JP3562246B2 - ヒトパルボウイルス感染株 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトパルボウイルスに感受性を示すヒト細胞株及び該細胞株を用いたヒトパルボウイルスの感染価測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
パルボウイルスは、直径約20nmほどの最小のDNAウイルスで、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ミンク、ヒト等多くの動物に感染することが知られている。この中で、ヒトに病原性を持つヒトパルボウイルスB19(Lancet, vol 1, p160−161, 1984 )(以下本明細書中においては、B19と記載する)はCossart らにより発見され、小児の伝染性紅斑、胎児水腫、溶血性貧血患者では一過性の赤血球造血障害による無形成発作、免疫不全状態の患者では慢性骨髄不全等の原因となることが知られている。また、B19はエンベロープを持たないため、変性剤や有機溶媒に対して耐性を示し、輸血や血液製剤を経由して感染する可能性が示唆されている(Lancet, Vol 343, p211−212, 1994 )。
【0003】
輸血や血液製剤からの感染を防ぐためには、PCR法やレセプター凝集法等を用いたB19の検出が行われているが、感染予防のためには、ウイルスの存在如何よりも、そのウイルスの感染性の測定が重要となる。B19に感受性を示す細胞としては、JK−1(Arch.virol., Vol 131, p201−208, 1993)、MB−02(J. Virol., Vol 67, p562−566, 1993 )、UT−7(Blood, Vol 79, p18−24,1992 )等が知られているが、これらの細胞は感受性がそれほど高くないため、B19の感染価を測定には用いることができない。B19の感染価測定には主にCFU−e障害試験が応用されているが、CFU−e細胞は株化されていないため、試験の度に培養を必要し、操作性の面で問題があった。このような状況において、より簡便なインビトロでの感染価測定法の確立が待ち望まれていた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、B19に感受性を示す細胞株を提供し、簡便な感染価測定方法を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、従来の課題を解決すべく、ヒト細胞にB19を感染させる研究を重ねた結果、ヒト慢性前骨髄性白血病より樹立されたKU812細胞にB19を感染させることに成功し、該感染細胞を用いたB19の感染価測定を可能にし、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、赤芽球に分化し得る継代培養可能なヒト株化細胞KU812Ep6であって、ヒトパルボウイルスB19をヒト細胞の培養条件下で前記ヒト細胞株に接種した後、培養することによりヒトパルボウイルスB19の感染を許し、ヒトパルボウイウルスB19の増殖が可能な細胞を10%以上含むことを特徴とするヒト細胞株を提供する。更に、本発明は、前記ヒト細胞株に検体を接種した後、培養することを含む検体のヒトパルボウイルスB19の感染価測定方法を提供する。
【0007】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0008】
本願発明のB19に感受性を示す細胞を樹立するには、ヒトの細胞であればいずれの細胞でも用いることができるが、B19が幹細胞から赤血球へ分化する過程の赤芽球段階で感染することから、赤芽球に分化し得る細胞であることが好ましく、具体的にはKU812が好ましい。ヒト細胞株KU812は、ヒト慢性前骨髄性白血病より樹立された細胞で、多機能分化性の幼若好塩基球である(Masaki Nakazawa et.al., Blood, 73(7), p2003−2013, 1989)。KU812細胞を用いる場合には、分化を促す因子としてエリスロポイエチンを含む培地を用いて限界希釈法にてクローニングすると、B19に感受性を示す細胞を効率よく得ることができる。
【0009】
本発明の樹立細胞を用いるB19の感染価測定は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、B19培養液またはB19陽性血清と本発明の樹立細胞とを混合して培養し、B19特異抗体を用いた蛍光抗体法にて、感染細胞の有無を確認することで、感染価を測定できるが、本発明の感染価測定方法は、これに限定されるものではない。
【0010】
【実施例】
本発明を以下参考例及び実施例により更に詳細に説明する。
【0011】
実施例1 パルボウイルス感染細胞の作製
理化学研究所より購入したKU812細胞を、6IU/mlエリスロポイエチン(以下本明細書中ではEPOと記載する)及び10%牛胎児血清(以下本明細書中ではFCSと記載する)を含むRPMI−1640培地(以下本明細書中では培地Aと記載する)を用いて希釈し、96ウエルプレートに細胞1個/ウエルになるように分注した。37℃で1週間培養後、成育したウエルから細胞を回収した。同様の方法にて培地Aで希釈、培養を2回繰り返し、最終的に限界希釈法によりクローニングされたクローンとして100クローンを得た。
【0012】
この100クローンそれぞれを、培地Aを用いて希釈し、2x104 細胞/mlの細胞懸濁液を調製した。その50μlを96ウエルプレートに分注し、更に、組織培養50%感染価(以下本明細書中では、TCID50と記載する)103 /mlになるよう培地Aで希釈したヒトパルボウイルス液を各ウエルに50μlづつ加え、7日間培養した。培養後、ヒトパルボウイルスに特異的なモノクローナル抗体(MAB8292、ケミコンインターナショナル社製)を用いた間接蛍光抗体法で、ヒトパルボウイルス感染細胞を確認した。
【0013】
間接蛍光抗体法は、培養した細胞をスライドグラスにマウントし、メタノールで固定化後、500倍希釈したモノクローナル抗体MAB8282と1時間反応さた。スライドグラスを洗浄後、FITC標識抗マウスIgG抗体と1時間反応させ、蛍光顕微鏡下で陽性率を確認した。この時の感染効率は10〜60%で、クローンにより異なっていた。
【0014】
この中から、感染効率の高いクローンとしてKU812Ep6株を取得した。尚、KU812Ep6株は工業技術院生命工学工業研究所微生物寄託センターに寄託され、その寄託番号はFERM P−16310である。
【0015】
実施例2 感染価測定
実施例1で作製したヒトパルボウイルス感染細胞KU812Ep6を培地Aで継代培養し、2〜5x104 細胞/mlになるよう希釈した。この懸濁液100μlを、48ウエルプレートに分注した。次に、ヒトパルボウイルス感染検体A〜Gを10n 連続希釈し、それぞれ100μlを添加後、37℃で1時間インキュベートした。次ぎに、300μlの培地Aを添加し、5%二酸化炭素ガス下、37℃で培養を開始した。1週間培養後、細胞を回収し、実施例1と同様の間接蛍光抗体法により、蛍光顕微鏡下で感染が確認される検体の最終希釈濃度を確認した。感染価はリード・ミンチの方法に従ってTCID50で表示した。結果を表1に示す。
【0016】
【表1】
【0017】
実施例3 感染価測定系のウイルス不活化試験への応用
ヒトパルボウイルス感染価TCID50108 /mlのウイルス液を30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃の水浴中で30分間インキュベートした後、残存するウイルス感染価を実施例2の感染価測定の方法に従って実施した。培地Aで2〜5x104 細胞/mlになるよう希釈したヒトパルボウイルス感染細胞KU812Ep6の懸濁液100μlを48ウエルプレートに分注した。次ぎに、各温度でインキュベートしたウイルス液を10 n 連続希釈し、それぞれ100μl添加後、37℃で1時間インキュベートした。次ぎに、300μlの培地Aを添加し、5%二酸化炭素ガス下、37℃で培養を開始した。1週間培養後、細胞を回収し、実施例1と同様の間接蛍光抗体法により、蛍光顕微鏡下で感染が確認される検体の最終希釈濃度を確認した。感染価はリード・ミンチの方法に従ってTCID50で表示した。結果を図1に示す。50℃30分の熱処理ではパルボウイルスB19は全く不活化されず、60℃30分の熱処理でも感染性は残存した。70℃30分の熱処理では感染性は全て失われた。
【0018】
【発明の効果】
本発明により、B19に感受性を示す細胞株を提供し、簡単な感染価測定方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図1】熱処理によるパルボウイルスB19の不活化を示す図である。
Claims (2)
- 赤芽球に分化し得る継代培養可能なヒト株化細胞であって、ヒトパルボウイルスB19をヒト細胞の培養条件下で前記ヒト細胞株に接種した後、培養することによりヒトパルボウイルスB19の感染を許し、ヒトパルボウイウルスB19の増殖が可能な細胞を10%以上含むことを特徴とするヒト細胞株KU812Ep6(寄託番号 FERM P-16310 )。
- 請求項1記載のヒト細胞株KU812Ep6(寄託番号 FERM P-16310 )に検体を接種した後、培養することを特徴とする検体のヒトパルボウイルスB19の感染価測定方法。
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