HU203984B

HU203984B - Proces for producing vaccine against dog coronavirus

Info

Publication number: HU203984B
Application number: HU882965A
Authority: HU
Inventors: Michael Alonzo Gill; Stephen William May
Original assignee: Norden Lab Inc
Priority date: 1987-06-08
Filing date: 1988-06-08
Publication date: 1991-11-28
Also published as: FI87531B; EP0295057A3; NO176004C; DE3882599T2; ES2058283T3; FI882689A0; KR970000233B1; IL86635A0; AU1747688A; KR890000105A; HUT46858A; AU612151B2; EP0295057A2; JP2655876B2; IE881689L; PH27018A; IE63006B1; US4904468A; NZ224865A; NO176004B

Description

A találmány tárgya eljárás kutya coronavírus elleni vakcina előállítására.

A coronavírusok sok állatfajnál, számos betegség esetén a legfontosabb előidéző okok egyike, ilyenek pl. az encephalitis, hepatitis, pneumonitis, neasopharyngitis, peritonitis és gastroenteritis. Tekintettel a bélben történő fertőzésre, a coronavírusok kimutathatók emberek, sertések, boijak, egerek, patkányok, csirkék, pulykák, kutyák, macskák és lovak ürülékében.

A kutya coronavírus (CCV) által okozott enteritisről először Binn és munkatársai számoltak be [Proc. 78th. Ann. Mtg. U. S. Anim. Health Assoc. Roanoke VA Oct: 359-366 (1974)]. A vírust először 1971-ben izolálták feltételezett vírusos gastroenteritisben szenvedő katonai kutyákból.

Még nem tisztázott okokból az 1970-es évek végén coronavírus eredetű enteritis bukkant fel kutyák jelentős betegségeként. A fertőzés primer forrása, úgy tűnik, fertőzött állatokból származó ürülék-anyag. A szájon át történő fertőzés replikációhoz vezet a vékonybél hámsejtjeiben. A vírust általában a fertőzést követő 3. és 14. napon fertőzött kutyák ürülékéből izolálhatjuk.

A CCV eredetű gastroenteritist enyhe depresszió, étvágytalanság és laza széklet jellemzi különlegesen átható szaggal. A betegség hirtelen tör ki, és hasmenéssel vagy a betegséget közvetlenül megelőző hányással társul. A hányás gyakorisága általában csökken a betegség első vagy második napja után. A széklet gyakran tartalmaz nyálkát és változó mennyiségű vért, narancstól vörösig terjedő színárnyalatot adva. Gyakran látható átrohanó hasmenés vizes vagy véres folyadék formájában. A fiatal kutyakölykök gyakran gyorsan kiszáradnak még akkor is, ha folyadékterápiát vezetünk be a betegség korai szakaszában. A pusztulás 24-36 órával a klinikai tünetek megjelenésétől számítva következik be a jól megalapozott gondoskodás ellenére. Úgy tűnik, hogy a stressz növeli a betegség súlyosságát Bizonyos esetekben megnövekedett testhőmérséklet figyelhető meg, de a legtöbb állat lázmentes, és néhány megbetegedett kutya esetében a hőmérséklet határozottan normális alatti. Lásd pl. Carmichael: „Infectious canine enteritis caused by a corona-like vírus” (Corona-jellegű vírus által okozott fertőző kutya enteritis), Laboratory Report, The James A. Baker Institute fór Animál Health, Comell U. 2 (9), (1978).

A leginkább fertőzött kutyák 1 hét— 1Ö nap után gyógyulnak, de azok a kutyák, amelyek gyors tüneti kezelést kapnak, és nyugodt, meleg környezetben vannak tartva, gyakran gyorsabban gyógyulnak [Appel és munkatársai: Comell Vet. 69, 123-133 (1979)]. 3-4 hetes állandó hasmenésről számolnak be bizonyos esetekben, amely ellenáll a kezelésnek [Appel és munkatársai: Canine Prac. 7, 22-36 (1980)]. Együttes szemés orrgennyesedés is előfordul, de kapcsolatuk a primer fertőzéssel nem ismeretes. A morfológiai károsodások a CCV enteritisben a bélben és a bélfodor nyirokcsomókban korlátozottak. A szövettani változások rendkívül hasonlóak ahhoz, amelyet szarvasmarha coronavírussal fertőzött gnotobiotikus borjaknál leírtak. A nem komplikált fertőzés kísérleti kutyákban enyhe, és a patológiai változások vagy nem mutathatók ki, vagy kitágult bélhurkokból állnak, amelyek vizes zöldessárga székletanyaggal vannak kitöltve. A bélfodor nyirokcsomók általában megnagyobbodottak és vérbők, vagy bevérzettek.

Az egyik esetben az inkubálási időtartam kísérletileg fertőzött kutyáknál mintegy 24-36 óra. A kutyák nem mutatnak tipikus klinikai tüneteket vagy a coronavírus gastroenteritisszel társult klasszikus hasmenést A mikroszkópos változások mérsékeltek, a bélbolyhok sorvadásával és a tüszőüreg mélyülésével, a lamina propria cellularitásában történő növekedéssel, a hámsejtek megnyúlásával, és a kehely-sejtek kiürülésével jellemezhetők. Az enyhe tünetek a kísérletileg fertőzött kutyák inokulálásához alkalmazott izolálási eljárás következményei lehetnek, és annak a ténynek, hogy a kutyák mentesek más fontosabb patogénektől és parazitáktól.

A CCV enteritis speciális kezelési módszere nem áll rendelkezésre. A terápia támogató jellegű, megkísérelve pótolni a folyadék- és elektrolit veszteséget, szabályozni a hasmenést és megakadályozni a másodlagos bakteriális fertőzést

A parenterálisan CCV-vel inokulált kutyákban a szérum antitest titer nagyobb, mint az orális fertőzésnek kitett kutyákban. Az orális fertőzés után a kutyák anamnéziás típusú antitest válasszal válaszolnak, és gyorsabb időtartamon belül elveszítik a vírust, mint a fertőzésnek ki nem tett kontroll kutyák. Úgy tűnik, hogy a helyi immunitás, amelyet valószínűleg IgA antitestek közvetítenek a bélben, esszenciális a CCV fertőzés elleni védelemhez, hasonló módon, mint az átvihető gastroenteritisnél sertésekben [Appel és munkatársai: Canine Prac. 7, 22-36 (1980)].

A CCV enteritis feltételezett diagnózisa klinikai jeleken alapszik. Az akut hányás és hasmenés egyéb okainak lehet tekinteni kutyákban az alábbi betegségeket: intoxikáció, bakteriális enteritis, coccidiosis, akut pancreatitis, akut vese- vagy májkárosodás, és más vírus-infekciók. A gyors elterjedés bizonyítása erősen sugallja a CCV enteritist. Számos közlemény van, amely leírja kutya parvovírus elektronmikroszkópos kimutatását CCV részecskékkel együtt kutya székletmintákban [lásd pl. Carmichael, fentebb idézett munka; Evermann és munkatársai: J. Am. Vet Med. Áss. 777, 784-786 (1980); Reseto és munkatársai: Arch. Virol. 66, 89-93 (1980)]. Az egyik beszámoló szerint kimutattak ezenkívül kutya rotavírust is egy székletmintában [McNulty és munkatársai: Vet. Rés. 706, 350-351 (1980]. Ez azt jelzi, hogy a hétköznapi eseteket bizonyos mértékig többszörös vírusfertőzésnek lehet tekinteni.

A CCV székletmintából vagy béltartalomból történő izolálásáról több kutató számolt be, és beszámoltak ennek bizonyos nehézségeiről. Kényes természetük és folyékony celluláris szubsztrátumaik hiánya miatt a coronavínisokat gyakran nem lehet izolálni vagy diagnosztizálni.

A szérum-átalakulást vagy post mortem meghatározást végzetes esetekben, beleértve a fagyasztott bél-21

HU 203 984 Β metszetek immunfluoreszcenciáját, mind lehet alkalmazni a megfelelő etiológiai diagnózishoz.

A coronavímsok nagy (mintegy 100 nm átmérőjű), burokkal ellátott RNS vírusok, amelyek csigavonalú nukleokapsziddal bírnak, jellegzetesen nagy bunkó alakú kiugrásokkal vagy tüskékkel, amelyeket peplomereknek nevezünk. Az RNS egyedi, lineáris szálat tartalmaz pozitív polaritással, durván 5,5 x 10⁶ dalton molekulatömeggel. Az ultravékony szöveti metszetekben elektronmikroszkóppal megfigyelhető, hogy a vírus a citoplazmában levő vakuolumokba becsírázva található.

A vírus antigenicitás szempontjából a Swine Transmissible Gastroenteritis vírussal (átvihető sertésgastroenteritis vírus) rokon.

Acree és munkatársai a 4 567 042 és 4 567 043 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírnak egy inaktivált, illetve egy legyengített coronavírus vakcinát; mindkettő tenyésztett tápközeget tartalmaz.

A találmány tárgya tehát eljárás vakcina előállítására, amely kutyák kutya coronavíiussal (CCV) történő fertőzés által okozott betegséggel szembeni védelmére szolgál, amely vakcina sejttel társult CCV peplomer fehérje hatásos mennyiségeiből áll.

A találmány szerinti eljárás az alábbi lépésekből áll:

a) a vírus replikálására alkalmas sejttenyészet fertőzése legalább 0,2 MOI értékű CCV-vel (MOI: Multiplicity of Infection, a fertőzés sokszorozása);

b) a sejtek tenyésztése 6-18 órán át;

c) az elhasznált tenyészfolyadék elöntése;

d) a sejtek szétzúzása;

e) a szétzúzott sejtekből a sejttel társult peplomer fehérje összegyűjtése; és

f) a sejttel társult peplomer kombinálása parenterálisan elfogadható hordozóval.

A találmány tárgya további eljárás olyan polivalens vakcina előállítására, amely a sejttel társult CCV peplomer hatékony mennyiségét és egy vagy több más patogén organizmus vagy vírus ellen védő hatású antigén komponens hatékony mennyiségét tartalmazza.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcinák kutyák CCV fertőzés által okozott betegség elleni védelmére alkalmazhatók oly módon, hogy parenterálisan az állatoknak adagoljuk a találmány szerinti vakcinát.

A CCV intracellulárisan replikálódik a fertőzés után. A replikációs ciklus folyamán a CCV RNS lefordítódik, hogy különböző szerkezeti és nem szerkezeti fehérjéket alakítson ki, amelyek a vírus replikációban érdekeltek. A kapszid fehérjék, beleértve a peplomer vagy E2 fehérjét, úgy tűnik, a membránhoz kötött poliriboszómákon fordítódnak le a durva endoplazmás retikulumnál. A vírus érési folyamata során a citoplazmás nukleokapszidok belecsíráznak az endoplazmás retikulumba, felvéve a kapszid fehérjéket, hogy érett vírus részecskéket képezzenek, majd külsőleg megnyilvánulnak a Golgi-apparátuson keresztül. A peplomer fehérje hasításon vagy más, transzláció utáni módosításon mehet keresztül a részecske képzést követően. Egyidejűleg bizonyos peplomer fehérjék, úgy tűnik, a sejtmembrán kettős lipid rétegébe beágyazva maradnak a fertőzött sejtbe való kezdeti belépéskor.

Felismertük, hogy a sejttel társult peplomer fehérje, azaz a peplomer fehérje, amely a fertőzött sejtben a részecske-képződés előtt létezik, a kutyákban parenterális beadáskor immunválaszt indukál, amely válasz védő hatású azok ellen a betegségi tünetek ellen, amelyek normálisan társulnak a virulens CCVvel történő fertőzéshez. Ez a felismerés meglepő annak a ténynek a fényében, hogy a teljes vírus, akár legyengített, akár inaktivált, viszonylag gyengén immunprotektív.

A sejttel társult peplomer fehérjét (mintegy 203 000 dalton molekulatömeg) fertőzött sejtek megfelelő tenyésztésével és kinyerésével, szintézissel vagy géntechnikai módszerekkel lehet előállítani.

Abból a célból, hogy a peplomert sejttenyésztéssel állítsuk elő, megfelelő sejttenyészetet vírussal fertőzünk és tenyésztjük. Bármilyen primer vagy folyamatos sejttenyészet, amely képes a vírus replikációjának elősegítésére, vagy amelyben a vírus adaptálható a replikálódáshoz, alkalmazható. Ilyenek például a primer kutyasejtek, pl. a kutya vesesejt és kutya timuszsejt; a kutya sejtvonalak, mint pl. a Madin Darby Canine Kidney sejtvonal és az A-72 fibroblaszt kutya sejtvonal (ATCC CRL 1542); primer macska sejtek/ mint a primer macska vesesejtek; macska sejtvonalak, mint pl. a Crandall Feline Kidney sejtvonal és a Wo-* od’s Feline sejtvonal; és más primer vagy folytonos emlős sejtek, mint pl. a Verő Monkey Kidney sejtvo’nal. *

A vírust a klinikai fertőzésekből ismert technikákkal lehet izolálni. Ilyen technika például egy fertőzött állat székletanyagának a szuszpendálása pl. szövettenyésztő tápkózegben valamely polikation jelenlétében, majd egy primer sejttenyészet inokulálását az ebből kapott felülúszóval [lásd pl. Binn és munkatársai: Proc. 78th Ann. Mtg. U. S. Anim. Health Assoc., Roanoke VA October: 359-366 (1974); Keenan és munkatársai: Am. J. Vet. Rés. 37,247-256 (1976); és Tingpalapong és munkatársai: Am. J. Vet. Rés. 43, 1687-1690 (1982)]. Egy virulens izolátum, az 1-71 törzs, amelyet Binn és munkatársai izoláltak 1971ben, többek között egyike azoknak, amelyek a köz számára rendelkezésre állnak. Ez beszerezhető pl. az American Type Culture Collectiontól (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC VR-809 számon. Egyéb izolátumokról, pl. a K-328ról, S-378-ról, A76-5-ről és az ATCC VR-2068-ról számolnak be Acree és munkatársai a 4 567 042 és 4 567 043 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban.

Abból a célból, hogy a sejttel társult peplomer antigént termeljük és kinyerjük, a sejttenyészetet 0,2-2,0 víms részecske/sejttel fertőzzük, vagyis a fertőzési sokszorozás (MOI) 0,2-2,0 közötti értékkel egyenlő, és a MOI érték előnyösen 0,4 és 1,5 között van. A fertőzött sejteket a fertőzéstől számított 6-18 órán át te3

HU 203 984 Β nyésztjiik, előnyösen 9-16 órán át, legelőnyösebben 9-12 órán át A növesztő tápközeget ezután eltávolítjuk és a peplomert a sejtekből kinyerjük. Ezt előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a használt folyékony tápközeget friss folyékony tápközeggel helyettesítjük, majd a sejteket szétzúzzuk, hogy kibocsássák a sejttel társult peplomert, amely a friss folyékony tápközegben gyűlik össze. A sejttel társult peplomert egyesítjük valamely parenterálisan elfogadható hígítószerrel vagy hordozóval a vakcinakészítményhez. Ezeket a lépéseket kényelmesen kombinálhatjuk a szétzúzás előtt használt folyékony tápközeg helyettesítésével olyan tápközeggel, amely parenterálisan tolerálható.

A szétzúzást végrehajthatjuk pl. mechanikus, ultrahangos vagy kémiai úton, vagy ezek kombinációjával. Ezt kényelmesen elvégezhetjük a sejtek lefagyasztásával mintegy -40 - -70 °C hőmérsékletre. Felengedtetés után a folyadékot, amely a sejttel társult peplomert tartalmazza, összegyűjtjük. Mivel a tápközeget, amelyben a fertőzött sejttenyészet növekszik, eldobjuk, a friss, folyékony közeg lényegében mentes az extracelluláris vírusoktól, amelyek a fertőzött sejttenyészet növekedése során kiválasztódtak.

A folyadékot azonban kezelni kell, hogy inaktiváljuk a maradék extracelluláris és intracelluláris vírusokat és nukleokapszidokát, amely intracelluláris részecskék és nukleokapszidok a szétzúzásra bocsátódnak ki.

Bármilyen standard vírus inaktiválási eljárást lehet alkalmazni, amennyiben a peplomer nem denaturálódik. Ilyen technika például a besugárzás és a kémiai inaktiválás, pl. binér etilén-imin, béta-propiolakton, formaldehid, fenol vagy acetil-etilén-imin hozzáadás. Stabilizálószereket, adjuvánsokat puffereket és/vagy konzerválószereket, amelyek parenterálisan tolerálhatók, szintén adagolhatunk a végső vakcinához. így pl. az előnyös vakcina tartalmaz mertiolátot, pl. 1:60 000 arányban, és etilén maleinsav anhidrid adjuvánst pl. 0,2% mennyiségben.

A találmány szerinti vakcina sejttenyésztéssel történő előállításában fontos, a CCV vakcina készítményekről szóló korábbi beszámolókkal ellentétben, hogy eltávolítsuk a használt folyékony tápközeget a sejtekből az összezúzás előtt. Bár az ok nem világos, a fentebb leírt módon készített, de használt tápközeget alkalmazva friss tápközeg helyett, vakcinák kisebb vírussemlegesítő antitest titereket alakítanak ki, mint a friss tápközeget tartalmazó vakcinák. Az alábbi 1. táblázat mutatja be a használt tápközeget és sejteket alkalmazva készített vakcina vímssemlegesítő antitest literét kutyakölykökben („Folyékony vakcina”) összehasonlítva olyan vakcinával, amely lényegében azonos módon készült azzal a kivétellel, hogy a használt tápközeget dekantáltuk és a találmány szerinti módon új tápközegre cseréltük („Sejtvakcina). A kutyakölyök vírussemlegesítő antitesttiterei azt mutatják, hogy a „Sejtvakcina védő immunológiai választ stimulál (a titer mértani átlaga 32) a második vakcinálás idejére. A vakcinálás utáni mintavétel idejére a válasz 108. mértani átlag titerre emelkedik. Ezzel ellentétben a „Folyékonyvakciná”val vakcináit kutyakölykök negatívak maradnak végig a vizsgált időszakon át. Ez meglepő eredmény, mivel a használt tápközeg tartalmaz CCV vírust, amelytől elvárható lenne, hogy részt vesz az immunvédelemben.

1. táblázat

A „Sejtvakcinák és használt „Folyadékvakcinák” potenciálja kutyakölykökben

Csoport	Kutya száma	Vírussemlegesítő antitest-titer
A második vakcinálás előtt	A második vakcinálás után
	DE-70	32	128
„Sejtvakcina”	DE-74 DE-76	69 16	128 64
	DE-86	32	128
Titer geometriai átlaga	32	108
	DE-78	0	0
.Folyadék-	DE-80	0	0
vakcina”	DE-82	0	0
	DE-84	0	0
Titer geometriai átlaga	-	-

Azokban a kísérletekben, amelyeket annak bemutatására szántunk, hogy a fertőzés utáni eltelt idő milyen fontos a sejttel társult peplomer antigén termelése szempontjából, a fehérje mennyiségét, amely sejttel társult, és azt a mennyiséget, amely a sejttenyésztő közegben van, és ezért vínissal társult, óránként meghatároztuk enzimmel kapcsolt immun-vizsgálat (ELISA) segítségével. Az antigén relatív mennyiségeit a 2. táblázatban mutatjuk be. Bár nem szándékozunk kötődni egy adott mechanizmushoz vagy magyarázathoz, úgy tűnik, hogy az idő hossza, amelyen át a sejteket tenyésztjük, fontos a változások miatt, amelyek a peplomerrel történnek később, a fertőzési ciklusban.

2. táblázat

Órák a fertőzés után	Peplomer fehérje
Sejttel társult	Vírussal társult
11	4830	475
12	3895	556
13	5946	748
14	7282	1454
15	4423	2044

A sejttel társult peplomer antigénről úgy találtuk, hogy a MOI értéktől is függ. A 3. táblázat adatokat mutat be olyan kísérletsorozatból, amelyben a MOI értéke 0,01 és 1,1 közti tartományban van. Az összes tenyészeteket 12 órával a fertőzés után nyertük ki, és az antigén mennyiségét ELISAval határoztuk meg.

HU 203 984 Β

3. táblázat

MOI	Peplomer fehérje
Sejttel társult	Vírussal társult
0,01	1221	0
0,04	2911	13
0,1	3805	93
0,4	7877	207
1,1	8927	646

A sejttel társult peplomer antigént másféle módszerekkel is előállíthatjuk. így pl. a peplomert lehet pl. immunaffinitás adszorpciós kromatográfiával tisztítani, szekvenciaelemzés után elő lehet állítani peptidszintézissel, vagy elő lehet állítani a peptid-szekvenciából származó DNS kódoló szekvencia kifejezésével valamely iekombináns gazda mikroorganizmusban vagy sejtben. Ezenkívül a peplomemek azokat a származékait, amelyek megőrzik a sejt-eredetű antigén immttnprotektív tulajdonságait, elő lehet állítani standard rekombináns DNS technikával, fehéqe-technikával vagy kémiai technikákkal.

Bárhogyan is állítjuk elő, a vakcinát parenterálisan, pl. intramuszkulárisan vagy szubkután adjuk be a kutyáknak, előnyösen legalább 3 hónapos korukban. Előnyösen beadunk egy második dózist is 2-4 héttel az első beadás után. Az évenkénti újravakcinálás ajánlatos. Ha fiatalabb kutyákat vakcinálunk, ezeket előnyösen 3 hónapos korukban újra vakcináljuk. A vemhes nőstények vakcinálását valószínűleg legjobb elkerülni.

Az egyes vakcinadózisok a sejttel társult peplomer hatásos mennyiségét tartalmazzák, azaz azt a mennyiséget, amely hatásos parenterális kétszeres vakcinálások után kutyák védelmében CCV fertőzés által okozott súlyos betegség-tünetek ellen, pl. gastroenteritis ellen. A fentebb leírt eljárást követően, amelyben az antigént sejttenyészet fertőzésével állítják elő, olyan folyadékot kapunk, amely tartalmazza ezt a hatásos mennyiséget Az ilyen folyadékot tipikusan hígítani lehet akár 1/10 arányban is, és ez még hatásos mennyiséget tartalmaz. Az egyes vakcinadózisok teljes térfogata tipikusan 0,5 és 2 ml, előnyösen 1-1,5 ml között van.

A találmány szerinti vakcinát lehet kombinálni más vakcináié szerekkel polivalens vakcinákban, pl. más inaktivált (elpusztított) vagy legyengített kutyavírussal kombinálva. Az ilyen más vakcinakomponensek előnyösen valamely bélbetegséget okozó víms, pl. rotavírus vagy parvovírus, vagy ezekből számlázó más immunprotektív antigén. Több ilyen inaktivált és legyengített vímsvakcina és antigén ismeretes. Előnyös polivalens vakcina egy olyan bivalens vakcina, amely a jelen találmány szerinti vakcina és egy módosított élő vagy elölt parvovírus vakcina kombinációja. Az ilyen vakcina a jelen találmány szerinti sejttel társult peplomer és a módosított élő vagy elölt parvovírus vakcinához elegendő mennyiségét (pl. 6,3 logi₀TCID_J0 adagonként) tartalmazza. (TCID: szövettenyészet fertőző dózis. TCID₅₀: az a vírusmennyiség, amennyi a szövettenyészet sejtjei 50%-ának a fertőzéséhez szükséges.) A teljes dózistérfogat 0,5-2 ml, előnyösen 1-1,5 ml. Carmichael és munkatársai (4 303 645 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) ismertetnek egy módosított éló kutya parvovírus vakcinát, beleértve a vakcináié törzsek és hatásos dózisaik előállítását, amelyet lehet kombinálni a jelen találmány szerinti vakcinával, hogy találmány szerinti bivalens vakcinát készítsünk.

Az ez után következő példák a találmány szerinti eljárás bemutatását szolgálják, és nem korlátozó jellegűek.

1. példa.

Vakcina készítése

Kutya coronavínis NL-18 törzset izolálunk olyan kutyák csoportjának székletmintájából, amelyek akut gastroenteritisben szenvednek. A kezdeti izolálás primer kutya-vesesejteken 50 pg dietil-amino-etil (DEAE) dextránt igényel a fenntartó tápközeg 1 ml-ére [alap tápközeg: Eagle (BME) Earle-sókkal (Grand Island Biological Co., Grand Island, New York)]. A további passzázsokhoz DEAE dextrán nem szükséges. A vímst 4 passzálással adaptáljuk a primer kutya-vesesejtben, és további 36 passzálással macska vesesejt-vonalban, amelyet a 73d-93d passzálási szintnél alkalmazunk. Gill [„Isolation and Characterisation of a Coronavims”, doktori disszertáció (University of Nebraska, 1982. augusztus)] leírja a CCV NL-18 törzs izolálását, ezt a törzset korábban CCV-18 törzsnek nevezték.

Gördülő palack tenyészetek vírussal való inokulálásához a macska vesesejtvonal tömör egy-rétegéről (monolayer) a tápközeget dekantáljuk. A tápközeget a fenntartó tápközeggel helyettesítjük, amely 4-8% Polybrene-vel (Sigma Chemical Co., SL Louís, Missouri) van kiegészítve; ez 2-10% vímst tartalmaz, amely viszont legalább 107,0 TCID₅₀/ml hígítatlan víms-titert (0,2-1,0 MOI) tartalmaz. Az inokulált tenyészeteket 9-16 órán át inkubáljuk 35-37 °C hőmérsékleten. A fertőzés tipikus citopatikus hatással (CPE) érvényesül a sejt egy-rétegen, nevezetesen legömbölyített sejtek foltjaival.

Az inkubálás után és mikroszkopikus vizsgálat után, hogy a CPE-t igazoljuk, a fenntartó tápközeget dekantáljuk és eldobjuk. 100 ml térfogatú Hals tápközeget adunk minden egyes 500 ml-es gördülő palackhoz. A Hals tápközeg Eagle alap-tápközeg (BME) Hank-féle sókkal (Grand Island Biological Co., Grand Island, New York), amely 0,5% laktalbumin hidrolizátummal (Humko Sheffield, Memphis, Tennessee) van kiegészítve. A tenyészeteket azután -50 °C hőmérsékleten fagyasztjuk 6 órán át. Felengedtetés után binér etilénimin (BEI) oldatot adunk hozzá 1% (térfogat/térfogat) végső koncentrációban, hogy inaktiváljuk a megmaradó vínisrészecskéket. A BEI oldatot úgy készítjük el, hogy 2,05 g 2-bróm-etil-amint és 0,8 g nátrium-hidroxidot adunk 100 ml vízhez. Az inaktiválást 35-37 °C hőmérsékleten végezzük, 35°-37 °C hőmérsékletet tartva fenn állandó ke verte réssel 2 napos inkubálással. Az inaktiválást úgy fejezzük be, hogy hideg (4 °C)

HU 203 984 Β nátrium-tioszulfát oldatot adunk hozzá 0,25% (tömeg/térfogat) végső koncentrációig. Tartósítószerként mertiolátot adunk hozzá 1:10 000 végső koncentrációban. A végső vakcinát úgy állítjuk elő, hogy a sejttenyésztő folyadékot összekeverjük fenntartó tápközeggel, majd adjuvánsként etilén-malein-sav-anhidridet adunk hozzá 0,2% végső koncentrációban. A vakcina tipikusan 20% sejttenyésztő folyadékot, 60% fenntartó tápközeget és 20% adjuváns oldatot tartalmaz, térfogat szerint számolva. Az adjuváns oldatot úgy készítjük, hogy etilén-maleinsav anhidrid (EMA) 91, Mon santa, St. Louis, Missouri) törzsoldatát hidráljuk 10 n nátrium-hidroxid hozzáadásával. Az EMA törzsoldat az alábbiakat tartalmazza:

Vegyes anyag gramm! liter

NaQ 0,5

KH₂PO₄ 0,565

Na₂HPO₄ 0,135

EMA 91 10,0 fenol-vörös 0,135

2. példa

A vakcina által biztosított védelem tanulmányozása

Primer kutya vesesejtekben negyedik passzálási szintnél levő CCV-71-et átviszünk A-72 sejtvonalra (ATCC CRL 1542), megfelelő térfogatokra osztjuk, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A vínist virulens fertőző vírusnak nevezzük, és úgy standardizáljuk, hogy 10⁵·³ TCID₅₀-et tartalmazzon milliliterenként (a CCV71 azonos az ATCC VR-809-cel).

Az A-72 sejtvonalat az ATCC-től szerezzük be a 33. passzálási szintnél (ATCC CRL 1542). Ezen a passzálási szinten az A-72 sejtek nem érzékenyek a CCV fertőzésre. A sejtvonalat sorozatban szaporítjuk 100 egymást követő passzálással, és a 139—140. passzálási szintnél alkalmazzuk a CCV szaporításhoz és tisztításhoz. Ezen a passzálási szinten az A-72 sejtvonal nagyon fogékony a CCV rögzítésére és replikálására.

Fiatal, egészséges kutyakölyköket (8-14 hetesek), amelyeknek nincs ELISA titere CCV-re, alkalmazunk a kísérletekben. Ezeket elkülönítő berendezésekben helyezzük el a kísérleti vizsgálatok időtartama alatt.

Összesen 20 kutyakölyöknek adunk szubkután két 1 ml-es adag vakcinák amelyet lényegében úgy készítünk, ahogyan ezt az 1. példában leírtuk; a két adag közt 21 nap van. Öt kutyakölyköt nem vakcinálunk, ezek a fertőzési kontrollok. A 20 vakcináit állatból és az 5 kontroliból vért veszünk a vakcinálás időpontjában. Majd vért veszünk a vakcinálás utáni 21. napon (abban az időpontban, amikor a vakcináit állatokat újra vakcináljuk), a második vakcinálás utáni 14. napon (amikor a kutyakölyköket provokáljuk és a provokálás (fertőzés) utáni 14. napon.

A vakcináit állatoknak és a kontrolioknak nem adunk enni a provokálás előtt 18-24 órával. A provokálást 5 ml virulens, fertőző víms szájon át végzett inokulálásával (10⁵·³ TCID₅₀/ml) végezzük. 18-24 órával a provokálás után a fertőzött kutyakölyköket visszaállítjuk a normális étrendre.

A pro vokálist követően a kutyakölyköket 14 napon át megfigyeljük a betegség vagy reakció jeleire. A megfigyelési időszak során a hőmérsékletet mérjük és vérmintákat gyűjtünk fehérvérsejt számláláshoz. Székletmintákat gyűjtünk naponta 21 napon át a CCV elleni bélsár-antitest (bél IgA antitest) meghatározásához.

Az egyes vakcinálásokat követően az összes kutya jól van és normális marad. A 4. táblázat mutatja be a kulyakölykök víruscentralizációs (VN) antitest titerét a vakcinálás előtt, második vakcinálás előtt és provokálás előtt. Az összes kulyakölyök VN szeronegatív az első vakcinálás idejében, és negatív marad, amikor a második adagot adagoljuk. A fertőzés időpontjában (két héttel a második vakcinálás után) a VN liter a 0-16 közti tartományban van, a titer mértani átlaga 5. Az 5. táblázat mutatja be a kutyák és a vérvételek adatait ugyanúgy, mint a 4. táblázatban, de ELISA-t alkalmazva az antitest-titerek meghatározásához. Akutyakölykök szeronegatívak az első vakcinálás időpontjában, és ezek közül csupán 7 mutat antitest-választ a második vakcinálás időpontjában. A provokálás időpontjában az összes kulyakölyök jó ELISA antitest ti tért mutat.

nappal a provokálás után a provokált kontroll kutyakölykök ELISA antitest titerének mértani átlaga 3880, míg a vakcináit állatok ELISA antitest titerének mértani átlaga >19 106 (5. táblázat). A vakcináit állatok magas Immorális antitest titere a vakcinálásnak és a provokálást követő jó másodlagos válasznak tulajdonítható, és ez a védelemre utal.

A provokálást követően néhány vakcináit állat rövid vagy átmeneti tüneteket mutat az étvágytalanságtól a hányásig. A provokálást kontrollállatok az étvágytalanság jeleit csak a provokálás után mutatják. Ezek a tünetek általában a provokálás után 6-10. napon figyelhetők meg. A provokálási kontroll kutyakölykök több klinikai tünetet mutatnak, mint a vakcináit csoport.

A fehérvérsejtszámot a provokálástól számítva naponta figyeljük a betegség értékeléséhez. Szignifikáns leukopéniát nem figyelünk meg sem a vakcináit, sem a provokálási kontroll kutyakölykökben. Enyhe leukocitózis figyelhető meg a provokálási kontroll kutyakölykökben a 9. naptól kezdődően, és ez folytatódik a 13. napig.

táblázat

Mintaoltás immunogenecitási vizsgálat Vírussemlegesítő antitest titerek (VN titerek)

Kutya száma	Vírussemlegesítő antitest titerek
Vakcinái- tok	Vakcinálás előtt	2. vakcinálás előtt	Provokálás előtt	Provokálás után
DE-88	0'	0	4	256
DE-89	0	0	16	1024
DE-90	0	0	2	256
DE-91	0	0	8	512
DE-94	0	0	8	1024

HU 203 984 Β

Kutya száma	Vírussemlegesítő antitest titerek
Vakcinál- tak	Vakcinálás előtt	2. vakcinálás előtt	Provokálás előtt	Provokálás után
DE-95	0	0	8	1024
DE-96	0	0	8	1024
DE-97	0	0	2	128
DE-98	0	0	2	256
DE-99	0	0	2	256
F-125	0	0	0	64
F-126	0	0	0	128
F-127	0	0	4	64
F-128	0	0	2	128
F-129	0	0	4	512
F-130	0	0	8	2048
F-131	0	0	2	1024
F-132	0	0	0	512
F-133	0	0	8	512
F-134	0	0	16	2048
Mértani átlag	0	0	5	402
Kontrollok
DF-53	ND²	ND	0	64
DF-54	ND	ND	0	128
DF-55	ND	ND	0	128
DF-56	ND	ND	0	518
DF-57	ND	ND	0	64
Mértani átlag	-	-	0	128

¹ Az antitest titert úgy fejezzük ki, mint annak a legnagyobb szérumhígításnak a reciprokát, amely teljes semlegesítést mutat ² ND - nem határoztuk meg

5. táblázat

Mintaoltás immunogenecitási vizsgálat ELISA semlegesítő antitesttiterek

Kutya száma	ELISA semlegesítő antitesttiterek
Vakcinál- tak	Vakcinálás előtt	2. vakcinálás előtt	Provokálás előtt	Provokálás után
DE-88	0'	0	640	>20 480
DE-89	0	80	10240	>20 480
DE-90	0	40	5120	>20 480
DE-91	0	10	640	20 480
DE-94	0	0	320	>20 480
DE-95	0	0	640	20 480
DE-96	0	0	640	>20 480
DE-97	0	0	640	10240

Kutya száma	ELISA semlegesítő antitesttiterek
Vakcinál- tak	Vakcinálás előtt	2. vakcinálás előtt	Provokálás előtt	Provokálás után
DE-98	0	0	1280	>20 480
DE-99	0	0	320	20 480
F-125	0	0	1280	>20 480
F-126	0	20	640	>20 480
F-127	0	10	160	>20 480
F-128	0	0	640	10240
F-129	0	0	320	>20 480
F-130	0	10	1280	>20 480
F-131	0	20	160	>20 480
F-132	0	0	80	>20 480
F-133	0	0	1280	>20 480
F-134	0	20	1280	>20 480
Mértani átlag	0	3	715	>19 106
Kontrollok
DF-53	ND²	ND	0	J5560
DF-54	ND	ND	0	Ii2o ;
DF-55	ND	ND	0	2560
DF-56	ND	ND	0	5120
DF-57	ND	ND	0	5120 ‘
Mértani átlag	-	-	0	3880 ’

-?r¹ Az antitest titert úgy fejezzük ki, mint annak a szérum-hígításnak reciprokát, ahol a különbség a 410 nm-nél mért adszorbanciában a coronavírust tartalmazó mikrotitráló lemez üregek és a sejtkontrollt tartalmazó üregek között >0,05.

²i\D -nem határoztuk meg

A fertőzés utáni hőmérséklet-választ szintén követjük, mint a klinikai CCV betegség paraméterét. A fertőzés után hőmérsékletválasz egyaránt előfordul mind a vakcináit, mind a kontroll állatokban. A viszonylagos növekedés a hőmérsékletben nagyobb a kontrollokban, mint a vakcináit állatokban. A növekedés a hőmérsékletben nem elég ahhoz, hogy gondot okozzon. A hőmérséklet-profil a kontroll kutyakölykökben, úgy tűnik, kétfázisú, egy másodlagos hőmérsékleti válasszal, amely a provokálás utáni 10. napon lép fel. A kétfázisú hőmérséklet-profilt azelőtt is észlelték virulens CCVvel fertőzött kutyakölyköknél. Ilyen kétfázisú hőmérsékleti választ nem jegyeztünk fel a kontroloknál.

ELISA módszert fejlesztünk ki, hogy közvetlenül mérjük a vakcináit kutyakölykök béltraktusában nyújtott védelmet a béltraktus fertőzése ellen virulens CCV-vel. A 6. táblázat mutatja be a provokálás után naponként végzett anti-CCV IgA meghatározásokat. A táblázatban található értékek vakcináit és nem-vakcináit állatok provokálás utáni relatív anti-CCV IgA értékét mutatják. Az anti-CCV IgA az alapvonal szintjénél vagy ahhoz közel marad.

HU 203 984 Β

A szignifikáns növekedés a vakcináit állatok antiCCV IgA-jában, amely a provokálás utáni 7. napon kezdődik, a bél nyálka felületek adjuvált, inaktivált CCV vakcinával történő parenterális feltöltésének tulajdonítható. Az orális provokálás stimulálja a nyálka IgA memória választ, jelentős anti-CCV IgA választ váltva ki a béltraktusban. Ez a nagy IgA válasz elegendő a védelemhez a fertőzés ellen. Kicsiny anti-CCV IgA válasz észlelhető vagy nem észlelhető válasz a provokált kontroliokban, demonstrálva a feltöltött memóriasejtek hiányát és a védelem hiányát

Ez a példa azt bizonyítja, hogy a sejthez társult CCV peplomert tartalmazó vakcina védő hatású a CCV-vel történő fertőzés által okozott betegség ellen.

6. táblázat

Mintaoltás immunogenecitási vizsgálat Széklet anti-CCV immunglobulin A.

Kutya- kölykök jele	Napok a fertőzés után
0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
DE-88	,04	,03	,04	,05	,01	,00	,01	,01	,00	,27	,38	,43	,36	,56	,43	,43	,33	,29	,25	,26	,33	,41
DE-89	,01	,09	,02	,06	,00	,04	,02	,07	,29	,26	,52	,81	,56	1,09	,78	,77	,69	,66	,70	,43	,65	22
DE-90	,02	,02	,01	,02	,00	,04	,06	,03	,06	,09	,18	22	,24	,29	,28	,32	,34	,12	,28	,18	,18	,21
DE-91	,04	,04	,01	,01	,00	,00	,04	,06	,14	,16	,12	,18	,20	,11	,12	,15	,18	,20	,11	,17	,15	.17
DE-94	,01	,10	,14	,02	,00	,03	,01	,06	,07	,06	,14	,14	,18	,21	,10	,10	,21	,28	,17	,17	,15	,17
DE-95	,01	,00	,01	,01	,03	,01	,01	,02	,05	,04	,06	22	,20	,19	,22	,17	,14	,19	,16	,13	,10	,17
DE-96	,03	,00	,01	,02	,10	,09	,09	,01	,12	,15	,21	,14	,15	,21	,14	,15	,20	,26	,23	,19	,18	,05
DE-97	,00	,07	,00	,04	,05	,02	,02	,02	,08	,06	,14	,14	,18	,12	,13	,37	,22	,15	,21	,25	,14	24
DE-98	,02	,03	,00	,00	,01	,00	,02	,03	,08	,07	,05	,04	,03	,16	,18	,28	,23	,11	,14	,08	,07	,09
DE-99	,00	,00	,02	,01	,08	,04	,03	,08	,11	,13	,14	,16	,08	,08	,12	,13	.12	,10	,13	,14	,03	,10
F-125	,03	,13	,00	,02	,01	,00	,00	,02	,14	,19	,22	,32	,37	,49	,51	,47	,49	,39	,39	,34	,37	,29
F-126	,06	,00	,00	,00	,04	,01	,02	,02	,10	,21	,26	,26	,48	,37	,45	,27	,24	,27	,20	,20	,13	,20
F-127	,06	,00	,00	,02	.07	,06	,00	,03	,20	,23	,40	,33	,34	,30	,34	,48	,43	,43	,29	,29	22	29
F-128	,00	,00	,00	,01	,02	,02	,05	,00	,00	,03	,12	,15	,17	,33	,32	,30	,18	,37	,19	,18	,18	22
F-129	,05	,02	,00	,00	,01	,00	,01	,15	,17	,22	,25	,21	,29	,52	,48	1,07	,77	,54	,44	,39	,13	,28
F-130	,17	,09	,04	,05	,06	,09	,03	,06	,15	,48	,38	,50	,76	,34	,28	,35	,30	,11	,24	,23	,17	,04
F-131	,12	,00	,02	,05	,05	,00	,00	,04	,17	,18	,32	,31	,29	,43	,30	,28	,36	,29	,25	,30	,28	,14
F-132	,01	,06	,02	,03	,00	,04	,05	,05	,05	,11	,15	,17	,21	,32	,17	,19	,25	,07	,25	,17	,32	,47
F-133	,20	,00	,05	,04	,03	,03	,02	,03	,04	,11	,43	,43	,45	,71	,29	,61	,61	.41	,23	.12	39	,40
F-134	,07	,00	,01	,02	,08	,05	,04	,05	,17	,20	,27	,39	,29	,26	,29	,29	,12	,16	,19	,25	,21	2i
Átlag	,05	,05	,03	,02	,03	,03	,03	,04	,11	,16	,24	,28	,27	,35	,30	,37	,32	,27	,25	,22	,22	,25
Kontrollok
DF-53	,044	,06	,02	,03	,06	,03	.02	,03	,02	,01	,02	,05	,05	,02	,03	,13	,03	,07	,06	,07	,06	,04
DF-54	,03	,07	,03	,02	,02	,02	,01	,03	,01	,02	,04	,03	,04	,02	,03	,13	,05	,07	,06	,07	,06	,04
DF-55	,02	,00	,04	,01	,01	,01	,05	,04	,00	,01	,01	,01	,05	,01	,01	,04	,00	,01	,01	,11	,04	,20
DF-56	,02	,00	,00	,01	,04	,03	,03	,03	,01	,02	,03	,09	,01	,00	,02	,03	,09	,03	,12	,15	,09	,04
DF-57	,02	,03	,04	,02	,01	.01	,00	,04	,04	,00	,01	,01	,01	,03	02	,08	,04	,10	,07	,08	,02	,17
Átlag	,03	,03	,03	,02	,03	,02	,02	,03	,02	,01	,02	,04	,03	,02	,02	,06	,04	,04	,05	,08	,05	,10

Megjegyzés: a vessző után megadott értékek a nulla egész utáni tizedes értékeket jelentik,

3. példa

Kombinációs vakcina

A jelen találmány szerinti CCV vakcinát és egy módosított, élő kutya parvovínis vakcinát (CPV) (6,3 1°8ioTCID_5o adagonként) adunk 6 darab, 9-12 hetes kutyakölyöknek.

héttel a vakcinálás után a kutyaköíykök ELISA antitest üterének mértani átlaga 113 a CCV frakcióra és VN titerének mértani átlaga 912 a CPV komponensre. Ebben az időpontban a kutyaköíykök kapnak egy második adagot a kombinációs termékből. Két héttel a második vakcinálás után a CCV ELISA antitest titer mértani átlaga 3260 és a CPV VN titer mértani átlaga 1448.

HU 203 984 Β

A 6 fogékony kutyakölyök második csoportját vakcinájuk monovalens, módosított, éló CPV vakcinával (6,3 log₁₀TCID_J0). A CPV-t sejt-passzálással módosítjuk. 3 héttel a vakcinálás után a kulyakölykök VN antitest titerének mértani átlaga CPV-re 1448. Ebben az 5 időpontban a kutyakölykök CPV vakcina második adagját kapják meg. Két héttel a második vakcinálás után a CPV VN titer mértani átlaga 2896. A különböző vér-mintavételekből kapott szérumokat CCV titene vizsgáljuk, és negatívnak találjuk ennek a vizsgálatnak 10 a folyamán.

Egy kutyakölyök kivételével az összes kutyakölyök jö választ ad CPV-re. Annak az egy kutyakölyöknek a kivételével mind azonos választ mutatnak CPV-re, akár CPV-vel van kombinálva, akár monovalens termékként 15 van jelen.

Ez a példa azt demonstrálja, hogy a találmány szerinti CCV vakcinát lehet kombináltan alkalmazni más vakcina komponensekkel, főleg kutya parvovírus vakcina komponenssel. 20

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás kutya coronavínis által okozott fertőzések elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a vírus replikációjára alkalmas sejttenyészetet fertőzünk legalább 0,2 fertőzési sokszorozási értékű (MOI értékű) kutya coronavírussal,

b) a sejteket 6-18 órán át tenyésztjük,

c) a használt folyékony tápközeget eltávolítjuk,

d) a sejteket szétzúzzuk,

e) a sejthez társult pepiomer fehérjét a szétzúzott sejtekből összegyűjtjük, és

f) a sejttel társult peplomert parenterálisan elfogadható hordozóval és adott esetben adjuvánssal összekeverve vakcinává alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek szétzúzását parenterálisan elfogadható folyadékban végezzük.
3. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttel társult peplomert tartalmazó hordozót adjuvánssal kévéjük össze.
4. Eljárás kombinációs vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított, kutya coronavínis elleni és egy parvovírus elleni vakcinát kombinálunk.