CN108350437B - 高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法 - Google Patents

高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供细小病毒的感染滴度为109TCID50/mL以上且前述细小病毒的感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比大于5000：1，来源于非浓缩的细胞培养上清的细小病毒及这样的高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法。

Description

高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法
技术领域
本发明涉及在培养上清中产生高感染滴度且高纯度的细小病毒的方法和利用该方法得到的高感染滴度且高纯度的细小病毒。
背景技术
病毒感染包括人在内的众多动植物、微生物并扩增。某些病毒是具有DNA作为基因组的DNA病毒，另外某些病毒是具有RNA作为基因组的RNA病毒，各病毒分别具有不同的增殖机理。人等动物感染时，引起病毒传染病的病毒也很多。病毒不能单独增加，却能感染其它动物/植物/微生物的细胞，利用该细胞的能力而增加。将病毒能够感染并增殖的细胞称为该病毒的“宿主细胞”。病毒能够感染/增殖的宿主细胞的种类根据病毒的种类而决定。
细小病毒为小型的单链DNA病毒，为直径小至约20nm的正20面体病毒，且不具有被膜(非专利文献1)。细小病毒感染动物而引起疾病。作为该疾病，已知有：B19细小病毒对人引起的传染性红斑、贫血、关节炎，除此之外还有由猴细小病毒(SPV)导致的贫血、由猫细小病毒(FPV)导致的猫的肠炎/白血球减少/失调症、由狗细小病毒(CPV)导致的狗的肠炎/心肌炎、由猪细小病毒(PPV)导致猪的死胎、由牛细小病毒(BPV)导致的牛的肠炎、由鹅细小病毒(GPV)导致的鹅的肠炎/心肌炎、由小鼠微小病毒(MVM)导致的小鼠的肠炎/肝炎等(非专利文献2、非专利文献3)。细小病毒作为引起狗、猫这样的人类饲养的动物的疾病的原因的病原体，是重要的。已知，如果狗感染狗细小病毒，则如前述那样引起肠炎，产生激烈的痢疾、呕吐，甚至死亡(非专利文献3)。如果猫感染细小病毒，则有时会引起急性肠炎、白血球减少，在二次感染时也会有死亡的可能性；另外，如果胎儿、新生儿感染，则中枢神经、胸腺受到损害，引起运动失调，有时也会死亡。
为了防止细小病毒传染病而进行了有关细小病毒的疫苗的研究(专利文献1、专利文献2)。这些研究中，需要生产病毒来使用。多数病毒可以通过培养宿主细胞，使其感染病毒而增殖，从而进行生产。使病毒弱毒化或灭活的疫苗生产也可按照与病毒生产同样的步骤而实现。
在制药行业中，为了保证基因重组药品(生物药品)、抗体药品等来源于生物的药品不被病毒污染(病毒安全性)，而需要对于制造工序的病毒清除(去除性能)进行评价。因此，通过向各工序前的药品中间产品中添加病毒并且对工序前后的病毒量进行定量，从而能够对各个工序所具有的病毒清除进行测定。特别是，用针对生物制剂的制造工序的病毒清除评价中所使用的病毒种类的选择方法而规定的ICH(International Conference onHarmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticalsfor Human Use：日美EU医药品法规协调国际会议)指导方针所记载的方法实施的血浆分级制剂的病毒清除评价中，细小病毒的一种猪细小病毒(PPV：Porcine Parvovirus)被频繁使用，生物药品的病毒清除评价中，细小病毒的一种小鼠微小病毒(MVM：Minute virus ofmice)被频繁使用。由此，在生物制剂的制造工序的病毒清除评价中频繁使用了细小病毒。
为了生产病毒，有如下方法：使用实验动物的方法、使用鸡蛋的方法、使用组织培养/培养细胞的方法(非专利文献4)。使用实验动物、鸡蛋的方法存在成本高的缺点。代替其的方法有使用培养细胞的方法。细小病毒的生产也通过使用培养细胞的方法进行(专利文献1)。
为了生产细小病毒等病毒，通常进行使宿主细胞的培养体系感染种病毒，使病毒增殖并进行回收的方法。此处所说的种病毒是指将病毒增殖初始所使用的少量的病毒视为“种”的称呼。现有的病毒生产中，使宿主细胞感染种病毒的时机通常是宿主细胞达到汇合(confluent)且形成为单层状态的阶段(非专利文献4、专利文献3～6)。即，通常将宿主细胞接种在培养容器，使之增殖，在宿主细胞增殖并铺展在培养容器的整个底面的状态下接种种病毒，这是因为能够感染的细胞高密度地存在的状况是提供生产更多病毒的场所的体系。从将宿主细胞接种在培养容器至其到达该汇合的状态为止，通常需要2～3天(非专利文献4)。该汇合状态下，宿主细胞为稳定期，不再增殖。因此，现有技术在完成宿主细胞的增殖培养工序之后，在不再发生细胞增殖的培养环境下开始病毒感染，与宿主细胞由于病毒感染而死亡同时进行从而在培养上清中生产病毒。这样的方法对于细小病毒也不例外，通过使汇合状态的细胞感染的方法进行病毒生产(非专利文献5、非专利文献6)，得到的细小病毒的感染滴度为105～107TCID50/mL。在现有的培养体系中，在细胞数最多的状态即汇合的状态下向宿主细胞中添加细小病毒，添加的细小病毒在宿主细胞内增殖并伴随宿主细胞的死亡而增加。通过在细小病毒感染滴度变得最高的时期对培养上清进行回收，从而能够对最高感染滴度的细小病毒溶液进行回收。对于用该方法在培养上清中得到的细小病毒，当然以悬浮在供于细胞培养的培养基中的状态被回收。
另外，对于如上述那样得到的细小病毒溶液，也进行去除杂质。作为去除方法，通过低速离心分离从而去除细胞的碎片等杂质而进行(非专利文献7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2007/125605号公报
专利文献2：日本特表平10-508485号公报
专利文献3：日本特开2009-297036号公报
专利文献4：日本特许第2655876号公报
专利文献5：日本特开昭58-22008号公报
专利文献6：日本特开昭61-24370号公报
非专利文献
非专利文献1：病毒·细菌感染新文件1997永井美之·渡边治雄编、羊土社：p.68(ウイルス·細菌感染newファイル1997永井美之·渡邊治雄編、羊土社：p.68)
非专利文献2：病毒学1997畑中正一编、朝仓书店：222-223(ウイルス学1997畑中正一編、朝倉書店：222-223)
非专利文献3：M.Azetaka et.al 1980Jpn.J.Vet.Sci.43:243-255
非专利文献4：病毒实验学总论国立预防卫生研究所学友会编1973：61、113、131和166-176(ウイルス実験学総論国立予防衛生研究所学友会編1973：61、113、131和166-176)
非专利文献5：P.A.Bachmann 1972Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(140)4:1369-1374
非专利文献6：P.A.Bachmann et al.1976Zbl.Vet.Med.B.No.23:355-363
非专利文献7：病毒实验学各论1973国立预防卫生研究所学友会·编22-23(ウイルス実験学各論1973国立予防衛生研究所学友会·編22-23)
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，为了用于来源于生物的药品的病毒安全性评价、疫苗生产，而期望生产出高感染滴度的细小病毒。
另外，如上所述的生物制剂的制造工序的病毒清除评价中，也希望生产高感染滴度的病毒。用于该评价的病毒去除滤器的病毒清除试验通过将实际生产工序按比例缩小的模型工序来实施，但是对于该病毒清除试验所要求的点有：第一，是不产生滤器堵塞程度的病毒悬浮液添加量；第二，是表现出评价工序的病毒清除数值即对数去除率(LRV)为4以上的添加量。对于前者，由于包括工序的流速的各参数必需与实际生产工序相同(WHOTechnical Report,Series No.924,2004 162-165)，所以必须设为不会因病毒添加导致堵塞的添加量。因此，期望以体积比计为1％以下、优选为0.1％以下进行添加。对于后者的LRV，其为4以上的工序被视为是关于病毒去除具有耐久性、有效且具有可靠性的工序(ARobust,effective and reliable process step)(WHO Technical Report,SeriesNo.924,2004 163-164)，因此需要设定为能够表现出4以上作为结果的病毒添加量。这样，作为病毒去除性能需要表现出LRV为4以上，另外，期望向中间产品中添加的病毒悬浮液的量以体积比计为1％以下，优选为0.1％。然而，添加1％或0.1％用现有的培养法得到的低感染滴度的细小病毒(感染滴度为105～107TCID50/mL，细小病毒的感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比小于10：1)时，由于预滤器的损失、定量误差的问题，LRV难以表现出4以上。此时，为了切实地表现出LRV为4以上，不得不增加病毒添加体积，这样一来则存在容易发生滤器的堵塞等障碍的问题。
另外，作为病毒去除膜的新的评价基准，近些年与以往相比增加每单位膜面积的病毒负荷量时的病毒去除性受到注目。该评价中，过滤比以往的测定更多的病毒溶液，因此随着添加的病毒悬浮液的增加，病毒悬浮液中所含的杂质蛋白质也一起被较多地过滤出来，发生滤器堵塞等障碍的可能性比以往测定还高。因此，期望病毒溶液中所含的杂质蛋白质浓度更低。
以往，为了解决这样的问题，可以使用通过利用超离心分离使病毒沉淀等的操作进行浓缩的方法。然而，这些方法中，杂质也同时被浓缩，因此存在杂质对于实验的结果、病毒去除滤器过滤时带来的不良影响的问题。
进而，利用铯密度梯度超离心分离方法、蔗糖密度梯度超离心分离等超离心分离对病毒进行浓缩的技术，操作极其复杂且要求较难的熟练技术。而且，常用的超离心分离机的离心管的体积成为速度限制，使扩大规模变得困难，所以通常只能进行小规模的实验，产业上引入这些浓缩工序是不现实的。
另外，为了得到高感染滴度的病毒悬浮液，还已知有如下方法：回收感染细胞并重复冷冻融解，强制地/物理地破坏细胞，从而将细胞内部蓄积的病毒回收。其是用小鼠微小病毒等通常进行的病毒生产方法，然而该方法会混入大量的宿主细胞内部的杂质。
由此，采用现有的病毒生产技术是极其困难的，期望不使用操作复杂的超离心分离等浓缩操作而更简便且有效率地得到高纯度的高感染滴度的细小病毒的方法。
用于解决问题的方案
本发明人发现：首先，使一直以来没有采用的极低的特定范围的细胞密度的宿主细胞以特定范围的低感染复数(MOI)感染细小病毒的种病毒，进而培养宿主细胞特定的期间并回收培养上清，由此利用细小病毒特有的增殖机理，得到了比现有方法还高的感染滴度的细小病毒(WO2014/080676)。
本发明人等为了解决上述的课题，对于将细小病毒的种病毒接种于宿主细胞而使细小病毒增殖的培养体系中的各条件(初始宿主细胞密度、包括培养基更换时期在内的培养时间)与得到的病毒感染滴度和纯度的关系，进行了深入研究，结果发现：令人惊奇的是，使用一直以来未采用的计算法来确定宿主细胞的感染时细胞数，进而培养宿主细胞特定的期间后，进行一次将培养上清更换为无血清培养基，继续培养特定的期间后回收培养上清，通过采用这种一直以来未进行的方法，从而得到了现有方法中无法得到的非常高感染滴度且高纯度的细小病毒。
即，本发明如下。
[1]一种高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法，其包括如下工序：
工序(a)，对于每个感染时细胞密度(A)，事先另行计算出宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化；
工序(b)，基于在工序(a)中事先计算出的细胞密度的经时变化来确定：
(b1)自感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)、
(b2)Tmax时的细胞密度(Bmax)与A满足以下的式(1)的A1、
(b3)这样的A1中最大的感染时细胞密度(Amax)、及
(b4)满足以下的式(2)的A2，
Bmax/A1＞1.2 式(1)
Amax≥A2≥Amax/10 式(2)；
工序(c)，在包含A2的感染时细胞密度的宿主细胞和血清培养基的所述培养基材料中以感染复数(MOI)成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述A2是由工序(b)的(b4)中确定的；
工序(d)，将包含工序(c)中得到的宿主细胞和细小病毒的培养物培养Tmax以上且少于Tmax+48小时的时间，所述Tmax是由工序(b)的(b1)中确定的；
工序(e)，将工序(d)的培养上清更换为无血清培养基，培养12小时以上；以及
工序(f)，对包含通过工序(e)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收；
所述工序(b)中，不存在满足式(1)的A的情况下，采用其它的感染时细胞密度A并再次实施工序(a)和工序(b)。
[2]根据[1]所述的方法，其中，前述宿主细胞为黏附依赖性细胞。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，前述细小病毒为猪细小病毒(PPV)、狗细小病毒(CPV)、小鼠微小病毒(MVM)、大鼠病毒(RV)、H-1病毒(H-1)、猫细小病毒(FPV)、鹅细小病毒(GPV)或牛细小病毒(BPV)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，前述工序(e)是将培养上清更换为无血清培养基，培养24小时以上的工序。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，前述工序(b)包括计算出Bmax和A满足以下的式(1’)这样的A1’的工序：
Bmax/A1’≥2.0 式(1’)。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细小病毒的产生方法，其中，前述工序(d)和(e)中的培养在33℃以上且39℃以下的温度下实施。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细小病毒的产生方法，其中，前述工序(d)和(e)中，前述宿主细胞与前述细小病毒同时进行增殖。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，前述工序(f)包括去除所述培养上清中所含的游离的宿主细胞和宿主细胞的碎片的去除工序。
[9]根据[8]所述的方法，其中，前述去除工序使用孔径0.2μm～0.45μm的膜过滤来进行。
[10]一种细小病毒，其是利用[1]～[9]中任一项所述的方法利用得到的、109TCID50/mL以上的感染滴度的细小病毒。
[11]一种来源于非浓缩的细胞培养上清的细小病毒，其中，细小病毒的感染滴度为109TCID50/mL以上，且前述细小病毒的感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比大于5000：1。
发明的效果
根据本发明，可以通过细胞培养简便且有效率地得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。由此，能够消除由细小病毒使用时的感染滴度不足和杂质蛋白质带来的问题。
具体实施方式
以下，对于用于实施本发明的方式(以下称为“本实施方式”)进行更详细地说明。需要说明的是，本发明不限定于以下的实施方式，可以在其主旨的范围内进行各种变形而实施。
本实施方式涉及生产细小病毒的方法，所述细小病毒为109TCID50/mL以上的高感染滴度且相对于杂质蛋白质浓度的病毒感染滴度为5000(TCID50/mL)/(ng/mL)以上的高纯度，所述方法包括如下工序：
工序(a)，对于每个感染时细胞密度(A)，事先另行计算出宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化；
工序(b)，基于在工序(a)中事先计算出的细胞密度的经时变化，确定：
(b1)自感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)、
(b2)Tmax时的细胞密度(Bmax)和A满足以下的式(1)的A1、
(b3)这样的A1中最大的感染时细胞密度(Amax)、及
(b4)满足以下的式(2)的A2；
Bmax/A1＞1.2 式(1)
Amax≥A2≥Amax/10 式(2)
工序(c)，在包含A2的感染时细胞密度的宿主细胞和血清培养基的前述培养基材料中以感染复数(MOI)成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述A2是由工序(b)的(b4)中确定的；
工序(d)，将包含工序(c)中得到的宿主细胞和细小病毒的培养物培养Tmax以上且少于Tmax+48小时的时间，所述Tmax是由工序(b)的(b1)中确定的；
工序(e)，将工序(d)的培养上清更换为无血清培养基，培养12小时以上；以及
工序(f)，对包含通过工序(e)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收；
前述工序(b)中，不存在满足式(1)的A的情况下，采用其它的感染时细胞密度A并再次实施工序(a)和工序(b)。
工序(a)：首先，对于每个感染时细胞密度(A)，事先另行计算出细小病毒宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化。
需要说明的是，宿主细胞可以通过传代培养而增殖。
细小病毒为小型的线状单链DNA病毒。DNA病毒是具有DNA作为基因组的病毒，利用宿主细胞的RNA聚合酶由基因组DNA合成mRNA，以该mRNA为基础合成蛋白质进行增殖。DNA病毒的大部分为双链DNA病毒，而细小病毒具有线状单链DNA作为基因组。在单链DNA的状态下不能进行病毒增殖，所以细小病毒具有以下特有的增殖机理：在宿主细胞的RNA聚合酶的基础上，还利用DNA聚合酶经过双链DNA的状态进行增殖。
细小病毒科(Parvoviridae)病毒已知有：属于细小病毒亚科的3个属，即，病毒复制中不需要辅助病毒而在宿主细胞内自主增殖的细小病毒属(Parvorivirus)、需要辅助病毒的依赖病毒属(Dependovirus)以及特异性地感染红血球的红病毒属(Erythrovirus)；以及属于浓核病毒亚科的3个属：感染昆虫的浓核病毒属(Densovirus)、重复病毒属(Iteravirus)和埃及伊蚊浓核病毒属(Aedes aegypti densovirus)。本实施方式中的“细小病毒”是指细小病毒属的病毒。细小病毒属的病毒全部具有相似的增殖机理，所以可以共通地利用本实施方式的方法。
更具体而言，细小病毒属的病毒不具有用于诱导使增殖停止的细胞(休止细胞)的DNA代谢的辅助蛋白质，另外，也不具有双链的转录模板，因此直至宿主细胞的DNA合成机理与S期的开始同时发生活化而自宿主细胞提供DNA互补链为止都无法表达自己的基因。这种结构的细小病毒属的病毒无法诱导使增殖停止的细胞的DNA代谢、从而不能利用其合成体系，因此具有感染正在分裂增殖的S期的细胞从而伴随细胞的增殖而增殖的增殖机理。
对于本实施方式中的细小病毒(细小病毒属病毒)，没有限定，包括：猪细小病毒(Porcine Parvovirus PPV)、狗细小病毒(Canine Parvovirus CPV)、小鼠微小病毒(Minute Virus of Mice MVM)、大鼠病毒(Rat Virus RV)、H-1病毒(H-1Virus H-1)、猫细小病毒(Feline Parvovirus FPV)、鹅细小病毒(Goose Parvovirus GPV)、牛细小病毒(Bovine Parvovirus BPV)。这些病毒具有类似的大小、基因组结构、病毒颗粒结构、增殖机理，都能够适宜地用在本实施方式的方法中。
本实施方式中，“细小病毒”只要没有特别说明，则是指细小病毒和包含其的细小病毒溶液中的任一种。细小病毒溶液不限定于包含细小病毒，例如包括对感染了细小病毒的宿主细胞进行了培养后的培养上清以及从该培养上清中去除了杂质后的病毒悬浮液。
对于本实施方式中的“宿主细胞”，只要是对上述细小病毒具有敏感性(能够感染细小病毒)的细胞，则其种类没有限定。作为对细小病毒具有敏感性的细胞，例如可列举出：对猪细小病毒具有敏感性的PK-13细胞、PK-15细胞、LCC-PK1细胞、ESK(embryonic swinekidney，猪胚肾)细胞、SK细胞、ST(swine testes，猪睾丸)细胞和MPK(Minipig kidney，小型猪肾)细胞，对于狗细小病毒具有敏感性的MDCK(Mardin-Darby canine kidney，马丁达比狗肾脏)细胞、FEA(feline embryonic fibroblasts，猫胚胎成纤维)细胞、CRFK(Crandell feline kidney，Crandell猫肾)细胞和FK-81细胞(embryonic feline kidney，猫胚肾)，对小鼠微小病毒具有敏感性的A9(mouse fibroblast，小鼠成纤维)细胞和C6(ratglial，大鼠神经胶质)细胞，对于大鼠病毒具有敏感性的NRK(normal rat kidney，正常大鼠肾)细胞，对于H-1病毒具有敏感性的Molt-4(human T-cell，人类T细胞)细胞、AV-1(human B-cell，人类B-细胞)细胞和NC-37(human B-cell，人类B-细胞)细胞，对于猫细小病毒具有敏感性的CRFK细胞、Mya 1细胞、NLFK(Norden Laboratories Feline Kidney，诺顿实验室猫肾)细胞和A72细胞，对于鹅细小病毒具有敏感性的GEF(goose embryofibroblast，鹅胚成纤维)细胞，对于牛细小病毒具有敏感性的BEK(bovine embryonickidney，牛胚肾)细胞、水牛肺成纤维细胞和EBTr(bovine embryonic trachea，牛胚胎气管)细胞等。宿主细胞优选利用通过感染引起细胞变性的细胞。例如，为猪细小病毒时可以使用猪的肾脏细胞，为狗细小病毒时可以使用狗肾脏细胞，但不限定于此，如上所述，只要是对于细小病毒具有敏感性且适宜地引起细胞变性的细胞则可以广泛地使用。另外，本实施方式中，可以使用具有无限增殖能力的动物细胞作为“宿主细胞”，通常可以使用被称为“细胞株(Cell line)”的细胞。
本实施方式中，从培养基更换容易这样的观点出发，宿主细胞优选为黏附依赖性细胞。“黏附依赖性细胞”是指如肌细胞、器官细胞那样，如果不是黏附于培养基质的状态就不能生存/增殖的细胞。黏附依赖性细胞附着于培养烧瓶等培养基材料的底面/壁面、附着于被称为微载体的载体而培养。烧瓶、培养皿通常应用于小规模培养。使用了微载体的培养具有容易逐次扩大规模的优点(日本特许第3982843号使用了多孔载体的动物细胞的逐次培养方法)。另外，本实施方式中还可以使用悬浮细胞。“悬浮细胞”以悬浮状态增殖，以悬浮于培养基中的状态静置或搅拌而培养。对于悬浮细胞，由于难以在回收培养上清之前进行培养基更换，所以优选例如附着于微载体而培养。
本实施方式中，对于“培养基材料”的种类没有限定，包括培养容器、培养烧瓶、培养皿、转瓶、培养板等、细胞培养中通常使用的任意的培养基材料。
培养可以使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基)、伊格尔培养基(MEM培养基)、F-12培养基等技术领域中通常使用的培养基、适宜地使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基)，在5％左右的二氧化碳气体环境下进行，只要是适合于宿主细胞的增殖的环境培养条件，则对其没有限定。培养温度可以设为适合于宿主细胞增殖的温度。由于已知细小病毒的宿主细胞在33℃～39℃的范围内增殖(“动物细胞培养法入门(生物化学实验法29)松谷丰著/学会出版中心”p.14-15(「動物細胞培養法入門(生物化学実験法29)松谷豊著/学会出版センター”p.14-15))，所以培养温度可以优选设为33℃以上且39℃以下例如约37℃。需要说明的是，期望使用以10％以下的比例包含含有细胞增殖因子的动物血清(胎牛血清、小牛血清、马血清等)的培养基，优选使用与后述工序(c)和(d)中的培养基同样的培养基。
本实施方式中，“感染滴度”是指表示病毒感染效价的单位，与病毒领域中经常使用的“效价(Titer)”是同义的。病毒由于使用光学显微镜也无法看见，所以不能像生物细胞那样用显微镜测量密度(个数/体积)。因此，为病毒的情况下，以利用了对于宿主细胞的感染能力的感染效价作为单位，作为其量、浓度的替代。例如，如果对宿主细胞的单层添加以适当的倍率进行稀释的病毒悬浮液，则病毒的个数作为空斑被检测出，可以以空斑形成单位(plaque forming unit＝pfu)/mL测定感染效价。或者，可以逐渐进行包含有病毒的液体的稀释，将对于宿主细胞产生感染阳性的比例为50％的浓度作为50％感染剂量(tissueculture infectious dose＝TCID50)/mL而测定感染效价。本实施方式中，使用的细小病毒均可以以TCID50/mL测定感染效价，可以以TCID50/mL表示感染效价。需要说明的是，也可以以pfu/mL等其他的单位表示细小病毒的感染效价。可以用其他的单位测定感染效价的细小病毒中，通过对于同一细小病毒悬浮液同时地使用两者的单位进行感染效价测定，能够容易地实施不同的单位间的换算。
本实施方式中，“宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化”的计算可以通过如下方式进行：在培养容器中接种以特定的多重感染性(MOI)感染了细小病毒的宿主细胞，然后每24小时回收细胞并测量培养基材料中的细胞数。此处，“感染复数”是指病毒的添加量相对于宿主细胞数的比率，用病毒感染滴度/宿主细胞数表示。细小病毒感染宿主细胞后，细胞首先增殖而培养基材料中的细胞密度增加。一定期间后，细胞由于病毒的致敏而开始死亡，细胞密度迎来峰值后减少。对于每个宿主细胞感染细小病毒时的感染时细胞数计算出这样的经时变化。
细胞数的计算可以使用本领域技术人员公知的方法进行，例如可以如下方式进行。首先，向黏附于细胞基材的细胞中加入少量的胰蛋白酶等蛋白质水解酶、EDTA等螯合剂或它们的混合液，从而使宿主细胞从培养容器上剥离。用包含血清的培养基稀释剥离的细胞溶液，抑制细胞剥离作用后，向血球计算盘等注入稀释后的溶液，在显微镜下测量细胞数。还可以用细胞分类器或细胞计数器测量细胞数。
本实施方式的工序(a)中，分别对于多种不同的感染时细胞密度(A)，计算出感染后的细胞密度每24小时的经时变化。对于工序(a)中的感染时细胞数的选择方法，只要能够在后述工序(b)中选择满足式(1)的A则没有特别限定。工序(b)中不存在满足式(1)的A的情况下，可以采用不同的A并再次实施工序(a)和(b)。
一方式中，例如，以宿主细胞的汇合状态的细胞密度(以下为C)作为基准，可以选择C～C/100左右例如C、C/3、C/10、C/30和C/100左右作为A。
工序(b)：基于在工序(a)中事先计算出的细胞密度的经时变化，确定适宜的感染时细胞密度。
(b1)感染了细小病毒的宿主细胞在感染后一定期间内增殖，但达到峰值后由于病毒的致敏而逐渐死亡，因此首先确定自感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)。
(b2)接着，由Tmax时的细胞密度(Bmax)和A确定满足以下的式(1)的A1。
Bmax/A1＞1.2 式(1)
可认为：细小病毒所特有的增殖机理中，病毒与宿主细胞同时增殖，因此自感染时细胞数(A)至峰值时的Tmax为止细胞增殖至大于1.2倍、例如1.5倍以上、优选为1.75以上、更优选为2.0倍以上这样的感染时细胞数A1是适当的。虽然这不受理论的束缚，但可认为是因为，A过大时，由于接近汇合状态的细胞数而宿主细胞本身无法增殖，从而有Bmax/A变小的倾向，而使每一细胞的病毒产生量降低。
(b3)接着，确定这样的A1中最大的感染时细胞密度(Amax)，
(b4)基于该Amax，确定满足以下的式(2)的A2。
Amax≥A2≥Amax/10 式(2)
A过小时，峰值时的细胞密度(Bmax)不会受到培养基材料的限制，因此Bmax/A为高的值且为恒定，每一细胞的病毒产生量达到稳定。另一方面可认为，病毒浓度依赖于宿主细胞的数量，因此有A越小病毒浓度越低的倾向。
因此，可认为适宜的感染时的细胞数A是在工序(a)中欲选择的几个A中的、Bmax/A满足式(1)的A1中最大的A(Amax)。进而，可认为即使自该Amax将感染时细胞密度降低至1/10左右也能够回收高感染滴度且高纯度的细小病毒。这虽然这不受理论的束缚，但可认为是因为即使A比Amax稍微减少，对应于A的减少而使每一细胞的病毒产生量上升，因此最终得到的细小病毒浓度不发生变化。
工序(c)：接着，在包含A2的适宜细胞密度的宿主细胞和血清培养基的培养基材料中以MOI成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述A2是由工序(b)中确定的。
工序(c)中，首先，以少于A2的细胞密度预先将宿主细胞接种在细胞基材中培养一定时间后制成A2的细胞密度；或者将成为A2的细胞密度的量的含有宿主细胞的血清培养基接种在培养基材料中，从而能够制备培养基材料。作为血清培养基，可以使用在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基)、伊格尔培养基(MEM培养基)、F-12培养基等中包含例如0.5％～15％、优选为1％～10％的胎牛血清、小牛血清、马血清等动物血清的培养基。
本实施方式的重要特征在于，如上所述，由感染了细小病毒的宿主细胞的细胞密度的经时变化来确定感染时细胞数，而不是由非病毒感染的宿主细胞的倍增时间、汇合状态的参数来确定感染时细胞数。为细小病毒的情况下，作为现有的病毒生产方法的常识的、使汇合状态的宿主细胞感染病毒的方法中，见不到宿主细胞的增殖，宿主细胞仅仅是经过由感染导致的细胞变性而逐步迈向死亡；与此相对，本实施方式中，以残留有在细小病毒感染后宿主细胞也增殖一定倍率以上的余量的宿主细胞密度进行病毒感染，从而成功地得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。作为过去的见解，存在以极低的细胞密度开始感染并使宿主细胞增殖和细小病毒增殖同时进行的技术(WO2014/080676)，但根据本实施方式，能够得到与上述技术相比更高感染滴度且高浓度的细小病毒。
接着，工序(c)中，在如上述那样制备的包含A2细胞密度的宿主细胞的培养基材料中以感染复数(MOI)成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒。对于细小病毒的种病毒的接种，可以与在培养基材料中接种上述宿主细胞同时地、以MOI成为0.001～0.1的方式接种种病毒；也可以以更低的细胞密度开始宿主细胞培养，在成为上述A2的细胞密度的时间点、以MOI成为0.001～0.1的方式接种种病毒。上述规定的MOI的范围是通常用于使细小病毒增殖时的值的范围，若在该范围内则不影响回收高浓度高纯度的病毒这样的目的。
工序(d)：接种细小病毒的种病毒后，将包含上述细小病毒和宿主细胞的培养物培养特定的时间。工序(d)中，宿主细胞和细小病毒同时进行增殖。培养时间是由上述工序(b)的(b1)中确定的、自病毒感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)以上且少于Tmax+48小时的时间，例如为Tmax以上且Tmax+36小时以下的时间、优选为Tmax以上且Tmax+30小时以下的时间、更优选为Tmax以上且Tmax+24小时以下的时间。上述规定时间的培养中，宿主细胞所感染的种病毒的大部分在宿主细胞中借助宿主细胞的功能而进行自我复制，从而留在细胞内。
工序(e)：工序(d)中进行了规定时间培养的培养上清中包含大量源自血清的杂质蛋白质，但感染了病毒的宿主细胞大多保持直接黏附于培养基材料上的状态。本实施方式中，通过将培养所用的血清培养基更换为无血清培养基，从而能够去除杂质蛋白质，回收高纯度的细小病毒。作为无血清培养基，可以使用在对于上述工序(c)所记载的培养基中未添加血清的培养基。
培养基更换后，通过培养12小时以上、优选为18小时以上、更优选为24小时以上，病毒从感染了病毒的宿主细胞中释放，从而可以得到包含病毒的培养上清。另外，可认为即使培养基更换后培养36小时以上也不会对得到的细小病毒的感染滴度产生影响。因此，从培养成本方面考虑，培养基更换后的培养时间优选设为36小时以下。
工序(d)和工序(e)中的培养时的培养温度可以设为适合于宿主细胞增殖的温度，优选为33℃以上且39℃以下，例如可以设为约37℃。另外，从期望在与工序(a)中的培养条件相同的条件下进行培养方面考虑，期望设为与工序(a)中事先计算出感染了细小病毒的宿主细胞的细胞密度时的培养温度同等程度的培养温度。
工序(f)：培养上述规定的时间后，回收包含细小病毒的培养上清。需要说明的是，作为现有方法，有通过对感染宿主细胞重复进行冷冻融解等而破坏感染宿主细胞来回收病毒的方法，但该方法中、在破坏时大量地释放出宿主细胞内部的杂质。另一方面，如本实施方式这样回收培养上清的方法中，虽然也会混入来源于由于病毒感染而崩解的宿主细胞的杂质，但杂质量与进行宿主细胞的冷冻融解破坏的情况相比显著减少。另外，通过将细小病毒和宿主细胞的培养上清更换为无血清培养基，从而与仅通过血清培养基进行培养的情况相比，来源于血清的杂质量也显著减少。因此，本实施方式中，能够简便地从培养上清中回收高感染滴度且高纯度的细小病毒。
利用上述本实施方式的方法，能够得到109TCID50/mL以上的高感染滴度细小病毒。
工序(f)的回收可以包括去除游离的宿主细胞、宿主细胞的碎片等杂质等的去除工序，该去除工序可以通过在已知的条件下进行低速离心分离来实施。或者/进而可以通过孔径0.1～0.5μm、优选为0.2～0.45μm的膜过滤而去除杂质。
工序(f)的回收优选可以不浓缩培养上清地进行。由此，不会发生后述的伴随浓缩的杂质浓缩，能够容易地得到高纯度的细小病毒。
如上所述，通过进行细小病毒的培养/回收，能够得到细小病毒的感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比大于5000：1、优选为大于9000：1的高纯度的细小病毒。作为“杂质”，可列举出：游离的宿主细胞、宿主细胞的碎片、来源于宿主细胞、血清成分的蛋白质等；由于游离的宿主细胞、宿主细胞的碎片的尺寸大，从而能够用上述离心分离、过滤等的已知方法容易地去除，因此本实施方式的一方式中，使用蛋白质浓度作为表示杂质的存在比例的指标。
杂质蛋白质浓度的测定可以使用本领域技术人员公知的方法进行，例如，如后述实施例中所示，可以使用市售的蛋白质分析试剂等并利用BCA法进行。
本实施方式还涉及高纯度且高感染滴度的、来源于非浓缩的细胞培养上清的细小病毒。
本实施方式中，浓缩是指与浓缩前相比，浓缩后的病毒浓度增加即感染滴度增加。一方式中，本实施方式的细小病毒是不经过这样的浓缩而由培养上清得到的、不存在伴随浓缩的杂质浓缩的高纯度的细小病毒。
具体而言，作为浓缩操作，可列举出：铯密度梯度超离心分离、蔗糖密度梯度离心分离等密度梯度离心分离；超离心分离；阳离子交换柱色谱；超滤；正切流动过滤；化学诱导性沉淀；病毒吸附型色谱；聚合物诱导性聚集；膜吸附等。
作为浓缩以外的操作，可列举出不是超离心分离的离心分离(10000xg以下且100000xg·小时以下的离心分离)、除菌膜过滤等，更具体而言，可列举出后述实施例中的纯化操作。
如上所述，通过本实施方式可得到杂质蛋白质浓度低的、高纯度且109TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒，能够消除起因于细小病毒使用时各种感染滴度不足的障碍。以下，对于代表性的3个用途进行叙述。
第一个用途即将病毒用于抗病毒药研发等研究用途的情况下，有杂质的存在带来阻碍目标反应等恶劣影响的担心。因此，预先生产出比实际供于试验的病毒感染滴度高的感染滴度的病毒，稀释至杂质不带来影响的程度为止，从而用于研究。为了能够对高的病毒抑制活性进行测定，不得不以高的病毒感染滴度供于试验，因此需要预先生产感染滴度更高的病毒。即，优选细胞培养中得到的病毒的感染滴度高。通过本实施方式，能够得到109TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒，由此在使用了细小病毒的抗病毒药研究中，能够进行稀释之后再作为研究材料而供给，能够降低由杂质带来的预料不到的反应、干扰。
第二个用途，即为了评价生物制剂的制造工序的病毒清除而生产病毒的情况下，也期望病毒为高纯度且为高感染滴度。如上所述，该病毒清除试验所要求的点为：第一，是不产生滤器堵塞程度的病毒悬浮液添加量；第二，是评价工序的病毒清除数值即对数去除率(LRV)表现出4以上的添加量。为了达到LRV4以上，不得不向供于病毒去除过滤工序的中间产品中以使病毒感染化成为104TCID50/mL的方式添加病毒，然而实际上，考虑到病毒感染滴度的定量误差、去除病毒颗粒的缔合体的预滤器中的损失、及病毒检测下限上升的可能性(过滤溶液具有细胞毒性时，必须稀释过滤溶液来测定病毒感染滴度，从而病毒检测下限上升)，需要以成为106TCID50/mL以上的方式添加病毒。为了以体积比计添加0.1％并达到106TCID50/mL以上，原本的病毒悬浮液需要达到109TCID50/mL以上。通过本实施方式，得到高纯度的109TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒，由此对各工序的细小病毒清除进行评价时，能够显著地减少细小病毒的添加，能够消除来源于细小病毒的杂质带来的滤器的堵塞的问题。需要说明的是，如上所述，作为近些年病毒去除滤器的新的评价基准，与以往相比增加每单位膜面积的病毒负荷量时的病毒去除性、负荷例如1013TCID50/m2以上的病毒时的病毒去除性受到注目。对于利用现有的方法可以回收的108TCID50/mL的病毒而言，只能通过用0.001m2的滤器过滤以体积比1％添加的溶液1L来负荷病毒(WO2014/080676)。通过本实施方式，由于可以得到高纯度的109TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒，因此在与上述相同的过滤条件下使1013TCID50/m2以上的病毒负荷量成为可能。
另外，第三个用途，疫苗生产中，由于用细胞培养生产的病毒为高纯度且高感染滴度，因此减轻了之后的病毒疫苗纯化工序的负荷，对于制造是有利的。若纯度低，则对纯化工序产生负荷；另外，若病毒感染滴度低，则杂质浓度相对地变高，所以对纯化工序产生负荷，对于制造是不利的。通过本实施方式，得到高纯度的109TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒，从而即便在细小病毒的疫苗生产中，纯化原料中的疫苗量也飞跃式地变多，所以能够更高效且低成本地实施疫苗纯化工序。
实施例
以下，基于实施例和比较例对本发明进行更详细地说明。需要说明的是，此处所示的实施例为代表例，本发明并不限定于该实施例。
[实施例1细小病毒感染后的细胞密度的经时变化1]
作为猪细小病毒(PPV)的宿主细胞，使用PK-15细胞(从ATCC购入、目录编号CCL-33、细小病毒敏感性的黏附依赖性细胞)，对其用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基、LifeTechnology Inc.制、制造型号11965-092)中添加了10％胎牛血清的培养基(以下称为“血清培养基”。后述实施例中也同样。)，在37℃、5％CO2环境下，使用75cm2底面积、容量15mL的组织培养用烧瓶(以下称为“烧瓶”。后述实施例中也同样。)进行传代培养。
接着，从上述烧瓶剥离PK-15细胞，将1.8×107细胞/烧瓶(试样1a)、6.0×106细胞/烧瓶(试样1b)、3.0×106细胞/烧瓶(试样1c)、1.2×106细胞/烧瓶(试样1d)、6.0×105细胞/烧瓶(试样1e)和1.0×105细胞/烧瓶(试样1f)的细胞密度(A)的宿主细胞与10mL的血清培养基一起分注到向新的烧瓶中。需要说明的是，可以认为，在将PK-15细胞的汇合增殖时的细胞密度(C)设为3.0×107细胞/烧瓶时，这些感染时细胞密度A分别为C/1.67、C/5、C/10、C/25、C/50和C/300。
在各细胞密度的条件下逐一分注到3个烧瓶中。接着，以成为MOI＝0.01的方式将PPV接种在该各烧瓶中，在37℃、5％CO2环境下培养。在感染开始后培养24小时、48小时和72小时的时间点回收位于烧瓶底面的细胞，计算出细胞密度(B)。
细胞数的计算如下所述进行。首先向黏附于细胞基材的细胞中加入少量的胰蛋白酶等蛋白质水解酶、EDTA等螯合剂或其混合液，从而使宿主细胞从培养容器上剥离。用包含血清的培养基稀释剥离的细胞溶液从而抑制了细胞剥离作用后，向血球计算盘等注入稀释后的溶液，在显微镜下测量细胞数。
将病毒感染时的细胞密度(A＝细胞数/烧瓶)以及基于该A和每培养24小时的细胞密度(B＝细胞数/烧瓶)计算出的比(B/A)示于表1。如此，通常细胞感染病毒时随时间的经过而逐渐死亡，但感染了细小病毒的细胞会继续细胞增殖，在任一感染时细胞密度A的情况下，直至经过48小时的时间点为止整体的细胞数均增加。然而，之后在经过72小时的时间点细胞由于病毒致敏而死亡，整体的细胞数显著减少。
另外，所试验的A的范围中，观察到有感染时细胞密度越高感染后的细胞增殖速度越低的倾向，但另一方面，并不是感染时细胞密度越低感染后的细胞增殖速度越高。
[表1]
表1培养细小病毒感染细胞后的细胞密度(B＝细胞/烧瓶)与病毒感染时细胞密度(A＝细胞/烧瓶)的比(B/A)
Figure GDA0001649080550000211
[实施例2细小病毒感染细胞培养后的培养基更换1]
与实施例1同样地对PK-15细胞进行传代培养，向新的烧瓶中，将与试样1a～1f同样的细胞密度的宿主细胞与10mL的血清培养基一起在各细胞密度的条件下逐一分注在6个烧瓶中(试样2a～2f)。接着，以成为MOI＝0.01的方式将PPV接种在该各烧瓶中，在37℃、5％CO2环境下培养。在感染开始后培养48小时和72小时的时间点分别去除每个烧瓶的培养上清，用未加入血清的DMEM培养基(以下称为“无血清培养基”。)清洗烧瓶底面的细胞，然后添加10mL的无血清培养基，进行进一步培养，在24小时后、48小时后和72小时后对于每个烧瓶回收上述无血清培养基的培养上清。将回收的无血清培养上清进行3000rpm、20分钟离心分离，用0.45μm滤器(Millipore Corporation制Millex-HV)过滤了上清级分。
使用96孔板通过利用基于病毒的细胞变性的CPE法、按照TCID50法测定PPV感染滴度。50％感染滴度的计算按照Reed-Muench法(医科病毒学、2000.南江堂.171-172)进行。将其结果示于表2。表2的数值将感染滴度以对数值表示。例如，9.1表示109.1TCID50/mL。如表2所示，对于得到的病毒的感染滴度，试样2b～2e中为109TCID50/mL以上的高感染滴度，但试样2a和2f中，在任一条件下均低于109TCID50/mL。
[表2]
表2改变了培养基更换前后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中PPV效价(单位：log[TCID50/mL])
Figure GDA0001649080550000221
进而，用Thermo Scientific公司的蛋白质分析试剂(BCA法)测定杂质蛋白质浓度，求出PPV感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比。将结果示于3。如表3所示，试样2b～2e中，可得到杂质蛋白质的比例非常低、高纯度的细小病毒。另一方面，试样2a和2f中，与试样2b～2e相比，得到的细小病毒中的杂质蛋白质的比例高。
[表3]
表3改变了培养基更换前后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中PPV效价(单位：log[TCID50/mL])与杂质蛋白质(ng/mL)的比
Figure GDA0001649080550000222
由上述实施例1和2的结果，确定了可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒的培养条件。
首先，由实施例1，记录每个感染时细胞密度(A)的感染后的细胞密度每24小时的经时变化，并且记录分别对应于各密度的峰值时(Tmax＝本实施例中48小时)的细胞密度(Bmax)，计算出成为感染后的细胞增殖速度的标准的Bmax/A的比，结果可认为若采用Bmax/A至少大于1.2的感染时细胞密度(例如为1.5以上、优选为1.75以上、更优选为2.0以上)，则可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。即，可认为为了得到高感染滴度且高纯度的细小病毒，A1和Bmax满足以下的式(1)是重要的。
Bmax/A1＞1.2 式(1)
另外，可认为只要是Bmax/A至少大于1.2的感染时细胞密度中最大的密度(Amax)的感染时细胞密度，就可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。进而，可认为即使将该密度降低至1/10左右，对应于A的减少而使每一细胞的病毒产生量上升，因此能够使最终得到的细小病毒浓度不发生变化地回收高感染滴度且高纯度的细小病毒。即，可认为为了得到高感染滴度且高纯度的细小病毒，宿主细胞的感染时细胞密度满足以下的式(2)是重要的。
Amax≥A2≥Amax/10 式(2)
由实施例2，可认为采用上述范围的感染时细胞密度，在细胞密度的经时变化达到峰值的时间点或自峰值时起经过一定时间后，将培养上清更换为无血清培养基并培养一定时间例如12小时以上、优选为18小时以上、更优选为24小时以上时，可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。
[比较例1]
与实施例1同样地对PK-15细胞进行传代培养，向新的烧瓶中，将与试样1b～1e同样的细胞密度的宿主细胞与10mL的血清培养基一起在各细胞密度的条件下逐一分注在3个烧瓶中(试样3b～3e)。接着，以成为MOI＝0.01的方式将PPV接种在该各烧瓶中，在37℃、5％CO2环境下培养。感染开始后，在培养96小时的时间点对于每1个烧瓶去除培养上清，用未加入血清的DMEM培养基(以下称为“无血清培养基”。)清洗烧瓶底面的细胞后，添加10mL的无血清培养基，进行进一步培养，在培养24小时后、48小时后和72小时后对于每个烧瓶回收上述无血清培养基的培养上清。将回收的无血清培养上清进行3000rpm、20分钟离心分离(1710×g、20分钟＝570×g·小时)，将上清级分用0.45μm滤器(Millipore Corporation制)进行过滤。
对于PPV感染滴度，使用96孔板并利用与实施例2同样的方法测定。将其结果示于表4。如表4所示，与感染时细胞密度相同的试样2b～2e相比，试样3b～3e中得到的病毒的感染滴度在任一条件下均低，未达到109TCID50/mL以上。明确了培养基更换前的培养时间对得到的病毒的感染滴度产生影响。
[表4]
表4感染后培养96小时，然后改变了培养基更换后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中PPV效价(单位：log[TCID50/mL])
Figure GDA0001649080550000241
进而，与实施例2同样地求出PPV感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比。将其结果示于表5。与感染时细胞密度相同的试样2b～2e相比，试样3b～3e中得到的细小病毒中的杂质蛋白质的比例高。明确了培养基更换前的培养时间也对得到的病毒的纯度产生影响。
由实施例2和比较例1的结果可认为，自细胞密度的经时变化达到峰值的时间点起进行少于48小时、例如36小时以内、优选为30小时以内、更优选为24小时以内的时间的培养后，更换无血清培养基时，可以得到高纯度和高感染滴度的细小病毒。
[表5]
表5感染后培养96小时，然后改变了培养基更换后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中PPV效价(单位：log[TCID50/mL])与杂质蛋白质(ng/mL)的比
Figure GDA0001649080550000251
[实施例3细小病毒感染后的细胞密度的经时变化2]
作为小鼠微小病毒(MVM)的宿主细胞，使用A9细胞(从ATCC购入，目录编号CCL-1.4、细小病毒敏感性的黏附依赖性细胞)，对其用血清培养基，在37℃、5％CO2环境下，使用烧瓶进行传代培养。
接着，从上述烧瓶上剥离A9细胞，将6.0×106细胞/烧瓶(试样4a)、3.0×106细胞/烧瓶(试样4b)、1.5×106细胞/烧瓶(试样4c)、6.0×105细胞/烧瓶(试样4d)、3.0×105细胞/烧瓶(试样4e)和1.0×105细胞/烧瓶(试样4f)的细胞密度(A)的宿主细胞与10mL的血清培养基一起分注到新的烧瓶中。需要说明的是，可认为，将A9细胞的汇合增殖时的细胞密度(C)设为3.0×107细胞/烧瓶时，这些感染时细胞密度A分别为C/5、C/10、C/20、C/50、C/100和C/300。
在各细胞密度的条件下逐一分注到3个烧瓶中。接着，以成为MOI＝0.01的方式将MVM接种在该各烧瓶中，在37℃、5％CO2环境下进行培养。在感染开始后培养72小时、96小时和120小时的时间点回收处于烧瓶底面的细胞，计算出细胞密度(B)。
细胞数的计算如下所述进行。首先向黏附于细胞基材的细胞中加入少量的胰蛋白酶等蛋白质水解酶、EDTA等螯合剂或其混合液，使宿主细胞从培养容器上剥离。用包含血清的培养基稀释剥离的细胞溶液而抑制了细胞剥离作用后，向血球计算盘等注入稀释后的溶液，在显微镜下测量细胞数。
将病毒感染时的细胞密度(A＝细胞数/烧瓶)以及基于该A和每培养24小时的细胞密度(B＝细胞数/烧瓶)计算出的比(B/A)示于表6。如此，通常细胞感染病毒时随时间的经过而逐渐死亡，但感染了细小病毒的细胞会继续细胞增殖，在任一感染时细胞密度A的情况下，直至经过72小时的时间点为止整体的细胞数均增加。然而，之后在经过96小时的时间点细胞由于病毒致敏而死亡，整体的细胞数减少。
另外，所试验的A的范围中，观察到感染时细胞密度越高感染后的细胞增殖速度越低的倾向，但另一方面，并不是感染时细胞密度越低感染后的细胞增殖速度越高。
[表6]
表6培养细小病毒感染细胞后的细胞密度(B＝细胞/烧瓶)与病毒感染时细胞密度(A＝细胞/烧瓶)的比(B/A)
Figure GDA0001649080550000261
[实施例4细小病毒感染细胞培养后的培养基更换2]
与实施例3同样地对A9细胞进行传代培养，向新的烧瓶中，将与试样4a～4f同样的细胞密度的宿主细胞与10mL的血清培养基一起在各细胞密度的条件下逐一分注在6个烧瓶中(试样5a～5f)。接着，以成为MOI＝0.01的方式将MVM接种在该各烧瓶中，在37℃、5％CO2环境下培养。感染开始后，在培养96小时和120小时的时间点对于每个烧瓶去除培养上清，用无血清培养基清洗烧瓶底面的细胞后，添加10mL的无血清培养基，进行进一步培养，在培养24小时后、48小时后和72小时后对于每个烧瓶回收上述无血清培养基的培养上清。对回收的无血清培养上清进行3000rpm、20分钟离心分离，用0.45μm滤器(MilliporeCorporation制Millex-HV)过滤了上清级分。
对于MVM感染滴度，将利用与实施例2同样的方法测定的其结果示于表7。表7的数值将感染滴度以对数值表示。例如，9.1表示109.1TCID50/mL。如表7所示，对于得到的病毒的感染滴度，试样5b～5e中为109TCID50/mL以上的高感染滴度；但试样5a和5f中，在任一条件下均低于109TCID50/mL。
[表7]
表7改变了培养基更换前后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中MVM效价(单位：log[TCID50/mL])
Figure GDA0001649080550000271
进而，用Thermo Scientific公司的蛋白质分析试剂(BCA法)测定杂质蛋白质浓度，求出MVM感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比。将结果示于8。如表8所示，试样5b～5e中，可得到杂质蛋白质的比例非常低的、高纯度的细小病毒。另一方面，试样5a和5f中，与试样5b～5e相比，得到的细小病毒中的杂质蛋白质的比例高。
[表8]
表8改变了培养基更换前后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中MVM效价(单位：log[TCID50/mL])与杂质蛋白质(ng/mL)的比
Figure GDA0001649080550000281
由上述的实施例3和4的结果，确定了可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒的培养条件。
首先，由实施例3，记录了每个感染时细胞密度(A)的感染后的细胞密度每24小时的经时变化并且记录分别对应于各密度的峰值时(Tmax＝本实施例中96小时)的细胞密度(Bmax)，计算出成为感染后的细胞增殖速度的标准的Bmax/A的比，结果可认为若采用Bmax/A至少大于1.2的感染时细胞密度(例如为1.5以上、优选为1.75以上、更优选为2.0以上)，则可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。即，可认为为了得到高感染滴度且高纯度的细小病毒，A1与Bmax满足以下的式(1)是重要的。
Bmax/A1＞1.2 式(1)
另外，可认为只要是Bmax/A至少大于1.2的感染时细胞密度中最大的密度(Amax)的感染时细胞密度，就可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。进而，可以认为即使将密度降低至1/10左右，对应于A的减少而使每一细胞的病毒产生量上升，因此能够使最终得到的细小病毒浓度不发生变化地回收高感染滴度且高纯度的细小病毒。即，可认为为了得到高感染滴度且高纯度的细小病毒，宿主细胞的感染时细胞密度满足以下的式(2)是重要的。
Amax≥A2≥Amax/10 式(2)
由实施例4，可认为采用上述范围的感染时细胞密度，在细胞密度的经时变化达到峰值的时间点或自峰值时起经过一定时间后，将培养上清更换为无血清培养基并培养一定时间例如12小时以上、优选为18小时以上、更优选为24小时以上时，可以得到高感染滴度且高纯度的细小病毒。
[比较例2]
与实施例3同样地对A9细胞进行传代培养，向新的烧瓶中，将与试样4b～4e同样的细胞密度的宿主细胞与10mL的血清培养基一起在各细胞密度的条件下各分注在3个烧瓶中(试样6b～6e)。接着，以成为MOI＝0.01的方式将MVM接种在该各烧瓶中，在37℃、5％CO2环境下培养。感染开始后，在培养144小时的时间点对于每个烧瓶去除培养上清，用无血清培养基清洗烧瓶底面的细胞后，添加10mL的无血清培养基，进行进一步培养，在培养24小时后、48小时后和72小时后对于每个烧瓶回收上述无血清培养基的培养上清。对回收的无血清培养上清进行3000rpm、20分钟离心分离(1710×g、20分钟＝570×g·小时)，将上清级分用0.45μm滤器(Millipore Corporation制)进行过滤。
对于MVM感染滴度，使用96孔板并利用与实施例2同样的方法测定。将其结果示于表9。如表9所示，与感染时细胞密度相同的试样5b～5e相比，试样6b～6e中得到的病毒的感染滴度在任一条件下均低，未达到109TCID50/mL以上。明确了培养基更换前的培养时间对得到的病毒的感染滴度产生影响。
[表9]
表9感染后培养144小时，然后改变了培养基更换后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中MVM效价(单位：log[TCID50/mL])
Figure GDA0001649080550000291
进而，与实施例2同样地求出MVM感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比。将其结果示于表10。与感染时细胞密度相同的试样5b～5e相比，试样6b～6e中得到的细小病毒中的杂质蛋白质的比例高。明确了培养基更换前的培养时间也对得到的病毒的纯度产生影响。
由实施例4和比较例2的结果，可认为自细胞密度的经时变化达到峰值的时间点起进行少于48小时、例如36小时以内、优选为30小时以内、更优选为24小时以内的时间的培养后，更换无血清培养基时，可以得到高纯度和高感染滴度的细小病毒。
[表10]
表10感染后培养144小时，然后改变了培养基更换后的培养时间时的细小病毒感染细胞的培养上清中MVM效价(单位：log[TCID50/mL])与杂质蛋白质(ng/mL)的比
Figure GDA0001649080550000301
产业上的可利用性
通过本发明的方法，能够得到高纯度且高感染滴度的细小病毒。该细小病毒可以用于抗病毒药研发等病毒研究材料的制备、生物制剂(药品)制造工序中的病毒清除安全性评价中使用的病毒的制备、还有疫苗产生等，本发明在这些领域中具有产业上的可利用性。
本申请要求基于2015年11月6日申请的日本专利申请第2015-218775号的优先权，将其内容作为参照引入其中。

Claims (9)

1.一种高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法，其包括如下工序：
工序(a)，对于每个感染时细胞密度(A)，事先另行计算出宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化；
工序(b)，基于在工序(a)中事先计算出的细胞密度的经时变化来确定：
(b1)自感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)、
(b2)Tmax时的细胞密度(Bmax)与A满足以下的式(1)的A1、
(b3)这样的A1中最大的感染时细胞密度(Amax)、及
(b4)满足以下的式(2)的A2，
Bmax/A1＞1.2 式(1)
Amax≥A2≥Amax/10 式(2)；
工序(c)，在包含A2的感染时细胞密度的宿主细胞和血清培养基的所述培养基材料中以感染复数(MOI)成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述A2是由工序(b)的(b4)中确定的；
工序(d)，将工序(c)中得到的包含宿主细胞和细小病毒的培养物培养Tmax以上且少于Tmax+48小时的时间，所述Tmax是由工序(b)的(b1)中确定的；
工序(e)，将工序(d)的培养上清更换为无血清培养基，培养12小时以上；以及
工序(f)，对包含通过工序(e)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收，
所述工序(b)中，不存在满足式(1)的A的情况下，采用其它的感染时细胞密度A并再次实施工序(a)和工序(b)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞为黏附依赖性细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细小病毒为猪细小病毒(PPV)、狗细小病毒(CPV)、小鼠微小病毒(MVM)、大鼠病毒(RV)、H-1病毒(H-1)、猫细小病毒(FPV)、鹅细小病毒(GPV)或牛细小病毒(BPV)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述工序(e)是将培养上清更换为无血清培养基，培养24小时以上的工序。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述工序(b)包括计算出Bmax和A满足以下的式(1’)这样的A1’的工序：
Bmax/A1’≥2.0 式(1’)。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述工序(d)和(e)中的培养在33℃以上且39℃以下的温度下实施。
7.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述工序(d)和(e)中，所述宿主细胞与所述细小病毒同时进行增殖。
8.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述工序(f)包括去除所述培养上清中所含的游离的宿主细胞和宿主细胞的碎片的去除工序。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述去除工序使用孔径0.2μm～0.45μm的膜过滤来进行。
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