CN101507814B - 多组分抗原无细胞百日咳疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种预防百日咳鲍特氏杆菌感染的含有多组分抗原的无细胞百日咳疫苗及其制备方法，该无细胞百日咳疫苗包含从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞经裂解、分离、提取、纯化得到的多组分细胞结构型抗原；还可以进一步包括从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分分离、提取、纯化得到的多组分细胞分泌型抗原。本发明的联合疫苗适合婴幼儿、儿童及青少年和成人预防百日咳鲍特氏杆菌的感染。
Description
技术领域
本发明涉及一种百日咳疫苗，具体而言，本发明涉及一种含有多组分抗原的无细胞百日咳疫苗。本发明还涉及所述的无细胞百日咳疫苗的制备方法。
背景技术
百日咳疾病是引起全球婴幼儿死亡的一个重要原因，即使在疫苗接种覆盖率较高的国家，百日咳仍是一个较受关注的公共卫生问题。据WHO最新估计，2003年全世界约有1760万百日咳病例，其中90％发生在发展中国家，约27.9万人因此死亡(WHO.WeeklyEpidemiological Record.No.4，2005，pp.31-39)。
百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella pertussis)是百日咳的病原，它是一种微小的、营养需求复杂的革兰氏阴性球杆菌，能专门附着在人呼吸道的粘膜层。鲍特氏菌属可以因环境条件改变而发生表型变化，毒力因子的表达水平也不同。这些因子包括百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)、百日咳粘着素(pertactin，PRN)、菌毛(filmbriae pili)、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)、气管细胞毒素(tracheal cytotoxin，TCT)和百日咳杆菌内毒素(endotoxin)。粘附因子如FHA、PRN和菌毛帮助百日咳细菌粘附在宿主细胞上，凝集原(agglutinogens，AGGS)可能和PT一起参与了百日咳细菌对宿主细胞的粘附作用。PT、TCT和AC-Hly可破坏上皮层，躲避宿主的免疫系统。但目前对百日咳发病机理的认识还不完全清楚。
百日咳杆菌通过飞沫从感染者传播给易感个体。经7～10天的潜伏期，患者出现卡他症状。疾病的卡他期、阵发期和恢复期可持续1至数月。有5～6％百日咳患者会出现并发症，多发生在＜6个月的婴幼儿。支气管肺炎(5.2％)是最突出的问题，死亡率相对高。百日咳相关脑病的发生率是0.9/10万。在发达国家，百日咳的致死率非常低，小于0.1％。而在发展中国家，婴幼儿的平均致死率估计为3.9％，1～4岁儿童为1％(WHO.Weekly Epidemiological Record.No.4，2005，pp.31-39)。
在卡他初期，百日咳传染性很强，在未免疫的家庭接触者中续发感染率高达90％。虽然卡他期后，该病的传染性迅速降低，但未治疗的患者出现典型的咳嗽症状之后传染性可持续3周或更长。百日咳的临床结果取决于多种因素，如年龄和疫苗接种情况。虽然大部分在临床上可辨别的百日咳病例发生在年龄在1～5岁的儿童，但报道的严重和死亡病例主要是未免疫的、年龄非常小的婴儿。在大龄儿童、青少年和成人中，由于其常见的不典型病程，通常不能辨识为百日咳。然而，大龄患者是易感婴幼儿的重要传染源。
在大规模使用疫苗以前，百日咳是最常见的儿童期疾病之一。在发达国家，平均年发病率为150～200/10万。在20世纪50年代至60年代间实施大规模百日咳疫苗接种后，发达国家的百日咳发病率和死亡率显著下降(＞90％)。自1974年开始，百日咳疫苗成为WHO扩大免疫规划的一部分。自20世纪80年代末开始，全世界已有约80％的婴幼儿接种了百日咳疫苗。WHO估计，2003年全球预防百日咳的疫苗免疫接种避免了约3830万感染病例和60.7万死亡病例的发生(WHO.Weekly Epidemiological Record.No.4，2005，pp.31-39)。
在国家儿童免疫规划中，接种的百日咳疫苗分为全细胞百日咳疫苗(whole cell pertussis vaccine，wP)和无细胞百日咳疫苗(acellularpertussis vaccine，aP)，通常与白喉内毒素、破伤风内毒素配制成全细胞百白破联合疫苗(DTwP)或无细胞百白破联合疫苗(DTaP)。
wP疫苗为灭活的百日咳杆菌菌体细胞混悬液，细菌灭活剂通常为甲醛溶液。所有wP(或DTwP)都采用铝盐作为佐剂，多数情况下，采用硫柳汞为防腐剂。wP不能冰冻，需在2～8℃保存。wP的有效期为24-36个月。数十年来，wP疫苗的免疫效果得到充分的证实，但是wP疫苗接种后的不良反应问题一直未得到解决。wP疫苗通常更多与轻度至中度不良反应相关，在某些国家，因wP疫苗的高反应原性而影响了免疫接种的高覆盖率。局部反应发生率随着年龄和接种次数具有增加的趋势，因此，WHO不推荐青少年和成人免疫接种用wP。
aP疫苗仅含灭活百日咳PT、或者还含有其他百日咳杆菌成分，如FHA、菌毛抗原和PRN。最好的aP与最好的wP具有相似的保护效果(≥85％)。aP疫苗经实验室证明毒性很低，人体临床试验结果和实验室一致，aP疫苗接种不良反应发生率显著低于wP疫苗。但在初免完成后，随着每次DTaP接种，局部反应的发生率和严重性仍倾向于增加。为减少加强免疫时疫苗的反应原性，已制备生产出抗原浓度减少的DTaP疫苗，用于青少年和成人的免疫接种。
由于抗原组分数量和含量、纯化和脱毒的工艺的不同，导致目前使用的aP也不尽相同。aP疫苗有单组分疫苗(仅含PT)、双组分疫苗(PT+FHA)和含有3～5组分的多组分疫苗(PT+FHA+PRN、PT+FHA+PRN+FIM2或PT+FHA+PRN+FIM2/3)。以美国FDA批准上市的aP疫苗为例，无论其抗原组分数量，还是抗原组分各自含量，甚至是各抗原组分间配制比例均显著不同(表1)。
表1.美国FDA批准上市的无细胞百白破疫苗
(资料来自：http://www.fda.gov/cber/vaccine/licvacc.htm)
单组分或双组分抗原的aP疫苗是否与多组分(3～5组分)抗原的aP疫苗具有相同的效果还存有争议(WHO.Weekly EpidemiologicalRecord.No.4，2005，pp.31-39)。有数据表明，在综合分析了6个保护效力的临床试验和45个安全性临床试验后显示，具有3组分或更多组分抗原的aP疫苗保护效果优于只有1个或2组分抗原的aP疫苗(Tinnion，O.Acellular vaccines for preventing whooping cough in children.CochraneRev Abstract.2007)。进一步的临床试验证实，在所有的aP疫苗中仅有5组分抗原的aP疫苗表现出具有和高免疫原性的wP疫苗相同的保护效力的能(Olin，P.，et al.Randomised controlled trial of two-component，three-component，and five-component acellular pertussis vaccinescompared with whole-cell pertussis vaccine.Lancet.1997.350：1569-1577.)。有学者建议更好的aP疫苗还应增加新的抗原组分，如腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)等抗原(Mattoo，S.，Cherry，J.Molecular Pathogenesis，Epidemiology，and Clinical Manifestations ofRespiratory Infections Due to Bordetella pertussis and Other BordetellaSubspecies.Clinical Microbiology Reviews.2005.18：326-382.)。研究表明，百日咳鲍特氏杆菌的抗原种类多达数十种，随着研究的深入，相信会发现更多的抗原在发挥免疫保护作用或具有佐剂的功能并最终被纳入到aP疫苗中。由此可见，目前还无法从现有的aP疫苗中根据抗原组分的数量、各抗原组分含量、抗原组分间配制比例筛选出最佳aP疫苗(张延龄，疫苗学，科学出版社，2004年834页)。
发明内容
本发明一方面提供一种无细胞百日咳疫苗，所述疫苗的抗原包括百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原。
本发明另一方面提供一种无细胞百日咳疫苗，所述疫苗的抗原包括百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原。
本发明所述的多组分细胞结构型抗原包括PT、FHA、PRN、FIM2/3、AGGS、AC、TCT等抗原。
本发明所述的多组分细胞分泌型抗原包括PT、FHA、AC、TCT抗原。
本发明又一方面提供一种百日咳-白喉-破伤风联合疫苗，通过本发明提供的的细胞结构型抗原或该细胞结构型抗原与细胞分泌型抗原混合所得的抗原，加上白喉类毒素和破伤风类毒素，组成百日咳-白喉-破伤风联合疫苗。
在本发明优选的实施方案中，aP疫苗、DTaP疫苗还可包含本领域常用的佐剂。优选的佐剂有铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素B亚单位(CTB)、皁角素Q21、类脂体、单磷酸类脂A(MPL)、MF59、大肠杆菌不耐热毒素(LT)，更优选的佐剂是铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。最优选佐剂是氢氧化铝。
在本发明提供的aP疫苗、DTaP疫苗中，疫苗的剂型和配伍按照药学领域一般技术人员所公知的技术标准来确定。在本发明优选的实施方案中，疫苗剂型优选是液体剂型、冻干剂型、丸剂、片剂、胶囊剂型，更优选是液体剂型或冻干剂型，最优选是液体剂型。
在本发明优选的实施方案中，aP疫苗、DTaP疫苗包含防腐剂，优选的防腐剂是硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇。更优选的防腐剂是2-苯氧乙醇。在本发明优选的另一实施方案中，aP疫苗、DTaP疫苗是无防腐剂疫苗。
本发明提供的aP疫苗、DTaP疫苗，接种途径包括皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，还包括经鼻腔、口腔、肛门、阴道、黏膜途径给药。
本发明所述多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原的重量比例优选为1∶0.1～10，(w/w)(本发明所述w/w系指重量比，例如μg/μg)的比例混合，多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原更优选的混合比例为1∶0.5～2(w/w)，多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原更优选的混合比例为1∶1(w/w)。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原优选地按照每次液体培养物抗原产量全部混合。
本发明所述的无细胞百日咳疫苗，按所含百日咳鲍特氏杆菌抗原蛋白总量表示，每剂优选为5～100μg，更优选的每一剂量蛋白含量为15～80μg，最优选的每一剂量蛋白含量为25～50μg。
本发明又一方面提供一种制备含有多组分细胞结构型抗原的无细胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将百日咳鲍特氏杆菌液体培养物经离心分离成上清液部分和菌体细胞沉淀物部分；
(b)将(a)的菌体细胞沉淀物部分进行裂解，再经化学试剂沉淀得到粗制细胞结构型抗原；
(c)将步骤(b)所得粗制细胞结构型抗原进行纯化；
(d)将步骤(c)纯化后的产物脱毒匀化处理制成多组分细胞结构型抗原。
本发明又一方面提供一种制备含有百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原的无细胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将百日咳鲍特氏杆菌液体培养物经离心分离成上清液部分和菌体细胞沉淀物部分；
(b)将(a)的菌体细胞沉淀物部分进行裂解，再经化学试剂沉淀得到粗制细胞结构型抗原；
(c)将步骤(b)所得粗制细胞结构型抗原进行纯化；
(d)将步骤(c)纯化后的产物脱毒匀化处理制成多组分细胞结构型抗原；
(e)将(a)的上清液部分经化学试剂沉淀得到粗制多组分细胞分泌型抗原；
(f)将步骤(e)所得粗制细胞分泌型抗原进行纯化；
(g)将步骤(f)纯化后的产物脱毒匀化处理制成多组分细胞分泌型抗原；
(h)将步骤(d)的多组分细胞结构型抗原和步骤(g)的多组分细胞分泌型抗原混合配制成疫苗。
本发明的一个优选实施方案中，上述方法步骤(b)中用于裂解的化学裂解剂包括胆汁酸及其衍生物(如去氧胆酸钠)、非离子表面活性剂(如Triton-100、Tween80)、十二烷基肌氨酸钠，更优选的化学裂解剂是去氧胆酸钠、Triton-100，最优选的化学裂解剂是去氧胆酸钠。
本发明将从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞经裂解、分离、提取、纯化得到的多组分细胞结构型抗原和从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分分离、提取、纯化得到的多组分细胞分泌型抗原经混合后配制成一种含多组分抗原的aP疫苗。
本发明提供来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗。换言之，本发明包含来源于百日咳鲍特氏杆菌的多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原所组成的aP疫苗，所述多组分细胞结构型抗原来自百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞，所述多组分细胞分泌型抗原来自百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清。进一步，所述多组分细胞结构型抗原包含PT、FHA、PRN、FIM2/3、AGGS、AC、TCT等抗原。所述多组分细胞分泌型型抗原包含PT、FHA、AC、TCT等抗原。本发明提供的aP疫苗用于预防婴幼儿、儿童和成人因百日咳鲍特氏杆菌感染而引发的疾病。
本发明提供来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原所组成的一种aP疫苗。因此，本发明包含来源于百日咳鲍特氏杆菌的多组分细胞结构型抗原所组成的aP疫苗，所述多组分细胞结构型抗原来自百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞。
本发明提供来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗。因此，本发明的aP疫苗的抗原系分别从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞和培养物上清提取、纯化得到的多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原混合而成。在本发明优选的实施方案中，所述多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原优选地按照每次液体培养物抗原量1∶0.1～10(w/w)(本发明所述w/w系指重量比，例如μg/μg)的比例混合，多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原更优选的混合比例为1∶0.5～2(w/w)，多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原最优选的混合比例为1∶1(w/w)。在本发明更优选的实施方案中，所述多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原优选地按照每次液体培养物抗原产量全部混合。
本发明提供来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗。因此，本发明的aP疫苗的抗原剂量是基于多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原蛋白总量而确定。在本发明优选的实施方案中，所述多组分抗原剂量优选的每一剂量蛋白含量为5～100μg，更优选的每一剂量蛋白含量为15～80μg，最优选的每一剂量蛋白含量为25～50μg。
另一方面，本发明提供一种联合疫苗，其中还进一步包含白喉类毒素和破伤风类毒素，组成无细胞百白破联合疫苗(diphtheria，tetanus，and acellular pertussis vaccine，DTaP)。因此，本发明包含来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原及白喉类毒素、破伤风类毒素所组成的DTaP。
本发明提供来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗。其中，所述多组分细胞结构抗原是从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞经裂解、分离、提取、纯化制成。因此，所述裂解是指用反复冻融裂解、或超声裂解、或化学裂解剂裂解等技术手段裂解收获的百日咳鲍特氏杆菌体细胞，以利于分离、提取、纯化存在于菌体细胞表面或内部的细胞结构性抗原。在本发明优选的实施方案中，裂解百日咳鲍特氏杆菌体细胞优选的方法选自冻融裂解、超声裂解、化学裂解剂裂解，更优选的裂解方法是选自冻融裂解、超声裂解、化学裂解剂裂解的任一组合，最优选的裂解方法是化学裂解剂裂解方法。裂解百日咳鲍特氏杆菌体细胞有多种其它的方法，在此所述裂解方法仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各种等同的裂解方法实现本发明所述的裂解百日咳鲍特氏杆菌体细胞，因此任何用于裂解百日咳鲍特氏杆菌菌体细胞的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。进一步，在化学裂解剂裂解百日咳鲍特氏杆菌体细胞方法中，优选的化学裂解剂包括胆汁酸及其衍生物(如去氧胆酸钠)、非离子表面活性剂(如Triton-100、Tween80)、十二烷基肌氨酸钠，更优选的化学裂解剂是去氧胆酸钠、Triton-100，最优选的化学裂解剂是去氧胆酸钠。同样，裂解百日咳鲍特氏杆菌体细胞有多种其它的化学裂解剂，在此所述化学裂解剂仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各种等同的化学裂解剂实现本发明所述的裂解百日咳鲍特氏杆菌体细胞，因此任何用于裂解百日咳鲍特氏杆菌菌体细胞的化学裂解剂都有可能用于实施本发明。
在本发明中，从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞制备多组分细胞结构型抗原的技术手段是本领域技术人员所公知的技术。技术人员可从本发明所述掌握多组分细胞结构型抗原的制备方法。在本发明优选的实施方案中，将百日咳鲍特氏杆菌菌种经过数代传代培养后，转种至发酵罐进行液体培养，经离心收集菌体细胞沉淀。菌体细胞经去氧胆酸钠裂解，再用不同浓度硫酸铵两次沉淀细胞结构型抗原，经透析或超滤后再用凝胶柱层析或蔗糖密度梯度离心纯化细胞结构型抗原，最后经戊二醛脱毒和超声匀化处理制成多组分细胞结构型抗原。制备多组分细胞结构型抗原有多种其它的方法，在此所述制备方法仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的多组分细胞结构型型抗原，因此任何用于制备百日咳鲍特氏杆菌多组分细胞结构型抗原的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。
在本发明中，从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分制备多组分细胞分泌型抗原的技术手段是本领域技术人员所公知的技术。技术人员可从本发明所述掌握多组分细胞分泌型抗原的制备方法。在本发明优选的实施方案中，将百日咳鲍特氏杆菌菌种经过数代传代培养后，转种至发酵罐进行液体培养，经离心收集上清液。用不同浓度硫酸铵两次沉淀细胞分泌型抗原，经透析或超滤后再用凝胶柱层析或蔗糖密度梯度离心纯化细胞分泌型抗原，最后经戊二醛脱毒和超声匀化处理制成多组分细胞分泌型抗原。制备多组分细胞分泌型抗原有多种已知的方法，在此所述制备方法仅仅是用于说明本发明。所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的多组分细胞分泌型抗原，因此任何用于制备百日咳鲍特氏杆菌多组分细胞分泌型抗原的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。
本发明提供来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗及其制备这种aP疫苗的方法。其中，所述方法包括以下步骤：
(a)将百日咳鲍特氏杆菌进行传代培养制成种子批菌种；
(b)将种子批菌种接种至发酵罐进行液体培养；
(c)收获的液体培养物经离心分离成上清液部分和菌体细胞沉淀物部分；
(d)对步骤(c)的菌体细胞沉淀物部分，可以用去氧胆酸钠或者其它裂解剂进行裂解，再用诸如硫酸铵一类的化学试剂进行沉淀，从而得到粗制多组分细胞结构型抗原，粗制多组分细胞结构型抗原经透析或超滤后再经凝胶柱层析或蔗糖密度梯度离心纯化，最后经戊二醛脱毒和超声匀化处理制成多组分细胞结构型抗原；
(e)对步骤(c)的上清液部分，用诸如硫酸铵一类的化学试剂进行沉淀，从而得到粗制多组分细胞分泌型抗原，粗制多组分细胞分泌型抗原经透析或超滤后再经凝胶柱层析或蔗糖密度梯度离心纯化，最后经戊二醛脱毒和超声匀化处理制成多组分细胞分泌型抗原；
(f)将多组分细胞分泌型抗原(d)和多组分细胞分泌型抗原(e)混合，再加入佐剂配制成aP疫苗；
在本发明中，配制和检定aP疫苗、DTaP疫苗的方法和标准是本领域技术人员所公知的技术，技术人员可参考世界卫生组织正式颁布的单组分或联合组分的无细胞百日咳疫苗制造及检定规程(WHOTechnical Report Series，No.878，1998)及白喉、破伤风和百日咳联合疫苗制造检定规程(WHO Technical Report Series，No.800，1990)和中国药典颁布的吸附无细胞百白破联合疫苗制造检定规程(中华人民共和国药典，三部，2005年版)配制和检定aP疫苗、DTaP疫苗。
本发明的多组分aP疫苗解决了目前aP疫苗所存在的抗原组分的数量、各抗原组分含量、抗原组分间配制比例的问题。
本发明的疫苗与现有技术中的疫苗相比，其区别及有益效果在于：(1)抗原组分不同：本发明的抗原组分超过现有技术疫苗的2～5组分抗原，因此，本发明疫苗具有更广谱的抗原性。(2)抗原制备方法不同；现有技术疫苗分别从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞或培养物上清分别提取单一组分抗原，再按比例配制。而本发明的疫苗系从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞和培养物上清分别提取多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原，混合后制成疫苗。(3)抗原彼此配制比例不同：现有技术疫苗是将各抗原组分按一固定比例进行配制，而本发明的疫苗系从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞和培养物上清分别提取多组分抗原混合而成，因此，本发明的aP疫苗所含多组分抗原彼此间含量比例更接近百日咳鲍特氏杆菌自然状态。
本发明的疫苗与现有技术中的另一疫苗相比，即采取共纯化方法(co-purification)制备的aP疫苗，其区别及有益效果在于：(1)抗原组分不同；本发明的aP疫苗抗原组分超过现有共纯化方法制备的aP疫苗3～4组分抗原(张延龄，疫苗学，科学出版社，2004年823页)，因此，本发明疫苗具有更广谱的抗原性。(2)抗原制备方法不同；现有共纯化方法制备的aP疫苗从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物提取3～4组分抗原，再配制成疫苗。而本发明的aP疫苗系从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞和培养物上清分别提取多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原，混合后制成疫苗。
换言之，本发明重点发现在于：
第一、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗，所含抗原组分比现有最多5组分抗原的aP疫苗具有更多的抗原组分，发明人后来发现本发明的aP疫苗具有更广谱的抗原性和更有效的免疫原性，这也许与抗原组分增多有关。
第二、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗，所含抗原各组分间比例比现有aP疫苗更接近百日咳鲍特氏杆菌自然状态，因此应当有更好的免疫效果。
第三、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原所组成的一种aP疫苗，多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原的免疫保护效力相互促进，具有协同增强效应。
第四、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原，再与白喉类毒素、破伤风类毒素组成的一种DTaP疫苗，百日咳多组分抗原的保护效力不被白喉类毒素和破伤风类毒素减弱，因此能够制备联合疫苗。
第五、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原，再与白喉类毒素、破伤风类毒素组成的一种DTaP疫苗，白喉类毒素、破伤风类毒素的保护效力不被减弱，因此可以制备联合疫苗。
第六、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和白喉类毒素、破伤风类毒素组成的一种DTaP疫苗，百日咳多组分抗原的保护效力不被白喉类毒素和破伤风类毒素减弱，因此可以制备联合疫苗。
第七、发明者发现，将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和白喉类毒素、破伤风类毒素组成的一种DTaP疫苗，白喉类毒素、破伤风类毒素的保护效力不被减弱。
第八、发明者发现，本发明所制备的aP疫苗的方法包括以下步骤：
(a)将百日咳鲍特氏杆菌进行传代培养制成种子批菌种；
(b)将种子批菌种接种至发酵罐进行液体培养；
(c)收获的液体培养物经离心分离成上清液部分和菌体细胞沉淀物部分；
(d)对步骤(c)的菌体细胞沉淀物部分，可以用去氧胆酸钠或者其它裂解剂进行裂解，再用诸如硫酸铵一类的沉淀剂进行沉淀，从而得到粗制多组分细胞结构型抗原，粗制多组分细胞结构型抗原经透析或超滤后再经凝胶柱层析或蔗糖密度梯度离心纯化，最后经戊二醛脱毒和超声匀化处理制成多组分细胞结构型抗原；
(e)对步骤(c)的上清液部分，用诸如硫酸铵一类的沉淀剂进行沉淀，从而得到粗制多组分细胞分泌型抗原，粗制多组分细胞分泌型抗原经透析或超滤后再经凝胶柱层析或蔗糖密度梯度离心纯化，最后经戊二醛脱毒和超声匀化处理制成多组分细胞分泌型抗原；
(f)将多组分细胞分泌型抗原(d)和多组分细胞分泌型抗原(e)混合，再加入佐剂配制成aP疫苗；
需要强调的是，本发明并非是将来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和来源于百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原简单地混合组成一种aP疫苗，或进一步再与白喉类毒素、破伤风类毒素简单地混合组成流DTaP，而是依据上述八项独立发现构成了本发明的核心内容。
本发明通过如下实施例，但非限制，举例进一步描述本发明的核心内容，所述实施例阐述本发明的概念和几个优选的实施方案。本发明的其它实施例在不背离本发明的核心的前提下为本领域技术人员所预见。
具体实施方式
本发明可通过如下实施例进一步了解，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅为了更好展示本发明，而非对发明内容进行限制。
实施例
实施例1
百日咳鲍特氏杆菌菌种传代及发酵罐培养
本发明所用百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella pertussis)菌种购自医学细菌保藏中心(CMCC)，其菌株号为CMCC 58003，是百日咳I相CS菌株。医学细菌保藏中心的全称为中国医学微生物菌种保藏管理中心，百日咳鲍特氏杆菌菌种保藏在该中心所属单位：中国药品生物制品检定所(NICPBP)，北京。该机构生产、销售百日咳鲍特氏杆菌菌种，公众可以购买。如果满足需要，也可采用其它适宜的百日咳鲍特氏杆菌菌株，这里给出的菌株仅仅是为了例示性说明本发明。
将百日咳鲍特氏杆菌冻干菌种启开，接种于包-姜培养基或其他适宜培养基，置35～37℃培养48～72小时。转种于包-姜培养基或其他适宜培养基，置35～37℃培养24～48小时。再转种于S-S培养基或其他适宜培养基，置35～37℃培养24～48小时。继续转种至已加入S-S液体培养基或其他适宜培养基的种子发酵罐内，于35～37℃培养16～24小时。最后将种子发酵罐培养物转种至已加入S-S液体培养基或其他适宜培养基的大发酵罐内，于35～37℃发酵培养36～48小时。发酵培养完毕，升温至56～62℃维持1～2小时再加入终浓度0.5～2％的2-苯氧乙醇甲醛液杀菌，也可加入终浓度0.005～0.02％的硫柳汞杀菌，或加入终浓度0.05～0.2％的甲醛杀菌。对发酵罐培养物以20～150L/h、12,000～18,000rpm离心分别收集培养物上清液和菌体细胞沉淀。
实施例2
百日咳鲍特氏杆菌多组分细胞结构型抗原的制备
于收获的菌体细胞沉淀物中加入终浓度0.05～0.20％的去氧胆酸钠磷酸盐缓冲液，于2～8℃振荡2～4小时，再于2～8℃搅拌18～24小时裂解细胞。加入硫酸铵至终浓度15～25％，于2～8℃放置5～7天，离心3,000～6,000rpm、30分钟，收集沉淀。于沉淀中加入浓盐浸提液，于2～8℃搅拌5～7天，离心9,000～18,000rpm、30～60分钟，收集上清液。再加入硫酸铵至终浓度25～35％，于2～8℃放置5～7天，离心4,000～9,000rpm、30～60分钟，收集沉淀。再于沉淀中加入浓盐浸提液，于2～8℃搅拌3～5天，再透析5～7天，离心10,000～30,000rpm、1～3小时，收集上清液。上清液经10～30％蔗糖密度梯度离心纯化，离心20,000～35,000rpm、16～24小时，收集抗原原液。于抗原原液中加入终浓度0.03～0.06％的戊二醛作用3～5小时，再加入终浓度0.1～0.3％的赖氨酸作用1～3小时，于2～8℃透析9～22天。再经50Hz5分钟超声匀化处理，成为多组分细胞结构型抗原。按中国药典颁布的吸附无细胞百白破联合疫苗制造检定规程(中华人民共和国药典，三部，2005年版)规定方法进行染色镜检、效价测定、无菌检查、不耐热毒素试验、特异性毒性检查、毒性逆转试验、热原检查等项目检定合格后，置2～8℃保存备用。
实施例3
百日咳鲍特氏杆菌多组分细胞分泌型抗原的制备
于收获的培养物上清液中加入硫酸铵至终浓度15～25％，于2～8℃放置5～7天，离心3,000～6,000rpm、30分钟，收集沉淀。于沉淀中加入浓盐浸提液，于2～8℃搅拌5～7天，离心9,000～18,000rpm、30～60分钟，收集上清液。再加入硫酸铵至终浓度25～35％，于2～8℃放置5～7天，离心4,000～9,000rpm、30～60分钟，收集沉淀。再于沉淀中加入浓盐浸提液，于2～8℃搅拌3～5天，再透析5～7天，离心10,000～30,000rpm、1～3小时，收集上清液。上清液经10～30％蔗糖密度梯度离心纯化，离心20,000～35,000rpm、16～24小时，收集抗原原液。于抗原原液中加入终浓度0.03～0.06％的戊二醛作用3～5小时，再加入终浓度0.1～0.3％的赖氨酸作用1～3小时，于2～8℃透析9～22天。再经50Hz5分钟超声匀化处理，成为多组分细胞分泌型抗原。按中国药典颁布的吸附无细胞百白破联合疫苗制造检定规程(中华人民共和国药典，三部，2005年版)规定方法进行染色镜检、效价测定、无菌检查、不耐热毒素试验、特异性毒性检查、毒性逆转试验、热原检查等项目检定合格后，置2～8℃保存备用。
实施例4
百日咳鲍特氏杆菌多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原的鉴别
用ELISA方法对多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原进行抗原组分鉴别，结果见表2。
表2.细胞结构型抗原和细胞分泌型抗原组分
实施例5
百日咳鲍特氏杆菌多组分抗原的配制
多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原合并成为配制aP疫苗或DTaP疫苗的百日咳多组分抗原，多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原按表3比例进行混合。
表3.多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原混合比例
备注：#每一发酵培养物产生的多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原全部混合。
实施例6
aP疫苗的配制
配制多组分百日咳抗原的aP疫苗的原材料包括：多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原混合后的多组分抗原、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇、注射用水。
(1)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(a)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(a)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(2)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(b)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(b)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(3)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(c)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(c)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(4)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(d)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(d)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(5)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(e)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(e)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(6)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(f)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(f)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(7)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(g)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(g)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(8)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)10μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(9)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)30μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(10)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)50μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(11)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(12)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)160μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(13)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)200μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(14)aP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分细胞结构型抗原、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分细胞结构性抗原100μg/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
实施例7
DTaP疫苗的配制
配制多组分百日咳抗原的DTaP疫苗的原材料包括：多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原混合后的多组分抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇、注射用水。其中，白喉类毒素和破伤风类毒素分别按照中国药典颁布的吸附白喉疫苗和吸附破伤风疫苗制造检定规程(中华人民共和国药典，三部，2005年版)制造和检定。
(15)DTaP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、白喉类毒素、破伤风类毒素、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)30μg/ml、白喉类毒素25～50Lf/ml、破伤风类毒素7～20Lf/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(16)DTaP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、白喉类毒素、破伤风类毒素、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)50μg/ml、白喉类毒素25～50Lf/ml、破伤风类毒素7～20Lf/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(17)DTaP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分抗原(h)、白喉类毒素、破伤风类毒素、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分抗原(h)100μg/ml、白喉类毒素25～50Lf/ml、破伤风类毒素7～20Lf/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
(18)DTaP疫苗的配制
用注射用水稀释多组分细胞结构型抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、氯化钠、氢氧化铝、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量为：多组分细胞结构型抗原100μg/ml、白喉类毒素25～50Lf/ml、破伤风类毒素7～20Lf/ml、氯化钠7.5～9.5mg/ml、氢氧化铝1.0～1.5mg/ml、2-苯氧乙醇5.0～6.0mg/ml，pH调至5.80～7.20。按吸出量≥0.5ml分装西林瓶并封口。
实施例8
本发明多组分抗原、aP疫苗、DTaP疫苗毒性检查
按照中国药典颁布的吸附无细胞百白破联合疫苗制造检定规程(中华人民共和国药典，三部，2005年版)规定方法对百日咳多组分抗原、aP疫苗、DTaP疫苗的进行特异性毒性检查和毒性逆转试验。结果表明本发明的百日咳多组分抗原、aP疫苗、DTaP疫苗的特异性毒性检查及毒性逆转试验全部合格，说明本发明的百日咳多组分抗原、aP疫苗、DTaP疫苗安全性良好。
实施例9
本发明多组分抗原、aP疫苗、DTaP疫苗保护效价测定
按照中国药典颁布的吸附无细胞百白破联合疫苗制造检定规程(中华人民共和国药典，三部，2005年版)规定方法测定多组分抗原、aP疫苗、DTaP疫苗的保护效价，效价测定结果分别见表4、表5、表6。
表4结果表明，多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原混合后的保护效力相互增强。
表5结果表明，多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原混合后再配制成aP疫苗具有良好的保护效力。单独将多组分细胞结构型抗原配制成aP疫苗仍具较好的保护效力。
表6结果表明，多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原混合后再配制成DTaP疫苗具有良好的保护效力，其中，百日咳的保护效力不被白喉类毒素和破伤风类毒素减弱，同时白喉类毒素、破伤风类毒素的保护效力不被百日咳多组分抗原减弱。单独将多组分细胞结构型抗原配制成DTaP疫苗也具有较好的保护效力，其中，多组分细胞结构型抗原的保护效力不被白喉类毒素和破伤风类毒素减弱，同时白喉类毒素、破伤风类毒素的保护效力不被多组分细胞结构型抗原减弱。
表4.多组分百日咳原液保护效价
备注：#每一发酵培养物产生的多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原全部混合。
表5.aP疫苗保护效价
表6.DTaP疫苗保护效价
Claims (13)
1.一种无细胞百日咳疫苗，包含百日咳鲍特氏杆菌Bordetellapertussis液体培养物菌体细胞的多组分细胞结构型抗原和百日咳鲍特氏杆菌Bordetella pertussis液体培养物上清部分的多组分细胞分泌型抗原，疫苗剂量按所含百日咳鲍特氏杆菌抗原蛋白总量表示，每剂5～100μg，其中所述多组分细胞结构型抗原是指从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体细胞经裂解、提取和纯化制得的，含有多种抗原组分的组合物；其中所述多组分细胞分泌型抗原是指从百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清液经提取和纯化制得的，含有多种抗原组分的组合物。
2.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于，所述的多组分细胞结构型抗原包括PT、FHA、PRN、FIM2/3、AGGS、AC、TCT抗原。
3.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于，所述的多组分细胞分泌型抗原包括PT、FHA、AC、TCT抗原。
4.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于，所述的多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原的重量比例为1∶0.1～10。
5.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于，所述的多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原为百日咳鲍特氏杆菌Bordetella pertussis液体培养物产生的全部多组分细胞结构型抗原与多组分细胞分泌型抗原的混合。
6.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于，其进一步包含佐剂。
7.根据权利要求6所述的无细胞百日咳疫苗，其中所述的佐剂包括铝佐剂、磷酸钙佐剂、霍乱毒素B亚单位、皁角素Q21、类脂体、单磷酸类脂A、MF59和大肠杆菌不耐热毒素。
8.根据权利要求7所述的无细胞百日咳疫苗，其中所述的铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。
9.一种百日咳-白喉-破伤风联合疫苗，所述的联合疫苗的抗原包括如权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗的抗原以及白喉类毒素和破伤风类毒素。
10.根据权利要求9所述联合疫苗，其特征在于，所述的联合疫苗抗原含量为：多组分细胞结构型抗原和多组分细胞分泌型抗原30～100μg/ml、白喉类毒素25～50Lf/ml、破伤风类毒素7～20Lf/ml。
11.一种制备无细胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将百日咳鲍特氏杆菌Bordetella pertussis液体培养物经离心分离成上清液部分和菌体细胞沉淀物部分；
(b)将(a)的菌体细胞沉淀物部分进行裂解，再经化学试剂沉淀得到粗制细胞结构型抗原；
(c)将步骤(b)所得粗制细胞结构型抗原进行纯化；
(d)将步骤(c)纯化后的产物脱毒匀化处理制成多组分细胞结构型抗原；
(e)将(a)的上清液部分经化学试剂沉淀得到粗制多组分细胞分泌型抗原；
(f)将步骤(e)所得粗制细胞分泌型抗原进行纯化；
(g)将步骤(f)纯化后的产物脱毒匀化处理制成多组分细胞分泌型抗原；
(h)将步骤(d)的多组分细胞结构型抗原和步骤(g)的多组分细胞分泌型抗原混合配制成疫苗。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(b)中用于裂解的化学裂解剂包括胆汁酸、非离子表面活性剂和十二烷基肌氨酸钠。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(b)中用于裂解的化学裂解剂是去氧胆酸钠。
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