PT87668B - Processo de preparacao de uma vacina contra coronavirus canino - Google Patents

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Description

Âmbito do Invento presente invento refere-se a vacinas veterinárias e, em, particular, a uma vacina para protecção dos animais caninos da infecção pelo Coronavirus Canino'.'
Informação Antecedente
Os Coronavirus encontram-se entre os principais agentes causadores de diversas doenças, incluindo encefalite, hepatite, pneumonite, nasofaringite, peritonite e gastrenterite, numa lar ga variedade de espécies animais. No que respeita a infecções entéricas, os coronavirus foram detectados nas fezes de humanos, porcos, vitelas, ratinhos, ratazanas, galinhas, perás, cães, ga tos e cavalos.
A enterite provocada pelo coronavirus canino (CCV) foi ini cialmente referida em 1974 por Binn, e col., Proc. 7oth Ann.
Mtg. U.S. Anim. Health Assoe. Roanoke VA Qcti 359-366 (1974).
vírus foi inicialmente isolado em 1971 a partir de cães militares que se suspeitava sofrerem de uma gastrenterite virai.
Por razões ainda pouco esclarecidas, no final da década de 70 a enterite coronaviral emergiu como uma doença significativa de cães. A fonte primária da infecção pareceu ter sido o material fecal de animais infectados. A infecção oral conduziu à replicação nas células epiteliais do intestino delgado. 0 vírus pede geralmente ser isolado cias fezes de cães infectados^en tre 3 e 14 dias após a inoculação,
A gastrenterite provocada pele CCV é caracterizada por uma ligeira depressão?anorexia e evacuação de matéria fecal com um oaor especialmente nauseante. 0 início da doença, é geralmente repentino, com diarreia, acompanhada ou imeciiatamente precediaa de vómitos. Cs vómitos diminuem geralmente de frequência após o primeiro ou segundo dia de cicença. As fezes contêm frequentemente muco e quantidades variáveis de sangue que lhes conferem uma coloração vermelho alaranjado. Verifica-se por vezes diar67 732
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-3reia em jacto , na forma de um fluido aquoso ou sanguinolento.
Os cachorros novos podem ficar rapidamente desidratados mesmo que se institua uma terapia com fluídos no principio do curso da doença. Têm ocorrido mortes em apenas 24 a 36 horas após o iní cio dos sinais clínicos, apesar dos bons cuidados de tratamento. A tensão (stress) parece aumentar a gravidade da doença. Observaram-se nalguns casos temperaturas corporais elevadas, mas a maioria dos animais tende a ser apirétíco e nalguns cães afectados as temperaturas podem ser distintamente sub-normais. Veja-se Carmichael, Infections canine enteritis causea by a co rona-like vírus, Laboratory Report, The James A. Baker Institute for Animal Health, Cornell U. 2(9) (1973).
A maioria dos cães afectados recupera numa semana a 10 dias, mas os cães que tenham sido submetidos à partida a um tra tamento sintomático e mantidos quentes e em repouso durante algum tempo, recuperam por vezes mais rapidamente. Appel e col., Cornell Vet. 69:123-133 (1979). Foi referida em vários casos uma diarreia persistente durante 3 a 4 semanas refractária ao tratamento. Appel e col., Canine Prac. 7:22-36 (1980). foram notadas descargas nasais e oculares concorrentes, mas desconhece-se a sua relação com a infecção primária. As lesões morfológicas na enterite provocada por CCV restringem-se ao intestino e aos nódulos linfáticos mesentéricos. As variações histológicas são notavelmente semelhantes às descritas em vitelas gnotobióticas infectadas com coronavirus bovino. A infecção sem complicações, em caês experimentais é ligeira e as variações patológicas ou não são detectáveis ou consistem numa dilatação das voltas intestinais cheias de material fecal aguado de corverde-amarelada. Os nódulos linfáticos mesentéricos, encontram -se geralmente aumentados e congestionados ou hemorrágicos.
Num caso, 0 período de incubação em cães experimentalmente infectados foi de cerca de 24 a 36 horas. Os cães não exibiram os sintomas clínicos típicos nem a diarreia clássica associada à gastrenterite provocada pelo coronavirus. Às variações microscópicas foram modestas, caracterizando-se por atrofia das vilosidades intestinais, intensificação das criptas, aumente da celularidade da lamina própria, amolecimento das células epite6η 732
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-4liais e descarga de células em forma de cone. Keenan e col., Am. J. Vet. Res. 37:247-256 (1976). Os sintomas ligeiros podem dever-se aos procedimentos de isolamento utilizados para inocular os cães experimentalmente infectados, e ao facto de os cães se encontrarem livres de outros patogénios e parasitas importan tes.
Não existe ainda um tratamento específico para a enterite provocada por CCV. A terapia utilizada é uma terapia^suporte que tenta compensar as perdas de fluídos e de electrólitos, con trolar a diarreia e prevenir ou controlar as infecções bacterianas secundárias.
Gs títulos de anticorpos no soro, em cães inoculados paren tericamente com CCV, foram maiores que em cães expostos oralmen te. Após desafio oral, os cães apresentaram uma resposta de anticorpos,do tipo anamnéstico e perderam o virus num período de tempo mais curto que os cães de controlo não expostos. Pare ce que a imunidade local, possivelmente mediada por anticorpos IgA no intestino, foi essencial para a protecção contra a infec ção pelo CCV, de uma forma semelhante à gastrenterite transmissível em porcos. Appel e col., Canine Prac. J7:22-36 (1980).
diagnóstico presumível da enterite provocada pelo CCV, baseia-se nos sinais clínicos. Outras causas de emése aguda e diarreia em cães, que podem também ser consideradas, incluem intoxicações, enterite bacteriana, coccidióse, pancreatite aguda, falência renal ou hepática aguda e outras infecções virais. A evidência de uma propagação rápida é fortemente sugestiva da enterite provocada por CCV. Foram publicados diversos artigos descrevendo a detecção, por microscopia electrónica, de parvovirus canino em associação com partículas de CCV em espécimes fecais caninas. Veja-se, por exemplo, Carmichael, acima citado; Evermann e col., J. Am. Vet. Med. Àss. 177:784-786 (1930); Reseto e col., Arch. Virol. 66: 09-93 (1980). Num dos artigos foi ainda referida a detecção adicional de um rotavirus canino num espécime fecal. McNulty e col., Vet. Res. 106:350-351 (1980). Isto indica que a gravidade dos casos deste campo, pode ser atribuída, em parte, a infecções virais múltiplas.
isolamento de CCV de espécimes fecais ou do conteúdo in-
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'.ι-,ίΜΛΙϊ
-5testinal, foi referido por vários investigadores como encerrando algumas dificuldades. Bevido à sua natureza fastidiosa e ausência de substratos celulares susceptívels, os coronavirus não são frequentemente isolados ou diagnosticados. À sero-conversão ou as investigações pos-mcrte, em casos fatais, incluindo a imunofluorescência de secções intestinais congeladas, podem ser utilizadas para um diagnóstico etiológico correcto.
Os coronavirus são vírus de ARU grandes (cerca de 100 nm de diâmetro), com envólucro, possuindo uma nucleocápsiue helicoidal com grandes projecções características,em forma de clava, ou espigões, referidas como peplómeros. 0 ARÍT compreende um único cordão linear simples, com polaridade positiva, de aprcximadamente 5)5 x 10° dalton. Ras secções de tecido ultrafinas, o vírus parece, por microscopia electrónica, formar-se por germinação em vacúolos, no citoplasma. 0 vírus é antigenicamente relacionado com o Vírus da Gastrenterite Transmissível de Suínos.
Acree e col., U.S. 4,567)042 e U.S. 4,567)043 descreveu uma vacina inactivada e uma vacina atenuada, respectivamente, contra o coronavirus canino, compreendendo ambas as vacinas um meio fluído consumido.
Descrição sumária do Invento
P presente invento refere-se a uma vacina para protecção de animais caninos contra a doença provocada por infecção com o Coronavirus Canino (CCV), vacina essa que compreende uma quanti dade eficaz da proteína peplômero de CCV associada às células.
invento refere-se também a um processo para a preparação dessa vacina, processo esse que compreende:
a. a infecção de uma cultura de células com uma Multiplicidade de Infecção (MCI), de CCV de pelo menos 0,2;
b. a cultura das células durante 6-18 horas;
c. a rejeição do meio fluído consumido;
d. o rompimento das células;
e. a recolha da proteína peplômero associada às células, das células rompidas; e, . J1 t>7 732
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— b—
f. a combinação do peplómero associado às células com um veículo parentericamente aceitável.
Outro aspecto do invento refere-se a uma vacina polivalente compreendendo uma quantidade eficaz da proteína peplómero de CCV associado às células e uma quantidade eficaz de um ccmponen te antigénico, protector contra um ou mais organismos ou vírus patogénicos adicionais.
Outro aspecto do invento refere-se a um processo de protec ção de um animal canino contra a doença provocada pela infecçãc com CCV, processo esse que compreende a administração parentérica ao animal, da vacina do invento.
Descrição Detalhada do Invento
CCV replica-se intracelularmente após a infecção. No de curso do ciclo de replicação, o ARN ao CCV é traduzido para pro duzir várias proteínas estruturais e não estruturais, envolvidas na replicação virai. As proteínas da cápside, incluindo a proteína peplómero, ou Eg, parecem ser traduzidas nos polirribossomas ligados à membrana no retículo endoplasmático rugoso. No decurso da maturação virai, as nucleocápsides citoplasmáticas germinam no retículo endoplasmático apanhando as proteí nas da cápsiae para formar partículas de vírus maduras e são en tão conduzidas ao exterior pelo aparelho de Golgi. A proteína peplómero pode sofrer clivagem ou outra modificação pós-tradução subsequente à formação da partícula. Simultaneamente, algu mas proteínas peplómerosparecem permanecer embebidas na bicamada lipídica da membrana celular aquando da entrada inicial na célula infectada.
Verificou-se agora que a proteína peplómero associada às células, isto é, a proteína peplómero tal como existe na célula infectada antes da formação de partículas, induz uma resposta imune aquando da administração parentérica a um animal canino, resposta essa que é protectora contra sintomas de doença normal mente associados à infecção pelo CCV virulento. Esta verificação é surpreendente face ao facto ae que o vírus na globalidade, atenuado ou inactivaao, é relativamente pouco imunoprotector.
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A proteína peplómero associada às células (PM de cerca de 203.000) pode ser produzida por cultura e recolha apropriadas de células infectadas, por síntese ou por engenharia genética.
Para produzir 0 peplómero por cultura celular, infecta-se uma cultura de células susceptíveis, com o vírus e efectua-se a cultura. Pode ser utilizada qualquer cultura de células primária ou contínua, capaz de suportar replicação do vírus, ou na qual o vírus possa ser adaptado para sofrer replicação. Exemplos são as células caninas primárias como as células de rim canino e as células de timo canino; as linhas de células caninas como a linha de células do rim canino, Madin Darby e a linha de célu las canina fibroblástica A-?2 (ATCC GRL 1^42); as células felinas primárias como as células de rim felinas primárias, as linhas de células felinas como a linha de células do rim felino, Crandall e a linha de células felina de Wood; e outras células de mamíferos primárias ou contínuas, como a linha de células de rim de macaco, Vero.
vírus pode ser isolado das infecções clínicas por técnicas conhecidas. Estas técnicas incluem a suspensão da matéria fecal de um animal infectado, como por exemplo num meio de cultura de tecido, na presença de um poli-catião, e em seguida a inoculação de uma cultura de células primárias com um sobrenadante dessa suspensão. Veja-se,por exemplo , Binn e col., Proc. 78 th Ann. Mtg. U. S. Anim. Health Assoe. , Roanoke VA October: 359-366 (1974), Keenan e col., Am. J. Vet Res. ^7:247-2% (1976) e Tingpalapong e col., Am. J. Vet. Res. 43;I087-IÓ90 (19θ2).
Um isolado virulento, a estirpe 1-71 originalmente isolada por Binn e col. em 1971, encontra-se entre aquelas que estão publicamente disponíveis. Pooe ser obtida por exemplo nc American Type Culture Collection em Rocteville, Maryland, U.5.A. sob o número de acesso VR-809. Outros isolados incluem K-378, 3-378, A76-5 e ATCC VR 2068, referidas por Àcree e col., em U.S. 4,567,042 e U.S. 4,567,043.
Para produzir e recolher o antigénio peplómero associado às células, a cultura celular é infectada com 0,2 a 2,0 partícu las de vírus por célula, isto é, com uma Multiplicidade de Infecção (M0I) igual a 0,2 a 2,0 e preferivelmente, ccm uma M0I de
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-*υ·*
0,4 a 1,5. As células infectadas são cultivadas durante cerca de 6 a 18 horas, preferivelmente 9 a 16 horas e mais preferível mente 9 a 12 horas, após a infecção. 0 meio de crescimento é então removido e o peplómero é recolhido das células. Esta recolha é preferivelmente efectuada pela substituição do meio fluido consumido por meio fluído fresco, seguida do rompimento das células para libertarem o peplómero associado às células, o qual é recolhido no meio fluido fresco. 0 peplómero associado às células é combinado com um diluente ou veículo parentericamente aceitável para a preparação da vacina. Convenientemente, estes passos podem ser combinauos por substituição do meio flui do consumido, por um meio fluido que seja parentericamente tole rado, antes do rompimento das células.
rompimento celular pode ser realizado por, por exemplo, meios mecânicos, ultrassónicos ou químicos ou por uma combinação destes meios. Convenientemente, o rompimento é realizado por congelação das células a uma temperatura entre cerca de -40 e cerca de -70°C. Na descongelação, recolhe-se o fluido que contém o peplómero associado às células. Uma vez que o meio em que se efectuou o crescimento da cultura celular infectada, é rejeitado, o meio fluido fresco encontra-se substancialmente li vre dos virus extracelulares que tenham sido conduzidos para o exterior das células durante o crescimento da cultura celular infectada. No entanto, o fluido deverá ser tratado para inacti var os vírus e nucleocápsides extracelulares e intracelulares residuais, partículas e nucleocápsides intracelulares essas, que são libertadas aquando dc rompimento cas células. Pode empregar-se qualquer procedimento padrão de inaetivação de vírus desde que não provoque a desnaturação do peplómero. Essas técnicas incluem irradiação e inaetivação química, como por exemplo, por adição de etileno-imina binária, beta-propiolactona, formaldeído, fenol ou acetiletilenc-imina. Podem também adicionar-se estabilizantes, adjuvantes, agentes tampão e/ou conservantes que sejam parentericamente tolerauos, para preparar a formulação fi nal ua vacina. Por exemplo, a vacina preferida compreende mertiolato, por exemplo l;60 000 e o adjuvante anidrido etilenamaleico, por exemplo, 0,2/.
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v-*··
-9Na preparação da vacina do invento por cultura celular, é importante, contrariamente às referências anteriores referentes à preparação aa vacina contra CCV, remover c meio fluido consumido das células, antes ae se proceder ao seu rompimento. Apesar de a razão não ser bem conhecida, as vacinas preparadas de acordo com a descrição anterior, mas usanuo o meio fluido consu mido em vez de um fluido fresco, produziram títulos de anticorpos neutralizantes ao vírus inferiores aos produzidos por uma vacina contendo meio fresco. A tabela 1, abaixo, apresenta o título de anticorpos neutralizantes do vírus, em cachorros de uma vacina preparada usando meio consumido e células (Vacina de Fluido) em comparação com uma vacina preparada significativamente da mesma maneira com a excepção de o meio consumido ter sido decantado e substituído de acordo com o presente inven to (Vacina de Células).
Tabela 1
Potência das Vacinas de Células e de Fluido Consumido em Cachorros
Cachorro Titulo de Anticorpos Neutralizante do Virus
X. V» A -L DE-70 32 128
DE-74 64 128
Vacina de
células DE-76 lò 64
DE-86 32 128
Título Médio Geométrico 32 108
DE-7 8 0 0
DE-80 0 0
Vacina de
fluido DE-82 0 0
DE-84 0 0
Título Méuio Geométrico - -
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-10Os títulos de anticorpos neutralizantes do vírus dos cachorros demonstram que a Vacina de Células estimulou uma respos ta imunológica protectora (Título Médio Geométrico de 32) na al tura da segunda vacinação. Ua altura da amostragem pós-vacinação, a resposta tinha aumentado para um título Médio Geométrico de 108. Em contraste, os cachorros vacinados com a Vacina de Fluido permaneceram negativos ao longo do período de teste.
Este é um resultado surpreendente, atendendo a que o meio consu mido contém o vírus CCV que se esperaria contribuir para a imunoprotecção.
ITuma experiência destinada a pôr em evidência a importância do tempo pôs-infecção para a produção do antigénio peplómero as sociado às células, a quantiuade de proteína que se encontrava associada às células e a quantidade que se encontrava no meio de cultura celular e portanto associada ao vírus foram determina das de hora a hora por um imunoensaio de enzimas ligadas (ELISA) As quantidades relativas do antigénio são apresentadas na tabela 2. Apesar de não nos pretendermos ligar a um mecanismo ou explicação particular, parece que o períouo de tempo durante o qual as células são cultivadas é importante devido às variações que ocorrem no peplómero mais tarde no ciclo de infecção.
Tabela 2
Horas Proteína Peplómero
após a infecção Associada às Células Associada ao víru,
11 4830 475
12 3895 556
13 5946 748
14 7282 14^4
15 4423 2044
A quantidade de antigénio peplómero associado às células
verificou-se ser dependente da MCI. A tabela 3 apresenta os re sultaaos de uma série de experiências em que a MOI variou entre 0,01 e 1,1. Todas as culturas foram recolhidas 12 horas após a infecção e a quantidade de antigénio foi determinada por ELISA.
(fi 732
SKB CASS 14179 »ϊ Ώ·»»
MOI -11- Tabela 3 Proteína Peplómero
Associaaa às células Associaaa ao Vírus
0,01 1221 0
0,04 2911 13
0,1 3805 93
0,4 7877 207
1,1 8927 046
antigénio peplómero associado às células pode ser preparado por procedimentos alternativos. Por exemplo, o peplómero pode ser purificado, como por cromatografia de adsorção de imunoafinidade, sequenciadc e em seguida preparado por síntese pep tídica ou por expressão, num microrganismo ou célula hospedeira recombinante, ue uma sequência de codificação de ABIÍ derivada da sequência peptídica. Além disso os derivados do peplómero que retêm as propriedades imunoprotectoras dc antigénio derivado das células, podem ser preparados por técnicas padrão de ADTT recombinante, engenharia de proteínas ou químicas.
Qualquer que seja a forma utilizada para a sua preparação, a vacina é administrada parentericamente, por exemplo intramuscularmente ou subcutaneamente, a cães com, preferivelmente, pelo menos 3 meses de idade. Preferivelmente, administra-se uma segunda dose 2 a 4 semanas após a primeira administração. Recomenda-se a re-vacinação anual. Se se vacinarem cães mais novos, estes deverão ser preferivelmente re-vacinados aos três meses de idade. A vacinação de femeas prenhes deverá ser evita da.
Cada dose de vacina contém uma quantidade eficaz do peplómero associado às células, isto é, uma quantidade que ê eficaz após vacinações duplas parentéricas, para a protecção de animais caninos contra o desenvolvimento de sintomas graves de doença, isto é, gastrenterite causada pela infecção com CCV. Seguindo o procedimento acima descrito para a produção do antigénio por infecção de uma cultura celular, obter-se-à um fluido que contém uma quantidade eficaz. Esse fluido tipicamente pode
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-12ser diluído até 1/10, continuando a conter uma quantidade eficaz. 0 volume total de cada cose de vacina é tipicamente de 0,5 a 2 ml, preferivelmente de 1 a 1,5 ml.
A vacina do invento pode também ser combinada com outros agentes vacinais, numa vacina polivalente, por exemplo, em combinação eom outros vírus caninos inactivados (mortos) ou atenua dos. Preferivelmente, esse outro componente vacinai é outro vírus causador de doença entérica, como os Rotavírus ou parvovírus ou outros antigénios imunoprotectores seus derivados. Muitas dessas vacinas ae vírus inactivados e atenuados e antigénios sSo conhecidas. Uma vacina polivalente preferida é uma vacina bivalente compreendendo uma combinação da vacina do invento e um Parvovírus vivo modificado ou morto. Essa vacina compreende quantidades vacinais do peplómero associado às células do invento e do Parvovírus vivo modificado ou morto (por exemplo, 6,3 Dog^ por dose). 0 volume total da dose é de 0,5 a 2 ml, preferivelmente de 1 a 1,5 ml. Carmichael e coL, Patente U.S. 4,303,645, descrevem uma vacina de Parvovírus Canino vivo modificado, incluindo a preparação aa estirpe vacinai e as suas doses eficazes, vacina essa que pode ser combinada com a vacina do invento para preparar uma vacina bivalente de acordo com o invento.
Os Exemplos que se seguem são ilustrativos e não limitativos do invento.
Exemplo 1 Preparaçãc da Vacina
Coronavírus Canino, estirpe ITL-18, foi isolado de um espécime fecal de um grupo de cães sofrendo de gastrenterite aguda. 0 isolamento inicial em células primárias de rim canino requereu 50 jig de dietilaminoetil (DEAE)-dextrano por ml de meio de manutenção (meio basal Eagle (BME) com sais de Earle) (Grand Island Biological Co. , Grand Island, New York.) Pão foi requerido DEAE-dextranc para passagens adicionais. 0 vírus foi adaptado à cultura de células com 4 passagens nas células primárias de rim canino e mais 36 passagens numa linha de células de rim de felino usada nos 73e a 93e níveis de passagem. Gill, Isola,4*
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-13tion and Characterizaticn of a Coronavirus, Doctoral Bissertation, University of Nebraska, Agosto ae 1982, descreve o isolamento da estirpe ÍTL-13 de CCV previamente referioa como estirpe
CCV-18.
Para a inoculação de culturas em frascos cilínuricos (rol ler) com o vírus, decanta-se o meio ae uma monocamada compacta das células da linha de células ae rim felino. 0 meio é substituído por meio de manutenção, suplementado com 4-8/ de Polybrene (Sigma Chemical Co., 3t. Louis, Missouri) contendo 2-10% de vírus, o qual contém um título de vírus não diluído ae pelo menos 107,0 TCID^/ml (0,2-1,0 LI0I). As culturas inoculadas são incubadas durante 9-16 horas a 35-37°C· A infecção manifes ta-se pelo efeito citopático típico (CPE) na monocamada de células, nomeadamente, retalhos de células arredondaaas.
Após a incubação e exame microscópico para confirmar o CPE, o meio de manutenção é decantado e rejeitado. Adiciona-se um volume de 100 ml de meio Hals a cada frasco cilíndrico de 500ml. 0 meio Hals é meio Sagle basal (BíS) com sais ae Hank (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY), suplementado com 0,5/ de hidrolisado de lactalbumina (Iiumko Sheffield, Memphis, Tennessee). As culturas foram então congeladas a -50cC durante 6 horas. Após o descongelamento aaiciona-se uma solução de etile no-imina binária (BEI) até uma concentração final de 1/ (v/v) para inactivar as partículas ae vírus restantes. A solução de BEI é preparada por adição de 2,O5g de 2-oromoetilamina e de 0,8 g de hidróxido de sódio a 100 ml ue água. A inactivação é mantida a 35-37 C, com agitação constante durante até 2 dias de incubação. A inactivação é terminada pela adição ae uma solução fria (4°C) de tiossulfato de sódio para originar uma concen tração final de cerca de 0,25/ (p/v) de tiossulfato de sódio. Adiciona-se mertiolato como conservante, até uma concentração final de 1:10 000. A vacina volumosa final é preparada por mis tura do fluido da cultura celular com o meio de manutenção, seguida da adição, como aajuvante, de aniarido etilenomaleico até uma concentração final de 0,2/. A vacina volumosa contém tipicamente 20/ de fluido da cultura celular, 60/ de meio de manutenção e 20/ de solução adjuvante, em volume, A solução adjuG7 732
SKB CASE 14179
*!&
-14vante é preparada pela hidratação de uma solução stock” de anidrido etilenomaleico (EMA 91? Monsanto, St Louis, Eisscuri) por adição de hidróxido de sódio 10 U. A solução stoek de EMA contém:
Produto químico
Grama/Litro
NaCl 0,5 kh2po4 0,565
Ka2HP04 0,135
EMA 91 10,0
Vermelho oe Fenol 0,135
Exemplo 2
Estudo oe
Protecção
CCV-71» no quarto nível de passagem em células primárias de ria de cães, foi passado uma vez na linha de células. A-72 (ATCC CRL 1542), dividido em volumes apropriados e armazenado a -70°C. Este vírus foi designado como vírus de desafio challenge virulento e foi padronizado para conter 10^’^ TCID^0 por ml. (A estirpe CCV-71 é igual à ATCC VR-Ô09).
A linha de células A-72 foi obtida a partir de ATCC no nível de passagem 33· Neste nível oe passagem, as células A-72 não eram sensíveis á infecção por CCV. A linha de células foi propagada em série durante mais ae 100 passagens consecutivas e usada no 1392 nível de passagem para o 140% para as propagações e titulações do CCV. Neste nível de passagem, a linha de células A-72 era muito susceptível à ligação e replicação de CCV.
Usaram-se nas experiências cachorros novos e saudáveis (8-14 semanas de idade) que não possuíam títulos ue anticorpos para CCV em ELISA. Os cachorros foram colocados em instalações de isolamento durante a duração dos testes experimentais.
Administrou-se a cada um aos cachorros, num total de 20, duas doses de 1 ml aa vacina preparada substancialmente como des crito no Exemplo 1, subcutaneamente, com um intervalo de 21 dias. Deixaram-se cinco cachorros sem receber vacinas, como controlos ae desafio. Os 20 cachorros vacinados e os 5 cachorros de conè>7 732
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-15trolc foram sangrados na altura aa vacinação. Os cachorros foram também sangrados 21 aias após a vacinação (altura em que se efectuou a re-inoculação dos cachorros vacinados), e 14 dias após a segunda vacinação (altura em que os cachorros foram desafiados) e 14 dias após o desafio.
Os cachorros vacinados e os cachorros de controlo deixaram de ser alimentados 18 a 24 horas antes ao desafio. 0 desafio foi realizado por inoculação oral de 5 ml do vírus de desafie virulento (10^ τΟΙΒ^θ por ml). Dezoito a vinte e quatro horas após o desafio, os cachorros desafiados retomaram o esquema normal de dieta.
Após o desafio os cachorros foram observados durante 14 dias em relação a sinais de doença ou reacção. Durante o perío do de observação, determinaram-se as temperaturas e recolheram-se amostras de sangue para contagem de glóbulos brancos. Recolheram-se diariamente amostras fecais, aurante 21 dias, para determinação do coprcanticorpo (anticorpo IgA intestinal) para GCV
Após cada vacinação, todos os cachorros permaneceram bem e normais. A tabela 4 apresenta os títulos ae anticorpos VN dos cachorros na pré-vacinação, pré-segunda vacinação e pré-desafio. Todos os cachorros eram VN seronegativos na altura da primeira vacinação e permaneciam negativos quando a segunda dose fei administrada. Na altura do desafio (duas semanas após a segunda vacinação), os títulos VN variavam entre 0 e 16, com um título médio geométrico de 5· A tabela 5 ilustra os cachorros e datas de sangria como na tabela 4, mas usando o ELISA para a determinação dos títulos de anticorpos. Os cachorros eram seronegativos na altura da primeira vacinação e apenas sete deles apresen taram respostas de anticorpos na altura da segunda vacinação.
Na altura do desafio, todos os cachorros apresentaram bons títulos de anticorpos em ELISA.
Catorze aias após o desafio, os cachorros de controlo desafiados possuíam um título méaic geométrico de anticorpos em ELISA de βθθθ» enquanto o título médio geométrico de anticorpos em ELISA dos cachorros vacinados era >19106 (tabela 5)· 0 elevado título humoral de anticorpos dos cachorros vacinados deve-se à vacinação e a uma boa resposta secundária após o desafio e é
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-16indicativo ae protecção.
Após o desafio, alguns animais vacinauos exibiram sintomas clínicos breves ou transitórios, variando entre anorexia e vómitos. Os cachorros de controlo de desafio mostraram sinais de anorexia apenas após o desafio. Estes sintomas foram geralmente notados entre o 6e e 10s uias após o desafio. Os cachorros de controlo de desafio demonstraram mais sintomas clínicos que o grupo vacinado.
As contagens de glóbulos brancos foram monitorizadas diariamente após o desafio para avaliação da doença. ITão foi obser vada leucopenia significativa quer nos cachorros vacinados quer άθ nos cachorros de controlo/desafio. Observou-se uma ligeira leucocitose nos cachorros de controlo de desafio começando no 9e dia e continuando até ao 13e dia.
I
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SKB CASE 14179 * 17“*
T ab ela 4
Teste de Imunogenicidade da Sementeira Principal Títulos de Anticorpos Neutralizantes do Virus
Títulos de Anticorpos Neutralizantes& Vírus
Cachorro Pré- Pré- Pré- Pós-
No. vac. 2ã. vac. desafio desafio
Vacinado res
DE-83 O1 0 4 256
DE-8 9 0 0 16 1024
DE-90 C õ 2 256
DE-91 0 0 8 512
DE-94 0 0 8 1024
DE-95 0 0 P 1024
DE-96 0 0 8 1024
DE-97 0 0 2 128
DE-98 0 0 2 256
DE-99 0 0 2 256
F-125 0 0 0 64
F-126 0 0 0 128
F-127 0 0 4 64
F-128 0 0 2 128
F-129 0 0 4 512
F-130 0 0 8 2048
F-131 0 0 t 1024
F-132 0 0 0 512
F-133 0 0 8 512
F-134 0 0 16 2048
Média Geométrica 0 0 5 402
Controlos
DF-53 ND2 ND 0 64
DF-54 ND ND 0 128
DF-5 5 ND ND 0 128
DF-5 6 ND ND 0 512
DF-5 7 ND ND 0 64
Média Geométrica — 0 128
W'
6? 732
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-13^Título de anticorpos expresso como o inverso da maior diluição de soro apresentando neutralização completa.
Não determinado
I
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-19Tabela 5
Teste de Imunogenecidade da Sementeira Principal
Títulos de Anticorpos Neutralizantes em ELISA
Títulos de Anticorpos Nêutralizantes em ELISA
Cachorro Pré- Pré- Pré- Pós-
No. vac. 2®. vac. desafio desafio
Vacinadores
DE-8 8 O1 0 640 >20480
DE-8 9 0 80 10240 >20480
DE- 90 0 40 5120 >20480
DE-91 0 10 640 20480
DE-94 0 0 320 >20480
DE-95 0 0 640 204Ô0
DE-96 0 0 640 >20480
DE-97 0 0 Ó40 10240
DE-98 0 0 I28O >204o0
DE-99 0 0 320 20480
F-125 0 0 I28O >20480
F-126 0 20 640 >20480
F-127 0 10 160 >20480
F-128 0 0 640 10240
F-129 0 0 320 >20480
F-130 0 10 1280 >20480
F-131 0 20 l60 >20480
F-132 0 0 80 204Ô0
F-133 0 0 128o >20480
F-134 0 20 I28O >20480
Média Geométrica 0 3 715 19106
Controlos
DK-53 ND2 ND 0 2560
DF-54 ND ND 0 5120
DF-55 ND ND 0 2560
DF-5 6 ND ND 0 5120
DF-57 ND ND ... 0 5120
Média Geométrica - — 0 388O
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soro para a qual a diferença na adsorvãncia a 410 nm entre os depósitos de placas de microtítulação contendo coronavirus e os depósitos contendo os controlos celulares é> 0,05.
p
Não determinado.
A resposta da temperatura após o desafio foi também monito rizada como um parâmetro da doença clínica provocada por CCV.
A resposta da temperatura ocorreu após o desafio tanto nos cachorros vacinados como nos cachorros de controlo. 0 aumento relativo na temperatura foi mais dramático nos cachorros de controlo que nos vacinados. 0 aumento de temperatura não foi suficientemente elevado para causar preocupações. 0 perfil de temperatura nos cachorros de controlo parece ser bifásico com a ocorrência de uma resposta secundária de temperatura, 10 dias após o desafio. Este perfil de temperatura bifásico tinha já sido notado anteriormente em cachorros desafiados com CCV virulento. Essa resposta de temperatura bifásica não foi notada nos cachorros
Desenvolveu-se uma análise ELISA para medir directamente a protecção proporcionada ao tracto intestinal dos cachorros vaci nados, contra a infecção do tracto intestinal com o desafio com CCV virulento. A tabela 6 mostra as determinações de IgA anti-CCV efectuada a intervalos diários após o desafio. A IgA anti-CCV permaneceu próxima ou mesmo sobre os níveis da linha de base.
aumento significativo na IgA anti-CCV nos cachorros vaci nados que se inicia no 7e dia após o desafio deve-se ao revestimento parentérico das superfícies das mucosas intestinais cora a vacina de CCV inactivado, adjuvada. 0 desafio oral estimulou a resposta da memória IgA das mucosas, inauzindo uma resposta significativa de IgA anti-CCV no tracto intestinal. Esta resposta elevada de IgA é suficiente para a protecção contra a infecção. Nos cachorros de controlo desafiados houve uma resposta muito pequena ou mesmo inexistente de IgA anti-CCV, demonstrando a ausência de células de memória revestidas e a ausência de
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rt
-21protecção.
Este exemplo aemonstra que uma vacina contra o CCV compreendendo o peplômero de CCV associado às células ê protectora contra a doença provocada pela infecção com CCV.
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SKB CASE 14179 /7
Exemplo 3
-23Vacina Combinada
Uma vacina bivalente compreendendo a vacina contra CCV do invento e uma vacina de Parvovírus Canino vivo modificado (6,3 Logic TCID^q por dose) foi administrada a 6 cachorros susceptíveis, com 9 a 12 semanas ae idaae.
Três semanas após a vacinação, os cachorros possuíam um título médio geométrico de anticorpos em ELISA de 113 para a fracção CCV e um título médio geométrico VN de 912 para o componente CPV. Nesta altura os cachorros receberam uma segunda dose do produto combinado. Duas semanas após a segunda vacinação, o título médio geométrico de anticorpos em ELISA para CCV era de 3Ó20 e o título médio geométrico VN para CPV era de 1448.
Um segundo grupo de 6 cachorros susceptíveis foi vacinado com uma vacina monovalente ae CPV vivo modificado (6,3 LogTCID^q). 0 CPV foi modificado por passagem em células. Três semanas após a vacinação, os cachorros possuíam um título médio geométrico de anticorpos VN para CPV ae 1448, Nesta altura, os cachorros receberam uma segunda dose de vacina de CPV. Duas semanas após a segunaa vacinação, o título médio geométrico VN para CPV era 2896. cs soros das diferentes sangrias foram monitorizados em relação aos títulos ae CCV e verificou-se serem negativos durante toda a duração deste teste.
Com excepção de um cachorro, todos os cachorros exibiram boas respostas para CPV. Todos os cachorros, menos esse, exibiram respostas iguais face ao CPV, quer em combinação com CCV quer como produto monovalente.
Este exemplo demonstra que a vacina de CCV dc invento pode ser utilizada em combinação com outros componentes de vacinas, e, em particular, com um componente de vacina de Parvovirus Canino.
Apesar de o invento e as suas concretizações preferidas se encontrarem totalmente descritas acima, deverá entender-se que o invento inclui todas as concretizações e modificações que se encontrem no âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims (4)

  1. REIVINDICAÇÕES
    19. - Processo de preparação de uma vacina para a protecção de animais contra a doença provocada pela infecçâo com Coronavirus Canino (CCV), caracterizado por compreender:
    a. a infecçâo de uma cultura de células com uma Multipli cidade de Infecçâo (KOI) de CCV de pelo menos 0,2;
    b. a cultura das células durante 6-18 horas;
    c. a rejeição do meio fluído consumido;
    d. o rompimento das células;
    e. a recolha da proteína peplómera associada às células, das células rompidas; e
    f. a combinação do peplómero associado às células com um veículo parentericamente aceitável.
  2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o rompimento das células se efectuar num fluído parentericamente aceitável e por se combinarem assim os passos (e) e (f).
    39. _ Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac terizado por compreender ainda a mistura do veículo contendo a proteína peplómera associada às células com um adjuvante,
    49. - Processo de acordo com as reivindicações 1-3, caraç terizado por a vacina compreender uma quantidade eficaz de pro teína peplómero de CCV, e estar isenta ou substancialmente isen ta de virus CCV externalizados durante a cultura de células infectadas .
  3. 5^. - Processo de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizado por a vacina compreender uma quantidade eficaz de proteína peplómero de CCV numa cultura inactivada de células infec tadas com CCV, cultura da qual se removeu 0 meio de crescimento
  4. 6®. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri, zado por a proteína peplómero estar na forma de monocamada de células inactivadas, da qual se retirou o meio de crescimento antes da inactivação.
PT87668A 1987-06-08 1988-06-07 Processo de preparacao de uma vacina contra coronavirus canino PT87668B (pt)

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US07/059,437 US4904468A (en) 1987-06-08 1987-06-08 Canine coronavirus vaccine

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