以下，對用以實施本發明之形態(以下稱為「本實施形態」)進行詳細說明。再者，本發明並不限定於以下之實施形態，可於其主旨之範圍內進行各種變化而實施。 本實施形態係關於一種微小病毒之生產方法，其係生產10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價且相對於雜質蛋白質濃度之病毒感染力價為5000(TCID
50
/mL)/(ng/mL)以上之高純度之微小病毒的方法，並且包括： (a)對各感染時細胞密度(A)預先另外算出宿主細胞感染微小病毒時之培養基材之細胞密度之每24小時之經時變化的步驟； (b)根據步驟(a)中預先算出之細胞密度之經時變化決定以下者的步驟： (b1)自感染起至細胞密度之經時變化之峰值時為止之時間(T
max
)、 (b2)T
max
時之細胞密度(B
max
)與A滿足以下之式(1)之A
1
、 (b3)此種A
1
中之最大之感染時細胞密度(A
max
)、及 (b4)滿足以下之式(2)之A
2
； B
max
/A
1
＞1.2 式(1) A
max
≧A
2
≧A
max
/10 式(2) (c)將微小病毒之種子病毒以感染多重性(MOI)成為0.001～0.1之方式接種至包含步驟(b)之(b4)所決定之A
2
之感染時細胞密度之宿主細胞及血清培養基之上述培養基材的步驟； (d)將步驟(c)中所獲得之包含宿主細胞及微小病毒之培養物培養由步驟(b)之(b1)所確定之T
max
以上且未達T
max
＋48小時之時間的步驟； (e)將步驟(d)之培養上清液更換為無血清培養基並培養12小時以上的步驟； (f)將藉由步驟(e)之培養所獲得之包含微小病毒之培養上清液加以回收的步驟；且 於上述步驟(b)中不存在滿足式(1)之A之情形時，採用其他感染時細胞密度A再次實施步驟(a)及步驟(b)。 步驟(a)：首先，對各感染時細胞密度(A)預先另外算出微小病毒宿主細胞感染微小病毒時之培養基材之細胞密度之每24小時之經時變化。 再者，宿主細胞可藉由繼代培養而增殖。 微小病毒係小型之線狀單鏈DNA病毒。DNA病毒係具有DNA作為基因組之病毒，利用宿主細胞之RNA聚合酶由基因組DNA合成mRNA，根據該mRNA合成蛋白質而進行增殖。DNA病毒之大部分為雙鏈DNA病毒，但微小病毒具有線狀單鏈DNA作為基因組。由於在單鏈DNA之狀態下無法進行病毒增殖，故而微小病毒具有除宿主細胞之RNA聚合酶以外亦使用DNA聚合酶經過雙鏈DNA之狀態而增殖的特有之增殖機制。 微小病毒科(Parvoviridae)病毒已知有屬於微小病毒亞科之3種屬、即病毒複製時無需輔助病毒而於宿主細胞內自主地增殖之微小病毒屬(Parvorivirus)、需要輔助病毒之依賴病毒屬(Dependovirus)、及紅血球特異性地感染之紅病毒屬(Erythrovirus)、及屬於濃核病毒亞科之3種屬、即感染昆蟲之濃核病毒屬(Densovirus)、相同病毒屬(Iteravirus)、及埃及斑蚊濃核病毒屬(Aedes aegypti densovirus)。本實施形態中所謂「微小病毒」係指微小病毒屬之病毒。由於微小病毒屬之病毒均具有類似之增殖機制，故而可共通地利用本實施形態之方法。 更具體而言，微小病毒屬之病毒由於不具有用以誘導停止增殖之細胞(靜止細胞)之DNA代謝之輔助蛋白質，又，亦不具有雙鏈之轉錄模板，故而於宿主細胞之DNA合成機制隨著S期之開始而活性化，從而有來自宿主細胞之DNA互補鏈之供給之前，無法表現自身之基因。此種結構之微小病毒屬之病毒由於無法誘導停止增殖之細胞之DNA代謝而利用其合成系統，故而具有感染正分裂增殖之S期之細胞並隨著細胞之增殖而增殖之增殖機制。 本實施形態中之微小病毒(微小病毒屬病毒)並無限定，包括豬微小病毒(Porcine Parvovirus PPV)、犬微小病毒(Canine Parvovirus CPV)、小鼠微小病毒(Minute Virus of Mice MVM)、大鼠病毒(Rat Virus RV)、H-1病毒(H-1 Virus H-1)、貓微小病毒(Feline Parvovirus FPV)、鵝微小病毒(Goose Parvovirus GPV)、牛微小病毒(Bovine Parvovirus BPV)。該等病毒具有類似之大小、基因組結構、病毒粒子結構、增殖機制，均可於本實施形態之方法中適宜地使用。 於本實施形態中，所謂「微小病毒」，只要未特別言及，則亦指微小病毒及包含其之微小病毒溶液之任一者。微小病毒溶液只要包含微小病毒，則無特別限定，例如包括培養感染微小病毒之宿主細胞後之培養上清液及自該培養上清液去除雜質後之病毒懸浮液。 本實施形態中之「宿主細胞」只要為對上述微小病毒具有敏感性(可感染微小病毒)之細胞，則其種類並無限定。作為對微小病毒具有敏感性之細胞，例如可列舉：對豬微小病毒具有敏感性之PK-13細胞、PK-15細胞、LCC-PK1細胞、ESK(embryonic swine kidney，胚胎豬腎)細胞、SK細胞、ST(swine testes，豬睾丸)細胞及MPK(Minipig kidney，小型豬腎)細胞、對犬微小病毒具有敏感性之MDCK(Mardin-Darby canine kidney，馬丁達比犬腎)細胞、FEA(feline embryonic fibroblasts，貓胚胎纖維母細胞)細胞、CRFK(Crandell feline kidney，克蘭德爾貓腎)細胞及FK-81細胞(embryonic feline kidney，胚胎貓腎)、對小鼠微小病毒具有敏感性之A9(mouse fibroblast，小鼠纖維母細胞)細胞及C6(rat glial，大鼠神經膠質)細胞、對大鼠病毒具有敏感性之NRK(normal rat kidney，正常大鼠腎)細胞、對H-1病毒具有敏感性之Molt-4(人類T細胞)細胞、AV-1(人類B細胞)細胞及NC-37(人類B細胞)細胞、對貓微小病毒具有敏感性之CRFK細胞、Mya 1細胞、NLFK(Norden Laboratories Feline Kidney，諾登實驗室貓腎)細胞及A72細胞、對鵝微小病毒具有敏感性之GEF(goose embryo fibroblast，鵝胚胎纖維母細胞)細胞、對牛微小病毒具有敏感性之BEK(bovine embryonic kidney，牛胚胎腎)細胞、水牛肺纖維母細胞及EBTr(bovine embryonic trachea，牛胚胎氣管)細胞等。宿主細胞較佳為可利用因感染而引起細胞改性之細胞。例如於豬微小病毒之情形時可使用豬之腎臟細胞，於犬微小病毒之情形時可使用犬腎臟細胞，但並不限定於該等，如上所述，只要為對微小病毒具有敏感性、較佳為引起細胞改性之細胞，則可廣泛地應用。又，於本實施形態中，作為「宿主細胞」，可使用具有無限增殖能力之動物細胞，可使用一般被稱為「細胞株(Cell line)」者。 於本實施形態中，就容易更換培養基之觀點而言，宿主細胞較佳為接著依賴性細胞。所謂「接著依賴性細胞」，係如肌肉細胞或器官細胞般若非接著於培養基質之狀態則無法生存、增殖之細胞。接著依賴性細胞係附著於培養燒瓶等培養基材之底面、壁面或被稱為微載體之載體而培養。燒瓶或培養皿一般用於小規模培養。使用微載體之培養具有逐次規模擴大較容易之優點(日本專利第3982843號 使用多孔質載體之動物細胞之逐次培養方法)。又，於本實施形態中，亦可使用浮游性細胞。「浮游性細胞」係於浮游狀態下增殖，於懸浮於培養基中之狀態下靜置或攪拌而培養。對於浮游性細胞，難以於回收培養上清液前進行更換培養基，因此較理想為附著於例如微載體而進行培養。 於本實施形態中，對於「培養基材」，其種類並不限定，包含培養容器、培養燒瓶、培養皿、旋轉瓶、培養盤等在細胞培養中通常使用之任意培養基材。 培養可使用杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM培養基)、伊格爾培養基(MEM培養基)、F-12培養基等在技術領域中通常使用之培養基、較佳為杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM培養基)，於5%左右之二氧化碳氣體環境下進行，只要為適於宿主細胞之增殖之環境培養條件，則並不限定於此。培養溫度可設為適於宿主細胞之增殖之溫度。已知微小病毒之宿主細胞係於33℃～39℃之範圍內增殖(「動物細胞培養法入門(生物化學實驗法29)松谷豐著/學會出版中心」p.14-15)，因此較佳為培養溫度可設為33℃以上且39℃以下，例如約為37℃。再者，較理想為使用以10%以下之比率含有包含細胞增殖因子之動物血清(胎牛血清或小牛血清、馬血清等)之培養基，較佳為使用與下述步驟(c)及(d)中之培養基相同之培養基。 於本實施形態中，所謂「感染力價」係表示病毒感染力價之單位，與病毒業界中常使用之「效價(Titer)」含義相同。由於病毒即便使用光學顯微鏡亦無法觀察到，故而無法如生物細胞般利用顯微鏡計測密度(個數/體積)。因此，於病毒之情形時以利用對宿主細胞之感染能力之感染力價作為單位，代替其量或濃度。例如若對宿主細胞之單層添加以適當之倍率稀釋而成之病毒懸浮液，則病毒之個數作為空斑被檢測出，可設為空斑形成單位(plaque forming unit＝pfu)/mL而測定感染力價。或者，可逐步進行包含病毒之液體之稀釋，將產生對宿主細胞之感染陽性之比率成為50%之濃度設為50%感染量(tissue culture infectious dose＝TCID
50
)/mL而測定感染力價。於本實施形態中，所使用之微小病毒均可設為TCID
50
/mL而測定感染力價，可以TCID
50
/mL之形式表述感染力價。再者，亦可藉由pfu/mL等其他單位而表示微小病毒之感染力價。對於可利用其他單位測定感染力價之微小病毒，可藉由對相同之微小病毒懸浮液同時利用兩者之單位進行感染力價測定，而容易地實施不同單位間之換算。 於本實施形態中，「宿主細胞感染微小病毒時之培養基材之細胞密度之每24小時之經時變化」之算出可藉由如下方式進行：於培養容器中接種以特定之多重感染性(MOI)感染微小病毒之宿主細胞後，每隔24小時回收一次細胞並計測培養基材中之細胞數。此處，所謂「感染多重性」係病毒之添加量相對於宿主細胞數之比率，以病毒感染力價/宿主細胞數表示。微小病毒感染宿主細胞後，細胞先增殖而培養基材中之細胞密度增加。一定期間後，細胞因由病毒所引起之敏化而開始死亡，因此細胞密度達到峰值後減少。對於宿主細胞感染微小病毒時之每個感染時細胞數算出此種經時變化。 細胞數之算出可使用從業者公知之方法而進行，例如可藉由如下方式進行。首先，對接著於細胞基材之細胞添加少量之胰蛋白酶等蛋白質分解酵素或EDTA等螯合劑或其等之混合液，而將宿主細胞自培養容器剝離。將剝離後之細胞溶液利用包含血清之培養基進行稀釋而抑制細胞剝離作用後，將稀釋後之溶液注入至血球計等中，並於顯微鏡下計測細胞數。亦可利用細胞分選儀或細胞計數器計測細胞數。 於本實施形態之步驟(a)中，對於複數種不同之感染時細胞密度(A)之各者，算出感染後之細胞密度之每24小時之經時變化。步驟(a)中之感染時細胞數之選定方法只要可於下述步驟(b)中選定滿足式(1)之A，則無特別限定。於步驟(b)中不存在滿足式(1)之A之情形時，可採用不同之A再次實施步驟(a)及(b)。 於一態樣中，例如可以宿主細胞之融合狀態之細胞密度(以下設為C)作為基準，選定C～C/100左右、例如C、C/3、C/10、C/30及C/100左右作為A。 步驟(b)：根據步驟(a)中預先算出之細胞密度之經時變化決定適當之感染時細胞密度。 (b1)由於感染微小病毒之宿主細胞於感染後一定期間內增殖，於達到峰值後因由病毒所引起之敏化而逐漸死亡，故而先確定自感染起至細胞密度之經時變化之峰值時為止之時間(T
max
)。 (b2)其次，決定T
max
時之細胞密度(B
max
)與A滿足以下之式(1)之A
1
。 B
max
/A
1
＞1.2 式(1) 於微小病毒特有之增殖機制中，由於病毒與宿主細胞同時增殖，故而認為至峰值時之T
max
為止自感染時細胞數(A)起細胞增殖至超過1.2、例如1.5倍以上、較佳為1.75以上、更佳為2.0倍以上之感染時細胞數A
1
較適當。此並不受理論限制，認為其原因在於：於A過大之情形時，由於變得接近融合狀態之細胞數，故而宿主細胞本身無法增殖，有B
max
/A變小之傾向，而每一細胞之病毒生產量降低。 (b3)其次，確定此種A
1
中之最大之感染時細胞密度(A
max
)， (b4)根據該A
max
決定滿足以下之式(2)之A
2
。 A
max
≧A
2
≧A
max
/10 式(2) 於A過小之情形時，由於峰值時之細胞密度(B
max
)不受培養基材之限制，故而B
max
/A固定為較高之值，而每一細胞之病毒生產量達到頂點。另一方面，由於病毒濃度取決於宿主細胞數，故而認為有A越小病毒濃度越低之傾向。 因此，認為適當之感染時之細胞數A係於步驟(a)中選定之若干A中之B
max
/A滿足式(1)之A
1
中最大之A(A
max
)。進而，認為即便將感染時細胞密度自該A
max
降低1/10左右亦可回收高感染力價且高純度之微小病毒。其並不受理論限制，認為其原因在於：無論A自A
max
減少多少，與A之減少相對應每一細胞之病毒生產量均上升，因此最終所獲得之微小病毒濃度不變。 步驟(c)：繼而，將微小病毒之種子病毒以MOI成為0.001～0.1之方式接種至包含步驟(b)中所決定之A
2
之適當之細胞密度之宿主細胞及血清培養基之培養基材。 於步驟(c)中，首先，可以少於A
2
之細胞密度將宿主細胞預先接種至細胞基材並培養一定時間後設為A
2
之細胞密度，或者將成為A
2
之細胞密度之量之含有宿主細胞之血清培養基接種至培養基材，藉此製備培養基材。作為血清培養基，可使用於杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM培養基)、伊格爾培養基(MEM培養基)、F-12培養基等中含有例如0.5%～15%、較佳為1%～10%之胎牛血清、小牛血清、馬血清等動物血清的培養基。 於本實施形態中，如上所述，根據感染微小病毒之宿主細胞之細胞密度之經時變化決定感染時細胞數為重要之特徵，而非未感染病毒之宿主細胞之倍增時間或融合狀態之參數。於微小病毒之情形時，於作為先前之病毒生產方法之常識的使融合狀態之宿主細胞感染上病毒之方法中，未見宿主細胞之增殖，宿主細胞僅經過因感染所引起之細胞改性便趨於死亡，相對於此，於本實施形態中，藉由以留有於微小病毒感染後宿主細胞亦增殖一定倍率以上之裕度的宿主細胞密度進行病毒感染，成功獲得高感染力價且高純度之微小病毒。作為以往之見解，存在以極低之細胞密度開始感染而同時進行宿主細胞增殖與微小病毒增殖之技術(WO2014/080676)，根據本實施形態，可獲得較該技術更高感染力價且高濃度之微小病毒。 其次，於步驟(c)中，將微小病毒之種子病毒以感染多重性(MOI)成為0.001～0.1之方式接種至如上所述般製備之包含A
2
之細胞密度之宿主細胞之培養基材。微小病毒之種子病毒之接種可於將上述宿主細胞接種至培養基材之同時以MOI成為0.001～0.1之方式接種種子病毒，亦可以更低之細胞密度開始宿主細胞培養，於成為上述A
2
之細胞密度之時間點以MOI成為0.001～0.1之方式接種種子病毒。上述特定之MOI之範圍為一般使微小病毒增殖時所使用之值之範圍，若為該範圍內，則不影響回收高濃度高純度之病毒之目的。 步驟(d)：於微小病毒之種子病毒之接種後，將包含上述微小病毒及宿主細胞之培養物培養特定時間。於步驟(d)中，宿主細胞與微小病毒同時進行增殖。培養時間為上述步驟(b)之(b1)所確定之自病毒感染起至細胞密度之經時變化之峰值時為止之時間(T
max
)以上且未達T
max
＋48小時之時間，例如為T
max
以上且T
max
＋36小時以下之時間，較佳為T
max
以上且T
max
＋30小時以下之時間，更佳為T
max
以上且T
max
＋24小時以下之時間。於上述特定時間之培養中，感染宿主細胞之種子病毒之大部分於宿主細胞中借助宿主細胞之功能進行自我複製，而留於細胞內。 步驟(e)：於步驟(d)中培養特定時間之培養上清液中含有大量源自血清之雜質蛋白質，感染上病毒之宿主細胞之大部分依舊接著於培養基材。於本實施形態中，可藉由將用於培養之血清培養基更換為無血清培養基，而去除雜質蛋白質，回收高純度之微小病毒。作為無血清培養基，可使用於對上述步驟(d)所記載之培養基中不添加血清者。 藉由在更換培養基後培養12小時以上、較佳為18小時以上、更佳為24小時以上，而自感染上病毒之宿主細胞釋出病毒，獲得包含病毒之培養上清液。又，認為即便於更換培養基後培養36小時以上亦不影響所獲得之微小病毒之感染力價。因此，就培養成本之方面而言，更換培養基後之培養時間較佳為設為36小時以下。 步驟(d)及(e)中之培養時之培養溫度可設為適於宿主細胞之增殖之溫度，較佳可設為33℃以上且39℃以下，例如約為37℃。又，由於較理想為於與步驟(a)中之培養條件相同之條件下進行培養，故而較理想為設為與步驟(a)中預先算出感染微小病毒之宿主細胞之細胞密度時之培養溫度相同程度的培養溫度。 步驟(f)：培養上述特定時間後，將包含微小病毒之培養上清液加以回收。再者，作為先前方法，有將感染宿主細胞反覆冷凍融解等將感染宿主細胞破壞而回收病毒之方法，於該方法中於破壞時宿主細胞內部之雜質被大量釋出。另一方面，如本實施形態般，即便為回收培養上清液之方法亦會混入源自因病毒感染而崩壞之宿主細胞之雜質，但雜質量明顯少於進行宿主細胞之冷凍融解破壞之情形。又，藉由將微小病毒及宿主細胞之培養上清液更換為無血清培養基，源自血清之雜質量亦明顯少於僅利用血清培養基進行培養之情形。因此，於本實施形態中，可自培養上清液中簡便地回收高感染力價且高純度之微小病毒。 藉由上述本實施形態之方法，可獲得10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價微小病毒。 步驟(f)之回收可包括去除游離之宿主細胞或宿主細胞之碎片等雜質等之步驟，該去除步驟可藉由施加已知條件下之低速離心分離而實施。或者/進而可利用孔徑0.1～0.5 μm、較佳為0.2～0.45 μm之膜過濾而去除雜質。 步驟(f)之回收較佳為可不將培養上清液濃縮而進行。藉此，不會發生下述濃縮所伴隨之雜質之濃縮，可容易地獲得高純度之微小病毒。 藉由如上所述進行微小病毒之培養、回收，可獲得微小病毒之感染力價(TCID
50
/mL)與雜質蛋白質濃度(ng/mL)之比超過5000：1、較佳為超過9000：1之高純度之微小病毒。作為「雜質」，可列舉游離之宿主細胞或宿主細胞之碎片、源自宿主細胞或血清成分之蛋白質等，由於游離之宿主細胞或宿主細胞之碎片之尺寸較大，可藉由上述離心分離或過濾等已知之方法而容易地去除，故而於本實施形態之一態樣中，使用蛋白質濃度作為表示雜質之存在比率之指標。 雜質蛋白質濃度之測定可使用從業者公知之方法而進行，例如可如下述實施例中所示，使用市售之蛋白質分析試劑等藉由BCA法而進行。 本實施形態又關於一種高純度且高感染力價之非濃縮之源自細胞培養上清液之微小病毒。 於本實施形態中，所謂濃縮係指與濃縮前相比濃縮後之病毒濃度增加，即感染力價增加。於一態樣中，本實施形態之微小病毒係不經過此種濃縮而由培養上清液獲得之無濃縮所伴隨之雜質之濃縮的高純度之微小病毒。 具體而言，作為濃縮操作，可列舉：銫密度梯度超離心、蔗糖密度梯度離心等密度梯度離心；超離心分離；陽離子交換管柱層析；超濾；切向流過濾；化學誘導性沈澱；病毒吸附型層析；聚合物誘導性凝聚；膜吸附等。 作為除濃縮以外之操作，可列舉：非超離心分離之離心分離(10,000g以下且100,000×g・h以下之離心分離)、除菌膜過濾等，更具體而言，可列舉下述實施例中之精製操作。 如上所述，藉由本實施形態可獲得雜質蛋白質濃度較低之高純度且10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價之微小病毒，可消除因使用微小病毒時之各種感染力價不足所引起之弊端。以下，對代表性之3種用途進行相關說明。 於第1種用途、即將病毒用於抗病毒藥探索等研究用途之情形時，雜質之存在有產生抑制目標反應等不良影響之虞。因此，預先生產較實際上供於試驗之病毒感染力價更高之感染力價之病毒，並稀釋至雜質不產生影響之程度而用於研究。為了能夠測定較高之病毒抑制活性，必須以較高之病毒感染力價供於試驗，因此必須預先生產較其更高之感染力價之病毒。即，較理想為利用細胞培養所獲得之病毒之感染力價較高。藉由本實施形態，可獲得10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價之微小病毒，藉此於使用微小病毒之抗病毒藥研究中，可於稀釋後作為研究材料而提供，而可減輕因雜質所引起之預料外之反應或干擾。 於第2種用途、即為了評價生物製劑之製造步驟之病毒清除率而生產病毒之情形時，亦較理想為病毒為高純度且高感染力價。如上所述，該病毒清除率試驗之要求為：第一，不產生過濾器之堵塞之程度之病毒懸浮液添加量；第二，可顯示出所評價之步驟之病毒清除率數值即對數去除率(LRV)為4以上之添加量。為了使LRV為4以上，必須向供於病毒去除過濾器步驟之半成品中以病毒感染力價成為10
4
TCID
50
/mL之方式添加病毒，實際上，考慮到病毒感染力價之定量誤差、或去除病毒粒子之聚集體之預濾器中之損失、及病毒檢測下限上升之可能性(於過濾溶液具有細胞毒性之情形時，必須將過濾溶液稀釋而測定病毒感染力價，導致病毒檢測下限上升)，必須以成為10
6
TCID
50
/mL以上之方式添加病毒。於以體積比計添加0.1%而設為10
6
TCID
50
/mL以上時，原本之病毒懸浮液必須為10
9
TCID
50
/mL以上。藉由本實施形態，可獲得高純度之10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價之微小病毒，藉此於評價各步驟之微小病毒清除率時，可顯著減少微小病毒之添加，而可消除因源自微小病毒之雜質所引起之過濾器之堵塞之問題。再者，如上所述，近年來，作為病毒去除過濾器之新評價基準，使每單位膜面積之病毒負載量較先前增加時之病毒去除性、例如負載有10
13
TCID
50
/m
2
以上之病毒時之病毒去除性備受關注。對於藉由先前方法可回收之10
8
TCID
50
/mL之病毒，僅能藉由將以體積比1%添加之溶液1 L利用0.001 m
2
之過濾器進行過濾而負載病毒(WO2014/080676)。藉由本實施形態，可獲得高純度之10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價之微小病毒，藉此可於與上述相同之過濾條件下實現10
13
TCID
50
/m
2
以上之病毒負載量。 又，即便於第3種用途、即疫苗生產中，亦藉由使利用細胞培養所生產之病毒為高純度且高感染力價，而減輕對其後之病毒疫苗精製步驟之負載，而對製造有利。若純度較低，則會對精製步驟施加負載，又，若病毒感染力價較低，則由於雜質濃度相對變高故而對精製步驟施加負載，而對製造不利。藉由本實施形態，可獲得高純度之10
9
TCID
50
/mL以上之高感染力價之微小病毒，藉此即便於微小病毒之疫苗生產中，精製原料中之疫苗量亦飛躍性地增多，因此可更有效率且更低成本地實施疫苗精製步驟。 [實施例] 以下，基於實施例及比較例更詳細地說明本發明。再者，此處所示之實施例為代表例，本發明並不限定於該實施例。 [實施例1 微小病毒感染後之細胞密度之經時變化1] 使用PK-15細胞(自ATCC購買，目錄編號CCL-33，微小病毒敏感性之接著依賴性細胞)作為豬微小病毒(PPV)之宿主細胞，將其利用向杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM培養基，life technology公司製造，製造編號11965-092)中添加有10%胎牛血清之培養基(以下稱為「血清培養基」；於下述實施例中亦相同)，於37℃、5%CO
2
環境下，使用75 cm
2
底面積、容量15 mL之組織培養用燒瓶(以下稱為「燒瓶」；於下述實施例中亦相同)進行繼代培養。 繼而，自上述燒瓶剝離PK-15細胞，將1.8×10
7
細胞/燒瓶(試樣1a)、6.0×10
6
細胞/燒瓶(試樣1b)、3.0×10
6
細胞/燒瓶(試樣1c)、1.2×10
6
細胞/燒瓶(試樣1d)、6.0×10
5
細胞/燒瓶(試樣1e)、及1.0×10
5
細胞/燒瓶(試樣1f)之細胞密度(A)之宿主細胞與10 mL之血清培養基一併分注至新燒瓶中。再者，認為該等感染時細胞密度A於將PK-15細胞之融合增殖時之細胞密度(C)設為3.0×10
7
細胞/燒瓶之情形時分別為C/1.67、C/5、C/10、C/25、C/50及C/300。 針對各細胞密度之條件分注各3個燒瓶。繼而，將PPV以成為MOI＝0.01之方式接種至該各燒瓶，並於37℃、5%CO
2
環境下進行培養。於感染開始後培養24小時、48小時及72小時之時間點回收位於燒瓶底面之細胞，並算出細胞密度(B)。 細胞數之算出係以如下方式進行。首先，對接著於細胞基材之細胞添加少量之胰蛋白酶等蛋白質分解酵素或EDTA等螯合劑或其混合液，而將宿主細胞自培養容器剝離。將剝離後之細胞溶液利用包含血清之培養基進行稀釋，而抑制細胞剝離作用後，將稀釋後之溶液注入至血球計等中，並於顯微鏡下計測細胞數。 將病毒感染時之細胞密度(A＝細胞數/燒瓶)及根據該A與培養每24小時之細胞密度(B＝細胞數/燒瓶)所算出之比(B/A)示於表1。如此，通常細胞係若感染上病毒則隨著時間經過而逐漸死亡者，但感染微小病毒之細胞繼續細胞增殖，於任一感染時細胞密度A之情形時，至經過48小時之時間點為止整體之細胞數均增加。然而，其後，於經過72小時之時間點細胞因病毒敏化而死亡，整體之細胞數顯著減少。 又，於所試驗之A之範圍內，可見感染時細胞密度越高，感染後之細胞增殖速度越慢之傾向，但另一方面，並非感染時細胞密度越低，感染後之細胞增殖速度越高。 [表1] 表1 培養微小病毒感染細胞後之細胞密度(B＝細胞/燒瓶)與病毒感染時細胞密度(A＝細胞/燒瓶)之比(B/A)
[實施例2 培養微小病毒感染細胞後之更換培養基1] 以與實施例1相同之方式將PK-15細胞進行繼代培養，於新燒瓶中將與試樣1a～1f相同之細胞密度之宿主細胞與10 mL之血清培養基一併針對各細胞密度之條件分注各6個燒瓶(試樣2a～2f)。繼而，將PPV以成為MOI＝0.01之方式接種至該各燒瓶中，並於37℃、5%CO
2
環境下進行培養。於感染開始後培養48小時、及72小時之時間點對每1個燒瓶去除培養上清液，並將燒瓶底面之細胞利用未添加血清之DMEM培養基(以下稱為「無血清培養基」)進行清洗後，添加10 mL之無血清培養基，進而進行培養，於24小時後、48小時後、及72小時後對每1個燒瓶回收上述無血清培養基之培養上清液。將所回收之無血清培養上清液進行3000 rpm、20分鐘離心，並將上清液組分利用0.45 μm過濾器(Millipore公司製造之Millex-HV)進行過濾。 使用96孔板，藉由利用因病毒所引起之細胞改性之CPE法且藉由TCID
50
法而測定PPV感染力價。50%感染力價之計算係藉由Reed-Muench法(醫科病毒學，2000. 南江堂. 171-172)進行。將其結果示於表2。表2之數值係以對數值表示感染力價。例如所謂9.1，表示10
9.1
TCID
50
/mL。如表2所示，所獲得之病毒之感染力價於試樣2b～2e中為10
9
TCID
50
/mL以上之較高之感染力價，於試樣2a及2f中於任一條件下均未達10
9
TCID
50
/mL。 [表2] 表2 改變更換培養基前後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中PPV效價(單位：log[TCID
50
/mL])
進而，利用Thermo Scientific公司之蛋白質分析試劑(BCA法)測定雜質蛋白質濃度，並求出PPV感染力價(TCID
50
/mL)與雜質蛋白質濃度(ng/mL)之比。將結果示於表3。如表3所示，於試樣2b～2e中雜質蛋白質之比率非常低，獲得高純度之微小病毒。另一方面，於試樣2a及2f中，與試樣2b～2e相比，所獲得之微小病毒中之雜質蛋白質之比率更高。 [表3] 表3 改變更換培養基前後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中PPV效價(單位：log[TCID
50
/mL])與雜質蛋白質(ng/mL)之比
根據上述實施例1及2之結果，決定獲得高感染力價且高純度之微小病毒之培養條件。 首先，根據實施例1，對各感染時細胞密度(A)記錄感染後之細胞密度之每24小時之經時變化，記錄與各密度對應之峰值時(T
max
＝於本實施例中為48小時)之細胞密度(B
max
)，並算出成為感染後之細胞增殖速度之標準之B
max
/A之比，結果認為若採用B
max
/A至少大於1.2之感染時細胞密度(例如為1.5以上，較佳為1.75以上，更佳為2.0以上)，則獲得高感染力價且高純度之微小病毒。即，為了獲得高感染力價且高純度之微小病毒，認為A
1
與B
max
滿足以下之式(1)較為重要。 B
max
/A
1
＞1.2 式(1) 又，認為若為B
max
/A至少大於1.2之感染時細胞密度中之最大之密度(A
max
)之感染時細胞密度，則獲得高感染力價且高純度之微小病毒。進而，認為即便將該密度降低1/10左右，與A之減少相對應地每一個細胞之病毒生產量亦上升，因此最終所獲得之微小病毒濃度不變而可回收高感染力價且高純度之微小病毒。即，為了獲得高感染力價且高純度之微小病毒，認為宿主細胞之感染時細胞密度滿足以下之式(2)較為重要。 A
max
≧A
2
≧A
max
/10 式(2) 根據實施例2，認為若採用上述範圍之感染時細胞密度，於細胞密度之經時變化成為峰值之時間點或自峰值時經過一定時間後，將培養上清液更換為無血清培養基，並培養一定時間、例如為12小時以上、較佳為18小時以上、更佳為24小時以上，則獲得高感染力價且高純度之微小病毒。 [比較例1] 以與實施例1相同之方式將PK-15細胞進行繼代培養，於新燒瓶中將與試樣1b～1e相同之細胞密度之宿主細胞與10 mL之血清培養基一併針對各細胞密度之條件分注各6個燒瓶(試樣3b～3e)。繼而，將PPV以成為MOI＝0.01之方式接種至該各燒瓶中，並於37℃、5%CO
2
環境下進行培養。於感染開始後培養96小時之時間點對每1個燒瓶去除培養上清液，並將燒瓶底面之細胞利用未添加血清之DMEM培養基(以下稱為「無血清培養基」)進行清洗後，添加10 mL之無血清培養基，進而進行培養，於24小時後、48小時後、及72小時後對每1個燒瓶回收上述無血清培養基之培養上清液。將所回收之無血清培養上清液進行3000 rpm、20分鐘離心(1710×g，20分鐘＝570×g・h)，並將上清液組分利用0.45 μm過濾器(Millipore製造)進行過濾。 使用96孔板，藉由與實施例2相同之方法測定PPV感染力價。將其結果示於表4。如表4所示，與感染時細胞密度相同之試樣2b～2e相比，試樣3b～3e中所獲得之病毒之感染力價於任一條件下均較低，未達到10
9
TCID
50
/mL以上。表明更換培養基前之培養時間會影響所獲得之病毒之感染力價。 [表4] 表4 感染後培養96小時，其後改變更換培養基後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中PPV效價(單位：log[TCID
50
/mL])
進而，以與實施例2相同之方式求出PPV感染力價(TCID
50
/mL)與雜質蛋白質濃度(ng/mL)之比。將其結果示於表5。與感染時細胞密度相同之試樣2b～2e相比，試樣3b～3e中所獲得之微小病毒中之雜質蛋白質之比率更高。表明更換培養基前之培養時間亦會影響所獲得之病毒之純度。 根據實施例2及比較例1之結果，認為若於自細胞密度之經時變化成為峰值之時間點培養未達48小時、例如為36小時以內、較佳為30小時以內、更佳為24小時以內之時間後更換為無血清培養基，則獲得高純度及高感染力價之微小病毒。 [表5] 表5 感染後培養96小時，其後改變更換培養基後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中PPV效價(單位：log[TCID
50
/mL])與雜質蛋白質(ng/mL)之比
[實施例3 微小病毒感染後之細胞密度之經時變化2] 使用A9細胞(自ATCC購買，目錄編號CCL-1.4，微小病毒敏感性之接著依賴性細胞)作為小鼠微小病毒(MVM)之宿主細胞，將其利用血清培養基於37℃、5%CO
2
環境下使用燒瓶進行繼代培養。 繼而，自上述燒瓶剝離A9細胞，將6.0×10
6
細胞/燒瓶(試樣4a)、3.0×10
6
細胞/燒瓶(試樣4b)、1.5×10
6
細胞/燒瓶(試樣4c)、6.0×10
5
細胞/燒瓶(試樣4d)、3.0×10
5
細胞/燒瓶(試樣4e)、及1.0×10
5
細胞/燒瓶(試樣4f)之細胞密度(A)之宿主細胞與10 mL之血清培養基一併分注至新燒瓶中。再者，認為該等感染時細胞密度A於將A9細胞之融合增殖時之細胞密度(C)設為3.0×10
7
細胞/燒瓶之情形時分別為C/5、C/10、C/20、C/50、C/100及C/300。 針對各細胞密度之條件分注各3個燒瓶。繼而，將MVM以成為MOI＝0.01之方式接種至該各燒瓶，並於37℃、5%CO
2
環境下進行培養。於感染開始後培養72小時、96小時及120小時之時間點回收位於燒瓶底面之細胞，並算出細胞密度(B)。 細胞數之算出係以如下方式進行。首先，對接著於細胞基材之細胞添加少量之胰蛋白酶等蛋白質分解酵素或EDTA等螯合劑或其混合液，而將宿主細胞自培養容器剝離。將剝離後之細胞溶液利用包含血清之培養基進行稀釋，而抑制細胞剝離作用後，將稀釋後之溶液注入至血球計等中，並於顯微鏡下計測細胞數。 將病毒感染時之細胞密度(A＝細胞數/燒瓶)及根據該A與培養每24小時之細胞密度(B＝細胞數/燒瓶)所算出之比(B/A)示於表6。如此，通常細胞係若感染上病毒則隨著時間之經過而逐漸死亡者，但感染微小病毒之細胞繼續細胞增殖，於任一感染時細胞密度A之情形時，至經過72小時之時間點為止，整體之細胞數均增加。然而，其後，於經過96小時之時間點細胞因病毒敏化而死亡，整體之細胞數減少。 又，於所試驗之A之範圍內，可見感染時細胞密度越高感染後之細胞增殖速度越低之傾向，但另一方面，並非感染時細胞密度越低，感染後之細胞增殖速度越高。 [表6] 表6 培養微小病毒感染細胞後之細胞密度(B＝細胞/燒瓶)與病毒感染時細胞密度(A＝細胞/燒瓶)之比(B/A)
[實施例4 培養微小病毒感染細胞後之更換培養基2] 以與實施例3相同之方式將A9細胞進行繼代培養，於新燒瓶中將與試樣4a～4f相同之細胞密度之宿主細胞與10 mL之血清培養基一併針對各細胞密度之條件分注各6個燒瓶(試樣5a～5f)。繼而，將MVM以成為MOI＝0.01之方式接種至該各燒瓶，並於37℃、5%CO
2
環境下進行培養。於感染開始後培養96小時、及120小時之時間點對每1個燒瓶去除培養上清液，並將燒瓶底面之細胞利用無血清培養基進行清洗後，添加10 mL之無血清培養基，進而進行培養，於24小時後、48小時後、及72小時後對每1個燒瓶回收上述無血清培養基之培養上清液。將所回收之無血清培養上清液進行3000 rpm、20分鐘離心，並將上清液組分利用0.45 μm過濾器(Millipore公司製造之Millex-HV)進行過濾。 將藉由與實施例2相同之方法測定MVM感染力價所獲得之結果示於表7。表7之數值係以對數值表示感染力價。例如所謂9.1，表示10
9.1
TCID
50
/mL。如表7所示，所獲得之病毒之感染力價於試樣5b～5e中為10
9
TCID
50
/mL以上之較高之感染力價，於試樣5a及5f中於任一條件下均未達10
9
TCID
50
/mL。 [表7] 表7 改變更換培養基前後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中MVM效價(單位：log[TCID
50
/mL])
進而，利用Thermo Scientific公司之蛋白質分析試劑(BCA法)測定雜質蛋白質濃度，並求出MVM感染力價(TCID
50
/mL)與雜質蛋白質濃度(ng/mL)之比。將結果示於表8。如表8所示，於試樣5b～5e中雜質蛋白質之比率非常低，獲得高純度之微小病毒。另一方面，於試樣5a及5f中，與試樣5b～5e相比，所獲得之微小病毒中之雜質蛋白質之比率更高。 [表8] 表8 改變更換培養基前後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中MVM效價(單位：log[TCID
50
/mL])與雜質蛋白質(ng/mL)之比
根據上述實施例3及4之結果，確定獲得高感染力價且高純度之微小病毒之培養條件。 首先，根據實施例3，對各感染時細胞密度(A)記錄感染後之細胞密度之每24小時之經時變化，記錄與各密度對應之峰值時(T
max
＝於本實施例中為96小時)之細胞密度(B
max
)，並算出成為感染後之細胞增殖速度之標準之B
max
/A之比，結果認為若採用B
max
/A至少大於1.2之感染時細胞密度(例如為1.5以上，較佳為1.75以上，更佳為2.0以上)，則可獲得高感染力價且高純度之微小病毒。即，為了獲得高感染力價且高純度之微小病毒，認為A
1
與B
max
滿足以下之式(1)較為重要。 B
max
/A
1
＞1.2 式(1) 又，認為若為B
max
/A至少大於1.2之感染時細胞密度中之最大之密度(A
max
)之感染時細胞密度，則可獲得高感染力價且高純度之微小病毒。進而，認為即便將該密度降低1/10左右，與A之減少相對應地每一個細胞之病毒生產量亦上升，因此最終所獲得之微小病毒濃度不變，而可回收高感染力價且高純度之微小病毒。即，為了獲得高感染力價且高純度之微小病毒，認為宿主細胞之感染時細胞密度滿足以下之式(2)較為重要。 A
max
≧A
2
≧A
max
/10 式(2) 根據實施例4，認為若採用上述範圍之感染時細胞密度，於細胞密度之經時變化成為峰值之時間點或自峰值時經過一定時間後，將培養上清液更換為無血清培養基，並培養一定時間、例如為12小時以上、較佳為18小時以上、更佳為24小時以上，則可獲得高感染力價且高純度之微小病毒。 [比較例2] 以與實施例3相同之方式將A9細胞進行繼代培養，於新燒瓶中將與試樣4b～4e相同之細胞密度之宿主細胞與10 mL之血清培養基一併針對各細胞密度之條件分注各6個燒瓶(試樣6b～6e)。繼而，將MVM以成為MOI＝0.01之方式接種至該各燒瓶，並於37℃、5%CO
2
環境下進行培養。於感染開始後培養144小時之時間點對每1個燒瓶去除培養上清液，並將燒瓶底面之細胞利用無血清培養基進行清洗後，添加10 mL之無血清培養基，進而進行培養，於24小時後、48小時後、及72小時後對每1個燒瓶回收上述無血清培養基之培養上清液。將所回收之無血清培養上清液進行3000 rpm、20分鐘離心(1710×g，20分鐘＝570×g・h)，並將上清液組分利用0.45 μm過濾器(Millipore製造)進行過濾。 使用96孔板，藉由與實施例2相同之方法測定MVM感染力價。將其結果示於表9。如表9所示，若與感染時細胞密度相同之試樣5b～5e相比，則試樣6b～6e中所獲得之病毒之感染力價於任一條件下均較低，而未達到10
9
TCID
50
/mL以上。表明更換培養基前之培養時間會影響所獲得之病毒之感染力價。 [表9] 表9 感染後培養144小時，其後改變更換培養基後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中MVM效價(單位：log[TCID
50
/mL])
進而，以與實施例2相同之方式求出MVM感染力價(TCID
50
/mL)與雜質蛋白質濃度(ng/mL)之比。將其結果示於表10。與感染時細胞密度相同之試樣5b～5e相比，試樣6b～6e中所獲得之微小病毒中之雜質蛋白質之比率更高。表明更換培養基前之培養時間亦會影響所獲得之病毒之純度。 根據實施例4及比較例2之結果，認為若於自細胞密度之經時變化成為峰值之時間點培養未達48小時、例如為36小時以內、較佳為30小時以內、更佳為24小時以內之時間後進行無血清更換培養基，則可獲得高純度及高感染力價之微小病毒。 [表10] 表10 感染後培養144小時其後改變更換培養基後之培養時間之情形時之微小病毒感染細胞之培養上清液中MVM效價(單位：log[TCID
50
/mL])與雜質蛋白質(ng/mL)之比
[產業上之可利用性] 藉由本發明之方法，可獲得高純度且高感染力價之微小病毒。該微小病毒可利用於抗病毒藥探索等之病毒研究材料之製備、或生物製劑(醫藥品)製造步驟中之病毒清除率安全性評價所使用之病毒之製備、又疫苗生產等，本發明具有該等領域中之產業上之可利用性。 本申請案係主張基於2015年11月6日提出申請之日本專利申請第2015-218775號之優先權者，其內容係作為參照而併入本文中。