JP3164351B2

JP3164351B2 - 疾患モデルおよびワクチンに使用するプロトタイプＦｅＬＶの分離体

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Publication number: JP3164351B2
Application number: JP32162789A
Authority: JP
Inventors: エー．フーバーエドワード; アイ．マリンズジェームズ
Original assignee: ハーバードユニバーシティ; コロラドステイトユニバーシティリサーチファウンデイション
Priority date: 1988-12-13
Filing date: 1989-12-13
Publication date: 2001-05-08
Anticipated expiration: 2016-05-08
Also published as: IE74875B1; EP0699758A1; AU4616289A; EP0377842B1; DK631089A; IE893974L; DE68929419D1; EP0377842A1; CA2005311C; AU661134B2; ES2084596T3; DK172633B1; CA2005311A1; DE68929419T2; JPH03117490A; ATE221119T1; ATE128730T1; DK631089D0; AU3710493A; DE68924478D1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、一般には、FeLVの様々なクローン、およ
びそれらのワクチンとしての使用ならびに疾患モデルに
おける使用に関する。

〔従来の技術〕

レトロウイルスは、エンベロープを持つRNAウイルス
の大きな一群であって、これらは数多くの特異的な宿主
哺乳動物に侵入する。これらのウイルスは、さまざまな
機構によって感染し、しばしば重篤な疾患を引き起こ
し、それらの構造中に共通のエレメントを有する。レト
ロウイルス群は、＋鎖RNAダイマー（ssRNA）から成り、
それらプロウィルスのDNA中間体の中に長鎖の同方向末
端反復配列構造（LTR）ならびにキャプシドタンパクを
コードするゲノム（gag遺伝子）、逆転写酵素ならびに
インテグラーゼ機能（pol遺伝子）、および膜エンベロ
ープ遺伝子（env）を有する。一定のウイルスでは、オ
ープンリーディングフレームがあって、特異的な機能の
タンパク質および共通遺伝子の機能をコードすることが
示されている。

ネコ科の白血病ウイルス（FeLV）は、異型交配ネコの
一連のリンパ性網内疾患を引き起こす。それらの疾患に
は、リンパ肉腫、白血病、再生不良性貧血、脊髄形成異
常、およびネコの後天性免疫不全症候群などが挙げられ
る（Hardyら、Cancer Res.36:582,1976:Hardy「ネコ白
血病ウイルス（Feline Leukemia Virus）」Hardy,Esse
x,McCelland編（Elsevir/North Holland,1980）,3−31
ページ;Hoover,Rojko,Olsen「ネコ白血病」Olsen編（CR
C Press,Boca Raton,Fla.,1980）,32−51ページ;Hardy
およびEssex,Prog.Allergy,37:353,1986）。FeLVゲノム
は、キャプシドタンパクをコードするgag遺伝子、プロ
テアーゼの逆転写酵素ならびにインテグラーゼをコード
するpol遺伝子、およびgp70ならびにp15Eウイルスのエ
ンベロープタンパクをコードするenv遺伝子から成る１
本鎖RNAの２量体（60−70S）である。その他のレトロウ
イルスでは、感受性細胞をFeLVで感染させた場合（in v
ivoおよびin vitro）、上記のゲノムが２本鎖DNAコピー
中に転写されてから、そのコピーが細胞のDNAに運ば
れ、５′−LTR（長鎖の同方向末端反復配列）−gag−po
l−env−LTR−３′領域に組み込まれたプロウイルスと
なる。そして、この挿入型プロウイルスは、FeLVRNAお
よび最終的に感染性のヴィリオンを産生する鋳型として
機能する。

FeLVは、ウイルスの干渉作用ならびに中和能、および
ネコの母集団間で著しく異なる亜群の分布に基づいて、
A,BならびにＣの各亜群に分類されている。亜群Ａのウ
イルスは、天然に存在するすべての感染物を検査するこ
と、そこに、単独または亜群ＢならびにＣと共に見い出
されている。亜群Ｂは、全感染物の約40％に見い出さ
れ、感染物の約１％に見い出される亜群Ｃは、亜群Ａな
らびにＢ、亜群ＡならびにＣ、または亜群A,Bならびに
Ｃの混合感染物として存在する。決定された亜群は、in
vitroでの感染宿主域、およびネコの病原性において相
関関係がある。例えば、FeLV−Ａ分離物は、ネコの細胞
増殖を抑制することがあり、その病原性は最も低い。Fe
LV−Ｂ分離物は、ヒトおよびイヌの線維芽様細胞などの
異種細胞中で成長し、増殖性の疾患に高頻度で見い出さ
れる。また、FeLV−Ｃ分離物は、まれにしか見られない
が、その宿主域が、ヒト、イヌならびにモルモット細胞
を含む広い範囲に広がっており、再生不良性貧血を誘発
し得る。

〔発明が解決しようとする課題〕

家ネコにおけるFeLV誘発疾患の細胞障害効果の観点で
は、感受性動物へのワクチン投与によってFeLVの感染を
予防することが、獣医学の研究者にとって最優先の課題
である。こういったワクチンを産生するための数々の試
みは、ほとんど失敗であった。実際、そのワクチンは、
１種類（Leukocell^m,Norden Laboratories,Lincoln,Neb
raska）だけ市販されているが、効果が疑わしいために
厳しい批判を受けている（Perdersonら、Feline Practi
ce 15:7−20,1985）。この発明は、適切なFeLVワクチン
産生の技術面での要求を満たし、その他の関連する利点
を提供する。すなわち、高い感染性を有するFeLV−Ａの
原型ウイルス、分子レベルのクローニングによる免疫不
全症誘発性の原型FeLV、およびネコならびにヒトを対象
としてレトロウイルス誘発性免疫不全症候群ならびに白
血病の研究に使用される疾患モデルを定義することなど
が含まれる。

〔課題を解決するための手段〕

要約すると、この発明は、（ａ）感受性が高く、病原
性が最低の原型ウイルス、（ｂ）複製能を欠き、ネコに
AIDSと類似した致死的な免疫不全症を引き起こす変異体
ゲノム（Hoover,Blood 70:1880−1892,1987;Overbaugh
ら、Science 239:906−910,1988）、および（ｃ）複製
能があり、上記の免疫不全症候群を誘発するキメラゲノ
ムをコードするネコ白血病ウイルス分離物のクローンを
開示する。さらに詳述すると、これらのクローンを使っ
て、感染ウイルスを産生する細胞系の確立を開示する
が、この際に生じたウイルスは、ワクチンの製造もしく
はウイルス血症の発症、または疾患モデルに有用であ
る。

この発明の１態様では、FeLV−Ａ亜型またはその生物
学的誘導物のプロウイルスゲノムをコードする単離DNA
配列を開示する。この発明には、FeLV−Ａ亜型または
「生物学的誘導物」として、亜型間での相同性が少なく
とも92％ある突然変異体が含まれる。「FeLV−Ａ亜型」
の具体例としてクローン61E及びクローン61Cが含まれ、
「生物学的誘導体」の具体例としてEECCが挙げられる。
クローン61Eは複製能を有するFeLV−Ａ亜型の例であ
り、クローン61Cは複製能を有しないFeLV−Ａ亜型の例
である。実施態様の中には、DNA配列が、プロウィルス
のクローン61C、またはクローン61EもしくはEECCと掛け
離れたものも含まれる。前者は、複製能を欠き、各種の
ネコ（Felis domestica）におけるウイルス血症を誘発
し得ない。後者の２つは、各種のネコで、持続性のウイ
ルス血症を誘発し得る。

FeLV−Ａ亜型またはその生物学的誘導物の発現を規定
し得る組換えプラスミド、およびこのような組換えプラ
スミドを移入した哺乳動物細胞も開示される。これに適
した動物細胞には、AH927,CRFK,FCWF,Fc9、ネコ胚線維
芽細胞などのネコの細胞、またはネコ細胞の初代培養
物、およびミンクの肺細胞が挙げられる。

この発明のもうひとつの態様では、FeLV−Ａ亜型また
はその生物学的誘導物の産生法が開示される。この方法
は、一般に以下の工程から成る。（ａ）哺乳動物の宿主
細胞に、FeLV−Ａ亜型またはその生物学的誘導物のプロ
ウィルスゲノムの発現を規定し得る組換えプラスミドで
あって、FeLV−Ａ亜型またはその生物学的誘導物のプロ
ウィルスゲノムをコードするDNA配列を含むプラスミド
を移入すること、（ｂ）適当な培地中で宿主細胞を増殖
させること、および（ｃ）FeLV−Ａ亜型またはその生物
学的誘導物を宿主細胞から分離すること。適当なDNA配
列には、クローン61CおよびEECC由来のものが挙げられ
る。さらに別の態様では、哺乳動物の宿主細胞に、上記
のような組換えプラスミド、クローン61C由来のDNA配列
を含むプラスミド、およびクローン61E由来のDNA配列な
どの複製能を有するプロウィルスゲノムをコードするDN
A配列を共移入する。この方法には、分離工程のあと
に、当該分野で知られている、FeLV−Ａ亜型または生物
学的誘導物の精製を含めてもよい。

この発明に関連する態様では、FeLVのワクチン製造法
を開示する。この方法は、一般に以下の工程を含む。
（ａ）哺乳動物の宿主細胞に、FeLV−Ａ亜型またはその
生物学的誘導物のプロウィルスゲノムの発現を規定し得
る組換えプラスミドを移入すること、（ｂ）適当な培地
で宿主細胞を増殖させること、（ｃ）このFeLV−Ａ亜型
またはその生物学的誘導物の免疫原を回収すること、お
よび（ｄ）このFeLV−Ａおよびまたはその生物学的誘導
物を不活化すること。別の態様では、上記のようにし
て、哺乳動物の宿主細胞を共移入する。このFeLV−Ａま
たはその生物学的誘導物は、不活化を起こす条件および
それに足る時間で、ホルマリン、ベータプロプリオラク
トンまたは２成分のエチレンイミン（BEI）への浸漬と
いった様々な方法で不活化することもできる。この方法
には、不活化工程のあとで、そのFeLV−Ａ亜型を濃縮し
て臨床的投与に適した抗原量が得られるような工程も含
めてもよい。そうすることによって、各種のネコで発病
を防ぐことができる。

さらに、この発明は、宿主のネコにおいてFeLV−Ａ感
染を予防する方法を開示する。このような方法の中に
は、不活化されたFeLV−Ａ亜型またはその生物学的誘導
物から成る組成物を、生理学的許容性のある担体または
希釈液と共に宿主のネコに投与する一つの方法がある。
適切な担体または希釈液には、滅菌水およびリン酸緩衝
液の生理食塩水が挙げられる。組成物には、完全もしく
は不完全フロインドアジュバント、RIBI、油性アジュバ
ントなどの適当なアジュバント、水酸化アルミニウムな
らびにリン酸化アルミニウムなどの粒状アジュバント、
またはアブリジンならびにama31−91などの一般的な免
疫刺激アジュバントを含めてもよい。この発明のひとつ
の態様では、生理学的許容性担体または希釈液として、
FeLV−Ａ亜型産生細胞に由来する無細胞上清が挙げられ
る。ここで、生理学的許容性担体または希釈液に、FeLV
−Ａ亜型産生細胞の全細胞溶解物を含めることもある。
関連の方法では、FeLV−Ａ亜型のenv遺伝子産物から成
る、免疫原として有効量の組成物を、生理学的許容性の
ある担体または希釈液と共に投与する。

上記のように、この発明は、FeLV誘発性の疾患に対す
るワクチンに開示する。この発明の１態様では、このワ
クチンは、適切なアジュバントと共に不活化したFeLV−
Ａ亜型またはその生物学的誘導物から成る。好ましい態
様では、FeLV−Ａ亜型またはその生物学的誘導物がクロ
ーンEECCまたはクローン61E由来のDNA配列によってコー
ドされている。

この発明のもうひとつの態様では、ワクチンは、クロ
ーン61Eといった、複製成分のFeLVクローン由来のDNA配
列によってコードされたFeLV−Ａ亜型、クローン61C由
来のDNA配列によってコードされたFeLV−Ａの生物学的
誘導物、および生理学的許容性のある担体または希釈液
から成る。

この発明のさらに別の態様は、FeLV−Ａ亜型またはそ
の生物学的誘導物の接種によって誘発した致死的免疫不
全疾患が表れるネコ宿主を開示する。こういったネコ宿
主は、ネコ科とその他の哺乳動物の両方に対して、疾患
モデルとして有用である。

この発明のこれらの態様は、以下の詳細な説明および
添付した図を参照にすれば、明らかになろう。

〔具体的な説明〕

上記のように、この発明は、特にはＡ亜型のFeLVまた
はその生物学的誘導物をコードする感染性プロウィルス
のクローンを提供することによって、宿主のネコをFeLV
感染から保護するための方法および組成物に関する。ク
ローン61Eのようなある種のクローンがin vitroでのネ
コの細胞に対する移入に使われた場合、こういった移入
細胞は、ネコのＴリンパ球または線維芽様細胞に細胞変
性効果のない感染性ウイルスを産生する。このウイルス
の増殖は、ネコの細胞に限られている（従って、捕食
性）。ネコの細胞に由来するウイルスは、離乳期から成
長期にかけて特異的病原体のないネコに感染させるた
め、以下に示す。これらのネコは、持続性のウイルス感
染に罹患するが、接種後１年を越えて疾患に冒される場
合はない。従って、FeLV−Ａのプロウィルスゲノムは、
原型で、捕食性、垂直感染性であって病原性が最低のネ
コ白血病ウイルスをコードする。このウイルスは、新生
児期以外のネコでのウイルス血症の持続的誘発力によっ
ても、その他のネコ白血病ウイルスと区別でき、今まで
開示されたいかなるウイルス株よりも天然で一般に見い
出されるFeLVに類似している。このエンベロープ遺伝子
のヌクレオチド配列は、易感染性でもあるFeLVの他の株
とDNAの保存性が極めて高く、天然のすべてのFeLV感染
ネコに見い出される。従って、この発明のFeLV−Ａによ
るワクチンに対して生じる免疫応答は、自然界で垂直感
染可能な、ほとんどすべてのネコ白血病ウイルスを予防
することが期待される。さらに、クローン61EまたはEEC
C由来のDNA配列をコードしたウイルスには特殊な能力が
あって、それが61EまたはEECCを接種したネコで高頻度
のウイルス血症を誘発させるので、相同ウイルスの感染
に対して予防効果のある有効な感染系が提供される。

この発明は、また、各種のネコの重大な疾患モデルを
つくる方法および組成物に関する。それらは、効果的な
ワクチン（すなわち、疾患に対する予防）の再試験に使
うか、他の種に見られる関連の免疫不全症（すなわち、
人間におけるヒト免疫不全ウイルスの感染）の予防およ
び治療の可能性を調べることができる。FeLVプロウィス
スのクローン61Cは、感染性がないが、ネコの細胞に移
入した場合、クローン61Eの連続移入または61Eウイルス
での感染によって修復することができる。その結果得ら
れた、クローン61Eとクローン61Cとの混合物は、これを
感受性のある８週令のネコに接種した場合、もとのFeLV
−FAIDS分離物を接種したネコに見られるものと同一の
致死的免疫不全症を４カ月以内に誘発する（Hoover,Blo
od 70:188−1982,1987;Overbaugh,Science 239:906−91
0,1988）。さらに、キメラFeLVのプロウィルスクローン
を、61Eと61Cのゲノムの部分的交換によって構成（EEC
C）することもできる。そういった構成体を感受性のネ
コの細胞に移入すると、得られたウイルス（FeLV−EEC
C）は、複製能があり、免疫不全症を誘発する。

複製能のあるウイルスを産生する好ましい態様では、
プロウイルスFeLV−61E−ＡおよびFeLV−EECCを、培養
中の適当な細胞宿主、例えば、CRFK〔ATCC＃CCL94」ま
たはAH927細胞系（Overbaugh,Science 239:906−910,19
88）に移入する。この際、プロウィルスプラスミドとし
て便宜、選択マーカーを使用しても使用しなくてもよ
い。移入法には、DEAEデキストラン沈澱法、リン酸カル
シウム沈澱法、または電気泳動が挙げられる。プロウィ
ルスDNAを導入した結果、そのプロウィルスゲノムが、
細胞のゲノムに取り込まれることになる。移入細胞は、
選択、増殖させて、逆転写酵素、ウイルス産生、ウイル
スタンパク抗原の放出レベル、およびワクチンとしての
ウイルスの使用に関連したその他のあらゆる特徴につい
てスクリーニングする。

FeLV−61Cのような複製能のないウイルスを産生する
には、プロウィルスゲノムを適当な培養宿主細胞に移入
し、得られた移入細胞系を、FeLV−61Eのような複製能
のあるプロウィルスゲノムまたはウイルスで共移入また
は共感染させる。

安定な移入細胞系を、例えば、250mlの細胞増殖用培
地を含む回転ビン当たり最低で５〜６×10⁷個の細胞濃
度となるように、150mlの回転ビン中で100％コンフルエ
ントが得られるまで増殖させる。細胞が３〜７日でコン
フルエントに達した後、増殖培地を捨て、その細胞に、
例えば、250mlのウイルス用増殖培地を添加する。さら
に、細胞を通常37℃で１ないし数日間インキュベーショ
ンし、FeLV含有培地を収穫する。収穫を何回か（好まし
くは、最低５回）行って、単層の細胞がビンからはがれ
始めるまで、その収穫物を静置する。FeLVの収穫物は、
先のウイルス液で記載したように、ウイルスの力価およ
び／または抗原量に応じて100倍まで濃縮することがで
きる。細胞系液の不活化、濃縮、およびアジュバント添
加は、ウイルス液のときと同様に行うが、これについて
以下に記載する。

適切なFeLV−Ａ亜型またはその生物学的誘導物を調製
し、宿主のネコに、クローン化プロウィルスDNAから生
じる十分量の不活化ウイルス、または適当な免疫応答を
起こさせるウイルスと細胞基質の混合物を適当な方法に
よって接種することもできる。ウイルスの使用量は、一
般には約10⁴ないし10⁵の範囲であるが、約１−５×10⁵
のフォーカス形成単位/kg宿主（FFU/kg）とすることが
多い。このウイルスは、生理学的に許容性のある培地、
例えば、滅菌水、リン酸緩衝液添加生理食塩水、増殖培
地などに入れることができる。この発明のワクチンは、
前以て感作した宿主へ投与することができる。１種類以
上のブースターを、１ないし６週、好ましくは２ないし
４週間隔で投与してもよい。

以下の実施例を要約すると、F6Aウイルスをコードす
るプロウィルスクローン61Eは、特異的病原体のないネ
コの小腸組織のDNAから直接由来し、続いて、天然に存
在するネコリンパ肉腫（Fort Collins,Colorado）にか
かったペットのネコから得られた無リンパ肉腫細胞上清
の接種を行ったものである。完全なプロウィルスを持っ
たクローンを得るために、まず、ネコ1161からのDNAはE
coR I（FeLVゲノム中では切断を生じない）で切断し、
続いて、ショ糖密度勾配をかけて分画した。全プロウィ
ルスを取り込むのに十分な長さのDNAを含む画分である
が、バクテリオファージベクターgtWES B（P.Leder,D.T
iemeier,L.Enquist,Science 196:175,1977）活性のある
ものをプールした。DNAライブラリーをつくり、外来性
のLTR特異的プローブ（Mullinsら、Nature 319:333−32
6,1984）を用いてスクリーニングした。全F6Aプロウィ
ルスのEcoR I断片、および宿主の隣接領域を、pUC18中
にサブクローニングした。続いて、欠失クローンを、エ
キソヌクレアーゼBAL31を用いた消化によってつくり、M
13mp18中に連結して、ダイデオキシ法によって配列決定
を行った。この完全な8,440塩基対（bp）のF6Aプロウィ
ルスを、２つの長鎖オープンリーディングフレーム中の
還元型アミノ酸配列とともに第１図に示した。F6A配列
中にgag（ヌクレオキャプシドタンパクをコード）、pol
（プロテアーゼ、逆転写酵素ならびにエンドヌクレアー
ゼをコード）、およびenv（細胞外〔gp70〕ならびに膜
貫通〔p15E〕エンベロープタンパクをコード）に対応す
るオープンリーディングフレームの位置を記した制限酵
素切断地図を第２図に示す。gagおよびenvの開始位置と
見られるメチオニン（ATG）は、それぞれ、906および59
81番目のヌクレオチドにあった。一般に、F6Aのプロウ
ィルス配列は、典型的なＣ型のレトロウイルスゲノムを
表している。詳細な配列は、Donahueらによって考察さ
れている（J.Virol.162:722−731,1988）。この発明に
関連して、以下の点が有意である。F6Aの還元gp70部分
を他の２つのＡ型分離物、F3AならびにFGA（Glasgow）
のそれと比較した場合、それらは、13才未満の天然の感
染ネコから分離されたり、面積の広い地域で分離された
にもかかわらず、共に著しく高い（98％）相同性を有し
ている。FGAは、1970年にスコットランドのグラスノー
で分離され、クローニングされる前の数年間は培養され
ていたものである。F3Aは、1977年にニューヨーク市で
単離され（E.ZuckermanおよびW.D.Hardy,Jr.,私信）、
クローニング前に培養によって徹底的に増殖させたもの
である。また、F6Aは、1983年にペットのネコから単離
したウイルスをin vivoで継代培養した後、ネコの組織D
NAからクローニングしたものであるが、クローニング前
のin vitroでの増殖は行わなかった。３つのプロウィル
のスすべては、クローニングおよび配列決定がなされ
た。これに見られる顕著な配列の保存性から、偏在性、
ウイルス血症誘発性、および垂直感染性のFeLV型におけ
る抗原性の変化に対抗する強い選択圧がかかっているこ
とが理解されよう。この配列データと以下のF6Aの生物
活性を比較することによって、F6Aは高度の保存性、垂
直感染性、最低の病原性のFeLV−Ａ亜型（これは、おそ
らく自然界のあらゆる感染ネコに存在するであろう）の
一つの原型を示すことが分かる。

F6Aの生物活性を定義するために、ネコの胚線維芽細
胞系（AH927）に、クローン61EDNAを移入した。逆転写
酵素（RT）は、プロウィルスDNAの場合と同様に、12日
までは培養物中に検出された。続いて、８週齢の16匹の
SPFネコに、移入細胞から得られた、61E由来のF6Aウイ
ルスの10⁵フォーカス形成単位を接種した（クローン81
のアッセイによって力価を測定、以下参照）。接種ネコ
のそれぞれは、２ないし４週以内にウイルス血症を起こ
し、どれもそのままの状態が続いた。10カ月から２年を
上回る期間、免疫不全疾患はまったく認められなかっ
た。１匹のネコがT^-細胞のリンパ肉腫に罹患したが、そ
の他のネコは正常であった。これは、F6Aは、病原性が
最低であっても感染性が極めて強く、他の慢性レトロウ
イルスと同様に、潜伏期間の長いリンパ肉腫を誘発し得
ることを示す。

以下の実施例によって、この発明を詳述するが、限定
を加えるわけではない。

実施例実施例１感作ネコ細胞にクローンの遺伝子移入による、FeLV亜型
Ａの産生細胞系の形成ワクチンを製造するために、FeLV−61E−Ａプロウィ
ルスをEcoR I断片として単離し（第３図）、pUC18のEco
R I部位にサブクローニングした（第４図）。Potterら
が記載した電気穿孔法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:71
76−7165,1984）に基づく移入によって、得られたプラ
スミド（pUC18−61E）をAH927ネコ胚線維芽細胞系へ導
入した。

AH927−61Eから放出された感染性F6Aウイルスの力価
は、４ないし８×10⁶ffu/mlの範囲であることが分かっ
た（Leeら、J.Natl.Cancer Inst.49:55−60,1972）。

実施例２以下の説明によって、この発明の範囲内で、細胞系液
ならびにウイルス液の不活化、濃縮ならびにアジュバン
ト処理に適した方法が示される。

ウイルス液または細胞系液の２成分エチレンイミン
（（BEI）不活化等量の0.2_Mブロモエチルアミン臭化水素酸塩溶液およ
び0.4_M水酸化ナトリウム溶液を混合し、約37℃で60分間
インキュベーションした。得られた環状不活性体が、容
量比で0.5ないし４％のウイルス液または細胞系液に添
加する２成分エチレンイミン（BEI）である。この不活
化ウイルスまたは細胞系の液体は、４ないし37℃で周期
的に撹拌しながら24ないし72時間放置した。

不活化ウイルスまたは細胞系の液体は、細胞培養物に
３回継代して、不活化が完全であるか調べるために、特
異的ウイルスの増殖に関する試験を行った。

ウイルス液または細胞系液の濃縮ウイルス液または細胞系液は、Amicon,pellicon（Mil
lipore）濃縮器などによる利用可能な技術、塩化アンモ
ニウムまたはポリエチレングリコール（PEG）などによ
る沈澱法、透析チーブを用いたCarbowax溶液もしくは蝋
による濃縮、またはリン酸アンモニウムなどを用いたア
ジュバント濃縮法をいくつか使って２ないし10倍に濃縮
することができる。PEG沈澱法では、80mlの50％PEGを１
のウイルス液または細胞系液に添加して、４℃で一晩
混合した。翌日、PEG−ウイルス液を2500rpm以上で遠心
分離し、上清を捨て、PEG−ウイルスのペレットを目的
の濃度になるように一定量の培地に再懸濁した。

アジュバント処理のウイルス培養液または細胞培養液以下のアジュバントは、動物での接種部位の硬結反応
およびアジュバントの相溶性に従って、単独または２種
類以上を組み合わせて使うことができる。

重量／用量比で１％の濃度に調製したエチレン無水マ
レイン酸（EMA）を、不活化ウイルス液または細胞系液
に容積比0.01％ないし６％で添加した（アジュバントと
は別個または一緒に濃縮）。得られた液体のpHは、1N水
酸化ナトリウム溶液の添加によって7.1ないし7.7に調整
した。

Neocryl A640は、共重合体のラテックスポリマー（ス
チレン、およびアクリル酸とメタクリル酸の混合物）の
商標である。Neocryl A640は、非会合の水溶性アクリル
酸ならびにスリテンの共重合体であり、pHが7.5、粘度
が100cps（Brookfield25℃）であって、重量比で40％お
よび容積比で38％の固体を含む場合、１ガロン当たりの
重量が8.6lbsである。A640という番号は、そのグレード
を示す。その他の有用なNeocrylのグレードは、520,62
5、および966である。「CSMA」という用語は、以下でス
チレン、およびアクリル酸ならびにメタクリル酸の共重
合体を示すために用いられる。水で容積比50％に調整し
たCSMA懸濁液を、不活化ウイルス液または細胞系液に、
単独または他のアジュバントと組み合わせて添加し、容
積比を0.2ないし10％とした。CSMAはpHが中性であるた
め、通常、pHを調整する必要はない。

Modern Veterinary Products（Omaha.Nebr.）の小動
物用Emulsigenアジュバントは、単独または他のアジュ
バントと組み合わせてウイルス液または細胞系液に対す
る容積比が１ないし20％となるように使われる水中油滴
型の乳濁液である。

Avridineは、単独または他のアジュバントと組み合わ
せて５ないし30mgの用量で使われる。2.4gのAvridine
は、18mlの無水エタノールに溶解し、1.8mlのTween−80
を添加して、この混合物を0.2ミクロンのフィルターに
通過させる。続いて、20.2mlのIntralipidタイズ油を、
無菌的にAvridineに添加する。このアジュバントは、ウ
イルス液または細胞系液に対する体積比で７ないし50％
でこれらの溶液に添加する。

サポニンは、原料または精製品を、単独または他のア
ジュバントと組み合わせて0.05mgないし5mgの用量で使
われる。サポニンは、200mg/mlの濃度で調製し、濾過滅
菌してから、容積比0.5ないし20％でウイルス液または
細胞系液に添加する。

用量0.01ないし5mgのリン酸アルミニウム、または用
量0.5ないし20mgの水酸化アルミニウムを、単独または
他のアジュバントと組み合わせて添加することもでき
る。

細胞およびウイルスの増殖培地ワクチンの産生では、細胞は、ビタミン類、各種の非
必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、10〜25m_Mヘッペ
ス緩衝液含有の重炭酸ナトリウム（Gibco,Grand Is lan
d,NY）、30g/mlポリミキシン、および30g/mlネオマイシ
ンを添加し、濾過滅菌して４℃で保存しておいた最小必
須培地（MEM）中で増殖させる。細胞を加える前に、2m_M
L−グルタミンおよびウシ血清を培地に添加した。細胞
を増殖させるには、ウシ血清を10％添加する。平均的な
収穫は、細胞濃度が10⁴個/mlを越えたもので行うのが好
ましい。

実施例３フロインドアジュバントを利用したワクチンとして、AH
927−61E細胞系から得られたF6Aウイルスの使用法ワクチン製造の目的で、AH927−61Eを以下のように増
殖させた。細胞懸濁液（２×10⁵ffu/ml）を含むF6Aウイ
ルスを回収すると同時に、これを濃縮して、0.1％〜２
％のホルマリンまたは２成分エチレンイミン（BEI）で
不活化した。不活化されたウイルス調製物は、完全また
は不完全フロインドアジュバントで製剤化し、1ml
（？）の筋肉内投与でSPFネコに数回接種した。第１表
に記載した試験では、ワクチン処理の開始時点、ネコの
月齢は４ないし10カ月であった。２ないし３回ワクチン
投与は、記載した時間間隔で行った。対照の免疫処理
は、Norden LEUKOCELLワクチンまたはアジュバント単独
で行った。ネコに、AH927−61Eから得られたF6Aウイル
ス（10⁵〜10⁶ffu/ml）で腹腔内注射）、またはFeLV−CS
Uの野外分離ウイルス＃05821（10⁵ffu/mlで腹腔内注
射）を投与した。この投与には、第１表に示すようなコ
ルチコステロイドをネコに対して処理する場合も、処理
しない場合もあった。ネコは、投与後に頚静脈から放血
させ、血清中のp27ELISA抗原の欠損および血球の免疫蛍
光測定によってFeLVウイルス血症の試験を実施した。持
続性のウイルス血症に罹ったネコは、この投与による感
染が成功したものと見なされた。持続性のウイルス血症
に罹らないネコは、感染していない、すなわち、投与に
抵抗性を示すものと見なされた。ネコの免疫能が抑制さ
れた場合、対照動物の75％〜83％が投与後のウイルス血
症に罹患した。免疫能の抑制が起きない場合は、60％の
動物がウイルス血症に罹患した。その後の試験では、対
照動物に100％のウイルス血症を起こさせるために、ウ
イルスの投与量を増加させた。61Eで免疫処理した全動
物のうち５％だけが、持続性のウイルス血症に罹患し
た。ある試験（CSUJJ4）では、61Eで処理したネコのす
べてが、ABサブタイプの異型FeLV分離物（05821）投与
によるウイルス血症に罹らなかったが、対照ネコでは25
％だけが罹患しなかった。これは、自然界で生じるよう
な、異物投与に対する、61Eに基づいたワクチン種類の
予防力に一致していた。試験CSUFDIでは、100％の動物
をウイルス血症から予防するのに２回の接種だけで十分
であった（対照動物のウイルス血症罹患率は60％）。

実施例４ FeLV誘発性疾患モデルの作成クローン61Eが分離される小腸DNA調製物では、コピー
数の等しい変異体ゲノム（制限酵素の多形による定義と
同じ、第２図参照）に着目した。61Cと呼ばれる「変異
体Ａ」の原型に相当するクローンを、バクテリオファー
ジベクター中で分離し、続いて、プラスミドベクター中
に挿入した（第4b図）。このプラスミドをネコの線維芽
細胞およびＴリンパ球培養物をin vitroで移入するため
に使用した。この配列は、感染性ウイルスをコードする
ものではなかった。pFeLV−61Eで共感染した場合、FeLV
−61Cは、高い感染性を有しており、得られた混合物
は、感染性が非常に高い。そして、得られた混合物は、
Ｔリンパ球に対して細胞変性効果があった。

pFeLV−61EとpFeLV−61Cとのキメラウイルスをin vit
roで構成し、各プロウィルスの5817番目のヌクレオチド
に見られるユニークなXho I制限酵素切断部位のどちら
かの側で配列を交換した。５′末端の配列は、pFeLV−6
1Eに由来し、３′末端の配列は、FeLV−61Cに由来して
いた。pFeLV−EECCと命名したこのプラスミド（第4c
図）を、in vitroでネコＴリンパ球培養物を移入するた
めに使用し、感染性の細胞変性ウイルスをコードするこ
とが示された。

FeLV−61E/61Cウイルス混合物とFeLV−EECCの両者
は、接種して持続性のウイルス血症に罹ったすべてのネ
コで、致死的な免疫不全症を誘発することが示された
（Hoover,Blood 70:1880−1892,1987;Overbaugh,Scienc
e 239:906−910,1988）。複製能のあるFeLV−EECCおよ
び類似のキメラは、潜伏期の短い疾病を誘発し、その潜
伏期間は、離乳期ネコに対する接種後20ないし60日であ
った。FeLV−61E/61C混合物を接種した動物の潜伏期間
は、90〜120日であった。

FeLV−EECCキメラに見い出された61Cゲノム部分のヌ
クレオチド配列が決定され、FeLV−61Eに対して拡散す
る配列を同定した（第３図）。この混合物およびキメラ
は、あらゆる生物に致死的な免疫不全症を誘発すること
が示され、最初に完全に定義されたレトロウイルスであ
る。従って、これらは、ネコでAIDSの誘発原因になって
いるゲノム配列の同定、抗ウイルス薬の効力の評価、投
与ウイルスとしてウイルス血症などの疾病の予防、およ
びにネコ白血病ウイルスに対する免疫性を刺激するワク
チンの開発に使うことができる。

この発明は、理解を助けるように例示によっていくぶ
ん詳細に記述したが、ある種の変更および修飾を行うこ
とは、添付した請求の範囲中で実施してもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図−１〜第１−７は、クローン61Eの完全なヌクレ
オチド配列を示す図である。この配列は、５′LTRに始
まり、第２図に模式的に示す8440の塩基対に相当する
３′LTRに伸長する。２つの大きなオープンリーディン
グフレーム（ORF）の還元型アミノ酸配列を、DNA配列の
下に１字のコードで示す。DNA配列上に示す。第２図に
示す制限酵素切断部位が示される。第２図においては、Ａはオープンリーディングフレーム
の配置を伴うクローン61Eの制限酵素切断地図である。
フレーム１ないし３を上から下に示す。縦線は、終止コ
ドンの位置を示す。ボックスは、ウイルスタンパクをコ
ードすることが知られているORF、およびgag（gag−po
l）ならびにenv翻訳産物に関する開始部位のメチオニン
の位置を示す。制限酵素切断部位は、BamH I（Ｂ）,Bgl
II（B2）,EcoR I,Hind III（H3）,Kpn I（Ｋ）,Pst I
（Ｐ）,Sma I（Ｓ）,Sst II（ｓ）、およびXho I（Ｘ）
に相当する。クローン61Cの制限酵素切断地図はＢに示
す。拡散部位だけを変異体クローンの地図に示す。第３−１図及び３−２図は、61Cのenv−３′LTRのヌ
クレオチド配列を示す図であって、クローン61Eの相当
領域と比較される。61Eのヌクレオチド配列部分は、env
タンパクの１文字翻訳とともに示す。クローン61Cの相
当配列を決定し、ヌクレオチドの異なるアミノ酸のみを
示す。２本の完全なヌクレオチド配列は、同定されてい
ないが、.....で示される。差が還元型アミノ酸配列
での変化となる場合、３文字のアミノ酸コードを示す。
ダッシュは、gapを示す。第4a図は、プラスミドpUC18−61Eを示す。第4b図は、プラスミド18−61Cを示す。第4c図は、プラスミドpUC18−61Cを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 999999999 コロラドステイトユニバーシティリサーチファウンデイションアメリカ合衆国，コロラド 80521，フォートコリンズ，ファーストフロアー，サウスホウェス 601 (72)発明者エドワードエー．フーバーアメリカ合衆国，コロラド 80525，フォートコリンズ，ナバジョ 1921 (72)発明者ジェームズアイ．マリンズアメリカ合衆国，マサチューセッツ 02146，ブルックライン，ゴーラム５ (56)参考文献特開昭63−159326（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．62，Ｎｏ．３Ｐ．722 −731（1988) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．58，Ｎｏ．３Ｐ．825 −834（1986)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物の宿主細胞に、FeLV−Ａ亜型のプ
ロウィルスゲノムの発現を規定し得る組換えプラスミド
であって、複製能を有するFeLV−Ａ亜型プロウィルスゲ
ノムをコードするDNA配列を含んで成るプラスミドをト
ランスフェクトすること、前記宿主細胞を適当な培地中で増殖させること、 FeLV−Ａ亜型の免疫原を収得すること、および FeLV−Ａ亜型を不活化すること、を含んで成るFeLVワクチンの製造方法。
【請求項２】哺乳動物の宿主細胞にFeLV−Ａ亜型のプロ
ウィルスゲノムの発現を規定し得る組換えプラスミドで
あって、クローン61E由来のDNA配列および複製成分であ
るFeLVクローン由来のDNA配列を含んで成るプラスミド
をトランスフェクトすること、前記宿主細胞を適当な培地中で増殖させること、 FeLV−Ａ亜型の免疫原を収得すること、および FeLV−Ａ亜型を不活化すること、を含んで成るFeLVワクチンの製造方法。
【請求項３】不活化されたFeLV−Ａ亜型と、適切なアジ
ュバントとを含んで成る、FeLV誘発疾患に対するワクチ
ン。