CN1470286A - 一种增强免疫力的药物组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物制剂技术领域。本发明公开了一种增强免疫力的药物组合物。本发明的组合物含有有效量特定抗原和卡介菌多糖核酸类似物以及药用稀释剂、辅助剂或载体。本发明的组合物可广泛用于需要诱导或增强抗体免疫力或细胞免疫力才能得到预防和治疗的微生物感染或其他病症。

Description

一种增强免疫力的药物组合物及制备方法

背景技术

本发明属生物制剂技术领域。具体涉及一种增强对抗原特异的免度力的药物组合物，制备方法和用途。

技术领域

微生物感染依然是人类所面临的巨大挑战，许多感染，如细菌感染可以通过使用抗生素治疗，但耐药菌的出现为治疗细菌感染提出了新的问题；而病毒感染，如艾滋病毒，肝炎病毒，乳头瘤病毒，流感病毒等，目前仍缺乏有效的治疗方法。

以乙型肝炎为例，乙型肝炎是人类所面临的最大的病毒感染，据统计，全世界带乙肝病毒的病人高达3亿多，接近世界人口的5％(Maynard et a1.In：Zuckerman AJ ed.Viral Hepatitis andLiver Diseases.New York，Alan R Liss Inc.，pp967-9699，1988)。乙型肝炎在东南亚地区尤其盛行，而中国就有一亿多乙肝病毒长期携带病人(Chen et al.J.Gastroenterol.Hepatol.15：E3-E6，2000)，这些长期病毒携带者，约25-40％的病人会死于肝硬化或肝癌等肝脏相关的疾病(Lok.B.J.Viral Hepatitis，1：105-124，1994)。

乙型肝炎的控制，需要从疫苗预防和药物治疗两个方面入手。乙肝疫苗经过多年临床应用，已被证明可有效降低乙型肝炎的感染率。例如，经过大规模接种，台湾地区的六岁儿童乙肝长期带病毒人数比例已由1984年前的10％降低到1990年后的1％以下(Chen et al.J.Gastroenterol.Hepatol.15：E3-E6，2000)。目前使用的乙肝疫苗，接种新生儿的保护效率几乎可达到100％，但对于年龄较大的成人以及一些乙肝高危人群，如母亲乙肝E抗原阳性的新生儿，艾滋病毒阳性，肾衰病人等，保护比例明显不足(Hollinger.In：Fields et al.eds.Virology.New York，Raven Press Ltd.，pp2171-2234，1990；Andre&Path，Am.J.Med.，87：14S-20S，1989；Bruguera et al.Am.J.Med.，87：30S-35S，1989)。

此外，现行的乙肝疫苗需要注射三针后抗体滴度才能达到保护水平，这对于病人的医从性以及大规模免疫均带来不便，并不利于降低乙肝感染的风险，并增加了免疫成本。

因此，新一代的乙肝疫苗，如果能达到高效保护成人和高危人群的结果，或者能够减少注射次数，将对控制乙型肝炎的传播有着重要的意义。

虽然乙肝可以通过乙肝疫苗有效预防，乙型肝炎的治疗目前仍面临很多困难。得到美国食物药品署批准的治疗乙型肝炎的药物只有干扰素和拉米呋啶，在亚洲人群中，干扰素疗法能够清除表面抗原的病人不到5％(Lok et al.Gastroenterol.，105：1833-1838，1993)，而清除e抗原的病人也只有15-20％(Lok et al.Gastroenterol.，102：2091-2097，1992；Guan，J. Gastroenterol.Hepatol.，15：E34-E40，2000)。最近进入市场的长效干扰素对于丙型肝炎的治疗效果有明显改善(Zeuzem et al.，New England J.Med.343：1666-1672，2000)，但对于乙型肝炎的疗效尚待确定。胸腺肽是治疗乙型肝炎的另一种免疫疗法，目前尚未得到FDA批准，其有效率在25-40％之间(Lau，J.Gastroenterol.Hepatol.，15：E46-E52，2000)。

拉米呋啶代表了能抑制病毒复制的核苷酸衍生物，这种治疗方法虽然能够将血液中的病毒数目大大减少，却很难达到根除病毒的效果，且长期使用会有耐药性产生(Leung，J.Gastroenterol.Hepatol.，15：E53-E60，2000)。

其他治疗方法还包括中药，但由于缺乏具有信服力的临床数据，中药对乙型肝炎的确切疗效仍然不能肯定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是研制能有效预防和治疗乙型肝炎的药物。

目前，科研界正在积极研究各种能够激活对乙肝病毒特异的细胞免疫方法，这些方法包括DNA疫苗(Manini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：12496-12501，1996)，短肽疫苗(Livingston et al.，J.Immunol.，159：1383-1392，1997)，抗原抗体复合物(Wen et al.，Lancet，345：1575-1576，1995，病毒载体(Sal lberg et al.，Hum.Gene Ther.，9：1719-1729，1998)，CPG寡核酸增强剂(Davis et al.，J.Immunol.，160：870-876，1998)，疫苗佐剂(Weeratna et al.，Vaccine，18：1755-1762，2000)，能诱导CTL的抗原(Vitiello et al.，J.Clin.，Invest.，95：341-349，1995)等，  这些方法有些在动物模型中显示出较好的效果，但仍需要进行漫长的临床研究，以确认这些方法的有效性和安全性。

卡介菌多糖核酸组份是中国科技工作者首先开发出的一种免疫调节剂，这种制剂具有能够激活机体免疫力，特别是能够对细胞免疫体系有较好的增强效果，因此被用来治疗免疫低下所造成的感染等，并用来调节免疫系统的平衡，治疗哮喘。此产品经过临床验证，被证明安全有效，在治疗哮喘，老年性慢性支气管炎，过敏和感冒等方面得到广泛的临床应用(马维勇等，医学理论与实践，14：2-4，2001；金一平等，上海免疫学杂志，14：5-8，1994)。

本发明提供了一种增强针对某种或某几种特定抗原免疫力的药物组合物，该组合物包含一种或几种特定抗原与卡介菌多糖核酸的有效剂量，和药物适用的稀释剂，稳定剂，辅剂或载体，其中卡介菌多糖核酸与特定抗原的有效质量比例为1∶0.1到1∶10000之间的任何比例。

这些抗原可以是单个蛋白质或多肽，如乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，乙肝E抗原，艾滋病毒GPl60抗原，艾滋病毒GAG，乳头瘤病毒E7抗原，丙肝NS抗原，乙肝短肽抗原，丙肝短肽抗原，艾滋病毒短肽抗原，乳头瘤病毒短肽抗原等等，这些抗原可以包括但不局限于乙肝病毒的其他抗原，丙肝病毒抗原，艾滋病毒抗原，乳头瘤病毒抗原，流感病毒抗原，疱疹病毒抗原等等，这些抗原可以是通过基因工程方法制备，也可以通过生物化学方法提取，或者通过化学方法合成。这些抗原可以是完整的抗原，也可以是片断或短肽，可以是单个的抗原，也可以是任何数目的抗原的复合物。也可以是这些抗原中的两个或多个的组合物，也可以是单个或多个抗原组成的高聚合物。

以上的抗原或抗原复合物与卡介菌多糖核酸按照一定比例进行混合，这种比例可以是在1∶0.1到1∶10000(质量比)范围内的任何比例，在混合过程中可加入传统使用的铝佐剂或其他佐剂，也可以不加任何佐剂。

卡介菌多糖核酸能够激活机体免疫反应，与特定抗原共同使用时可以产生或增强针对特定抗原的免疫反应，包括抗体和细胞免疫.卡介菌多糖核酸的提取是从卡介菌(Mycobacterium bovis Calmette-Guerin bacillus，BCG)提取，但也可以从其他与卡介菌相关的细菌中提取。

如采用加热灭活的结核杆菌(Mycobacteraium tuberculosis)在矿物油中即用来作为增强免疫力的佐剂，被称为弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvant).可以预计，从结核杆菌中提取的多糖核酸组份与卡介菌多糖核酸具有同样的意义.

又比如，活的BCG，加热灭活的BCG或者加热灭活的短棒状杆菌Propionibacerium parvum可以用来作膀胱灌注来治疗膀胱癌，是目前最有效的方法之一，其机理便是激发了局部的免疫反应，采用同一类细菌来提取多糖核酸组份，即可达到与卡介菌多糖核酸类似效果。

又例如，与卡介菌相关的红色诺卡氏菌Norcardia rubra的细胞壁骨架或者卡介菌的细胞壁骨架可以激发免疫反应，被应用作为免疫治疗的重要药物，这类细胞壁骨架的主要组份包含多糖组份，可以达到卡介菌多糖核酸类似的效果。

因此，卡介菌多糖核酸的应用也包括从这些相关的细菌提取的多糖核酸组份或细胞壁骨架组份，统称为卡介菌多糖核酸类似物。

抗原和卡介菌多糖核酸混合后，以肌肉，皮下，腹腔或静脉等常规用药方法使用，在产生抗体反应和细胞免疫反应的观察期内，可以在血清中检测到与特异抗原反应的抗体，并可以检测得到对抗原特异的能够杀伤表达该抗原细胞的细胞毒性T淋巴细胞。

对某种或某几种抗原达到一定程度的抗体反应，在很多情况下，可以防止表达该种抗原的致病微生物所导致的疾病。如乙型肝炎病毒表面抗原的使用，可以作为疫苗诱导抗表面抗原的抗体产生，此抗体水平达到一定程度时，即可达到防止乙肝病毒对机体产生侵袭的危害。

对某种或某几种抗原所形成的细胞免疫反应，在很多情况下，可以使机体有效地防止受表达该种抗原的致病微生物感染，并可能在感染后将致病微生物从机体清除，因此有效诱导针对特异抗原的细胞免疫制剂，可用于预防被致病微生物感染，并治疗已被感染的病人。

本发明将乙肝表明抗原与卡介菌多糖核酸组份共同使用以大幅度增加乙肝表面抗原诱导产生抗体的能力，可使同样剂量的乙肝表面抗原产生更强的抗体反应，机体产生的针对乙肝表面抗原的抗体(表面抗体)可以通过商业化的酶联或放免试剂盒进行测定，也可以采用如在Antibody一书中所描述的方法测定抗体滴度，通过这些方法测定的抗体滴度结果表明，采用乙肝表面抗原与卡介菌多糖核酸混合免疫的表面抗体滴度要显著高于常规的乙肝疫苗，这种新的药物组份可对乙肝疫苗低应答人群提供保护，或者在减少注射次数的前提下，即可达到保护水平的抗体反应，以增加医从性。

同时，本发明将乙肝表面抗原与卡介菌多糖核酸组份共同使用以激活对乙肝表面抗原特异的细胞免疫力可激活对乙肝表面抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞，为机体提供常规乙肝表面抗原疫苗所不能提供的细胞免疫保护机制，更可以作为治疗手段，治疗被乙肝病毒感染而成为长期病毒携带者的病人。细胞毒性T淋巴细胞的测定方法是在进行免疫注射后设定时间，将小鼠杀死，取脾脏细胞，并按不同比例与表达表面抗原的靶细胞在二氧化碳培养箱共同培养一定时间后，计算或测定存活靶细胞的数目。存活靶细胞数目越少，则证明激活细胞毒性T淋巴细胞的免疫能力越强。常规乙肝疫苗已在动物和临床试验中证实基本不能诱导细胞毒性T淋巴细胞的形成，而经过乙肝表面抗原与卡介菌多糖核酸混合物免疫的小鼠脾脏细胞可有效杀伤表达乙肝表面抗原的靶细胞，使共培养后的靶细胞存活率大大降低，证明了针对乙肝表面抗原细胞毒性T淋巴细胞的激活。

本发明所的药物组合物，可以用来制备更为有效的新型疫苗，包括乙型肝炎疫苗，乳头瘤病毒疫苗，艾滋病毒疫苗等，这种有效性体现在使用同样的抗原剂量而产生更为强烈的抗体反应，或者减少免疫次数，依然达到能够具保护水平的抗体水平，并能治疗被微生物特别是被病毒感染的人群。很多被微生物感染的人群，包括乙型肝炎，结核杆菌，乳头瘤病毒等，由于缺乏有效的细胞毒性T淋巴细胞的细胞免疫系统激活，而成为病菌长期携带者，不仅危害自身健康，还继续提供了疾病传播的源泉。使用本发明所阐述的激活针对特异抗原的细胞毒性T淋巴细胞等细胞免疫体系的方法以及相应的药物组份，可以有效诱导产生针对某种微生物特异抗原的细胞免疫力，从而使机体有可能将已经寄居在机体内部的微生物清除，达到治疗微生物感染的目的。

本发明的另一目的是提供了上述一种增强免疫力的药物组合物的制备方法，该方法包括下列步骤：

(1)乙肝表面抗原疫苗的制备

由基因工程乙肝表面抗原溶液制备乙肝表面抗原疫苗，该乙肝疫苗的成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，铝含量为0.35-0.62mg/ml；

(2)卡介菌多糖核酸的制备

由精制卡介菌多糖核酸用生理氯化钠溶液溶解，360微克/毫升，121℃20分钟灭菌，即为卡介菌多糖核酸溶液；

(3)乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物制备

将制备好的乙肝疫苗溶液于250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入上述的卡介菌多糖核酸溶液，使最终体积达到原乙肝疫苗溶液体积，混和后于2-8℃振荡12小时，即为乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，其成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，铝含量为0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸324微克/毫升；将该混合物保存于2-8℃备用，使用前摇匀。

本发明以乙肝表面抗原为实例，公开了将卡介菌多糖核酸或其类似物与特定抗原联合使用，从而有效产生或增强针对特定抗原的体液(抗体)免疫力，并诱导产生或增强针对特定抗原的细胞免疫能力的方法以及相应的药物组合物和生产这种药物组合物的方法。此方法可广泛使用于需要增强抗体免疫能力或需要诱导细胞免疫力才能够得到预防和治疗的微生物感染。HSV，HIV，HCV，HBV，HPV，H.pylori；tumors，

具体实施方式实施例1乙肝表面抗原疫苗制备

1、乙肝表面抗原溶液的获得、过滤和保存

乙肝表面抗原溶液由深圳康泰生物制品有限公司提供，系由该公司按照《中国生物制品规程》由重组酵母发酵表达并经纯化得到，抗原含量为120微克/毫升(LOWRY法测定)，溶解于磷酸缓冲盐水中，用MILLIEX0.22微米孔径除菌滤器(MILLIPORE)进行过滤，保存于2-8℃。

2、佐剂的制备

取250毫升磷酸缓冲盐水(PBS)，置于磁力搅拌器上进行搅拌，然后边搅拌边加入22.325克硫酸钾铝[KAl(SO₄)₂]，溶解后加入10.6克氢氧化钠，待其溶解后，用1.0M氢氧化钠水溶液将溶液的pH值调整至7.1。于室温持续搅拌2小时，然后于2-8℃静置沉降12小时。用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入生理氯化钠溶液，使终体积为300毫升，于2-8℃搅拌2小时后，于2-8℃静置沉降12小时。用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入生理氯化钠溶液(0.15M NaCl)，使终体积为300毫升，于2-8℃搅拌2小时后，于2-8℃静置沉降12小时。用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入生理氯化钠溶液，使终体积为250毫升，于2-8℃搅拌30分钟后，于121℃灭菌30分钟，室温冷却后即为佐剂。将佐剂置于2-8℃保存，临使用前摇匀，在层流净化工作台中取出需要使用的体积。该佐剂的铝含量为0.35-0.62mg/ml，pH为5.5至7.0，实测pH值为6.7。

3、乙肝疫苗的配制和保存

无菌操作，取60微克乙肝表面抗原(0.5毫升)和10.2毫升佐剂，混和后于2-8℃振荡至少12小时。250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入12.0毫升经121℃30分钟灭菌的生理氯化钠溶液(0.15M NaCl)，于2-8℃振荡30分钟，250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入12.0毫升经121℃30分钟灭菌的生理氯化钠溶液(0.15M NaCl)，混和后于2-8℃振荡30分钟，250g离心5分钟。用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入12.0毫升经121℃30分钟灭菌的生理氯化钠溶液(0.15M NaCl)，  混和后于2-8℃振荡30分钟，250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入经121℃30分钟灭菌的生理氯化钠溶液(0.15M NaCl)，使最终体积为10.2毫升，混和后于2-8℃振荡30分钟，  即为乙肝疫苗。该乙肝疫苗的成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，铝含量为0.35-0.62mg/ml。将该乙肝疫苗保存于2-8℃备用，使用前摇匀。实施例2乙肝表面抗原与卡介菌多糖核酸组份的混合物

1、精制卡介菌多糖核酸的获得、预处理和保存精制卡介菌多糖核酸由成都生物制品研究所提供，系按照《中国生物制品规程》用卡介菌经热酚法提取多糖、核酸并经干燥得到，于25℃密封干燥保存。其多糖含量为76％，核酸含量为13％，蛋白质含量0.1％。

在与乙肝疫苗混和之前，用生理氯化钠溶液溶解精制卡介菌多糖核酸(360微克/毫升)，121℃20分钟灭菌，即为卡介菌多糖核酸溶液。

2、乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物的制备与保存将在本发明实施例1中制备的乙肝疫苗3.0毫升于250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入本实施例步骤1中制备的卡介菌多糖核酸溶液，使最终体积为3.0毫升，  混和后于2-8℃振荡12小时，即为乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，其成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，铝含量为0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸324微克/毫升。  将该混合物保存于2-8℃备用，使用前摇匀。实施例3乙肝疫苗，乙肝疫苗和卡介菌多糖核酸组份混合物一次性

免疫小鼠

1、实验动物

6-8周龄BALB/C小鼠(雌性70％，雄性30％)购自HARLAN公司。

2、药物及剂量

(1)待测药物为在本发明实施例2中制备的乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，每剂含卡介菌多糖核酸55微克，乙肝表面抗原1微克，每剂体积170微升。

(2)阳性对照为在本发明实施例1中制备的乙肝疫苗，每剂含乙肝表面抗原1微克，每剂体积170微升。

3、给药

取20只小鼠，按每组7只雌性、3只雄性随机分成2组，一组命名为治疗组，另一组命名为对照组。从眼眶内取血100至200微升后，在治疗组小鼠的后大腿肌内注射一剂待测药物，在对照组小鼠的后大腿肌内注射一剂阳性对照。实施例4血样的采集和抗体滴度测定

1、采血方法与时间

用肝素预处理过的毛细管(SUREPREP，BECTON-DICKINSON)，分别于给药之前0日、给药后3周、7周和12周时从治疗组和对照组小鼠眼眶内取血100至200微升，将血样置于1.5毫升微离心管中。

2、血清的分离与保存

将血样于37℃温育30分钟后，于2-8℃静置过夜。14000转离心10分钟后(EPPENDORF CENTRIFUGE 5415C)，取出血清，保存于2-8℃待测。

3、用ELISA法测定抗乙肝表面抗原抗体滴度本发明用终点稀释度ELISA法检测抗乙肝表面抗原抗体滴度。终点滴度的定义是在阈值为0.05时，光吸收值(OD 450)是未免疫血清光吸收值的2倍的最高血清稀释度。抗乙肝表面抗原抗体滴度以组平均滴度±标准偏差的形式表示。治疗组与对照组之间抗体滴度差异的统计学显著性用Student t检验确定。具体测定步骤如下：

(1)用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释本发明实施例1中的乙肝表面抗原溶液，使乙肝表面抗原终浓度为1微克/毫升，以每孔100微升的量加入微滴定板(EIA/RIA 8 Well Strip Flat Bottom，CostarCat#2580)，于室温以50RPM在摇床上过夜。  用含有0.02％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS)清洗各孔2次，甩干。加入200微升含有10％牛血清或3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水，于室温以50RPM在摇床上过夜。用含有0.02％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS)清洗各孔2次，甩干并立即用于本实施例步骤3(2)中。

(2)用含有3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水稀释治疗组和对照组血清，可以采用倍比连续稀释或1比10连续稀释。将各个稀释度的样品各50微升加入本实施例步骤3(1)中的微滴定板孔中，记录每孔中的样品名称和稀释度，空白对照为含有3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水。于室温以50RPM在摇床上放置1小时。甩干，用含有0.02％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS)清洗各孔4次，甩干。每孔加入50微升缀联了辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠抗体(已用含有0.02％吐温20、10％牛血清或3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水稀释15000倍)。于室温以50RPM在摇床上放置1小时。甩干，用含有0.02％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBS)清洗各孔4次，甩干。每孔加入50微升TMB底物溶液(3，3’，5’5-Tetramethyl benzidine LiquidSubstrate System，Sigma)，于暗处室温放置5-30分钟，向每孔加入50微升1.0M硫酸溶液。用微滴定板读数仪(Softmax软件；Precision microplate reader，Molecular Devices)测定450纳米的光吸收值。

(3)测定结果(表1)对血清中抗乙肝表面抗体滴度测定结果如表I所示.

表1抗乙肝表面抗原抗体(HBsAb)滴度

组别		标本数	滴度(X±SD)	p值
					3周	乙肝疫苗	10	64±46.5
3周	乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	10	46±46.5
					7周	乙肝疫苗	10	172±293.3
7周	乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	10	1243±3101.8	p＞0.05
					12周	乙肝疫苗	5	1000±0
12周	乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	5	2600±4157.8	p＞0.05

以上结果表明，小鼠后腿肌内给药一次，免疫7周后卡介菌多糖核酸与乙肝疫苗混合物诱导的表面抗体滴度是常规乙肝疫苗的7倍，免疫12周后卡介菌多糖核酸与乙肝疫苗混合物诱导的表面抗体滴度是常规乙肝疫苗的2.6倍，但是p值均大于0.05。实施例5小鼠脾细胞培养及与表达乙肝表面抗原的靶细胞共培养

(1)配制裂解缓冲液：在总体积1000毫升中，溶解89.9克氯化铵，10克碳酸氢钾，370毫克EDTA四钠盐，调整pH至7.3。使用前用超纯水稀释10倍并除菌过滤。

(2)靶细胞培养与照射：靶细胞为表达乙肝病毒表面抗原的中国仓鼠卵巢细胞CHO-C28(成都生物制品研究所)，将靶细胞在培养瓶中培养(DME High Glucose，Irvine Scientific)至80-90％密度时，用胰酶消化1分钟，再用DME培养基悬浮细胞，用钴60射线照射，照射剂量8Gy。1000转离心5分钟后，去除原培养液，用RPMI1640培养液(Irvine Scientific)悬浮细胞，使细胞密度为1.5×10⁶/5ml。

(3)分离脾细胞：给药后第8周时每组各处死2只雌性和3只雄性小鼠，取脾脏。将脾脏研磨匀浆，用RPMI1640培养液悬浮细胞，于1500转离心5分钟。用裂解缓冲液悬浮沉淀的细胞，于室温放置5分钟以裂解红细胞。1000转离心5分钟后，用PBS悬浮脾细胞，使其密度为3×10⁷细胞/5mL。

(4)脾细胞与靶细胞共培养：将本实施例步骤(2)与(3)中的靶细胞与脾细胞等体积混和成10毫升脾细胞和靶细胞混悬液，于37℃(5％CO₂)培养箱中培养5天。

(5)存活靶细胞计数：将本实施例步骤(4)中的靶细胞与脾细胞混悬液1000转离心5分钟，用RPMI 1640培养液悬浮清洗细胞一次，将密度调整为5×10⁵细胞/50微升，铺于96孔板(Microtest^TM 96，Becton Dickinson Labware)中，4小时后吸去上清液，用PBS清洗贴壁靶细胞一次，照相、计数贴壁的靶细胞。

(6)结果(表2)：经与免疫后小鼠脾细胞共培养的靶细胞存活数量如表2所示.

表2靶细胞存活数量

组别	标本数	靶细胞存活数(X±SD)	p值
				乙肝疫苗	5	1370.4±634.9
乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	5	309.2±56.35	p＜0.01

以上结果表明，小鼠后腿肌内给药一次，用给药8周后的小鼠脾细胞与靶细胞共培养，与乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物免疫组脾细胞共培养存活的靶细胞数量是与对照组(常规乙肝疫苗免疫)脾细胞共培养存活的靶细胞数量的22.5％。说明乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物诱导抗乙肝的细胞免疫能力显著高于乙肝疫苗。实施例6 乙肝疫苗，乙肝疫苗和卡介菌多糖核酸组份混合物多次性

    免疫小鼠

1、乙肝疫苗的配制方法同实施例1，成分为生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，铝含量为0.35-0.62mg/ml。

2、乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物的制备同实施例2，将制备的乙肝疫苗3.0毫升于250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入卡介菌多糖核酸溶液，使最终体积为3.0毫升，混和后于2-8℃振荡12小时，即为乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，其成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，铝含量为0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸940微克/毫升。将该混合物保存于2-8℃备用，使用前摇匀。

3、实验动物

6-8周龄雌性BALB/C小鼠购自HARLAN。

4、药物及剂量

(1)待测药物为在本实施例步骤2中制备的乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，每剂含卡介菌多糖核酸94微克，乙肝表面抗原1微克，每剂体积100微升。

(2)阳性对照为在本实施例步骤1中制备的乙肝疫苗，每剂含乙肝表面抗原1微克，每剂体积100微升。

(3)给药取小鼠10只，按每组5只随机分组，一组命名为治疗组，另一组命名为对照组。从眼眶内取血100至200微升后，在治疗组小鼠的后大腿肌内注射一剂待测药物，在对照组小鼠的后大腿肌内注射一剂阳性对照。一周后在治疗组小鼠的后大腿肌内再注射一剂待测药物，在对照组小鼠的后大腿肌内再注射一剂阳性对照。实施例7多次免疫后血样的采集及抗体滴度测定

采血方法，血清的分离，抗乙肝表面抗原抗体滴度的测定与实施例4相同，第一次免疫后第4周小鼠血清中表面抗体滴度的测定结果如表3所示。

表3抗乙肝表面抗原抗体滴度

组别	标本数	滴度(X±SD)	p值
				乙肝疫苗	5	8.2×103±4.4×103
乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	5	4.6×105±4.9×105	p＜0.05

以上结果表明，小鼠后腿肌内给药二次，首次给药4周后乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物诱导的表面抗体滴度是常规乙肝疫苗的56倍，存在显著性差异。乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物诱导表面抗体的能力显著高于常规乙肝疫苗。实施例8卡介菌多糖核酸增强抗体反应的量效关系

1、乙肝疫苗的配制方法同实施例1，成分为生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，铝含量为0.35-0.62mg/ml。

2、乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物的制备同实施例2，将制备的乙肝疫苗3.0毫升于250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入按实施例2方法制备的卡介菌多糖核酸溶液(浓度分别为200微克/毫升，1000微克/毫升，2000微克/毫升)，使最终体积为3.0毫升，混和后于2-8℃振荡12小时，即为乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，其成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，铝含量为0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸200，1000，或2000微克/毫升。将该混合物保存于2-8℃备用，使用前摇匀。

3、实验动物

6-8周龄雌性BALB/C小鼠购自HARLAN。

4、药物及剂量

(1)待测药物为在本实施例步骤2中制备的乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，每剂含卡介菌多糖核酸20，100或200微克，乙肝表面抗原1微克，每剂体积100微升。

(2)阳性对照为在本实施例步骤1中制备的乙肝疫苗，每剂含乙肝表面抗原1微克，每剂体积100微升。

(3)给药

取小鼠40只，按每组10只随机分为四组，一组命名为对照组，用1微克常规乙肝疫苗免疫，另三组为治疗组，用1微克乙肝疫苗分别与20微克，100微克或200微克卡介菌多糖核酸混合物免疫小鼠。从眼眶内取血100至200微升后，在治疗组小鼠的后大腿肌内注射一剂待测药物，在对照组小鼠的后大腿肌内注射一剂阳性对照。

5.采血方法，血清的分离，抗乙肝表面抗原抗体滴度的测定与实施例4相同，一次免疫后第4周小鼠血清中表面抗体滴度的测定结果如表4所示。

表4抗乙肝表面抗原抗体滴度

组别	标本数	滴度(X±SD)	p值
				乙肝疫苗	10	1.4×104±9.0×103
乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	10	7.5×104±1.2×104	P＞0.05
				乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	10	9.2×104±7.7×104	P＜0.05
乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物	10	1.0×105±9.1×104	P＜0.05

以上结果表明，小鼠后腿肌内给药一次，4周后乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物诱导的表面抗体滴度是常规乙肝疫苗的5-7倍，100微克和200微克卡介菌多糖核酸剂量组与对照相比有显著性差异。诱导产生的表面抗体滴度随卡介菌多糖核酸剂量增加而增加，但缺乏显著性差异。乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物诱导表面抗体的能力显著高于常规乙肝疫苗。

Claims (12)

1.一种药物组合物，其特征在于该组合物包括一种或几种特定抗原与卡介菌多糖核酸类似物组成的混合物的有效剂量及稀释剂，稳定剂或载体所组成。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中所述的卡介菌多糖核酸类似物为卡介菌多糖核酸。

3.根据权利要求1和2所述的药物组合物，其特征在于其中所述的抗原为乙肝表面抗原。

4.一种药物组合物，其特征在于向对象提供权利要求1-3的药物组合物后，能够产生或增强针对药物组合物所含抗原的抗体反应。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述的对象是包括人在内的哺乳动物。

6.一种药物组合物，其特征在于向对象提供权利要求1-3的药物组合物后，能够产生或增强针对药物组合物所含抗原的细胞免疫反应。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述的对象是包括人在内的哺乳动物。

8.一种如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)乙肝表面抗原疫苗的制备

由基因工程乙肝表面抗原溶液制备乙肝表面抗原疫苗，该乙肝疫苗的成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，铝含量为0.35-0.62mg/ml；

(2)卡介菌多糖核酸的制备

由精制卡介菌多糖核酸用生理氯化钠溶液溶解，360微克/毫升，121℃20分钟灭菌，即为卡介菌多糖核酸溶液；

(3)乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物制备

将制备好的乙肝疫苗溶液于250g离心5分钟，用连接了真空装置的玻璃吸管尽量地除去上清液。加入上述的卡介菌多糖核酸溶液，使最终体积达到原乙肝疫苗溶液体积，混和后于2-8℃振荡12小时，即为乙肝疫苗与卡介菌多糖核酸混合物，其成分为：生理氯化钠溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，铝含量为0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸324微克/毫升；将该混合物保存于2-8℃备用，使用前摇匀。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的卡介菌多糖核酸类似物为卡介菌多糖核酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的抗原为乙肝表面抗原。

11.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征为此药物组合物可用于生产预防乙型肝炎的药物。

12.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征为此药物组合物可用于生产治疗乙型肝炎的药物。