任意形式。
疫苗组合物可通过任何合适的给药途径给予,所述途径包括口服和非经肠如静脉内、真皮内、肌内、经粘膜、经鼻或皮下给药途径。
用于非经肠给药的疫苗组合物可被制为包含轮状病毒和可药用载体的注射液。合适的水性和非水性载体的实例包括水;乙醇;多元醇如丙二醇、聚乙二醇、甘油等,以及它们的合适混合物;植物油如橄榄油;以及可注射有机酯如油酸乙酯。可保持合适的流动性,例如通过使用包衣如卵磷脂;在分散系的情况下通过保持所需的粒径;以及/或者通过使用表面活性剂如十二烷基硫酸钠。任选包括稳定剂,如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化剂。
用于给药或用于悬浮于液体然后给药的固体剂型包括例如胶囊剂、片剂、粉剂和粒剂。在这些固体剂型中,将轮状病毒与以下成分混合:至少一种载体,所述载体包括例如缓冲剂如柠檬酸钠或碱金属磷酸盐,所述碱金属磷酸盐包括例如磷酸钠、磷酸钾和磷酸钙;填充剂如淀粉、乳糖,蔗糖,葡萄糖,甘露醇和硅酸;粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶;保湿剂如甘油;崩解剂,例如琼脂-琼脂、碳酸钙、植物淀粉如马铃薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸,某些复合硅酸盐和碳酸钠;溶液缓聚剂如石蜡;吸收加速剂如季铵化合物;润湿剂如十六烷醇、单硬脂酸甘油酯和二醇;吸附剂如高岭土和膨润土;润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇或十二烷基硫酸钠;防腐剂如抗细菌剂和抗真菌剂,包括例如山梨酸、庆大霉素和苯酚;以及稳定剂如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化剂。
固体剂型任选包括包衣如肠溶衣。所述肠溶衣通常为聚合材料。优选的肠溶衣材料的特点为是可生物蚀解的、可逐渐水解的和/或可逐渐溶于水的聚合物。用于固体剂型的包衣材料的量通常决定服药和药物释放之间的时间间隔。使用的包衣具有的厚度使得整个包衣不溶解在与胃酸有关的pH小于3的胃肠液中,而溶解在pH大于3的小肠环境中。可以预期,在实施本发明的过程中,任何具有pH依赖性的溶解性特征的阴离子聚合物都可容易地作为肠溶衣,以实现将所述活性物质递送到下胃肠道中。具体肠溶衣材料的选择倚赖于以下性质,例如,对胃中崩解的抗性;对胃液的不渗透性而活性物质在胃中扩散;在目标肠位置消散的能力;储存过程中的物理和化学稳定性;无毒性;以及易用性。
合适的肠溶衣材料包括,例如,纤维素聚合物如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、琥珀酸羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠;丙烯酸聚合物和共聚物,优选地由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸铵、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或乙酯形成;乙烯基聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物;虫胶;以及它们的结合物。一种具体的肠溶衣材料包括例如美国专利No.6,136,345所述的丙烯酸聚合物和共聚物。
所述肠溶衣任选包含增塑剂以防止形成可使胃液渗入所述固体剂型的孔和裂缝。合适的增塑剂包括,例如,柠檬酸三乙酯(Citroflex 2)、三醋精(三醋酸甘油酯)、乙酰柠檬酸三乙酯(Citroflec A2)、Carbowax 400(聚乙二醇400)、邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰化甘油一酯、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和邻苯二甲酸二丁酯。具体地,由阴离子羧基丙烯酸聚合物构成的包衣通常含有大约10-25wt%增塑剂,尤其是邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯和三醋精。所述包衣也可含有其他包衣赋形剂如防粘剂(detackifier)、消泡剂、润滑剂(如硬脂酸镁)和稳定剂(如羟丙基纤维素、酸或碱)以溶解或分散所述包衣材料并且改善包衣性能和所包覆的产品。
用于口服给药的液体剂型包含轮状病毒和可药用载体,被制成乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酏剂。液体剂型的本发明的疫苗组合物可包括润湿剂、乳化剂、助悬剂、增甜剂、调味剂或芳香剂。
关于用于制备剂型的常规成分、设备和方法的详细信息参见PharmaceuticalDosage Forms:Tablets,eds.H.A.Lieberman et al.,New York:Marcel Dekker,Inc.,1989;and in L.V.Allen,Jr.et al.,Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,8th Ed.,Philadelphia,PA:Lippincott,Williams &Wilkins,2004,throughout and in chapter 16;A.R.Gennaro,Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,Lippincott Williams & Wilkins,21st ed.,2005,particularly chapter89;and J.G.Hardman et al.,Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,McGraw-Hill Professional,10th ed.,2001。
本发明实施方案的病毒组合物中任选包含佐剂。佐剂为本领域所知晓,包括例如弗氏佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、皂角甙、葡聚糖如DEAE-葡聚糖,植物油(如花生油、橄榄油和/或维生素E醋酸酯)、矿物油、细菌脂多糖、肽聚糖和蛋白聚糖。
本文使用的术语“受试者”是指人。在本发明的具体实施方案中,术语受试者也可指非人动物,例如,包括其他灵长类、牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、鸟类、家禽和啮齿动物。
将所分离的轮状病毒进行处理以灭活或减毒所述轮状病毒。因此,在具体实施方案中,人轮状病毒疫苗包含减毒活人轮状病毒或者灭活人轮状病毒。
术语“减毒活轮状病毒”是指具有感染合适宿主或宿主细胞并复制的能力的轮状病毒,该术语用于区分“灭活”轮状病毒。术语“减毒活轮状病毒”是指特征在于与野生型人轮状病毒相比毒力大大降低的轮状病毒。术语“毒力”用于描述轮状病毒对宿主细胞或宿主生物体的致病性程度。毒力可使用本领域已知的多种测定的任一种确定。例如,毒力可通过下述方式来评估:使培养的宿主细胞接触减毒轮状病毒,并确定呈现致病反应的细胞的数量和/或引起的致病反应的严重度。当减毒轮状病毒在宿主细胞和/或宿主生物体中导致一种或多种致病效应的能力降低时,就存在毒力降低。
本文使用的术语“灭活”轮状病毒是指已被杀死并因此既不能复制也不能感染宿主细胞或宿主生物体的轮状病毒。
灭活可通过多种技术中的任一种实现,所述技术例如包括使用一种或多种化学试剂灭活、热灭活和/或UV线灭活。
用于灭活轮状病毒的化学试剂为本领域所知,例如包括乙撑亚胺类(ethyleneimines)如二乙撑亚胺类(binary ethyleneimine);交联醛类如甲醛和戊二醛;蛋白酶类例如包括链霉蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶;以及洗涤剂如辛基酚乙氧基化物和烷基三甲基铵盐。轮状病毒可通过用碱处理例如通过在高于10.0的pH下孵育轮状病毒而灭活。
热灭活可通过在例如高于50℃的温度下加热而实现。
灭活可通过本领域的标准技术评估,所述技术例如包括在灭活步骤过程中的多个时间采集病毒样品并观察样品对合适细胞例如Vero细胞的细胞病变效应或感染性。
应理解,除了减毒活轮状病毒和灭活轮状病毒以外,本发明的疫苗组合物还任选包含轮状病毒的抗原性部分。因此,例如,能够诱导受试者体内免疫反应的来源于轮状病毒的蛋白或肽被认为在本发明的范围内。具体而言,本发明的疫苗组合物任选包含被鉴定为CDC-9或CDC-66的人轮状病毒株的抗原性部分。
本发明的实施方案提供了诱导受试者体内对轮状病毒介导的疾病的免疫反应的方法,包括给予治疗量的包含至少一种人轮状病毒株的疫苗组合物。
本文所用的术语“治疗有效量”是指可有效地诱导足以预防或改善轮状病毒介导的疾病的体征或症状的免疫反应的量。诱导受试者体内的免疫反应可通过本领域所知多种技术中的任一种确定,所述技术包括例如轮状病毒抗体、轮状病毒抗体滴度和/或淋巴细胞增殖测定。Tsunemitsu,H,et al.,J.Clin.Microbiol,1992;30:2129-2134描述了用于检测轮状病毒抗体的示例性方法,所述文献的内容以引用的方式纳入本文。可监测轮状病毒介导的疾病的体征和症状以检测给予受试者本发明疫苗组合物所诱导的免疫反应。免疫反应例如为轮状病毒介导的疾病的临床体征和症状的减轻,例如粪便中病毒脱落量的下降、粪便中病毒脱落天数的减少、受试者腹泻天数的减少、死亡率的下降、发病率的下降、体重减少的下降或体重增加。免疫反应例如为给予发明的组合物之后抗轮状病毒抗体的产生,T细胞、B细胞或其他免疫细胞的活化,或者本领域已知的其他免疫反应。
在具体实施方案中,诱导受试者体内对轮状病毒介导的疾病的免疫反应的方法包括以典型疫苗组合物给予104-108ffu的减毒活疫苗或者1-25μg的灭活病毒。
在某些实施方案中,诱导受试者体内对轮状病毒介导的疾病的免疫反应的方法包括给予治疗有效量的包含人轮状病毒株CDC-9和/或CDC-66、其多肽片段、其同源物或它们的结合物的疫苗组合物。
在另一实施方案中,诱导受试者体内对轮状病毒介导的疾病的免疫反应的方法包括给予治疗有效量的包含G1群血清型和特征在于具有G2群血清型的第二人轮状病毒株的疫苗组合物。
在具体实施方案中,根据本发明方法给予疫苗组合物包括一次性给予受试者一剂或多剂疫苗组合物。或者,以数天、数周或数年的时间间隔给予两剂或多剂疫苗组合物。给予疫苗组合物剂量的合适方案倚赖若干因素,包括例如受试者的年龄和健康状态,所用疫苗组合物的类型和给药途径。本领域技术人员能够容易地确定用于给予具体受试者的给药剂量和方案。
以下实施例举例说明了本发明组合物和方法的实施方案。提供这些实施例是出于说明的目的,而不应被认作对本发明组合物和方法的范围的限制。
实施例
实施例1-适应和传代:
将1ml在DMEM中的10%病毒悬浮液与新霉素加入一个1.7ml无菌低结合试管中,充分混合,然后在Eppendorf微量离心机中以3,000rpm离心10分钟。将上清液转移至新试管并以10,000rpm(8,000xg)离心10分钟。将澄清的上清液通过穿过0.45微米孔滤膜进行除菌。用EIA(Rotaclone;Meridian Biosciences)检测所述上清液,如果OD值>1.0,则将其保存在4℃直至用于感染。感染前一天可进行粪便提取和Rotaclone测试。
将各个转管中的培养基从细胞单层除去。将每个转管用2ml维持培养基洗涤,然后向每试管中加入2ml维持培养基并在37℃下在转动设备中孵育直至准备好病毒接种物。
将一小份0.5ml的上清液转移至无菌试管中,加入1μl CaCl2储液(300g/l),使终浓度为800μg/ml。将该试管在室温下孵育30分钟,然后加入3μl猪胰蛋白酶储液(2.5mg/ml),使终浓度为15μg/ml。将所得混合物在37℃下孵育60分钟。以相同方式处理相同体积的MEM作为假接种液。使用不同的移液器枪头来吸取病毒悬浮液和胰蛋白酶溶液。全部病毒吸取均应在生物安全柜中进行。
从每个转管中除去培养基并使用不同的无菌移液器向每个转管中加入0.2-0.3ml的胰蛋白酶消化的病毒悬浮液或假接种液。将盖旋紧并将所述试管在位于培养箱中的转管设备上于37℃孵育。孵育2小时后,使用1ml移液器取出接种物并用2ml维持培养基轻柔地洗涤。
向每试管中加入2ml含有不同浓度(10、20或30μg/ml,取决于病毒株)的胰蛋白酶的维持培养基并在位于培养箱中的转管设备上于37℃孵育2小时。
每天观察所述细胞的细胞病变效应(CPE),在第4天采收所述细胞并保存于-70℃。在下次传代之前将所述细胞冻融2次。
如上所述用CaCl2和胰蛋白酶处理冻融的细胞裂解物,并如上所述进行后续传代。将所述细胞冻融至少一次,然后用Rotaclone试剂盒测定轮状病毒抗原或者通过FFA测定法确定病毒滴度。
实施例2-轮状病毒株的产生和纯化
轮状病毒的产生通过使用大规模生产转瓶来完成。简言之,将Vero细胞在添加有5%胎牛血清(Invitrogen Corp.,Grand Island,NY)和50μg/ml的新霉素(Sigma,St.Louis,MO)的DMEM培养基中培养。将转瓶中单层汇合的Vero细胞用某种轮状病毒株感染,感染复数为0.1。
将通过大规模生产得到的轮状病毒根据标准操作步骤纯化。简言之,在感染后4天从感染的Vero细胞培养物中采收轮状病毒。通过以下方式从上清液中纯化三层的轮状病毒颗粒:使用SW32Ti转头通过TNC缓冲液中的40%蔗糖垫层以106,750×g离心2小时,然后使用SW40Ti转头以111,160g通过等密度的CsCl梯度度离心17小时。还可使用蔗糖梯度纯化轮状病毒颗粒。TNC缓冲液是10mM Tris(pH 8.0)、140mM NaCl和10mM CaCl2。将纯化的病毒颗粒重悬浮于稀释缓冲液中,所述稀释缓冲液为含有CaCl2和MgCl2(Invitrogen Corp.,GrandIsland,NY)并添加有10%的山梨糖醇(Sigma Corp.,St.Louis,MO)的汉克斯平衡盐溶液。将所述重悬浮的分离轮状病毒保存于-70℃直至将其灭活并给予此实施例中的受试者。
通过多种技术的任一种分析纯化的轮状病毒的纯度和种类,所述技术例如包括SDS-PAGE和后续考马斯亮蓝染色、使用轮状病毒特异性抗体的蛋白质印迹和/或电子显微术。此外,纯化的轮状病毒株的纯度和种类还可通过识别具体结构病毒蛋白实现。
图4A示出了CsCl纯化的轮状病毒株CDC-9。图4B示出了所确定的双层和三层CDC-9的结构病毒蛋白,通过SDS-PAGE分析,与分子量标记相对比。
实施例3-灭活轮状病毒(IRV)的免疫原性
在小鼠模型中测试了轮状病毒株的免疫原性。将纯化的灭活轮状病毒颗粒肌内给予小鼠而不给予佐剂。用量为2-20μg的灭活轮状病毒蛋白免疫动物。
通过测量在给药后各个时间获得的血液样品中包括IgM、IgA和IgG的免疫球蛋白滴度测定免疫原性。通过Jiang B,et al.,Vaccine 1999;17:1005-13中详细描述的微量中和试验测量中和抗体滴度,所述文献的内容以引用的方式纳入本文。简言之,将小鼠血清进行两倍系列稀释,每个稀释度重复两个孔,用以胰蛋白酶灭活的RRV轮状病毒孵育。将灭活轮状病毒或经类似处理的无血清MEM培养基在无小鼠血清的情况下孵育,分别用作阳性和阴性对照。将添加有终浓度为10μg/ml的胰蛋白酶和0.5%鸡血清(Invitrogen Corp.,Grand Island,NY)的MEM培养基中的MA104细胞加入每孔中。在37℃下孵育18小时后,用福尔马林固定细胞。通过用兔抗RRV超免疫血清、HRP-标记的抗兔IgG然后用四甲基联苯胺孵育细胞来检测MA104细胞中的轮状病毒抗原。血清中的中和抗体滴度被定义为吸收值比病毒对照吸收值降低70%时的最高稀释度的倒数。
比较以灭活纯化轮状病毒颗粒注射的小鼠中的抗体滴度与对照小鼠中的抗体滴度。对照小鼠中的抗体滴度通常小于100。图5A和5B显示了对照和接种小鼠中的总抗体和中和抗体滴度。总血清抗体(图5A)和中和抗体(图5B)对小鼠中热灭活轮状病毒反应。用灭活YK-1通过两次肌内注射(I.M.)接种小鼠,如上所述用EIA确定轮状病毒特异性总抗体(IgA、IgG和IgM)和中和抗体。对于总抗体,以初始稀释度1∶100对每个血清样品进行检测。预抽的血清样品在此稀释度下检测不到抗体。将数值20用于确定几何平均滴度并作图。以初始稀释度1∶20检测中和抗体。抗体滴度表示为每组(n=7或6)的几何平均值。误差棒表示1标准误差。
实施例4-佐剂
在另一实施例中,在给予小鼠的疫苗中加入Al(OH)3作为轮状病毒颗粒的佐剂。用含有或不含600μg Al(OH)3的2μg或0.2μg灭活纯化轮状病毒颗粒经肌内免疫动物一次。在给予的轮状病毒的两个浓度下,AlOH均强烈地增加小鼠中的总抗体滴度。在以600μg Al(OH)3免疫的对照小鼠中未检测到抗体滴度(<100的稀释度)。
图6是柱形图,示出了在对照和接种小鼠中对以Al(OH)3制剂的热灭活轮状病毒反应的总血清抗体滴度。用含有或不含有Al(OH)3的灭活YK-1经肌内注射(I.M.)接种小鼠一次,如上所述用EIA确定轮状病毒特异性总抗体(IgA、IgG和IgM)。对于总抗体,以初始稀释度1∶100对每个血清样品进行检测。预抽的血清样品在此稀释度下检测不到抗体。将数值20用于确定几何平均滴度并作图。抗体滴度表示为每组(n=6)的几何平均值。误差棒表示1标准误差。
实施例5-限菌小猪模型
使用轮状病毒疾病的限菌小猪模型。此小猪模型使得检测可在确定环境下进行,从而避免动物暴露环境的问题,并使得疾病可用作结果变量。此模型使得还可检测针对同型Wa攻击的具有G1血清型的灭活轮状病毒疫苗。限菌小猪是目前最好的用于人轮状病毒株的感染和疾病的动物模型(See Saif LJ,et al.,Archives of Virology,1996;12:S153-61和Iosef C,et al.,Vaccine,2002;20:1741-53;其内容均以引用的方式纳入本文)。
选择13只限菌幼猪并随机分为表6所示的4组。
表6.小猪研究设计
组名 | 组中小猪数量 | CDC-9抗原(μg) | 磷酸铝(μg) |
AA | 4 | 0 | 750 |
BB | 4 | 75 | 0 |
CC | 3 | 75 | 750 |
DD | 2 | 0(缓冲液) | 0(缓冲液) |
表6所示的每组动物均圈养在不同的隔离室。分别用不含或含有佐剂的灭活轮状病毒疫苗肌内接种组BB和CC中的动物三次。此实施例中的疫苗制剂在混合有750μg磷酸铝的稀释液中包含75μg灭活纯化CDC-9轮状病毒。分别用750μg磷酸铝和缓冲液以相同方式接种AA组和DD组中的动物。用布拉德福特法确定抗原吸收,显示约50%的抗原与磷酸铝结合。在这些免疫接种中,注射了结合和未结合的抗原。
如表6所示,用包含以下成分的疫苗制剂对小猪进行免疫:750μg磷酸铝但无抗原、75μg抗原但无磷酸铝、75μg抗原和750μg磷酸铝或者既无抗原也无磷酸铝(即仅缓冲液)。每次接种都是通过将0.5ml疫苗制剂注射到小猪的后肢肌肉内进行。在以10-12天的间隔给予3剂疫苗制剂后,用毒力Wa轮状病毒经口服攻击小鼠。病毒攻击之前,对每只小猪接种3ml碳酸氢钠以中和胃中的酸。每天从被攻击的小猪收集粪便样品,持续10天。在整个实验过程中,以7-14天的间隔采集血样。图7A示出了用无抗原的750μg磷酸铝接种的4只小猪的粪便样品中的病毒脱落。图7B示出了用无佐剂的抗原免疫的小猪的粪便样品中的病毒脱落。图7C示出了用抗原和佐剂免疫的小猪的粪便样品中的病毒脱落。图7D示出了在只用缓冲液免疫的小猪的粪便样品中测量的病毒脱落。这些结果显示,只用磷酸铝或只用稀释缓冲液假接种的小猪均脱落轮状病毒,最长达5天并处于高滴度。相反,用无磷酸铝的灭活轮状病毒接种的小猪被部分保护,以缩短的1天脱落或者脱落延迟和降低为证。在用灭活轮状病毒和磷酸铝接种的3只小猪中,2只被完全保护,1只仅短短1天的降低的脱落。因此,这些结果表明了本发明实施方案的灭活疫苗制剂的有效性。
实施例6-限菌小猪模型-II
为重复上述实验,选择11只限菌幼猪并随机分为表7所示的2组。
表7.小猪研究设计
组名 | 组中小猪数量 | CDC-9抗原(μg) | 磷酸铝(μg) |
GG | 5 | 0 | 600 |
HH | 6 | 50 | 600 |
如表7所示,并如Wang,Y,et al.,Inactivated rotavirus vaccine inducesprotective immunity in gnotobiotic piglets(付印中,其内容以引用的方式纳入本文)所述,用包含以下成分的疫苗制剂免疫小猪:600μg磷酸铝但无抗原、或者50μg抗原和600μg磷酸铝。每次接种都通过将0.5ml疫苗制剂注射到小猪的后肢肌肉内进行。在以10-12天的间隔给予3剂疫苗制剂后,用毒力Wa轮状病毒经口服攻击小鼠。病毒攻击之前,对每只小猪接种3ml碳酸氢钠以中和胃中的酸。每天从被攻击的小猪收集粪便样品,持续10天。在整个实验过程中,以7-14天的时间间隔采集血样。
图8A示出了在用无抗原的600μg磷酸铝(实心柱)接种的小猪或者用50μg抗原和600μg磷酸铝(阴影柱)接种的小猪的血清中的轮状病毒特异性IgG抗体反应的水平。图8B示出了在用无抗原的600μg磷酸铝(实心柱)接种的小猪或者用50μg抗原和600μg磷酸铝(阴影柱)接种的小猪的血清中的中和抗体反应。以抗原接种的小猪产生显著水平的血清IgG。经口轮状病毒攻击进一步增强了血清IgG水平。在以50μg的抗原和600μg的磷酸铝接种的小猪中的中和活性水平显著高于假免疫动物中的中和活性水平。
图9A示出了以50μg抗原和600μg磷酸铝接种的小猪的粪便样品中的病毒脱落。图9B示出了以无抗原的600μg磷酸铝接种的小猪的粪便样品中的病毒脱落。这些图表明,只用磷酸铝或只用稀释缓冲液假接种的小猪均脱落轮状病毒,最长达5天并处于高滴度。相反,以灭活轮状病毒和磷酸铝接种的小猪被保护不发生病毒脱落。
这些结果显示了本发明实施方案的疫苗制剂的有效性,并确证了第一小猪实验中的结果。这些结果清楚地表明,以铝制剂的IRV具有高度免疫原性并防护小猪免于感染,因此建立了灭活轮状病毒疫苗的概念证明。
实施例7-限菌小猪模型-III——以CDC-66进行免疫:
为使用CDC-66轮状病毒重复上述实验,选择11只限菌幼猪并随机分为表8所示的2组。
表8.小猪研究设计
组名 | 组中小猪数量 | CDC-66抗原(μg) | 磷酸铝(μg) |
GG | 5 | 0 | 600 |
HH | 6 | 50 | 600 |
如表7所示,用包含以下成分的疫苗制剂对小猪进行免疫:600μg磷酸铝但无抗原、或者50μg抗原和600μg磷酸铝(AlPO4)。每次接种都通过将0.5ml疫苗制剂注射到小猪的后肢肌肉内进行。在以10-12天的间隔给予3剂疫苗制剂后,用毒力DS-1轮状病毒经口服攻击小鼠。病毒攻击之前,对每只小猪接种3ml碳酸氢钠以中和胃中的酸。每天从被攻击的小猪收集粪便样品,持续10天。在整个实验过程中,以7-14天的时间间隔采集血样。
以抗原接种的小猪产生了显著水平的血清IgG。经口轮状病毒攻击进一步增强了血清IgG水平。在以50μg的CDC-66抗原和600μg的磷酸铝接种的小猪中的中和活性水平显著高于假免疫动物中的中和活性水平。
只用磷酸铝或只用稀释缓冲液假接种的小猪均脱落轮状病毒,最长达5天,并处于高滴度。相反,以灭活轮状病毒CDC-66和磷酸铝接种的小猪被保护不发生病毒脱落。
这些结果显示了本发明实施方案的疫苗制剂的有效性,并确证了第一小猪实验中的结果。这些结果清楚地表明,以铝制剂的IRV具有高度免疫原性并防护小猪免于感染,因此建立了灭活轮状病毒疫苗的概念证明。
本说明书提到的所有专利或出版物都以引用的方式纳入本文中,程度相当于每篇单独的出版物都被具体地且分别地指出以引用的方式纳入本文中。
本文所述的组合物和方法在目前表示优选的实施方案、实例,而非意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员会想到其中的变化和其他应用。这些变化和其他应用可在不背离如权利要求所限定的本发明范围的情况下作出。
Claims (11)
1.一种用于诱导受试者体内对轮状病毒的免疫反应的疫苗组合物,包含:
与可药用载体混合的分离轮状病毒株CDC-9或分离轮状病毒株CDC-66,其中所述分离轮状病毒株CDC-9的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.5所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.8所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.11所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.17所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.20所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.23所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.29或SEQ ID No.30所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQID No.32所示的VP7蛋白;
并且其中所述分离轮状病毒株CDC-66的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.71所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.77或SEQ ID No.78所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.83所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.89所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.95或SEQ ID No.96所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.101或SEQ ID No.102所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.107所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.113或SEQID No.114所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.119或SEQ ID No.120所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.125所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.131所示的VP7蛋白。
2.权利要求1的疫苗组合物,还包括佐剂。
3.权利要求1的疫苗组合物,其中所述分离人轮状病毒株是减毒活轮状病毒。
4.权利要求1的疫苗组合物,其中所述分离人轮状病毒株是灭活轮状病毒。
5.权利要求1的疫苗组合物,其被配制用于对受试者非经肠给药。
6.权利要求1的疫苗组合物,其被配制用于对受试者经口给药。
7.CDC-9或CDC-66的分离轮状病毒株,其中所述CDC-9的特征在于:氨基酸序列SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.5所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.8所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.11所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.17所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.20所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.23所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.29或SEQ IDNo.30所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.32所示的VP7蛋白;
并且其中所述CDC-66的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.71所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.77或SEQ ID No.78所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.83所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.89所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.95或SEQ IDNo.96所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.101或SEQ ID No.102所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.107所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.113或SEQ ID No.114所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.119或SEQ ID No.120所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.125所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.131所示的VP7蛋白。
8.一种用于诱导受试者体内对轮状病毒的免疫反应的疫苗组合物,包含:
与可药用载体混合的特征在于具有G1群血清型的分离轮状病毒株和特征在于具有G2群血清型的分离轮状病毒株,其中所述具有G1群血清型的分离人轮状病毒株是灭活轮状病毒,并且其中所述具有G2群血清型的分离人轮状病毒株是灭活轮状病毒;
其中所述特征在于具有G1群血清型的人轮状病毒株是CDC-9,其中所述CDC-9的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.5所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.8所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.11所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.17所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.20所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.23所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQID No.29或SEQ ID No.30所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.32所示的VP7蛋白;
其中所述特征在于具有G2群血清型的人轮状病毒株是CDC-66,其中所述CDC-66的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.71所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.77或SEQ IDNo.78所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.83所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.89所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.95或SEQ ID No.96所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.101或SEQ ID No.102所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.107所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.113或SEQ ID No.114所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.119或SEQ ID No.120所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.125所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.131所示的VP7蛋白。
9.权利要求8的疫苗组合物,其中所述特征在于具有G1群血清型的人轮状病毒株和所述特征在于具有G2群血清型的人轮状病毒株各自独立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。
10.包含与可药用载体混合的分离人轮状病毒株CDC-9或CDC-66的疫苗组合物在制备用于诱导受试者体内对轮状病毒的免疫反应的药物中的用途,其中所述CDC-9的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.5所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.8所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.11所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.17所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.20所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.23所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQID No.29或SEQ ID No.30所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.32所示的VP7蛋白;
并且其中所述CDC-66的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.71所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.77或SEQ ID No.78所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.83所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.89所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.95或SEQ IDNo.96所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.101或SEQ ID No.102所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.107所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.113或SEQ ID No.114所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.119或SEQ ID No.120所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.125所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.131所示的VP7蛋白。
11.包含与可药用载体混合的特征在于具有G1群血清型的分离人轮状病毒株和特征在于具有G2群血清型的分离人轮状病毒株的疫苗组合物在制备用于诱导受试者体内对轮状病毒的免疫反应的药物中的用途,其中所述具有G1群血清型的分离人轮状病毒株是灭活轮状病毒,并且其中所述具有G2群血清型的分离人轮状病毒株是灭活轮状病毒;
其中所述特征在于具有G1群血清型的人轮状病毒株是CDC-9,其中所述CDC-9的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.5所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.8所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.11所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.17所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.20所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.23所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQID No.29或SEQ ID No.30所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.32所示的VP7蛋白;
其中所述特征在于具有G2群血清型的人轮状病毒株是CDC-66,其中所述CDC-66的特征在于:氨基酸序列SEQ ID No.71所示的NSP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.77或SEQ IDNo.78所示的NSP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.83所示的NSP3蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.89所示的NSP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.95或SEQ ID No.96所示的NSP5蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.101或SEQ ID No.102所示的VP1蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.107所示的VP2蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.113或SEQ ID No.114所示的VP3蛋白;氨基酸序列SEQ IDNo.119或SEQ ID No.120所示的VP4蛋白;氨基酸序列SEQ ID No.125所示的VP6蛋白;以及氨基酸序列SEQ ID No.131所示的VP7蛋白。
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