CN102238959B

CN102238959B - 包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物及其在制备药剂中的应用

Info

Publication number: CN102238959B
Application number: CN2009801485026A
Authority: CN
Inventors: 宁云山; 关继峰
Original assignee: Jiuzhitang Co Ltd
Current assignee: Hunan Siqi Biopharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN102238959A; WO2010081257A1

Abstract

提供了包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其中所述的多糖占该组合物质量的10％～69％，所述的核酸占该组合物质量的30％～89％，该组合物通过混合所述多糖和所述核酸制成，其中所述的多糖和所述的核酸通过下列方法从卡介菌培养物中获得：从卡介菌培养物中提取所述多糖和所述核酸的混合物，并且通过离子交换层析法从该混合物中分离所述多糖和所述核酸。还提供了包含所述多糖和所述核酸的组合物在制备用于治疗或预防微生物感染、肿瘤、变态反应的生物药剂中的应用。

Description

包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物及其在制备药剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物以及该组合物的应用。

背景技术

卡介菌为牛型减毒结核菌，无致病性，有免疫原性，用卡介菌接种代替结核菌初次感染而获得对结核病的免疫力，是目前世界上应用最广泛的菌苗之一。

1882年，Robert成功分离出结核杆菌，确定了肺结核的病原菌。1908年，法国巴斯德研究所的Calnette和Guerin成功培育出一株弱毒牛型结核杆菌，并命名为卡介菌(BCG)。1921年，Weill-Halle成功地将该菌应用于人体，防治结核病。1971年，长沙防治气管炎研究组首先采用死卡介菌划痕法防治慢性支气管炎、哮喘、风湿性关节炎取得了较好的效果。1987年，湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司(原长沙神箭制药厂)与长沙市医工所合作在湖南医科大学著名呼吸道疾病专家谭礼智教授研究的基础上，进行了卡介菌(BCG)提取物的研究，采用热酚法去掉菌体蛋白质，再用乙醇沉淀提取菌体多糖和核酸及少量的蛋白质混合物而制成，在临床应用上取得了显著的效果。1994年湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司与中国生物制品检定所合作，改进工艺，提高质量标准，进一步降低了本制品的副反应，研制成新一代的卡介菌提取物，并使该产品进入了95版、2000版《中国生物制品规程》，并命名为卡介菌多糖、核酸注射液，该制剂为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为70％～80％左右，核酸为10％～20％，蛋白含量小于1％左右。自从卡介菌多糖、核酸注射液上市以后，就成为临床应用研究的热点。国内临床研究表明，卡介菌多糖、核酸注射液具有广泛的免疫调节作用，除了能增强人体细胞免疫功能外，还具有双向免疫调节作用。在预防和治疗感冒、哮喘、变应性鼻炎等呼吸道疾病及湿疹、荨麻疹、扁平疣、寻常疣、尖锐湿疣等皮肤疾病有较好的疗效。

现代生物化学、免疫学、基因组学及蛋白组学的研究结果初步揭示了结核分枝杆菌(卡介菌)在呼吸道、皮肤病等疾病预防和治疗中的物质基础和作用机制。研究表明卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖和核酸组分发挥着重要的生理功能。在卡介菌中，多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸)和脂类常结合在一起，构成细胞壁的主要成分。目前的研究表明：BCG细胞壁和其他细胞器上存在可结合人和动物Toll受体(TLR)的配体，这些配体至少可结合5种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，当它们同TLR结合促进树突状细胞(DC)的成熟，并且诱导IL-12的分泌，IL-12对促进Th0细胞向T_H1细胞亚群转化和IFN-γ分泌，从而产生T_H1占优势的非特异性免疫反应(JExp Medd 2003；197：403-411)。

CpG基序(CpG motifs)是一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为核心的寡聚脱氧核酸(oligodeoxynucleotides，ODN)，其碱基排列大多遵循以下规律：5’PurPurCGPyPyr3’，即5’端为两个嘌呤，3’端为两个嘧啶。这种序列可激活多种免疫效应细胞，因此又被称为免疫刺激DNA序列(Immuno-stimulatory DNA sequence，ISS)。Yamamoto等(Yamamoto ST et al.J Immunol.1991；148：4072)首先报道从卡介苗(BCG)中分离的长为30个碱基的寡脱氧核酸(ODN)可激活小鼠NK细胞的杀伤活性，刺激其Y-干扰素分泌，认为是由于ODN中含有六碱基的回文序列所致。1995年，Krieg等发现人工合成的和细菌来源的包含未甲基化CpG的DNA片段都能激活B细胞增殖、分化、并产生抗体。比较细菌、病毒、脊椎动物(包括人类)基因组序列发现：细菌、病毒的基因组DNA中富含CpG基序，而脊椎动物的DNA中CpG基序相对缺乏。其中在已分析的细菌基因组中，结核分枝杆菌所含有的CpG基序的比例最高(通过生物信息学技术对结核分枝杆菌H37Rv基因组数据分析表明：结核分枝杆菌H37Rv基因组中的GC％含量为66.1％左右，CpG的百分含量为22％左右)。

大量研究证实，细菌基因组的DNA和人工合成的CpG ODNs主要依赖其序列中CpG基序激活特异性和非特异性系统的细胞发生免疫应答。细菌CpG DNA在体内外均能激活多种免疫活性细胞，包括单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)、B细胞和T细胞，刺激免疫活性细胞分泌多种细胞因子并能上调某些表面分子、趋化因子、粘附分子和共刺激分子等，诱导机体天然免疫系统活化，并产生抗原特异性的获得性免疫应答，同样，CpG DNA可诱发T_H1型免疫应答反应，抑制T_H2型免疫应答反应，调节T_H1/T_H2的平衡，在纠正由于T_H1/T_H2失衡所引发的疾病中具有重要的作用。目前CpG DNA主要应用于以下研究方面：

1.在传染性疾病预防和治疗中的作用

CpG DNA作为免疫佐剂增强疫苗对机体的免疫能力已在多种动物模型中得到证实。Davis等CPG ODN与HBV疫苗共同注射给猩猩，其血清转阳率达100％，明显高于单一注射HBV疫苗的15％的血清转阳率。由于猩猩与人类在遗传上极为相似，这一阳性结果表明CpG-ODN可发展成为成功的人用佐剂(Vaccine，2000，18(18)：1920-1924)。目前，CpG ODN作为佐剂已进人临床实验，初步结果表明可大大加速血清阳转，提高抗体滴度，而无明显不良反应。另外，有人观察了CpG-ODN和重组HBsAg对HBV慢性无症状携带者转基因鼠的影响，发现CpG DNA、HBsAg共同作用实验动物后，其体内抗原特异性抗体明显增多；将其CD8⁺T细胞移植入另一转基因鼠体内，可清除受体鼠体内的HBsAg，说明CpG DNA在治疗慢性HBV感染者方面具有潜在的应用价值(J Virol，2001，75(14)；6482-6491.)。CpG DNA作为免疫佐剂，在HIV疫苗研究中也显示了巨大的潜力。将含CpG基序的质粒在体外刺激DC细胞，再将其与HIV外壳蛋白共同注射到Balb/c小鼠体内，可明显增强小鼠HIV特异性细胞免疫和体液免疫的能力(Vaccine，2002，20：2857-2865.)。另外，gp-120/CpGODN连接体可明显激发小鼠特异性的免疫反应，包括诱生大量a趋化因子、特异性的抗体生成和特异性的CTL反应(J Immunol，2001，167(3)：1584-1591.)。

2.CpG-DNA在肿瘤免疫治疗中的研究

实验表明CpG DNA是肿瘤疫苗的有效佐剂，能诱导机体保护性免疫力，从而抵抗致死量肿瘤的攻击。Auf等研究报道，CpG DNA能够通过激活巨噬细胞，有效对抗肿瘤的发展，在肿瘤早期治疗中起重要作用(ClinCancer Res，2001，7(11)：3540-3543)。另外，Sipos等报道，CpG ODN与抗原刺激的DC细胞共同注射到患结肠癌的鼠体内，可明显提高DC的抗瘤活性；并且全身给药抑制肿瘤生长的能力比5-FU和甲酞四氢叶酸强(7th Intenational Symposmum on dendritic cell[C]，Germany，2002，Austria：Robidruck，2002.29.)。同样，CPG DNA可抑制WHEI231 B淋巴细胞的凋亡，增加免疫活性细胞(如脾细胞、巨噬细胞)和造血细胞对λ-射线的耐受能力，从而增强肿瘤患者对放疗的耐受能力，提高肿瘤放射治疗的效果。(Mol Immunol，2006，43c8：1163-71)。

3.CpG-ODN在过敏性疾病中的研究

过敏性疾病(变态反应性疾病)是由环境过敏原诱导机体产生T_H2型免疫应答所致。由于CpG DNA强烈的T_H1免疫应答增强剂的作用，不仅能够防止T_H2型免疫应答的发生，而且可以使已经发生的T_H2型免疫应答转向T_H1型免疫应答。Sur S等证实，以CpG DNA接种对豚草敏感的小鼠48h后，小鼠对T_H2型细胞因子的合成受到抑制，过敏原特异的IgE生成细胞数量减少，过敏反应显著减弱，而且存在有特异的免疫记忆效应，提示可用CpG DNA与过敏性疾病的特异性抗原免疫机体，以防治相应的过敏性疾病(J Immunol，1999，162(10)：6284-6293)。CpG DNA不仅在哮喘小鼠模型中预防变态反应疾病的发生，且能防止致敏小鼠遭遇变应原时的不良反应；通过对多种哮喘动物模型的研究发现，无论腹腔注射给药还是鼻腔滴入给药，无论是致敏或激发前、后给药，CpG DNA能完全阻止变应原引起的哮喘动物呼吸道嗜酸性粒细胞增多，降低支气管高反应性，抑制肺部及全身的T_H2型免疫应答，降低变应原诱生的IL-4水平及IgE合成，尤其在CpG DNA与抗原同时使用的情况下，效果特别明显，更有意义的是CpG DNA提供的保护作用能持续相当长的时间(J ClinImmunol，2001，21：175-182；WildJS Allergy 2001，6：365-376；J AllergyClin Immunol 2002；111：706-712)。

综上所述，细菌CPG DNA或合成的CPG DNA在预防和治疗微生物感染(单独或做为免疫佐剂)、肿瘤的免疫治疗或辅助治疗及纠正T_H1/T_H2细胞失衡的变态反应疾病中将具有非常广阔的应用前景。

目前已上市的卡介菌多糖、核酸注射液是通过从卡介菌培养经热酚法提取的多糖核酸制剂，该制剂为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为70％～80％左右，核酸为10％～20％，蛋白含量小于1％左右。从目前研究的数据表明，该制剂在临床应用上表现为显效慢、有效持续时间短等不足，该制剂中多糖和核酸的比例是由于当时卡介菌多糖、核酸提取工艺的水平所决定，这种比例是否合适和最佳并没有经过科学的方法进行优选。因此对卡介菌多糖、核酸混合物中多糖与核酸的比例进行研究，将为提高现有卡介菌多糖、核酸注射液的疗效或为研制疗效显著、作用持久、安全可广泛应用于治疗或预防感染性疾病、过敏性疾病和肿瘤等新一代卡介菌衍生制剂提供物质基础。

发明内容

本发明的目的之一即是提供一种可在不同疾病中发挥不同效果的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，该组合物中卡介菌多糖和卡介菌核酸的比例可以根据需要进行配比；本发明的另一目的是提供上述包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物的用途。

本发明提供一种包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，该组合物中多糖的质量百分含量为10％～69％，该组合物中核酸的质量百分含量为30％～89％。

上述组合物由卡介菌多糖和卡介菌核酸经混合制成；其中卡介菌多糖和卡介菌核酸通过以下方法从卡介菌培养物中提取得到：

(1)从卡介菌培养物中提取卡介菌多糖、核酸混合物；

(2)通过离子交换层析法从卡介菌多糖、核酸混合物中分离出卡介菌多糖；

(3)将步骤(2)所得卡介菌多糖与卡介菌核酸按比例混合。

其中，上述步骤(1)可以包括以下步骤：

(11)将卡介菌菌种接种于适合分支杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；

(12)上述菌体经破碎后离心收集上清液；

(13)上清液经有机溶剂抽提后，通过透析法或凝胶层析法除去有机溶剂。

上述步骤(2)中所述的离子交换层析法可以是采用阴离子交换介质的柱层析法，所述阴离子交换介质最好是Q Sepharose^TM XL。

上述步骤(2)可以包括以下步骤：

(21)将步骤(1)获得的卡介菌多糖、核酸混合物上样，同时开始收集流穿液；

(22)上样结束后，用生理盐水洗柱，收集洗柱液，将流穿液和洗柱液合并；

(23)将合并液采用脱盐柱进行脱盐，得到卡介菌多糖；

(24)步骤(22)洗柱结束后，采用浓度为0.1～2mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱峰；

(24)将收集的洗脱液采用脱盐柱进行脱盐，得到卡介菌核酸。

本发明还提供上述包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物在制备治疗或预防微生物感染、肿瘤或变态反应疾病的药物中的应用。

本发明所提供的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物可以调节机体细胞免疫功能，激活单核-巨噬细胞系统并诱生干扰素等细胞因子，从而调节体液免疫，具有抗病毒、抗炎、抗过敏等广泛的免疫调节作用，更为重要的是其免疫调节功能显著优于已上市的卡介菌核酸多糖核酸注射剂，因此本发明所提供的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物可以制成用于治疗或预防微生物感染、肿瘤、变态反应等疾病的新生物制剂。

本发明提供的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，一个重要的特点是来源于卡介菌(卡介苗)的天然产物，卡介菌(卡介苗)或卡介菌多糖、核酸制剂在人体临床上应用几十年，在预防和预防微生物感染、肿瘤、变态反应等疾病显示了良好的安全性和有效性，因此为研制新生物制剂提供可能。

具体实施方式

以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解利用的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。

实施例一卡介菌的培养和收获

(一)菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所菌苗室提供)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃连续培养14-20天；或在37℃连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃连续培养14-20天。

其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：

取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；

用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时；

用纯化水冲洗土豆斜面块；

用苏通培养基冲洗斜面块；

取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；

将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；

0.11MPa的大气压121℃，灭菌20分钟。放冷至室温待接种苏通培养基配制比例：

每1000ml：

改良的液体苏通培养基配方及制备：

天冬素(AR)：4g

柠蒙酸(AR)：2g

K2HPO43H2O(AR)：0.5g

MGSO47H2O(AR)：0.5g

柠檬酸铁铵(CP)：0.05g

甘油(药用)：60ml

蒸馏水：940ml

然后加1％(W/V)硫酸锌1ml，10磅20分钟灭菌。

(二)菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。

实施例二卡介菌多糖、核酸混合物的制备

(一)制备方法一：透析法

1.菌体破碎和热酚处理：将实施例一收集的菌体按10∶1的比例加入纯化水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次，将菌体捣碎，然后再加入与破碎菌悬液等量的热苯酚(60～65℃)，在低速搅拌中保温30分钟～1小时。

2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚好的混合液自然沉淀1～10天，吸取上清液，管式离心机离心后，上清装入透析袋(截流分子量＞5000道尔顿)中在100倍体积的注射用水中透析1～10天，除去苯酚。将透析好的液体中加入适量乙醇使含醇量60～85％，自然沉淀1～10天后，沉淀物用无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次。然后用乙醚洗涤离心3次后，放至干燥器干燥，干燥2～5天即为卡介菌多糖核酸混合物。

(二)制备方法二：凝胶层析法

2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚好的混合液自然沉淀1～10天，吸取上清液，管式离心机离心后，上清通过纯化系统按30％的体积上样于预先平衡的凝胶层析柱(层析用填料为GH-25或G-25，平衡液为0.9％生理盐水)，采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的目的峰通过0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖、核酸混合物，于4℃或-20℃保存待用。

实施例三从卡介菌多糖核酸混合物制备卡介菌多糖和卡介菌核酸

1.离子交换层析柱的制备：将1L～100L的离子交换填料(QSepharose^TM XL)按其说明书提供的方法装入相应的层析柱中，用2～10倍柱体积的注射用水淋洗层析柱，在通过2～10倍柱体积的注射用生理盐水平衡层析柱；

2.从卡介菌多糖核酸混合物中分离多糖和核酸：将10倍柱体积的通过实施例二制备获得的卡介菌多糖、核酸混合物上样，同时开始收集流穿液。上样结束后，用2倍柱体积的生理盐水洗柱，收集洗柱液，将流穿液和洗柱液合并，并命名为组分I(卡介菌多糖)，并通过0.45μm无菌滤器过滤，于4℃或-20℃保存待用。洗柱结束后，采用1mol/L的氯化钠溶液(注射用水配置)进行连续洗脱，通过紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)进行检测，收集洗脱峰，命名为组分II(卡介菌核酸)。采用脱盐柱进行脱盐(流动相为注射用生理盐水)，将脱盐后的组分II通过0.45μm无菌滤器过滤，于4℃或-20℃保存待用。

实施例四对制备的卡介菌多糖和卡介菌核酸组份进行检测和鉴别

按本发明提供的方法，连续从卡介菌培养物中制备三批卡介菌多糖和卡介菌核酸组份，采用《中国生物制品规程》(2000)和《分子克隆第三版》等所提供的标准方法对从实施例三中制备获得的组份I和组份II进行卡介菌多糖、卡介菌核酸的鉴别和含量测定，结果见表1。

表1卡介菌多糖和卡介菌核酸组份测定结果

注：

1.多糖含量的测定：参考《中国生物制品规程》(2000)版的恩酮法。

2.核酸含量的测定：参考《分子克隆第三版》。

3.核酸纯度的测定：参考《分子克隆第三版》。

4.蛋白含量的测定：参考《中国生物制品规程》(2000)版的lowry法。

5.核酸中CpG含量的测定：

(1)甲基化修饰反应

甲基化修饰反应严格按照供应商提供的方法进行，即DNA用SssI甲基化酶在合适的NEBuffer中处理，37℃加入S-腺苷蛋氨酸(SAM)，每4小时补充SAM，24小时后酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次，分别用乙醚，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，空气中风干，溶解于TE缓冲液中。

(2)甲基化修饰程度的检测

DNA原液和甲基化酶处理过的DNA用限制性内切酶Hpa II处理1小时，1％琼脂糖凝胶电泳60分钟，EB染色。

(3)酶水解反应

利用核酸酶Pl(Nuclease P1)、细菌碱性磷酸酶(BAP)(Sigma)水解DNA。取50μlDNA溶液(500ug/ml溶于TE缓冲液中，PH8.0)至1.5ml离心管中，沸水10分钟变性后置冰水5分钟灭活，样品加100μl 30mM乙酸钠，pH5.3。

5μl 20mM硫酸锌以及10ul nuclease Pl(1mg/ml 200units per mgin30mM乙酸钠pH5.3)于37℃水浴2小时，加20μl0.5M Tris-cl调pH8.5，再加入10ul细菌碱性磷酸酶(BAP)(10.8mg/ml 43.7units/mg.)37℃水浴2小时，-20℃保存备用。

(4)RP-HPLC

HPLC系统：waters 2695高效液相色谱仪，2998双光道紫外检测器。HPLC条件：

色谱柱：C-18反相柱；

流动相：缓冲液A(2.5％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH 4.0)22.5分钟；

缓冲液B(8.0％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH 4.0)30分钟；

洗脱液：70％甲醇-水10分钟；

流速：1ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：254nm，280nm双波长同时检测。

(5)数据处理

由于双链DNA特殊碱基互补原则，理论上dC/dG＝1dT/dA＝1，因此对dC/dG、dT/dA的摩尔比的检测能够反应检测的准确性。以已知量的各种脱氧核苷为标准，以8Br-Guo为内标，对所水解的BCG-CpG-DNA中的各种脱氧核苷进行摩尔定量后分别计算dC/dG、dT/dA的摩尔比，及GC的摩尔百分含量，将各种脱氧核苷的摩尔量和其相应脱氧单核苷酸的分子量的积累加计算出核酸的质量；根据M的5次方-dC的摩尔量和CpG分子量乘积，计算出CpG的质量，二者相比，即可得到CpG质量百分含量。

实施例五卡介菌不同组份对免疫功能低下模型鼠的T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响

1.免疫功能低下模型鼠的建立

免疫功能低下小鼠模型是参照《抗炎免疫药物药效学指导原则.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学)》完成，即每天注射氢化可的松(100mg/kg，ic，0.1ml/10g体重)，每日1次，共进行7天。

2.实验分组

试验分为8组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、卡介菌多糖注射组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量96％)、卡介菌核酸注射组(浓度＝1.0mg/ml，核酸含量92％，纯度＞1.8)、新卡介菌多糖核酸注射液组I(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝69％，核酸含量＝30％)、新卡介菌多糖核酸注射液组II(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝54％，核酸含量＝45％)、新卡介菌多糖核酸注射液组III(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝10％，核酸含量＝89％)、已上市卡介菌多糖核酸注射液组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量≈75％，核酸含量≈15％)。

卡介菌多糖注射组、卡介菌核酸注射组和卡介菌核酸多糖核酸注射液组小鼠在造模前2周至造模期间，后肢股部肌内注射相应的样品(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行试验。正常动物对照组后肢股部肌内每天注射生理盐水(ic，0.1ml/10g体重)，每日1次，共进行21天。

3.小鼠T淋巴细胞亚群和细胞因子的检测

①总T细胞％：常规制备淋巴细胞悬液，并用RPMI1640完全培养液调细胞浓度至4×10⁹个/L。用生理盐水将SRBC洗3次，并用培养液调至1％浓度。在1ml塑料离心管中，每管加入淋巴细胞悬液和培养液各50μl，37℃水浴中保温1小时。再加入SRBC悬液100μl混匀，37℃水浴保温10分钟。离心(800rpm，5分钟)水浴2小时。将细胞轻轻悬起，加100μl 4％戊二醛固定液(用锌酸缓冲液配制)混匀。计数前将上清液全部移除，加生理盐水100μl和20倍稀释的1％美蓝染色液100μl染色，20分钟后计数，即得总T细胞％。

②茶碱抵抗细胞花环％：在50μl淋巴细胞悬液中加入含100mmol/L茶碱的培养液50μl混匀，其余步骤同上。

③Th、Ts细胞％：按下式计算。

Ts细胞％＝100％-Th细胞％

④血清IFN-γ的测定：用ELISA方法，按试剂盒说明书进行。

4.实验结果

小鼠连续皮下注射氢化可的松(100mg/kg，1次/日)7天，可显著降低总T细胞、Th细胞、Ts细胞数以及血浆IFN-γ水平；卡介菌多糖注射组、卡介菌核酸注射组、新卡介菌核酸多糖核酸注射液组I、II、III、已上市卡介菌核酸多糖核酸注射液组可升高总T细胞、Th细胞、Ts细胞数以及血浆IFN-γ水平，其中新卡介菌多糖核酸注射液I、II和已上市卡介菌多糖核酸注射液相比，具有显著差异(P＜0.05，表2)。

表2卡介菌多糖核酸注射液对小鼠细胞免疫功能的影响(

n＝9-10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs正常动物对照组；⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01vs免疫功能低下组；

^#P＜0.05vs已上市卡介菌多糖核酸注射组。

实施例六卡介菌不同组份对豚鼠生殖器单纯疱疹病毒(HSV-2)感染的影响

1.动物模型的建立

建模方法参见(Bernatein DI，et al.J Infect Dis，2001；183(6)：844)，即首先用生理盐水清洗外阴，干棉签磨擦阴道数次，造成阴道粘膜损伤，然后用接有灌胃针头的注射器吸取HSV-2(效价为10^-4～-6TCID₅₀，由中国科学院武汉病毒研究所提供)0.1ml，将针头插入豚鼠阴道内约3～4cm将病毒注入阴道穹窿后缓慢退出，用明胶海绵塞入阴道以维持毒液，针头上少许毒液滴在外阴，用玻璃棒轻轻涂抹均匀，使病毒渗入皮肤。

2.动物分组

注入病毒14天后根据皮损程度分层随机分为七组：模型组、卡介菌多糖注射组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量96％)、卡介菌核酸注射组(浓度＝1.0mg/ml，核酸含量92％，纯度＞1.8)、新卡介菌多糖核酸注射液组I(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝69％，核酸含量＝30％)、新卡介菌多糖核酸注射液组II(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝54％，核酸含量＝45％)、新卡介菌多糖核酸注射液组III(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝10％，核酸含量＝89％)、已上市卡介菌多糖核酸注射液组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量≈75％，核酸含量≈15％)。

第15天开始，模型组、卡介菌多糖注射组、卡介菌核酸注射组、新卡介菌核酸多糖核酸注射液组、已上市卡介菌核酸多糖核酸注射液组分别后肢股部肌内注射生理盐水和卡介菌不同组份(给药容积均为0.1ml/100g体重)，间日1次，共3周；观察给药期间复发率(出现皮损的次数和天数)和皮损情况，末次给药后24h采血测定血清IFN-γ水平。

皮损程度参考文献(Bernatein DI，et al.J Infect Dis，2001；183(6)：844)方法进行评分：0分，无症状；0.5分，微红；1.0分，红肿无水疱；1.5分，单个小水疱(≤2mm)；2.0分，单个大水疱(＞2mm)；2.5分，多个小水疱和(或)阴道溃疡(出血)；3.0分，多个大水疱；3.5分，严重外阴肿胀；4.0分，多个小(大)水疱融合；4.5分，后肢瘫痪；5.0分，外阴溃疡。

3.实验结果

接种HSV-2后，豚鼠均出现类似于人类外阴生殖器疱疹的症状，主要表现为外阴红肿、水疱、溃疡，部分动物甚至后肢瘫痪。皮损症状多在按种后2～3天开始出现，首先表现为分散的红肿性小水疱，第4-10天发展为水疱-溃疡性皮损，第8-12天开始结痂，第13-15天痂皮脱落。第7-12天有8只动物出现后肢瘫痪，该症状第12-14天消失。

HSV-2接种14天后，根据皮损程度把豚鼠分层随机分为七组，分别给予生理盐水和卡介菌不同组份。结果发现，卡介菌多糖注射组、卡介菌核酸注射组、新卡介菌核酸多糖核酸注射液组I、新卡介菌核酸多糖核酸注射液组II、新卡介菌核酸多糖核酸注射液组III、已上市卡介菌核酸多糖核酸注射液组均可明显减少皮损的复发天数，并可显著升高血浆IFN-γ水平，但新卡介菌多糖核酸注射液II、III和已上市卡介菌多糖核酸注射液相比，具有显著差异(P＜0.05，表3)。

表3卡介菌不同组份对豚鼠生殖器疱疹复发天数和血浆IFN-γ水平的影响(

n＝15-16)

P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组；P＜0.05vs已上市卡介菌多糖核酸注射组。

实施例七对二硝基氟苯诱导小鼠迟发性(IV型)变态反应的影响

1.试验分组

试验分为六组：生理盐水对照组、氢化可的松阳性对照组(25mg/kg)、卡介菌多糖注射组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量96％)、卡介菌核酸注射组(浓度＝1.0mg/ml，核酸含量92％，纯度＞1.8)、新卡介菌多糖核酸注射液组I(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝69％，核酸含量＝30％)、新卡介菌多糖核酸注射液组II(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝54％，核酸含量＝45％)、新卡介菌多糖核酸注射液组III(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝10％，核酸含量＝89％)、已上市卡介菌多糖核酸注射液组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量≈75％，核酸含量≈15％)，(n＝8-12)。

2.致敏接触

致敏前24h小鼠腹部用8％Na₂S去毛，范围约3cm×3cm，试验第1日和第2日于去毛处涂抹1％2，4-二硝基氟苯溶液(DNFB，临用时以1∶1丙酮、麻油为溶媒配成)50μl致敏。

3.抗原攻击

第6日取1％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠左耳(两面)诱发皮炎，右耳涂抹等体积的溶媒进行自身对照。诱发皮炎后24h，颈椎脱臼处死小鼠，称重后剪下左右耳廓，在左右耳中部用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，计算左右耳重量差(即肿胀度)；同时取小鼠胸腺和脾脏称重，分别计算胸腺指数和脾指数(mg/10g小鼠体重)。

卡介菌不同组份注射液组小鼠在抗原攻击前3周，后肢股部肌内注射(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行抗原攻击。生理盐水和氢化可的松对照组致敏接触前1日开始后肢股部肌内注射生理盐水和氢化可的松，给药体积为0.1ml/10g体重，1次/日，连续用药7日，末次给药后1h进行抗原攻击。

4.实验结果

小鼠体重各组间无明显差异。与生理盐水组比较，卡介菌多糖注射组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量96％)、卡介菌核酸注射组(浓度＝1.0mg/ml，核酸含量92％，纯度＞1.8)、新卡介菌多糖核酸注射液组I(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝69％，核酸含量＝30％)、新卡介菌多糖核酸注射液组II(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝54％，核酸含量＝45％)、新卡介菌多糖核酸注射液组III(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝10％，核酸含量＝89％)、已上市卡介菌多糖核酸注射液组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量≈75％，核酸含量≈15％)可显著降低小鼠胸腺指数和脾脏指数，而新卡介菌核酸多糖核酸注射液I和已上市卡介菌核酸多糖核酸注射液相比，具有显著差异(P＜0.05，见表4)。

表4：卡介菌多糖核酸注射液对二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应的影响(

n＝8-12)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs生理盐水对照组；^#P＜0.05vs已上市卡介菌多糖核酸注射组

实施例八对速发型(I型)变态反应的影响--大鼠同种被动皮肤过敏反应

1.试验分组

试验分为八组：生理盐水对照组、氢化可的松阳性对照组(25mg/kg)、卡介菌多糖注射组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量96％)、卡介菌核酸注射组(浓度＝1.0mg/ml，核酸含量92％，纯度＞1.8)、新卡介菌多糖核酸注射液组I(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝69％，核酸含量＝30％)、新卡介菌多糖核酸注射液组II(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝54％，核酸含量＝45％)、新卡介菌多糖核酸注射液组III(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝10％，核酸含量＝89％)、已上市卡介菌多糖核酸注射液组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量≈75％，核酸含量≈15％)，(n＝10)。

2.抗血清制备

取体重90～100g大鼠6只，天花粉蛋白以4％氢氧化铝凝胶配成5mg/ml的混悬液，给大鼠4个足跖注射各0.1ml，共0.4ml。于致敏后14天，颈总动脉插管采血，离心(3000rpm，15min，4℃)分离血清，置-20℃保存备用。

3.被动皮肤致敏及抗原攻击

大鼠乙醚麻醉后剪去背部脊柱两侧毛(每侧约3cm×3cm)，将1∶20，1∶40稀释的抗血清皮内注射于大鼠背部，每一稀释度注射两点，每点0.1ml。48h后进行抗原攻击，即静脉注射0.5％伊文思蓝溶液1ml(内含天花粉蛋白1mg)。20min后断头处死动物，翻转背部皮肤，剪下蓝斑皮肤，每点以5ml丙酮生理盐水溶液(3∶7V/V)浸泡48h，离心(3000rpm，15min，4℃)，取上清液，590nm波长下测定光密度值，计算蓝斑抑制百分率。

卡介菌多糖核酸注射液组大鼠在抗原攻击前3周，后肢股部肌内注射卡介菌各组分(0.1ml/100g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行抗原攻击。生理盐水和马来酸氯苯那敏对照组抗原攻击前1h后肢股部肌内注射生理盐水和马来酸氯苯那敏，给药体积为0.1ml/100g。

4.试验结果

与生理盐水组比较，卡介菌多糖注射组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量96％)、卡介菌核酸注射组(浓度＝1.0mg/ml，核酸含量92％，纯度＞1.8)、新卡介菌多糖核酸注射液组I(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝69％，核酸含量＝30％)、新卡介菌多糖核酸注射液组II(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝54％，核酸含量＝45％)、新卡介菌多糖核酸注射液组III(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量＝10％，核酸含量＝89％)、已上市卡介菌多糖核酸注射液组(浓度＝1.0mg/ml，多糖含量≈75％，核酸含量≈15％)，(n＝8-12)均可抑制大鼠皮肤蓝斑形成，表现为吸光度显著降低；而新卡介菌核酸多糖核酸注射液I、II和已上市卡介菌多糖核酸注射液相比，具有显著差异(P＜0.05，表5)。

表5卡介菌不同组份对大鼠同种被动皮肤过敏反应的影响(

n＝10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs生理盐水对照组；^#P＜0.05vs已上市卡介菌多糖核酸注射组。

从实施例五、六、七和八可以得出如下结论：通过本发明所制备的卡介菌多糖注射液(多糖含量＞95％)、卡介菌核酸注射液(核酸含量＞90％，纯度＞1.8)和由上述卡介菌多糖和卡介菌核酸按新比例配制的新卡介菌核酸多糖核酸注射液均可增强总T细胞、Th细胞、Ts细胞数和血浆IFN-γ水平；在豚鼠生殖器疱疹模型上表明：上述注射液也可明显减少皮损的复发天数，升高血浆IFN-γ水平。同样，上述注射液可显著抑制二甲苯所致迟发性变态反应以及大鼠同种被动皮肤过敏反应。上述结果提示：通过本发明所制备的卡介菌多糖、卡介菌核酸和由上述卡介菌多糖和卡介菌核酸按新比例配制的新卡介菌核酸多糖核酸制剂可以调节机体细胞免疫功能，激活单核-巨噬细胞系统并诱生干扰素等细胞因子，从而调节体液免疫，具有抗病毒、抗炎、抗过敏等广泛的免疫调节作用，更为重要的是按新比例配制新卡介菌核酸多糖核酸制剂的免疫调节功能显著优于已上市的卡介菌核酸多糖核酸注射剂，因此通过本发明所制备的卡介菌多糖、卡介菌核酸可以单独方式或按一定比例组合形成治疗或预防微生物感染、肿瘤、变态反应等疾病的新生物制剂。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其特征在于，该组合物中多糖的质量百分含量为10%～69%，该组合物中核酸的质量百分含量为30%～89%。

2.根据权利要求1所述的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其特征在于，该组合物由卡介菌多糖和卡介菌核酸经混合制成；其中卡介菌多糖和卡介菌核酸通过以下方法从卡介菌培养物中提取得到：

（1）从卡介菌培养物中提取卡介菌多糖、核酸混合物；

（2）通过离子交换层析法从卡介菌多糖、核酸混合物中分离出卡介菌多糖和卡介菌核酸；

（3）将步骤（2）所得卡介菌多糖与卡介菌核酸按比例混合。

3.根据权利要求2所述的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其特征在于，步骤（1）包括以下步骤：

（11）将卡介菌菌种接种于适合分支杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；

（12）上述菌体经破碎后离心收集上清液；

（13）上清液经有机溶剂抽提后，通过透析法或凝胶层析法除去有机溶剂。

4.根据权利要求2所述的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其特征在于，步骤（2）中所述的离子交换层析法为采用阴离子交换介质的柱层析法。

5.根据权利要求4所述的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其特征在于，所述阴离子交换介质为Q Sepharose^TM XL。

6.根据权利要求5所述的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物，其特征在于，步骤（2）包括以下步骤：

（21）将步骤（1）获得的卡介菌多糖、核酸混合物上样，同时开始收集流穿液；

（22）上样结束后，用生理盐水洗柱，收集洗柱液，将流穿液和洗柱液合并；

（23）将合并液采用脱盐柱进行脱盐，得到卡介菌多糖；

（24）步骤（22）洗柱结束后，采用浓度为0.1～2mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱峰；

（24）将收集的洗脱液采用脱盐柱进行脱盐，得到卡介菌核酸。

7.权利要求1所述的包含卡介菌多糖和卡介菌核酸的组合物在制备治疗或预防微生物感染、肿瘤或变态反应疾病的药物中的应用。