JP2655876B2

JP2655876B2 - イヌ科コロナウイルスワクチン

Info

Publication number: JP2655876B2
Application number: JP14035988A
Authority: JP
Inventors: マイケル・アロンゾ・ギル; ステファン・ウイリアム・メイ
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1987-06-08
Filing date: 1988-06-07
Publication date: 1997-09-24
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: FI87531B; EP0295057A3; NO176004C; DE3882599T2; ES2058283T3; FI882689A0; KR970000233B1; IL86635A0; AU1747688A; KR890000105A; HUT46858A; AU612151B2; EP0295057A2; IE881689L; PH27018A; HU203984B; IE63006B1; US4904468A; NZ224865A; NO176004B

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、獣医学ワクチンに関し、さらに詳しくは、
イヌ科コロナウイルスによる感染からイヌ科動物を保護
するワクチンに関する。

発明の背景コロナウイルスは、多くの種類の動物種における脳
炎，肝炎，肺炎，鼻咽頭炎，腹膜炎および胃腸炎を包含
するいくつかの疾患の最も重要な原因病原体の１つであ
る。腸疾患に関して、コロナウイルスは、ヒト、ブタ、
子ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、七面鳥、イヌ、ネ
コおよびウマの糞中に検出されている。

イヌ科コロナウイルス（CCV）腸炎は、ビンら（Binn,
et al.）Proc.78th Ann.Mtg.U.S.Anin.Health.Assoc.Ro
anoke VA Oct:359〜366（1974）により最初に報告され
た。

該ウイルスは、疑似ウイルス性胃腸炎に罹患している
軍用犬から1971年に最初に単離された。

まだ明らかでない理由により、1970年代の末期に、コ
ロナウイルス腸炎がイヌの重大疾患として出現した。主
な感染源は、感染動物からの糞便であると考えられる。
経口感染は、小腸の上皮細胞において応答を生じる。ウ
イルスは、通常、接種後３〜14日の間の感染イヌの糞か
ら単離しうる。

CCV胃腸炎は、軽度抑うつ、食欲不振および特別の不
快臭を伴う軟便により特徴付けられる。該疾患は、、し
ばしば、嘔吐を伴うかまたは直前に嘔吐を生じる下痢に
より突然始まる。嘔吐は、通常、疾患の１日または２日
後に回数が減少する。該糞は、しばしば、粘液および種
々の量の血液を含んでおり、それを赤味がかった橙色に
する。噴出した下痢は、時には、水性または血液性流体
のいずれかのように見える。若い子イヌは、たとえ該疾
患の経過の初期に流体療法を開始しても急速に脱水状態
になるうる。良好な支持治療にもかかわらず臨床的徴候
が現われた後僅か24〜36時間位以内に死亡する。ストレ
スは、該疾患の重篤度を増大させると考えられる。ある
場合には体温の上昇が認められたが、大部分の動物は無
熱性の傾向にあり、かつ、いくらかの罹患したイヌにお
いては、体温が明らかに正常以下である。カーミカエ
ル、「コロナ様ウイルスにより生じた感染性イヌ科腸
炎」、ラボラトリー・レポート、ザ・ジェームズ・エー
・ベーカー・インスチチュート・フォー・アニマル・ヘ
ルス、コーネル大学（Carmichael,“Infectious canine
enteritis caused by a corona−like virus,“Labora
tory Report,The James A.Baker Institute for Animal
Health,Cornell U.）２（９）（1978）参照。大部分の
感染したイヌは１週間〜10日後に回復するが、初期の徴
候的治療を受けたイヌおよび暖かく、かつ、安静にして
いたイヌは、しばしば、より早期に回復する。アぺル
ら、コーネル・ベテリナリアン（Appel et al.,Cornell
Vet.）、69、123〜133（1979）。難治性である３〜４
週間の持続性下痢が数例報告されている。アペルら、ケ
イナイン・プラクティス（Canine Prac.）、７、22〜36
（1980）。眼および鼻分泌物が併発的に認められるが、
主要感染症とそれらの関係は知られていない。CCV腸炎
の形態学的病変は、腸および腸間膜リンパ結節に限定さ
れる。組織学的変化は、ウシ属コーネルウイルスに感染
した無菌子ウシにおいて記載された変化と非常に類似し
ている。実験用イヌの併発症を伴わない感染は軽度であ
り、病理学的変化は認められないか、水分の多い緑−黄
色糞便が満ちた膨張した腸ループからなるかのいずれか
である。該腸間膜リンパ結節は、通常、拡大し、かつ、
うっ血または出血している。

ある場合において、実験的に感染したイヌのインキュ
ベーション期間は、約24〜36時間であった。該イヌは、
典型的臨床症状またはコロナウイルス胃腸炎に伴う典型
的な下痢を示さなかった。顕微鏡的変化は、腸絨毛の萎
縮および陰窩の深化、固有層の細胞性の増加、上皮細胞
の平滑化および杯状細胞の障害により特徴付けられ、小
さなものであった。キーナンら、アメリカン、ジャーナ
ル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Keenan et al.Am.
J.Vet.Res.）、37、247〜256（1976）。軽度の症状は、
実験的に感染したイヌに接種するために用いた単離操作
および該イヌが他の主要な病原体および寄生虫に罹患し
ていないという事実のためでありうる。

CCV腸炎の特定の治療法は得られていない。治療は、
体液および電解質損失を回復し、下痢を制御し、かつ、
２次細胞感染を抑制または抑制する試みで支えられてい
る。

非経口的にCCVを接種したイヌの血清抗体力価は、経
口的に暴露したイヌより高かった。経口チャレンジ後、
該イヌは既往タイプ抗体応答を生じ、非暴露対照イヌよ
りも短期間でウイルスを減じた。おそらく、腸における
IgA抗体により伝達される局所免疫が、ブタの伝染性胃
腸炎と同様の様式でCCV感染に対する保護に必須である
と考えられた。アペルら、ケイナイン・プラクティス、
７、22〜36（1980）。

CCV腸炎の推定的診断は、臨床的徴候に基づく、同様
に考えられうるイヌの急性嘔吐および下痢の他の原因と
しては、中毒、細菌性腸炎、コクシジウム症、急性膵
炎、急性腎または肺不全および他ののウイルス性感染症
が挙げられる。急速に広まった証拠はCCV腸炎を強く示
唆している。イヌの糞検体のCCV粒子に関連したイヌ科
パルボウイルスの電子顕微鏡検出を記載したいくつかの
報告が存在する。例えば、カーミカエル、前記分献、エ
バーマンら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナ
ル・メディカル・アソシエーション（Evermann et al.,
J.Am.Vet.Med.Ass.）、177、784〜786（1980）；レセト
ら、アルカイブス・オブ・バイロロジー（Reseto et a
l.,Arch.Virol.）、66;89〜93（1980）参照。さらに、
ある報告は、ある種の糞検体中にイヌ科ロタウイルスを
検出した。マックヌルティら、ベテリナリー・リサーチ
（McNulty et al.,Vet.Res.）、106:350〜351（198
0）。これは、野外の場合の過酷さが、いく分は複合ウ
イルス性感染症に起因しうるということを示している。

いくつかの困難性を伴う糞検体または腸内容物からの
CCVの単離が数人の研究者により報告されている。それ
らの培養条件の面倒な性質および感受性細胞基質の欠如
のため、コロナウイルスは、しばしば、単離されないか
診断されない。血清変換または凍結腸切片の免疫蛍光検
査を包含する致命的な場合の死後の調査結果は、全て、
適切な病因診断のために用いうる。

コロナウイルスは、ペプロマーと称する特徴的な大き
な棍棒状突起またはスパイクを有するらせん状ヌクレオ
カプシドを有する大きな（直径約100nm）外被RNAウイル
スである。該RNAは、約5.5×10⁶ダルトンの陽極性を有
する単一の線型一重鎖からなる。極薄組織切片におい
て、該ウイルスは、電子顕微鏡により、細胞質の液胞中
に出芽することにより形成すると考えられる。該ウイル
スは、抗原的にブタ伝染性胃腸炎ウイルスと関連してい
る。

アクリーら、米国特許第4567042号および同第4567043
号は、それぞれ、共に廃液体培地からなる不活化および
弱毒化イヌ科コロナウイルスワクチンを記載している。

発明の要約本発明は、有効量の細胞性CCVペプロマータンパク質
からなることを特徴とするイヌ科コロナウイルス（CC
V）に感染することにより生じる疾患からイヌ科動物を
保護するワクチンに関する。

本発明は、また、 a.少なくとも0.2の感染の多重度（MOI）のCCVで細胞培
養を感染し、 b.該細胞を６〜18時間培養し、 c.廃液体培地を廃棄し、 d.該細胞を粉砕し、 e.該粉砕細胞から該細胞性ペプロマータンパク質を収集
し、および f.該細胞性ペプロマーと非経口的に許容される担体を合
する、とを特徴とするそのようなワクチンの調製方法に関す
る。

本発明のもう１つの態様は、有効量の細胞性CCVペプ
ロマータンパク質および１またはそれ以上の病原性生物
体またはウイルスに対して保護する有効量の抗原成分か
らなることを特徴とする多価ワクチンである。

本発明のもう１つの態様は、本発明のワクチンをイヌ
科動物に非経口投与することを特徴とするCCV感染によ
り生じる疾患に対してイヌ科動物を保護する方法であ
る。

発明の詳説 CCVは、感染後細胞内的に複製する。該複製サイクル
において、CCVRNAが翻訳され、ウイルス複製に包含され
る種々の構造タンパク質および非構造タンパク質を生じ
る。該ペプロマーを含有するカプシドタンパク質、また
はE2、タンパク質は、粗い小胞体の膜結合ポリリボソー
ムで翻訳されると考えられる。ウイルス成熟の過程にお
いて、細胞質ヌクレオカプシドが該小胞体中に出芽し、
該カプシドタンパク質を得て成熟ウイルス粒子を形成
し、ついでゴルジ装置により顕在化される。該ペプロマ
ータンパク質は、開裂または他の翻訳後修正を受け、そ
の後粒子形成を受けうる。同時的に、いくつかのペプロ
マータンパク質は、最初に該感染細胞中に進入した際の
細胞膜の脂質二重層中に依然として固着していると考え
られる。

細胞性ペプロマータンパク質、すなわち、粒子形成の
前に該感染細胞中に存在するようなペプロマータンパク
質は、イヌ科動物に非経口投与した際にその応答が通
常、ヴィルレントCCVによる感染に伴う疾患症状に対し
て保護する免疫応答を誘発するという知見を今回得た。
この知見は、弱毒化または不活化した全ウイルスが、相
対的に不十分な免疫保護しか示さないという事実の観点
から驚くべきことである。

該細胞性ペプロマータンパク質（約203000MW）は、合
成によりまた遺伝子工学により感染細胞の適当な培養お
よび収穫により産生しうる。細胞培養により該ペプロマ
ーを産生するために、感受性細胞培養を該ウイルスで感
染し、かつ、培養する。該ウイルスの複製を維持しうる
または該ウイルスを複製するために適用しうるいずれも
の１次または連続細胞培養を用いうる。例として、イヌ
腎臓細胞およびイヌ胸腺細胞のような１次イヌ細胞、マ
ディン・ダービー（Madin Darby）イヌ腎臓細胞株およ
びＡ−72繊維芽細胞イヌ細胞株（ATCC CRL1542）のよう
なイヌ細胞株、１次ネコ腎臓細胞にょうな１次ネコ細
胞、クランダル（Crandall）ネコ腎臓細胞株およびウッ
ド（Wood）ネコ細胞株のようなネコ細胞株およびヴェロ
（Vero）サル腎臓細胞株のような他の１次または連続哺
乳動物細胞が挙げられる。

該ウイルスは、公知の方法により臨床的感染症から単
離できる。そのような方法は、ポリカチオンの存在下、
例えば、細胞培地において、感染動物からの糞便を懸濁
し、ついでそれからの上清を用い１次細胞培養を接種す
ることを包含する。例えば、ビンらは（Binn et a
l.）、Proc.78th Ann.Mtg.U.S.Anim.Health Assoc.,Roa
noke VA10月:359〜366（1974）、キーナンら、アメリカ
ン．ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Keen
an et al.,Am.J.Vet.Res.）、37:247〜256（1976）およ
びチングパラポングら（Tingpalapong et al.）、アメ
リカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ、
43:1687〜1690（1982）参照。ヴィルレトン単離物、す
なわち1971年にビンらにより最初に単離されたＩ−71株
は、公けに入力しうる他のものの１つである。例えば、
これは、受託番号VR−809の下、米国メリーランド州ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンから得ることができる。他の単離物としては、米国
特許第4567042号および同第4567043号においてアクリー
らが言及しているＫ−378、Ｓ−378、A76−５およびATC
C VR22068が挙げられる。

該細胞性ペプロマー抗原を産生し、かつ、収穫するた
め、該細胞培養を１細胞当り0.2〜2.0ウイルス粒子、す
なわち0.2〜2.0に等しい感染の多重度（MOI）、好まし
くは0.4〜1.5のMOIで感染させる。感染細胞を感染後約
６〜18時間、好ましくは９〜16時間、最も好ましくは９
〜12時間培養する。ついで、該増殖培地を除去し、該ペ
プロマーを該細胞から収穫する。これは、好ましくは、
該廃液体培地と新鮮な液体培地を代替し、ついで該細胞
を粉砕して該細胞性ペプロマーを遊離させ、それを該新
鮮培地中に収集する。ワクチン調製のため、該細胞性ペ
プロマーを非経口的に許容される希釈剤または担体と合
す。好都合には、これらの工程は、粉砕前に該廃液体培
地と非経口的に許容されるそれらを代替することにより
併合できる。

粉砕は、例えば、機械的、超音波もしくは化学的手段
またはそれらの組合せにより行うことができる。それ
は、好都合には、該細胞を約−40〜約70℃に凍結するこ
とにより行なう。解凍時に該細胞性ペプロマーを含有す
る液体を収集する。該感染細胞培養を増殖した培地を廃
棄したので、該新鮮液体培地は、該感染細胞培養の増殖
の間に顕在化した細胞外ウイルスを実質的に含まない。
しかしながら、該液体を処理して、粉砕の際に細胞内粒
子およびヌクレオカプシドを遊離する残留細胞外および
細胞内ウイルスおよびヌクレオカプシドを不活化すべき
である。該ペプロマーを変性しない限り、いずれの標準
的ウイルス不活化方法も用いうる。そのような方法とし
ては、照射および２成分系エチレンイミン、ベータプロ
ピオールアセトン、ホルムアルデヒド、フェノールまた
はアセチルエチレンイミンなどの化学的不活化が挙げら
れる。非経口的に許容される安定剤、アジュバント、緩
衝剤および／または保存剤も添加して最終ワクチン処方
を調製しうる。例えば、好ましいワクチンは、メンチオ
レート、例えば1:60000およびエチレンマテイックアン
ハイドライドアジュバント、例えば0.2％からなる。

細胞培養による本発明のワクチンの調製において、CC
Vワクチン調製の従来の報告とは逆に、粉砕前に該細胞
から該廃液体培地を除去することが重要である。理由は
明らかではないが、新鮮な液体より廃培地を用いる以外
前記のごとく調製したワクチンは、新鮮な培地に含まれ
るワクチンより低いウイルス中和抗体力価を生じた。以
下の第１表は、本発明に従って、廃培地をデカンテーシ
ョンし、取り替える以外実質的に同様の方法にて調製し
たワクチン（「細胞ワクチン」）と比較して、廃培地お
よび細胞を用いて調製したワクチン（「液体ワクチ
ン」）の子イヌにおけるウイルス中和抗体力価を示す。

子イヌのウイルス中和抗体力価は、該細胞ワクチンが
第２ワクチン接種の時までに保護免疫応答を刺激する
（32の幾何平均力価）ことを示している。ワクチン接種
後サンプリング時までに、該応答は、108の幾何平均力
価まで増加した。対照的に、該液体ワクチンでワクチン
接種した子イヌは、テスト期間を通じて陰性であった。
このことは、該廃培地が免疫保護が寄与すると予想され
るCCVウイルスを含有しているので意外な結果である。

細胞性ペプロマー抗原の産生のための感染後の時間の
重要性を示すために計画した実験において、細胞性であ
るタンパク質の量および細胞培地中に存在し、したがっ
てウイルス性であるものの量をエンザイムリンクトイム
ノアッセイ（ELISA）により１時間毎に測定した。該抗
原の相対的な量を第２表に示す。特定の機構または説明
と結び付ける意図はないが、感染サイクルの後期に該ペ
プロマーを産生する変化のため、細胞を培養する期間が
重要であると考えられる。

細胞性ペプロマー抗原の最もMOIに依存することが判
明した。第３表は、MOIが0.01〜1.1の範囲にある一連の
実験からの結果を示す。全培養を感染後12時間目に収獲
し、抗原の量をELISAにより測定した。

該細胞性ペプロマー抗原は、別法により調製しうる。
例えば、該ペプロマーをイムノアフィニティ吸着クロマ
トグラフィーなどで精製し、シーケンシングし、ついで
ペプチド合成によりまたは該ペプチド配列由来のDNAコ
ーディング配列の組換え体宿主微生物または細胞におけ
る発現により調製しうる。さらに、該細胞由来抗原の免
疫保護特性を保持している該ペプロマーの誘導体は、標
準組換え体DNA、タンパク質工学または化学的方法によ
り調製しうる。

いかなる方法でも調製し、該ワクチンを、好ましく
は、少なくとも生後３カ月のイヌの非経口的、例えば、
筋肉内または皮下投与する。好ましくは、第１投与後２
〜４週間目に第２用量を投与する。年１回のワクチン再
接種を推奨する。より幼若イヌをワクチン接種する場合
には、好ましくは生後３カ月目にワクチン再接種を行な
う。妊娠している雌へのワクチン接種は、おそらく避け
るのが最良である。

各ワクチン用量は、該細胞性ペプロマーの有効量、す
なわち、CCV感染により生じる重篤疾患症状、すなわち
胃腸炎の発展に対しイヌ科動物を保護する際の非経口的
２元ワクチン接種において有効である量を含有する。細
胞培養の感染により該抗原を産生する前記の方法に従っ
て、有効量を含有する液体を得る。そのような液体は、
典型的には、1/10くらいまで希釈でき、なお有効量を含
有する。各ワクチン用量の全容積は、典型的には、0.5
〜2ml、好ましくは１〜1.5mlである。

本発明のワクチンは、また、多価ワクチンにおいて他
のワクチン剤、例えば、他の不活化（死菌）または弱毒
化イヌ科ウイルスと組合せうる。好ましくは、そのよう
な他のワクチン成分としては、ロタウイルスまたはパル
ボウイルスのような他の腸疾患原因ウイルスまたはそれ
から誘導される他の免疫保護抗原が挙げられる。多くの
そのような不活化および弱毒化ウイルスワクチンおよび
抗原が知られている。好ましい多価ワウチンは、本発明
のワクチンおよび修正生または死菌パルボウイルスの組
合せからなる２価ワクチンである。そのようなワクチン
は、ワクチン量の本発明の細胞性ペプロマーおよび修正
生または死菌パルボウイルス（例えば、用量当り6.3Log
₁₀TCID₅₀）からなる。全用量容積は、0.5〜2ml、好しく
は１〜1.5mlである。カーミカエルら、米国特許第43036
45号は、本発明のワクチンと合して本発明の２価ワクチ
ンを調製しうる、該ワクチン株の調製およびその有効用
量を包含する修正生イヌ科パルボウイルスワクチンを開
示している。

実施例つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。

実施例１ワクチン調製イヌ科コロナウイルス、株NL−18は、急性胃腸炎に罹
患している一群のイヌからの糞検体から単離した。１次
イヌ腎臓細胞についての最初の単離には、維持培地［ア
ール塩を含有する基本培地イーグル（BME）］［グラン
ド・アイランド・バイオロジカル・カンパニー・グラン
ド・アイランド、ニューヨーク（Grand Island Biologi
cal Co.,Grand Island New York）］1ml当り50μｇのジ
エチルアミノエチル（DEAE）−デキストランを必要とす
る。DEAE−デキストランは、付加的継代のために必要で
はなかった。該ウイルスを、１次イヌ腎臓細胞において
４継代まで、および第73〜93継代水準において用いられ
るネコ腎臓細胞株においてさらに36継代まで細胞培養に
適用した。ギル、［コロナウイルスの単離および特性付
け」（Gill,“Isolation and Characterization of a C
oronavirus,"）博士論文、ネブラスカ大学、1982年８月
は、先に株CCV−18と称したCCV株NL−18の単離を記載し
ている。

ウイルスを回転壜培養に接種するために、ネコ腎臓細
胞株細胞の緻密な単層からの培地をデカンテーションす
る。該培地を、少なくとも107.0TCID₅₀/mlの未希釈ウイ
ルス力価を含有する（0.2〜1.0MOI）２〜10％ウイルス
を含有する４〜８％ポリブレン（Polybrene）［ミズー
リ州セントルイス、シグマ・ケミカル・コーポレーショ
ン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri）］を補足
した維持培地で代替する。接種培地を35〜37℃で９〜16
時間インキュベートする。感染は細胞単層、すなわち、
円形細胞の斑についての典型的細胞変性効果（CPE）に
より示す。

インキュベーションおよびCPEを確認するための顕著
顕検査後、該維持培地をデカンテーションし、廃棄す
る。100mlの容量のハルス（Hals）培地を各500ml回転壜
に加える。ハルス培地では、0.5％ラクトアルブミン水
解物［テネシー州メンフィス、フンコ・シェフィールド
（Humko Sheffield,Memphis,Tennesee）］を補足したハ
ンク塩含有基本培地イーグル（BME）（ニューヨーク州
グランド・アイランド、グランド・アイランド・バイオ
ロジカル・カンパニー（Grand Island Biological Co.,
Grand Island,NY）］である。ついで、該培養を−50℃
で６時間凍結する。解答後、２成分系エチレンイミン
（BEI）溶液を１％（v/v）の終濃度まで加えて残留ウイ
ルス粒子を不活化する。該BEI溶液は、2.05gの２−ブロ
モエチルアミンおよび0.8gの水酸化ナトリウムを100ml
の水に加えることにより調製する。不活化は、２日間ま
でのインキュベーションの間一定撹拌しながら35〜37℃
で維持する。不活化は、約0.25％（w/v）のチオ硫酸ナ
トリウムの終濃度になるまでチオ硫酸ナトリウムの冷
（４℃）溶液を加えことにより停止する。メルチオレー
ト（merthiolote）を保存剤として1:10000の終濃度まで
加える。最終バルクワクチンは、細胞培養液体と維持培
地を混合し、ついで、アジュバントとしてエチレンマレ
イックアンハイドランドを0.2％の終濃度まで加えるこ
とにより調製する。該バルクワクチンは、典型的には、
容積単位で20％細胞培養液、60％維持培地および20％ア
ジュバント溶液を含有する。該アジュバンド溶液は、10
N水酸化ナトリウムを加えてエチレンマイレックアンハ
イドライド（EMA91、ミズーリ州セントルイス、モンサ
ント）のストック溶液を水和することにより調製する。
該EMAストック溶液は以下の成分を含有する：化合物 g/ NaCl 0.5 KH₂PO₄ 0.565 Na₂HPO₄ 0.135 EMA91 10.0 フェノールレッド 0.135 実施例２保護試験１次イヌ腎臓細胞についての第４継代水準のCCV−71
をＡ−72細胞株（ATCC CRL1542）上に１回通し、適当な
容積に分割し、−70℃で貯蔵した。このウイルスをヴィ
ルレントチャレンジウイルスと命名し、1ml当り10^5.3TC
ID₅₀を含有することを標定した。（株CCV−71は、ATCC
VR−809と同一である。）Ａ−72細胞株は、継代水準33のATCCから得た。この継
代水準において、Ａ−72細胞はCCV感染に感受性ではな
かった。該細胞株を100連続継続代中連続増殖し、第139
〜140番目の継代水準で、CCV増殖および力価測定のため
に用いた。この継代水準において、該Ａ−72細胞株はCC
Vの付着および複製に対して非常に感受性であった。

CCVに対してELISA抗体力価を有しない若く健康な小イ
ヌ（８〜14週令）を実験に用いた。それらは、実験テス
トの間を通じて隔離設備に収容した。

実質的に前記実施例１と同様にして調製したワクチン
1ml用量を合計20匹の小イヌに、それぞれ、21日間隔で
２回皮下投与した。５匹の小イヌはチャレンジ対照とし
てワクチン接種しないままとした。20匹のワクチン接種
被検体および５匹の対照をワクチン接種時に採血した。
それらは、また、ワクチン接種後21日目（その時点で該
ワクチン接種被検体を再接種した）、第２のワクチン接
種後14日目（その時点で該子イヌをチャレンジした）お
よびチャレンジ後14日目に採血した。

ワクチン接種被検体および対照は、チャレンジ前18〜
24時間絶食させた。チャンレンジは、5mlヴィルレント
チャレンジウイルス（1ml当り10^5.3TCID₅₀）の経口接種
により行なった。チャレンジ後18〜24時間目に、該チャ
レンジ小イヌを通常に食餌スケジュールに戻した。

チャレンジ後、徴候または疾患または反応について小
イヌを14日間観察した。観察期間の間、体温を測定し、
白血球計数のため血液試料を収集した。CCVに対する糞
便抗体（腸IgA抗体）の測定のため21日間糞試料を毎日
収集した。

各ワクチン接種後、全ての子イヌは健康で正常であっ
た。第４表は、ワクチン接種前、第２ワクチン接種前お
よびチャレンジ前の該小イヌのVN抗体力価を示してい
る。全ての子イヌは、第１ワクチン接種時にVN血清陰性
であり、第２用量を投与した時も依然として陰性であっ
た。チャレンジの時に（第２ワクチン接種後２週間）、
該VN力価は０〜16の範囲で５の幾何平均を有した。第５
表は、抗体力価の測定のためにEUISAを用いる以外第４
表と同じ小イヌおよび採血日時を示す。該子イルは第１
ワクチン接種時に血清陰性であり、これらのうちの７匹
しか第２ワクチン接種時に抗体応答を示さなかった。チ
ャレンジの時に、全ての小イヌは良好なELISA抗体力価
を示した。

チャレンジ後14日目に、該チャレンジ対照小イヌは38
80の幾何平均ELISA抗体力価を示し、一方、該ワクチン
接種比検体幾何平均ELISA抗体力価は＞19106であった
（第５表）。該ワクチン接種被検体の高体液性抗体力価
は、ワクチン接種およびチャレンジ後の良好な第２応答
に起因し、かつ、保護を示す。

チャレンジ後、いく匹かのワクチン接種動物は、食欲
不振ないし嘔吐に至る短期または一時的臨床症状を示し
た。該チャレンジ対照小イヌは、チャレンジ後にのみ食
欲不振の徴候を示した。これらの症状は、一般に、チャ
レンジ後６日目から10日目に現われた。該チャレンジ対
照小イヌは、ワクチン接種群よりも多くの臨床的症状を
示した。

患者の評価のため、チャレンジ後毎日白血球総数をモ
ニターした。

ワクチン接種またはチャレンジ対照小イヌのいずれに
おいても顕著な白血球減少症が認められなかった。チャ
レンジ対照小イヌにおいて僅かな白血球増加症が９日目
に始まり13日目まで続いた。

チャレンジ後の温度応答も臨床的CCV疾患のパラメー
タとしてモニターした。温度応答は、チャレンジ後ワク
チン接種被検体および対照の両方において生じた。温度
における相対的増加は、ワクチン接種被検体においてよ
り対照においてより劇的であった。温度における増加
は、感心を引くほども高くはなかった。対照小イヌにお
ける温度効果は、チャレンジ後10日目に生じる第２温度
応答に関して２元的であると考えられる。この２元的温
度効果は、ヴィルレントCCVでチャレンジした小イヌに
おいて以前に認められた。そのような２元的温度応答
は、対照において認められなかった。

ELISAを発展させ、ヴィルレントCCVチャレンジによる
腸管の感染に対してワクチン接種した小イヌの腸管に与
える保護を直接測定した。第６表は、チャレンジ後１日
間隔で行なった抗CCVIgA測定を示している。該抗CCVIgA
は、以前としてベースライン水準付近かベースラインの
ままである。

チャレンジ後７日目に始まるワクチン被検体における
抗CCVIgAの顕著な増加は、アジュバント不活化CCVワク
チンによる腸粘膜表面の非経口的プライミングに起因す
る。経口チャレンジは、腸管の顕著な抗CCVIgA応答を顕
在化する粘膜IgA記憶応答を刺激した。この高いIgA応答
は、感染に対する保護として十分である。該チャレンジ
対照において抗CCVIgA応答はほとんどないし全く存在せ
ず、プライム記憶細胞の欠如および保護の欠如を示し
た。

この例は、該細胞性CCVペプロマーがCCVによる感染に
より生ずる疾患に対して保護することを示している。

実施例３複合ワクチン本発明のCCVワクチンおよび修正生イヌ科パルボウイ
ルスワクチン（１用量当り6.3Log₁₀TCID₅₀）からなる２
価ワクチンを９〜12週令の６匹の感受性小イヌに投与し
た。

ワクチン接種後３週間目に、該小イヌはCCVフラクシ
ョンに対して113の幾何平均ELISA抗体力価を示し、CPV
成分に対して912の幾何平均VN力価を示した。この時に
該小イヌは第２用量の複合生成物の投与を受けた。第２
ワクチン接種後２週間目に、該CCV幾何平均ELISA抗体力
価は3620であり、かつ、該CPV幾何平均VN力価値は1448
であった。

第２群の６匹の感受性小イヌは、１価修正生CPVワク
チン（6.3Log₁₀TCID₅₀）でワクチン接種した。該CPVは
細胞継代により修正した。ワクチン接種後３週間目に、
該小イヌは、CPVに対して1448の幾何平均VN抗体力価を
示した。この時に、該小イヌは、第２用量のCPVワクチ
ン投与を受けた。第２ワクチン接種後２週間目に、該CP
V幾何平均VN力価は2896であった。異る採血からの血清
をCCV力価についてモニターし、このテストの継続期間
中陰性であることが判明した。

１匹の小イヌを除き、全ての小イヌは、CVPに対して
良好な応答を示した。その１匹の小イヌを除いて全ての
小イヌは、CCVと組合せても１価生成物としてもいずれ
でも該CPVに対し同等の応答を示した。

この実施例は、本発明のCCVワクチンが他のワクチン
成分、特にイヌ科パルボウイルスワクチン成分と組合せ
て用いうることを示している。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】有効量の細胞性CCVペプロマータンパク質
からなることを特徴とするイヌ科コロナウイルス（CC
V）による感染により生じる疾患からイヌ科動物を保護
するワクチン。
【請求項２】CCV感染細胞培養から調製した前記第
（１）項のワクチン。
【請求項３】該感染細胞培養の増殖の間に顕在下する細
胞外ウイルスを実質的に含まない前記第（２）項のワク
チン。
【請求項４】さらにアジュバントからなる前記第
（１）、（２）または（３）項のワクチン。
【請求項５】a.少なくとも0.2の感染の多重度（MOI）の
CCVで細胞培養を感染し、 b.該細胞を６〜18時間培養し、 c.廃液体培地を廃棄し、 d.該細胞を粉砕し、 e.該粉砕細胞から該細胞性ペプロマータンパク質を収集
し、および f.該細胞性ペプロマーと非経口的に許容される担体を合
することを特徴とするイヌ科コロナウイルス（CCV）による
感染により生じる疾患から動物を保護するためのワクチ
ンの調製方法。
【請求項６】該細胞を非経口的に許容される物体中に粉
砕し、それにより工程（ｅ）および（ｆ）を併合する前
記第（５）項の方法。
【請求項７】さらに、該細胞性ペプロマータンパク質含
有担体とアジュバントを混合することからなる前記第
（５）または第（６）項の方法。
【請求項８】有効量の細胞性ペプロマータンパク質およ
びそのような１またはそれ以上の付加的病原性生物体ま
たはウイルスに対して保護する有効量の抗原性成分から
なることを特徴とするCCVによる感染により生じる疾患
および１またはそれ以上の付加的病原性生物体による感
染により生じる疾患からイヌ科動物を保護するワクチ
ン。
【請求項９】該細胞性ペプロマータンパク質をCCVで感
染した細胞の培養により調製する前記第（８）項のワク
チン。
【請求項１０】該細胞性ペプロマータンパク質が、該細
胞培養の増殖の間に産生する細胞外CCVを実質的に含ま
ない前記第（９）項のワクチン。
【請求項１１】該付加的病原体がイヌ科パルボウイルス
（CPV）であり、かつ、該付加的病原成分が有効量の死
菌CPVまたは修正生CPVである前記第（８）、（９）また
は（10）項のワクチン。
【請求項１２】前記第（１）、（２）、（３）または
（４）項のワクチンをイヌ科動物に非経口投与すること
を特徴とするCCVによる感染により生じる疾患に対して
イヌ科動物を保護する方法。
【請求項１３】前記第（８）、（９）または（10）項の
ワクチンをイヌ科動物に非経口投与することを特徴とす
るCCVによる感染により生じる疾患または１またはそれ
以上の付加的病原性生物体またはウイルスに感染するこ
とにより生じる疾患に対してイヌ科動物を保護する方
法。