CN110903387A - 一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法和应用 - Google Patents
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法和应用，属于免疫学及基因工程领域。以北京地区分离鉴定的犬冠状病毒BJ02为基础毒株制备犬冠状病毒灭活疫苗，按一定程序免疫健康牛，定期采血监测抗体水平，产生高效价抗体后收集高免血，加入青霉素和链霉素，自然凝固分离高免血清，采用硫酸铵沉淀法分离高免血清中的免疫球蛋白，以胃蛋白酶酶切Fc’片段后，Protein A+G柱纯化回收获得高活性免疫球蛋白F(ab′)2。本发明制备的F(ab′)2特异性强，可作为犬接触感染犬冠状病毒时的紧急预防和治疗制剂，增加病犬机体免疫力和病毒抵抗力，具有效价高、安全性好、无临床副作用，具有良好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学及基因工程领域，具体一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法和应用。
背景技术
犬冠状病毒病是由犬冠状病毒(CCV)引起的，以犬胃肠炎为主要症状的一种高度接触性传染病。该病毒最早在1971年从德国腹泻的军犬中分离获得，之后在世界各地相继有报道。1985年以来，我国也陆续出现CCV的报道。CCV可主要感染犬科动物，各年龄、品种、性别的犬均可感染，其中2-4月龄的幼犬发病率和死亡率最高，其它种属动物，如猫、大熊猫、小熊猫、狐、狼和猪等均有易感性。CCV感染主要以呕吐、腹泻、精神沉郁、脱水为主要临床特征，既可单独感染，也可与犬细小病毒、腺病毒、轮状病毒等病原混合感染或继发感染，与其它病原混合感染时，临床症状表现严重，死亡率会明显增高。
目前，疫苗接种是预防犬冠状病毒感染最常用且最有效的手段，对于发病动物，尚无特效治疗药物，临床上常采用对症治疗，支持疗法、特异疗法、控制继发感染进行综合治疗。特异性抗病毒治疗普遍使用全冠状病毒免疫血清，利用血清中的抗体特异性识别病毒表面抗原，中和病原体。虽然抗犬冠状病毒免疫血清应用取得了较好的治疗效果，但因犬血液含量有限，犬源CCV免疫血清制备成本较高，并且，直接使用犬源免疫血清，可能会因其纯度问题易造成动物产生不良反应，同时还可能会因血清中含有其它病原而导致某些传染病的扩散传播，因此开发高纯度异源CCV抗体成了治疗犬冠状病毒的最佳选择之一。目前，国内对异源犬冠状病毒治疗抗体相关研究较少。本研究大量制备牛源抗犬冠状病毒高免血清，提取和纯化高效价F(ab′)2抗体，用于犬冠状病毒疾病的预防和治疗，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的发明目的之一是，针对上述问题，提供一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2，以犬冠状病毒免疫健康牛，制备了牛源免疫球蛋白F(ab′)2，具有效价高、安全性好、无临床副作用，具有良好的推广应用前景。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2，先采用犬冠状病毒灭活疫苗免疫健康牛，采集血分离高免血清，然后从高免血清中分离纯化IgG，经胃蛋白酶酶切，将酶切产物过亲和层析柱，收集洗脱液，过滤，除菌得犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
优选的，所述犬冠状病毒为犬冠状病毒BJ02。
优选的，所述的犬冠状病毒灭活疫苗的制备方法为：将犬冠状病毒BJ02在MDCK细胞上扩大培养后，以47份的灭活的犬冠状病毒与4份的吐温-80及终浓度为0.3mg/mL胸腺肽制备水相，94份白油与2份硬脂酸铝及6份司本80制备油相，油相与水相混合乳化后制成油乳灭活苗，疫苗中病毒含量≥105TCTD50/0.1mL。
优选的，所述采用犬冠状病毒灭活疫苗免疫健康牛的免疫程序为：首次以肌肉多点及交会穴注射3-5mL的犬冠状病毒灭活疫苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射3-5mL犬冠状病毒灭活疫苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5-1mL。
优选的，加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰时采血。抗体效价达到25以上就可以大量采血，一般在28时大量采血。
优选的，分离纯化IgG具体包括以下步骤：
(5)向采集的血液加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃下静置8-12h后收集血清；
(6)向血清中先后加入2倍体积的0.06M，pH4.2的PBS和1/20体积的正辛酸充分混匀后离心收集上清液；
(7)向所述上清液加入0.227g/mL硫酸铵，放置8-12h后离心收集沉淀；
(8)将沉淀溶解于PBS，再加入硫酸铵至溶液中硫酸铵饱和度为35％，离心再次收集沉淀，最后将沉淀溶解于原血清等体积的PBS中，透析，离心去除沉淀获得IgG。
优选的，将分离纯化的IgG的pH调整为3-4，加入10-20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化1-3h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
本发明还提供所述制备方法制备的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
本发明还提供所述犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2在制备用于预防和/或治疗犬冠状病毒病药物中的应用。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，以犬冠状病毒免疫健康牛，制备了牛源免疫球蛋白F(ab′)2。相对于犬高免血清，牛源免疫球蛋白F(ab′)2可避免因血清纯度问题造成犬只产生不良反应，还可防止同种动物之间其他病毒的人为传播。而且用于制备免疫球蛋白F(ab′)2的原料血浆有稳定高效的来源，能满足血浆的供给，从而减低成本。
2.本发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，采用交会穴和肌肉注射免疫，并多次加强免疫，从而提高犬冠状病毒抗体效价。
采用优化的正辛酸-硫酸铵沉淀法提取IgG，相对常规正辛酸-硫酸铵沉淀法、硫酸铵沉淀法和低温乙醇沉淀法，浓度较高，抗体效价高。
Protein A与Protein G是主流纯化单抗或多抗的亲和层析介质，产品被开发后一直不断被改良，而新一代的Protein A+G柱具有高载量、亲和力高、耐洗涤和重复利用等优点。利用亲和层析法，去除引起过敏反应的Fc片段，使免疫球蛋白F(ab′)2分离纯化，从而得到较高纯度的抗体。
3.本发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，北京地区分离鉴定的犬冠状病毒BJ02为基础毒株，该毒株的病毒滴度较高，免疫原性好，制备出抗体抗体效价高，且能更好针对流行毒株的免疫保护作用。
4.本发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2，具有较好的疗效，临床试用表明，本发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2配伍其它药物制剂防治后治愈率高，具有无毒副作用、安全性高，疗效好，成本低等优点，极具推广前景。
附图说明
图1为本发明实施例1凝胶电泳结果；
其中，M：蛋白Mark，1：IgG蛋白样品，2 3：酶切过柱后样品；
图2为本发明实施例1和对比例1-3凝胶电泳结果；
其中，M：蛋白Marker，1：IgG蛋白样品(实施例1)，2：IgG蛋白样品(对比例1)，3：IgG蛋白样品(对比例2)，4：IgG蛋白样品(对比例3)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，包括以下步骤：
S1.犬冠状病毒灭活疫苗的制备
选择北京地区分离鉴定的犬冠状病毒BJ02为基础毒株，将犬冠状病毒按1/10体积比接种到长满单层的MDCK细胞，37℃5％CO2培养箱中静置吸附2h后弃掉生长液并换成维持液继续培养，逐日观察细胞病变，待75％细胞出现病变时，收集细胞，-20～20℃反复冻融3次，然后4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片，收集上清液，测定其TCID50/0.1mL值≥5.0，加入胸腺肽至终浓度为0.3mg/mL后，加入甲醛至终浓度为0.1％，37℃灭活24h，每隔4h振荡1次，随后按照47mL病毒液加入4mL吐温-80比例制备水相，同时94mL白油加入6mL司本80及2g硬脂酸铝比例制备油相，将水相缓慢加入油相中，乳化器高速搅拌乳化，制备CCV油乳剂灭活苗。
S2.犬冠状病毒F(ab′)2的制备
(1)以肌肉多点注射及交会穴注射5mL的犬冠状病毒灭活苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射5mL犬冠状病毒灭活苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5mL。
(2)加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰28时采牛高免血，加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃静置10小时收集血清；
(3)血清中先后加入2倍体积的0.06M，pH4.2的PBS和1/20体积正辛酸充分混匀后4℃离心收集上清液，再加入0.227g/mL硫酸铵，室温搅拌后，4℃放置10h后，4℃离心收集沉淀；
(4)用PBS溶解沉淀恢复到原血清体积，缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵饱和度为35％，室温静置40min,4℃离心20min，收集沉淀；
(5)PBS溶解沉淀，装入透析袋，置于PBS中透析24h，其间更换3次PBS，5000rpm离心20min去除沉淀获得精制IgG；
(6)测定IgG含量，调IgG溶液pH至3.2，加入20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化2h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
图1为凝胶电泳结果，可以看出IgG过酶切后，经ProteinA+G亲和柱纯化成功回收目的蛋白F(ab′)2。
实施例2
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2制剂，将实施例1制备的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2调整蛋白浓度，使最终中和效价在128以上，加入蛋白稳定剂，制备成注射液，所述蛋白稳定剂为麦芽糖，质量分数为10％。
该试剂用于治疗犬冠状病毒，皮下或肌肉注射，1-2ml/kg，每天注射1次，连续注射3-5d。可配伍其它药物制剂使用。
对比例1
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，采用正辛酸-硫酸铵沉淀法制备IgG，包括以下步骤：
S1.犬冠状病毒灭活疫苗的制备
同实施例1。
S2.犬冠状病毒F(ab′)2的制备
(1)以肌肉多点注射及交会穴注射5mL的犬冠状病毒灭活苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射5mL犬冠状病毒灭活苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5mL。
(2)加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰采牛高免血，加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃静置10小时收集血清；
(3)取150mL乙酸缓冲液(60mmol/L，pH＝4.0)加入离心杯，再加入50mL血清充分混匀，用浓氨水调至pH＝4.5，在30min内缓慢搅拌加入2mL正辛酸，4℃冰箱放2h后，10000r/min离心30min，吸取上清液用滤纸过滤后，加入10％总体积PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)，再加入硫酸铵(现溶液体积×0.277g)，继续搅拌30min(调pH＝7.2)，4℃冰箱过夜后，10000r/min离心30min去除上清，用50mL无菌PBS(0.01mol/L、Ph＝7.2)溶解沉淀，再以12000r/min离心30min，弃沉淀取上清。
(4)测定IgG含量，调IgG溶液pH至3.2，加入20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化2h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
对比例2
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，采用硫酸铵沉淀法制备IgG，包括以下步骤：
S1.犬冠状病毒灭活疫苗的制备
同实施例1。
S2.犬冠状病毒F(ab′)2的制备
(1)以肌肉多点注射及交会穴注射5mL的犬冠状病毒灭活苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射5mL犬冠状病毒灭活苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5mL。
(2)加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰采牛高免血，加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃静置10小时收集血清；
(3)于无菌离杯中加入50mL血清，再加入100mL灭菌的0.9％NaCl，充分混匀，搅拌30min，同时缓慢加入125mL配制好的饱和硫酸铵溶液，4℃存放12h。以4 000r/min离心30min，弃上清。
(4)加67mL PBS(0.01mol/L、Ph＝7.2)溶解沉淀再加入33mL饱和硫酸铵溶液充分搅拌30min，4℃存放12h。重复上步操作一次。最后用50mL无菌PBS溶解沉淀，转到透析袋中，置4℃冰箱中72h(换水3次以上)进行透析除盐(上述整个操作过程应无菌操作，尽量减少内毒素产生。下面所述提纯操作也同样为无菌操作)。在碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH＝8)溶液中煮沸10min，用蒸馏水清洗干净，继续于1mmol/L EDTA(pH＝8)溶液中煮沸10min，取出透析袋备用。
(5)测定IgG含量，调IgG溶液pH至3.2，加入20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化2h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
对比例3
一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，采用低温乙醇沉淀法制备IgG，包括以下步骤：
S1.犬冠状病毒灭活疫苗的制备
同实施例1。
S2.犬冠状病毒F(ab′)2的制备
(1)以肌肉多点注射及交会穴注射5mL的犬冠状病毒灭活苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射5mL犬冠状病毒灭活苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5mL。
(2)加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰采牛高免血，加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃静置10小时收集血清；
(3)提前30min打开制冰机，将乙醇放到-20℃冰箱预冷。准备一盆冰水混合物，取无菌离杯加入50mL血清，再加入100mL灭菌的0.9％NaCl充分混匀(调pH＝7.7)放到盆中，快速搅拌加入30mL-20℃乙醇，直到出现白色沉淀，4800r/min离心30min去除上清液，收集沉淀。
(4)向沉淀中加入50mL预冷的0.9％NaCl溶解沉淀，用乙酸溶液调pH值到5.1，再次出现沉淀，4800r/min离心30min收集上清。
(5)将上清调至pH＝7.4加入无菌离心杯中，再加入20mL预冷的-20℃乙醇，保持在冰水混合物的盆中，使其产生沉淀，4800r/min离心30min去除上清。最后用50mL无菌PBS溶解沉淀，得到IgG。
(6)测定IgG含量，调IgG溶液pH至3.2，加入20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化2h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
图2为实施例1和对比例1-3提取的IgG的电泳图，从图中可以看出，实施例1制备的IgG浓度最高，采用优化的正辛酸-硫酸铵沉淀法提取IgG，相对常规正辛酸-硫酸铵沉淀法、硫酸铵沉淀法和低温乙醇沉淀法，浓度较高，在后续的纯化过程中能的较高浓度含量的F(ab′)2抗体。
实验例1F(ab′)2抗体效价测定
1、抗体浓度采用BCA蛋白浓度试剂盒进行测试，本发明采用碧云天产品编号为P0011的试剂盒进行测试。
实验结果：实施例1所制备的抗犬冠状病毒F(ab′)2抗体的浓度达84mg/mL。
2、微量中和实验测定蛋白效价，
具体实验方法为：采用固定病毒-稀释血清法，在96孔微量细胞培养板上进行。首先将血清样品置于56℃水浴3muin灭活血清中非特异性病毒抑制成分，随后向血清样品中加入终浓度为0.25％诺沙星，10000min离心10min，去除可能的细菌污染物，取上清作2倍连稀释(第一孔血清不做稀释，共8个稀释度)。或先将血清稀释成1:2，再作2倍连续稀穎共8个稀释度)。随后分别加入等量含100TCID50的病毒悬液。经37℃感作1h后，分别加入96孔板，每个稀释度加4个孔，每孔加100L。然后将分散并稀释成2.5-3.0×106个mL的MDCK细胞悬液加入96孔板，每孔加50uL，置5％CO2培养箱内，37℃培养。同时设阴性、阳性血清对照、病毒对照及正常细胞对照。第5d判定结果，以每孔完全不出现融合性细胞病变作为阳性标准，并以其最高稀释滴度为中和终点，按Reed-muencl法计算血清的中和抗体效价。
实验结果：实施例1制备的抗犬冠状病毒F(ab′)2中和抗体效价达到1:180。
实验例2F(ab′)2抗体安全性检验
按每千克体重2mL的剂量，皮下或肌肉注射5月龄比格犬，连续观察21d；同时按每只0.5mL的剂量腹腔注射昆明小白鼠，连续观察7d；犬注射部位未见肿胀和过敏等异常现象，小白鼠全部健活，未出现任何异常现象，表明实施例1制备的抗犬冠状病毒F(ab′)2抗体无副作用。
实验例3F(ab′)2抗体效力检验
取10月龄健康比格犬10只，随机分2组，每组5只，试验组每只犬每次肌肉注射实施例1制备的F(ab′)2抗体2mL，连续注射2d进行被动免疫，对照组同样方法注射2mL生理盐水，最后一次注射抗体48h后，试验组和对照组犬均进行犬冠状病毒皮下注射和滴鼻攻毒，隔离喂养，连续观察21d。结果显示，试验组犬仅在攻毒后24h内出现精神较差，对照组在攻毒后两星期内精神状态都较差；对照组犬没有犬只表现腹泻症状，对照组犬有4只犬出现明显的腹泻症状，1只没有出现症状的犬精神状态也明显比试验组未发病犬差。
综上所述，本发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2，具有较好的疗效，发明提供的的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)，具有无毒副作用、安全性高，疗效好，成本低等优点，极具推广前景。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术构思下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (10)
1.一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，其特征在于，先采用犬冠状病毒灭活疫苗免疫健康牛，采集血分离高免血清，然后从高免血清中分离纯化IgG，经胃蛋白酶酶切，将酶切产物过亲和层析柱，收集洗脱液，过滤，除菌得犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
2.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，所述犬冠状病毒为犬冠状病毒BJ02。
3.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，所述的犬冠状病毒灭活疫苗的制备方法为：将犬冠状病毒BJ02在MDCK细胞上扩大培养后，以47份的灭活的犬冠状病毒与4份的吐温-80及终浓度为0.3mg/mL胸腺肽制备水相，94份白油与2份硬脂酸铝及6份司本80制备油相，油相与水相混合乳化后制成油乳灭活苗，疫苗中病毒含量≥105TCTD50/0.1mL。
4.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，所述采用犬冠状病毒灭活疫苗免疫健康牛的免疫程序为：首次以肌肉多点及交会穴注射3-5mL的犬冠状病毒灭活疫苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射3-5mL犬冠状病毒灭活疫苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5-1mL。
5.根据权利要求4所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到25时开始采血。
6.根据权利要求5所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰时开始大量采血。
7.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，分离纯化IgG具体包括以下步骤：
(1)向采集的血液加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃下静置8-12h后收集血清；
(2)向血清中先后加入2倍体积的0.06M，pH4.2的PBS和1/20体积的正辛酸充分混匀后离心收集上清液；
(3)向所述上清液加入0.227g/mL硫酸铵，放置8-12h后离心收集沉淀；
(4)将沉淀溶解于PBS，再加入硫酸铵至溶液中硫酸铵饱和度为35％，离心再次收集沉淀，最后将沉淀溶解于原血清等体积的PBS中，透析，离心去除沉淀获得IgG。
8.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法,其特征在于，将分离纯化的IgG的pH调整为3-4，加入10-20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化1-3h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法制备的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
10.根据权利要求9所述的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2在制备用于预防和/或治疗犬冠状病毒病药物中的应用。
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2019
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