KR0123536B1 - 백신 및 진단시약 제조용 푸우말라바이러스(Puumala virus) 항원의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 특허출원은 푸우말라(Puumala)바이러스를 대량으로 배양 정제하여 백신 및 진단시약용 항원의 제조방법 및 이 항원을 이용한 유행성출혈열 백신, 및 유행성출혈열 진단제를 개시(開示)한다. 더 상세하게는 햄스타(Hamster)에서 증식하도록 적응한 푸우말라바이러스를 생후 24시간 이내의 시리안 햄스타의 뇌내에 접종하여 뇌염증세를 나타낸 햄스타의 뇌를 무균적으로 채취하여 믹서와 소니케이터를 이용하여 대량의 바이러스를 추출한 후, 프로타민 술페이트, 에탄올 및 초고속 원심분리기를 사용하여 상층액중에 함유된 바이러스항원을 정제하여 푸우말라바이러스 항원을 제조하는 방법과 푸우말라바이러스를 햄스타의 뇌조직에서 배양하여 얻은 바이러스를 불활화하여 얻은 후, 정제한 바이러스 항원에 면역용 알룸겔을 첨가하여 제조한 유행성출혈열 백신을 개시한다.

Description

백신 및 진단시약 제조용 푸우말라바이러스 항원의 제조방법

제 1 도는 PCR로 증폭한 33개 한타바이러스 cDNA 산물을 제한 엔도뉴클레아제 Nco I 및 Alu I로 절단한 패턴을 나타낸다.

제 2 도는 PCR로 증폭한 33개 한타바이러스 cDNA 산물을 제한 엔도뉴클레아제 Mbo II 및 Pst I로 절단한 패턴을 나타낸다.

제 3 도는 푸우말라바이러스의 햄스타에서의 증식곡선을 나타낸다.

제 4 도는 푸우말라바이러스의 Vero E6 세포에서의 증식곡선을 나타낸다.

제 5 도는 푸우말라바이러스 0.05% 포르말린 첨가시의 불활화곡선을 나타낸다.

제 6 도는 푸우말라바이러스 백신을 접종한 렛트의 항체곡선을 나타낸다.

제 7 도는 생 푸우말라바이러스를 접종한 렛트의 항체곡선을 나타낸다.

본 발명은 푸우말라(Puumala)바이러스를 대량으로 배양 정제하여 백신 및 진단시약용 항원의 제조방법에 관한 것이다.

신중후출혈열을 과거 한국에서는 한국형 출혈열 또는 유행성 출혈열이라 하였고, 일본과 중국에서는 유행성출혈열, 러시아에서는 유행성 신우신장염, 그리고 유럽에서는 유행성신염으로 불렀다. 그러나, 1982년 세계보건기구는 이들 질병이 한탄바이러스 및 이와 유사한 바이러스에 의하여 발생됨으로 병명을 통일하여 신중후출혈열이라 명명하였다. 그러나 한국에서는 아직도 유행성 출혈열이라는 이름으로 널리 사용되고 있다.

유행성 출혈열은 급성전염성 질환으로 병원에서는 한타바이러스속에 속하는 바이러스이며, 현재까지 알려진 병원체는 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스 및 벨그라드 바이러스(Belgrade virus)의 4종류이며 사망율은 1∼7%이며, 우리나라에서는 제2종 법정 전염병으로 지정되어 있는 무서운 병이다.

이 질병은 상기한 4가지 바이러스에 감염된 보균동물의 뇨, 타액 및 변중에 바이러스가 있으며, 이런 배설물에 오염된 흙, 밭농사, 감자, 고구마, 및 곡식등에 묻어있다가 먼지와 함께 에어솔로 호흡기를 통하여 사람에게 감염된다.

한국에서 유행하고 있는 유행성 출혈열은 주로 한탄바이러스와 서울바이러스에 의해 발생하나, 최근 푸우말라바이러스에 의한 환자도 있다는 사실이 증명되었다. 중국에서는 한탄바이러스와 서울바이러스가 병원체이며 일본, 미국 및 아프리카에서는 서울바이러스에 의한 환자가 발생한다. 그리고 유럽에서 유행하는 유행성 출혈열의 원인균은 주로 푸우말라바이러스이나 한탄바이러스와 벨그드바이러스에 의한 환자도 있음이 증명되었다. 일반적으로 한탄바이러스 및 서울바이러스에 의한 환자는 임상증상이 심하며 4∼7%의 사망율을 나타내나 푸우말라바이러스에 의한 임상증상은 한탄바이러스나 서울바이러스 감염보다 경하여 사망율도 1% 이하이다.

푸우말라바이러스에 의한 환자는 바이러스 감염후 1∼4주간의 잠복기를 거쳐 오한, 두통, 구토, 복통을 수반하는 급성질환의 증상을 나타내며, 40℃ 전후의 고열이 수일간 지속되며 내장에 출혈을 일으키게 된다. 그후 심한 요통, 구토, 결막출혈, 설사 등을 나타내며, 약 1주일후 저혈압기와 쇼크증상이 나타나고 신장염으로 감뇨기가 따르고 신장기능부진으로 사망하는 경우도 있다. 저혈압기를 거쳐 회복기에 달하며 회복에서는 1-2개월이 소요되며 신장기능의 저하가 후유증으로 남는 경우가 많다. 우리나라에는 푸우말라바이러스가 존재않지 않는 것으로 생각되어 왔으나 최근 한국에서는 푸우말라바이러스에 의한 환자가 있다는 사실이 증명되었다. 현재 매년 유행성 출혈열 환자는 아시아 지역에서 약 10∼15만명이 발생하며, 한국에서는 약 2000명의 환자가 입원하고 있다. 그리고 북유럽에서 수천명, 서유럽에서 수백명 그리고 미국 및 아프리카에서도 소수 발생하고 있다. 최근 한국에서는 한탄바이러스 백신(한타박스)이 녹십자에서 제조 판매하고 있으나 아직까지 푸우말라바이러스 백신은 개발하지 못하고 있다.

최근 일본에서 서울바이러스 B-1로 예방 백신을 개발하였다는 보고가 있으며, 미국과 중국에서는 한탄바이러스 백신을 개발중에 있다. 녹십자사에서 제조되고 있는 한탄바이러스 백신은 한탄바이러스 84/105주를 생후 1일된 젓빨이 마우스 뇌내에 접종하여 대량의 한탄바이러스 항원을 얻은 후, 일본뇌염백신 제조방법을 응용한 방법으로 제조하고 있다. 세계보건기구는 유행성 출혈열의 백신은 세계보건기구가 설정한 일본뇌염 백신 제조방법과 생물제제에 준할 것을 권장하고 있으며, 공지된 한탄바이러스 백신 제조방법은 다음과 같다(참고. 특허공고 번호 제90-7952호).

한탄바이러스에 감염된 마우스 뇌조직의 20% 용액을 4℃에서 3000rpm 30분간 원침하고 상층액을 프로타민 술페이트(protamin sulfate) 0.2mg/ml로 처리한 후, 그 상층액을 40% 에탄올로 처리하고 4℃에서 6,000rpm 30분간 원침하여 침전물을 얻는다. 바이러스가 함유된 침전물을 옴니믹서에서 분쇄하여 용액으로 만든 후, 다시 프로타민 술페이트 0.05Mg/ml을 가하여 원침하여 뇌세포 조직성분을 제거한 다음, 순수한 한탄바이러스 항원을 채취한다. 대량으로 제조된 바이러스 항원은 ELISA 방법으로 항원의 양을 측정한 다음, 0.05% 포르말린으로 4℃에서 2주간 불활성화 한다. 불활성화된 한탄바이러스 항원은 여과한 후, 멸균성과 안정성 검사를 거친 다음, 알룸 겔(alum gel) 500㎍/ml로 15일간 4℃에서 처리한 후 백신으로 사용하게 된다.

유행성 출혈열을 일으키는 바이러스중 한탄바이러스, 서울바이러스 및 벨그라드 바이러스는 생후 1일된 마우스 뇌에서 잘 증식되나, 푸우말라바이러스는 생후 1일된 마우스의 뇌조직에서도 전혀 증식되지 않는다. 따라서, 푸우말라바이러스 백신과 진단용 시약을 만들기 위하여는 다량의 바이러스 항원을 얻을 수 있는 배양방법과 기술이 해결되어야 한다. 현재까지 유전공학 방법으로 얻은 푸우말라바이러스의 RNA나 당지질은 항원성이 좋지 못하기 때문에 백신용 항원으로 사용되지 못하고 있다.

본 발명자는 상기의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, Vero E6세포에서 분리한 들쥐유래의 푸우말라바이러스 소트카모(Sotkamo)주와 유행성 출혈열 환자로부터 분리한 푸우말라바이러스 K27주를 생후 24시간 이내의 새끼 시리안 햄스타 뇌내에 접종하여 20일 간격으로 15∼20대 계대배양하여 햄스타 뇌세포에서 잘 증식되도록 순화적용한 다음, 대량의 바이러스 항원을 새끼 햄스타에서 배양하여 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 항원성이 우수한 백신용 푸우말라바이러스 항원을 대량 배양 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 정제된 푸우말라바이러스항원을 사용하여 푸우말라바이러스에 의한 신중후출혈열의 예방백신 및 진단 시약을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

푸우말라바이러스 백신용 항원을 제조하는데 사용한 바이러스는 세계보건기구유행성 출혈열 연구협력센타에 보관되어온 푸우말라바이러스 소트카모주와 1993년 4월 23일 한국종균협회에서 병원성 균주임으로 기탁이 거부된 푸우말라바이러스 K27주(기탁거부서 참조)를 사용하였으며, 바이러스의 특성은 후기 표 1과 같다. 조직배양 세포에서는 대량의 바이러스를 배양할 수 없고 항원성이 약하기 때문에 백신을 만들수가 없어서, 전술한 바와같이 항원성이 높은 푸우말라바이러스를 생후 1일된 햄스타 뇌조직에 접종하여 다량 생산하게 된 것이다.

본 발명의 햄스타에 적응한 푸우말라바이러스는 생후 1일된 햄스타 뇌내에 0.02ml의 바이러스를 접종하면 약 7일후에 햄스타가 뇌염으로 사망하게 되며, 바이러스의 역가는 표 2에 나타난 바와 같이 LD₅₀가 10^7.8/ml이다. 햄스타 뇌조직중의 바이러스 항원을 ELISA법으로 측정한 결과, 8,000-10,000unit/0.1ml이라는 다량의 순수한 푸우말라바이러스 항원을 얻을 수 있었다. 햄스타 내에서 배양된 고역가의 푸우말라바이러스를 앰플에 분주하여 종 바이러스(seed virus)로 -80℃에 보관하면서, 필요에 따라 생후 24시간 이내의 시리안 햄스타(Syrian hamster)의 뇌내에 접종하여 대량의 바이러스 항원을 생산하였는데 이것은 푸우말라바이러스를 대량 생산할 수 있는 최초의 방법이다. 푸우말라바이러스 항원의 정제 및 불활화공정은 한탄바이러스 백신의 공정과 유사하며 세계보건기구가 요구하는 일본뇌염 백신제조 기준을 충족시키는 것이다.

유행성 출혈열을 일으키는 바이러스는 상기한 바와 같이 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스의 4종이 있는데 이들 바이러스에 대한 항체는 형광항체법으로 교차반응을 나타내기 때문에 한탄바이러스 속으로 분류되어 있다.

그러나, 이들 바이러스는 면역학적으로 항원성이 다르고 분자생물학적으로 RNA성분도 다르다. 특히 바이러스에 대한 중화항체가 특이하기 때문에 바이러스를 중화항체검사로 구분하며 더욱이 중화항체는 이들 바이러스의 면역에 직접 간여한다. 한탄바이러스 백신을 맞은 사람은 한탄바이러스에 대해서만 예방효과가 있으며 푸우말라바이러스에 대한 예방효과는 없다. 따라서 푸우말라바이러스 백신을 제조함으로써 구라파 전역과 아시아 일부지역에서 발생하는 유행성 출혈열을 예방할 수 있게 되며 또 간단하고 값싼 진단용 시약도 개발할 수 있게 되었다.

[실시예]

1) 푸우말라바이러스의 취득

본 발명에 사용한 푸우말라바이러스는 2종류였다.

① 미국 arbovirus catalogue에 등록되고 세계보건기구유행성 출혈열 연구협력센타에 보관되어 있는 푸우말라바이러스 소트카모(Sotkamo)주와 ② 러시아에서 발생한 신중후출혈열 환자에서 1985년 분리한 푸우말라바이러스 K27주를 Tkachenko로 부터 분양 받아 사용하였다. 상기 2종의 바이러스중 세계보건기구 연구협력센타에 보관되고 있는 소트카모주는 발명자가 직접 관리하고 있는 것이고 K27주는 고대바이러스병 연구소와 러시아 소아마비 및 뇌염연구소의 연구협정에 따라 1992년 5월에 분양 받았으며 병원성 균이기 때문에 국내 기탁기관에서 기탁을 거부하였기에 본 출원서에 기탁거부서를 첨부하였다(기탁일 : 1993년 4월 23일).

상기 2종의 푸우말라바이러스를 Vero(베로) E6세포에 7대 계대한 후, 발명자들이 베로 E6세포에서 플레이크(plaque)를 형성하여 각각 두개의 클론(clone)을 채취, 유전학적으로 순수한 푸우말라바이러스 균주를 만들어 다시 세포에서 배양한 후 백신 및 진단시약 제조용 바이러스 항원으로 사용하였다.

2) 푸우말라바이러스의 특성

본 발명에 사용한 푸우말라바이러스의 분자생물학적 특성과 햄스타에서의 병원성 및 바이러스이 역가는 표 1,2 및 제 1 도, 제 2 도에 나타나 있다.

소트카모주와 K27주는 혈청학적으로 교차반응을 일으키며 중화항체 검사로 푸우말라바이러스임이 증명되었다.

표 1. PCR방법으로 제조한 한탄바이러스 cDNA를 제한효소 절단한 cDNA 단편의 비교

주 : *1)은 소련에서 채취한 서울바이러스와 유사한 균주로서 본 출원인이 보관.

*2)은 타이렌드에서 채취한 서울바이러스와 유사한 균주로서 본 출원인이 보관.

*3)은 프로스펙트힐 균주.

상기 균주는 본 발명의 구성과는 직접적인 관계는 없으나, 본 발명의 균주와 비교하기 위해 기재한 것임.

표 2. 푸우말라바이러스의 햄스타 치사율(LD₅₀)

그러나 분자생물학적으로 종특이적인 푸우말라바이러스의 프라이머(primer)와 반응하나, 제 1 도 및 제 2 도에 나타난 바와 같이 PCR에서의 RELP치에는 다소 차이가 있음을 나타내었다.

바이러스의 특성 :

가) 비리온 입자(virion particle)

직경이 90∼110nm의 구형 RNA 바이러스

나) 외막(envelope)

인지질 되어 있으며 2∼10nm의 돌기를 갖고 있다.

다) 구조

단일나선이고, 분자량은 3.5×10⁶

3개의 nucleocapsid를 갖고 있다.

라) G+Cmol%는 39%

마) G1 분자량 67K

G1 분자량 58K

N 분자량 53K

바) G2의 RFLP치는 다음과 같이 차이가 있다.

3) 푸우말라바이러스의 배양

푸우말라바이러스 소트카모주와 푸우말라바이러스 K27주를 베로 E6세포에서 이미 기술한 바와 같은 방법으로 배양한 후 바이러스가 함유된 조직배양 상층액을 생후 24시간 이내의 시리안 햄스타의 뇌내에 0.02ml를 접종하고 약 2주후 햄스타의 뇌를 무균적으로 적출 간접면역형광체법으로 바이러스의 증식을 확인하였다. 바이러스감염 뇌조직의 20% 용액을 3주 간격으로 생후 24시간 이내의 햄스타 뇌에 20대이상 계대배양하면서 병원성을 증가시키고 대량의 바이러스가 증식되도록 햄스타에 적응시켰다. 이렇게 적응한 바이러스를 접종한 시리안 햄스타가 바이러스 접종후 10∼14일경에 뇌염으로 사망하기 직전 무균적으로 햄스타 뇌를 적출하여 20% 용액이 되도록 티슈 그라인더(tissue grinder)에서 분쇄한 후 4℃에서 3,000rpm 30분간 원침후, 상층액을 시이드 바이러스(seed virus)로 사용하였다. 시이드 바이러스는 언제나 생후 24시간 이내의 햄스타 뇌내에 접종하여 대량의 푸우말라바이러스 항원을 생산하는데 사용하였다. 푸우말라바이러스의 베로 E6세포와 생후 24시간 이내의 시리안 햄스타 뇌에서의 증식곡선은 제 3 도 및 제 4 도와 같다.

실험에서 사용한 햄스타는 일본 SLC 실험동물회사에서 사육한 무균 시리안 햄스타이며 이들 햄스타는 항상 동물안전 캐비넷내에서 사육하였다.

4) 푸우말라바이러스의 불활화 및 정제

생후 24시간 이내의 시리안 햄스타 뇌에서 배양한 후 프로타민 술페노이트와 에탄올을 처리하여 얻은 순수한 푸우말라바이러스를 0.04∼0.05% 포름알데히드를 가하고 4℃에서 10일간 불활화한 성적은 제 5 도와 같으며 백신용으로 정제한 바이러스의 성분과 항원의 양은 표 3 과 같다.

표 3. 푸우말라바이러스 백신 성분

5)푸우말라바이러스 백신의 제조방법 및 조성

세계보건기구에서 추진한 일본뇌염 백신의 제조기준에 따라 햄스타 뇌에서 배양된 푸우말라바이러스로 백신을 다음과 같이 제조하였다.

푸우말라바이러스를 접종한 SPF 시리안 햄스타(일본 SLC)의 뇌를 무균적으로 적출한 후 pH7.6의 PBS로 20% 용액을 만든 후, 소니케이터(Ultrasonic W-370)로 10분간 뇌세포를 분쇄하여 바이러스를 분리한 다음, 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침한 후, 상층액을 0.2mg/ml의 프로타민 술페이트로 1시간 4℃에서 잘 혼합한 다음, 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침한다. 그 상층액을 냉 40% 에탄올로 처리하여 4℃에서 24시간 잘 혼합한 다음, 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침하여 침전물을 얻은 후 옴니믹서로 분쇄하여 용액으로 만들고, 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침 후, 상층액을 다시 프로타민 술페이트 0.01∼0.03mg/ml을 가하여 4℃에서 1시간 혼합한 9,000rpm 30분간 원침한다. 이 상층액을 4℃에서 혼합한 후 9,000rpm 30분간 원침한 후, 다시 상층액으로 4℃에서 20,000~40,000rpm 10~12시간 초고속 원침하여 순수한 바이러스 침전물을 얻은 다음, 다시 옴니믹서로 용액을 만들고, 일정량의 항원을 0.01% 포르말린으로 4℃에서 2주일간 불활화한다. 불활화한 푸우말라바이러스 항원용액중에 함유된 단백질의 양은 마이크로-케달(Micro-Kehldal)방법으로 항상 측정하여 50㎍/ml 이하가 되도록 한다. 불활화된 바이러스 용액을 투석하고 0.4μm 여과기를 통과시킨 후 멸균성과 안정성을 검사하고 바이러스 항원의 양을 ELISA법으로 측정하여 5.000unit/0.1ml이 되도록 희석한 다음, 애드주반트로 알롬겔 500μg/ml을 4℃에서 15일간 처리하여 백신으로 만든다. 이 백신용액은 다시 마사이오레이트를 0.01%를 가하여 안정성과 순수성을 장기간 유지하도록 하였다.

6) 푸우말라바이러스 백신의 면역효과

포르말린 용액으로 불활화한 푸우말라바이러스 백신(1,000ELISA 항원 unit/0.1ml) 0.5ml을 위스타 랫트의 근육에 3회(0, 10, 30일) 접종하고 푸우말라바이러스에 대한 형광 항체가를 검사하였다. 제 6 도에 나타난 바와 같이 백신 접종회수에 따라 항체가가 상승하였으며, 3회 접종 약 1개월 후에 항체가가 16,384라는 최고치에 달한 후 105일후까지도 높은 항체가를 유지하고 있었다. 제 6 도의 항체반응 곡선은 랫트 4수의 평균 항체가를 나타낸 것이다. 제 7 도는 백신의 대조실험으로 살아있는 푸우말라바이러스 1,000LD₅₀를 위스타 랫트의 근육내에 1회 접종한 후 형광항체 형성곡선을 나타낸 것으로 바이러스 접종 2주후에 1,024라는 높은 항체가를 나타내고 약 2개월간 지속된 후 감소되고 있음을 알 수 있다. 3회 접종한 백신의 형광항체가 1회 접종한 생바이러스의 항체가 보다 높았다.

7) 혈청 진단용 푸우말라바이러스 항원의 제조방법 및 조성

푸우말라바이러스에 대한 항체증명용 순수한 바이러스 항원은 상기 5)항에 기술한 바와 같이 푸우말라바이러스 백신의 제조방법과 동일하게 처리한 순수한 바이러스 항원을 사용한다. 포름알데하이드로 불활화한 바이러스 항원 용액을 0.4μ의 여과기를 통과시키고 다이아리시스한 다음, 샌드위치 ELISA법으로 푸우말라바이러스 항원의 양을 측정한다. 보통 20% 햄스타 뇌조직에서 추출한 푸우말라바이러스의 항원은 4,000∼6,000ELISA 단위가 0.1ml에 함유되어 있다. ELISA법에서는 4∼8unit/0.1ml의 바이러스 항원을 사용하며 고농도입자응집 반응에서는 16∼32unit/0.1ml의 항원을 고농도입자에 부착시킨 후 용액 또는 냉동건조후 분말상태로 사용한다. 혈청진단용 항원의 조성은 표 3에 나타난 푸우말라바이러스 백신의 구성성분과 동일하다.

Claims (4)

1. 햄스타(Hamster)에서 증식하도록 순화 적응한 푸우말라바이러스를 생후 24시간 이내의 시리안 햄스타의 뇌내에 접종하여 뇌염증세를 나타낸 햄스타의 뇌를 무균적으로 채취하여 믹서와 소니케이터를 이용하여 대량의 바이러스를 추출한 후, 프로타민 술페이트, 에탄올 및 초고속 원심분리기를 사용하여 상층액중에 함유된 바이러스 항원을 정제하는 것을 특징으로 하는 푸우말라바이러스 항원의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 불활화제로서 포름알데하이드를 사용하는 것이 특징은 제조방법.
3. 푸우말라바이러스를 햄스타의 뇌조직에서 배양하여 얻은 바이러스를 불활화하여 얻은 후, 정제한 바이러스 항원에 면역용 알롬겔을 첨가한 것을 특징으로 하는 유행성 출혈열 백신.
4. 푸우말라바이러스를 햄스타의 뇌조직에서 배양하여 얻은 바이러스의 유제를 백신제조과정과 같이 처리한 후, 고속원심침전하여 상층액중의 바이러스를 포름알데하이드로 불활화한 다음, 항원항체 반응용 항원으로 사용하며 푸우말라바이러스에 대한 각종 항체를 간단하게 검출할 수 있는 양이 함유되도록 한 유행성 출혈열 진단제.