CN101686992B - 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗变态反应性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗变态反应性皮肤病的药物中的应用。一种含有多糖0.32mg/ml-0.38mg/ml，核酸50μg/ml-100μg/ml，卡介菌菌体蛋白0μg/ml-2.5μg/ml，苯酚残留量和杂菌数为零的卡介菌多糖核酸注射剂。以及一种由卡介菌多糖核酸提取物制备卡介菌多糖核酸注射剂的方法。

Description

卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗变态反应性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域。具体说，本发明涉及一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗变态反应性皮肤病的药物中的应用，以及由该卡介菌多糖核酸提取物制备的卡介菌多糖核酸注射剂及其制备方法。

背景技术

卡介苗(Bacilli Calmette Guerin，BCG)是一种弱化的牛型分枝杆菌，是目前预防结核病最有效的疫苗。自1948年以来，全球已有30亿人接种，其安全性已被证实。BCG除了用于预防结核病以外，还可以用于多种疾病的治疗，如变态反应性疾病及肿瘤。但是由于其成分复杂，副作用如皮疹、瘙痒等发生率较高。因此，对BCG进行纯化、提取其中的有效成分有助于减少其副作用的发生率。卡介菌多糖核酸注射剂是卡介菌多糖核酸提取物配以灭菌生理盐水制成的免疫调节剂。临床及实验资料均显示，具有广泛的免疫调节及抗炎作用，在改善免疫功能、抗过敏、抗感染方面具有良好的疗效，临床用于多种免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病，如难治性肺结核、支气管哮喘、支气管炎、病毒感染性疾病及皮肤变态反应疾病等。自从卡介菌多糖核酸注射剂上市后，其作用机制一直是医学研究的热点，目前研究的成果表明：

卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂类)和核酸组分发挥着重要的生理功能。在卡介菌中，多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸)和脂类常结合在一起，构成细胞壁的主要成分。目前的研究还表明：BCG细胞壁和其他细胞器上存在可结合人和动物Toll受体(TLR)的配体，这些配体至少可结合5种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，当它们同TLR结合促进树突状细胞(DC)的成熟，并且诱导IL-12的分泌，IL-12对促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌，从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应。

同样，在卡介菌的核酸中含有丰富的CpG基序，CpG基列在体内外均能激活多种免疫活性细胞，包括树突状细胞(DC)、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、B细胞和T细胞，刺激免疫活性细胞分泌多种细胞因子并能上调某些表面分子、趋化因子、粘附分子和共刺激分子等，诱导机体天然免疫系统活化，并产生抗原特异性的获得性免疫应答。

综上所述，BCG及卡介菌多糖核酸注射剂主要是其核酸和多糖通过识别和结合人体的Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，激活DC、T细胞、B细胞及巨噬细胞等多种免疫活性细胞，刺激多种免疫活性细胞分泌免疫活性分子(细胞因子、趋化因子、粘附分子和共刺激分子)而发挥抗微生物感染、抗肿瘤及调节Th1/Th2平衡的作用。

近十年来的体内、体外研究表明：卡介菌多糖核酸注射剂可以特异性增强机体的Th1型细胞免疫反应，抑制Th2细胞免疫反应，进而调节Th1/Th2平衡的作用。

研究表明，卡介菌多糖核酸注射剂可增加T细胞及脾细胞膜上IL-2的表达，促进T细胞克隆增殖及T细胞集落形成，此外卡介菌多糖核酸注射剂还能增加活化T细胞IFN-γ的分泌，增强巨噬细胞功能。卡介菌多糖核酸注射剂还能抑制多种过敏反应，稳定嗜碱性和肥大性细胞的功能，减少IgE的产生。因而，卡介菌多糖核酸注射剂在预防和治疗微生物感染(细菌、病毒等)、肿瘤的免疫治疗或辅助治疗及纠正Th1/Th2细胞失衡的变态反应疾病中将具有非常广阔的应用前景。

目前已上市的卡介菌多糖核酸注射液是通过从卡介菌培养经热酚法提取的卡介菌多糖核酸提取物配制而成，现行的卡介菌多糖核酸提取物、卡介菌多糖核酸注射液的质量标准和工艺按2000版《中国生物制品规程》执行。2000版《中国生物制品规程》规定的卡介菌多糖核酸提取物质量标准为：该制剂为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为70％～80％左右，核酸为10％～20％，卡介菌菌体蛋白含量小于1％，杂菌数不超过为100个/克。2000版《中国生物制品规程》规定的卡介菌多糖核酸注射剂质量标准为：1ml/支，含卡介菌多糖0.28-0.42mg/ml，核酸不低于30μg。

现行的卡介菌多糖核酸提取物、卡介菌多糖核酸注射液的质量标准存在一些问题，主要表现为：(1)卡介菌多糖核酸提取物的多糖和核酸的范围较宽，造成卡介菌多糖核酸注射液批次间多糖和核酸的含量不一致，从而使卡介菌多糖核酸注射液批次间疗效不稳定；(2)卡介菌多糖核酸提取物中杂质的含量比较高，特别是卡介菌菌体蛋白、杂菌数和苯酚的残留量。例如由于原卡介菌多糖核酸提取物中含有较高比例的卡介菌菌体蛋白和杂菌，造成卡介菌多糖核酸注射液中卡介菌菌体蛋白和杂菌较高，按2000版《中国生物制品规程》规定生产的每支卡介菌多糖核酸注射液中含有5μg的卡介菌菌体蛋白，同时可能数量不等的杂菌物质。相对人体而言，卡介菌菌体蛋白和杂菌是异源抗原或毒性物质，可引起较强的免疫排斥反应和毒性反应(因为要连续使用3个月)，表现为临床上使用该制剂时常出现病人注射部位发生严重溃烂，同时约有5-10％的病人出现发烧现象，少数病人出现严重的过敏反应；(3)现有的卡介菌多糖核酸注射液中只规定了核酸含量的下限，但在长期的临床应用中却发现，当每只注射剂中核酸的含量大于110μg时，约有90％的患者表现为注射部位红肿、疼痛、甚至严重肿胀影响日常生活。

慢性特发性荨麻疹是临床常见多发的变态反应性疾病，致病因素复杂，发病与机体免疫机能有关，部分病例的发生发展与自身机体免疫机能有关。细胞免疫功能失调可能在慢性特发性荨麻疹发生发展中发挥一定作用。慢性特发性荨麻疹反复发作可长达数月至数年，给病人造成很大的痛苦，由于发病原因很难查找，在临床上多采用抗组胺药物及外用止痒剂的常规治疗，治疗效果往往不够理想，特别治疗后复发频率高，需长期用药。卡介菌多糖核酸注射液做为免疫调节剂，通过调节细胞免疫功能，激活单核巨噬细胞的吞噬能力，稳定肥大细胞减少其脱颗粒所释放的活性物质以提高机体抗过敏能力，达到治疗预防疾病的目的。

发明内容

本发明一方面提供一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗变态反应性皮肤病的药物中的应用，其中该卡介菌多糖核酸提取物含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于10％的水分，其中多糖质量百分含量为70-78％，核酸质量百分含量为12-20％，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为0-0.5％，苯酚的残留量为零，杂菌数为0-20个/克。

其中，所述卡介菌多糖核酸提取物通过以下步骤制备：

(a).对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b).采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d).通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。

上述变态反应性皮肤病可以与患者的免疫功能失衡有关，特别是与机体Th1/Th2平衡失调有关。该变态反应性皮肤病可以包括特应性皮炎、接触性皮炎和荨麻疹等。

上述用于治疗变态反应性皮肤病的药物包括卡介菌多糖核酸注射剂。该注射剂优选含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg/ml～100μg/ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，苯酚的残留量和杂菌数为零。上述卡介菌多糖核酸注射剂中的药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其含量优选为9mg/ml。

另一方面，为了克服原卡介菌多糖核酸注射液批间疗效差异大，副反应大等问题，本发明提供一种由卡介菌多糖核酸提取物制备的卡介菌多糖核酸注射液，该卡介菌多糖核酸注射液中含有卡介菌多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml、核酸含量为50μg/ml～100μg/ml、卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，苯酚的残留量为零。该卡介菌多糖核酸注射液中的杂菌数优选为零。上述药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其含量优选为9mg/ml。

本发明还提供一种制备用于治疗变态反应性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其包括以下步骤：

(a).培养卡介菌，并收获卡介菌培养物；

(b).采用物理方法破碎所述卡介菌培养物，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法处理所述卡介菌多糖核酸混悬液，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d).通过凝胶柱层析法分离所述卡介菌多糖核酸混合物，得到卡介菌多糖核酸提取液，并对所述卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

(e).将卡介菌多糖核酸提取物稀释于含药学上可接受的辅料的注射用水中，混匀，使最终溶液中的多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg/ml～100μg/ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，将该溶液过滤后湿热灭菌分装，即得卡介菌多糖核酸注射剂。

其中，上述步骤(e)中所述的药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其在所得卡介菌多糖核酸注射液中的含量优选为9mg/ml。

另外，上述步骤(e)还可以包括在过滤前用pH值调节剂将pH值调节至6.0～7.2。其中所述pH值调节剂优选为氢氧化钠和盐酸。

上述卡介菌多糖核酸注射剂可通过激活机体的树状突细胞(DC)，促使Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌，从而产生Th1占优势的非特异性细胞免疫反应。同时，该卡介菌多糖核酸注射剂可稳定嗜碱性和肥大性细胞的功能，减少IgE的产生。因此，采用该卡介菌多糖核酸注射剂或将其同其它药物(或方法)联合应用，可显著提高治疗的有效率，同时可延长疾病的复发周期、减少复发次数，减少激素等药物的使用量，从而降低药物对患者的副作用。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射液的主要药效学研究资料表明：小鼠间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射液，可剂量依赖性地抑制二甲苯所致耳廓肿胀和耳异种被动皮肤过敏反应，也可显著抑制2，4-二硝基氟苯诱导的迟发性变态反应。大鼠间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射液，可剂量依赖性地抑制角叉菜胶所致足跖肿胀和同种被动皮肤过敏反应。结果提示，卡介菌多糖核酸注射液具有抗炎、抗过敏作用。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射液的临床研究表明：卡介菌多糖核酸注射液能显著升高人血清γ-干扰素水平，显著降低白介素-4水平，明显降低血清IgE水平，提示卡介菌多糖核酸注射液可调节患者免疫功能特别是细胞免疫功能。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射液的临床研究表明：卡介菌多糖核酸注射液同其它药物(或方法)联合作用对于慢性特发性荨麻疹等变态反应性皮肤病具有较好的疗效，主要表现在卡介菌多糖核酸注射液同其它药物(或方法)联合作用可显著提高治疗的有效率，同时可延长疾病的复发周期、减少激素等药物的使用量等。

具体实施方式

以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解利用的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。

实施例一卡介菌的培养和收获

1.菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃连续培养14-20天；或在37℃连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃连续培养14-20天。

其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：

(1)取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时，再用纯化水冲洗土豆斜面块；用苏通培养基冲洗斜面块，取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；

(2)将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；

(3)0.11MPa的大气压121℃，灭菌20分钟。放冷至室温待接种。

苏通培养基配制比例：

每1000ml：

硫酸镁      0.5g    磷酸氢二钾      1.04g

味精        8.0g    枸橼酸          2.0g

甘油        60ml    10％柠檬酸铁铵  0.5ml

加纯化水至  1000ml  氨水调至        pH8.0左右

2.菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。

实施例二卡介菌多糖核酸混合物的制备

1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10∶1的比例加入纯化水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5-2.0倍体积量的热苯酚(30～100℃)，在低速搅拌中保温30分钟～1小时。

2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚好的混合液自然沉淀1～10天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45um无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。

实施例三精制卡介菌多糖核酸提取物的制备

采用美国密里博(MILLIPORE)公司制造的K-PRIME 40II凝胶层析过滤系统和GH-25凝胶介质进行卡介菌多糖核酸、苯酚及卡介菌蛋白的分离。具体的制备过程如下：

1.平衡：用0.9％生理盐水以1000mL/分钟经柱正向流动，直至柱前柱后电导、PH一致时结束平衡过程。

2.上样：将卡介菌多糖核酸混合物经上样系统进行上样，上样速度为600mL/分钟。

3.洗脱：上样结束后，用0.9％生理盐水以800mL/分钟速度进行洗脱，采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的目的峰通过0.45μm无菌滤器过滤，即为精制卡介菌多糖核酸提取液。

4.精制：将所收集的精制卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，在精制卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。

实施例四卡介菌多糖核酸提取物的检测

通过本方法制备的九批精制卡介菌多糖核酸提取物按照2000版《中国生物制品规程》和2005版《中国药典》进行检测，结果如下表1、表2、表3所示。

表1三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表2三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表3三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

实施例五卡介菌多糖核酸注射液的制备和检测

1.溶解：

准确称取处方量的卡介菌多糖核酸提取物，加入适量注射用水用磁力搅拌器溶解，未溶解的部分继续加注射用水用磁力搅拌器溶解，直至完全溶解为止，再离心，取上清液。

2.配液：

先加入注射用水至接近批量刻度线，再将上清液和每批量所需的氯化钠加入稀配罐，加入注射用水至刻度线后搅拌均匀，取样检验多糖、核酸含量，并用NaOH或HCl调pH值于6.0～7.2之间，通过过滤器滤过，打入贮液罐，运至灌封间灌封。

应该理解，虽然上述步骤中只加入了氯化钠和NaOH及HCl作为辅料，但是所属技术领域的技术人员应该能够认识到，所属技术领域的其它公知注射剂用药用辅料也可以加入其中，例如抗氧化剂、稳定剂、等渗调节剂等等。

3.灌封：

在万级保护的局部百级层流罩下进行。

(1)洗瓶：操作人员在十万级区使用安瓿超声波清洗机洗瓶，依次经循环水，喷淋水，新鲜水三次用压缩空气加压淋洗，新鲜水为注射用水，洗涤后的安瓿用杀菌干燥机干燥灭菌。

(2)灌封：使用洗灌封联动线灌装封口，灌装前检查设备是否正常，管道是否淋洗干净，调节装量至规定范围。检查熔封质量是否封口完整光滑。

4.灭菌：

使用安瓿检漏灭菌柜，将安瓿放在安瓿推车上，于检漏灭菌柜内高压蒸汽灭菌(121℃、0.11MPa、F0：20)。

5.检测：

按照2000版《中国生物制品规程》和2005版《中国药典》对卡介菌多糖核酸注射液进行检测，结果如下表4、表5、表6所示。

表4三批卡介菌多糖核酸注射液检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表5三批卡介菌多糖核酸注射液检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表6三批卡介菌多糖核酸注射液检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

实施例六卡介菌多糖核酸注射液抗变态反应的主要药效学试验研究

1.对急性炎症的影响——对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

1.1方法

试验分为五组：生理盐水对照组、氢化可的松阳性对照(25mg/kg)组、三个剂量(0.15，0.30，0.60mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射液组(n＝8-11)。卡介菌多糖核酸注射液组小鼠在致炎试验前3周，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸注射液(0.1ml/10g体重)，间日一次。生理盐水和氢化可的松对照组致炎试验前1周，后肢股部肌内注射生理盐水和氢化可的松，给药体积为0.1ml/10g体重，1次/日，末次给药后1h，在左耳两面同位涂抹二甲苯各30μl，2h后小鼠颈椎脱臼处死，剪下左右耳廓，用直径8mm打孔器左右耳同位打孔，取耳片，称重，计算左右耳片重量差(即肿胀度)，进行组间比较。卡介菌多糖核酸注射液组末次给药后24小时按以上方法进行致炎试验。

1.2结果

卡介菌多糖核酸注射液可剂量依赖性地抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，减少左右耳重量差；氢化可的松亦可显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀(表7)。

表7卡介菌多糖核酸注射液对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(n＝8-11)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs生理盐水对照组。

2.对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响

2.1方法

试验分为六组：生理盐水对照组、阿司匹林阳性对照组(50mg/kg，ip)、0.5％羧甲基纤维素组、三个剂量(0.1，0.2，0.4mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射液组(n＝10-11)。卡介菌多糖核酸注射液组大鼠在致炎试验前3周，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸注射液(0.1ml/100g体重)，间日一次。生理盐水和阿司匹林对照组大鼠腹腔注射药物(0.1ml/100g体重)后30min，右后足跖腱膜下注射1％角叉菜胶(用灭菌生理盐水配制)0.1ml，用毛细管放大法测定致炎前及致炎后30，60，120，180，240，300，360min右后足容积，计算致炎前后的足容积差值，进行组间比较；卡介菌多糖核酸注射液组末次给药后24小时按以上方法进行直接致炎试验。为保证动物体内水分的一致性，各组大鼠均在致炎前30min灌胃给予自来水5ml。

2.2结果

致炎前各组间足容积无明显差异。与生理盐水组比较，卡介菌多糖核酸注射液可剂量依赖性地抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀，阿司匹林也可显著抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀；0.5％羧甲基纤维素对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀无明显影响(表8)。

表8卡介菌多糖核酸注射液对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀(ml)的影响(n＝10～11)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs生理盐水对照组。

3.对二硝基氟苯诱导小鼠迟发性(IV型)变态反应的影响

3.1方法

试验分为五组：生理盐水对照组、氢化可的松阳性对照组(25mg/kg)、三个剂量(0.15，0.30，0.60mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射液组(n＝8-12)。

致敏接触：致敏前24h小鼠腹部用8％Na₂S去毛，范围约3cm×3cm，试验第1日和第2日于去毛处涂抹1％2，4-二硝基氟苯溶液(DNFB，临用时以1∶1丙酮、麻油为溶媒配成)50μl致敏。

抗原攻击：第6日取1％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠左耳(两面)诱发皮炎，右耳涂抹等体积的溶媒进行自身对照。诱发皮炎后24h，颈椎脱臼处死小鼠，称重后剪下左右耳廓，在左右耳中部用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，计算左右耳重量差(即肿胀度)；同时取小鼠胸腺和脾脏称重，分别计算胸腺指数和脾指数(mg/10g小鼠体重)。

卡介菌多糖核酸注射液组小鼠在抗原攻击前3周，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸注射液(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行抗原攻击。生理盐水和氢化可的松对照组致敏接触前1日开始后肢股部肌内注射生理盐水和氢化可的松，给药体积为0.1ml/10g体重，1次/日，连续用药7日，末次给药后1h进行抗原攻击。

3.2结果

小鼠体重各组间无明显差异。与生理盐水组比较，高剂量(0.60mg/kg)卡介菌多糖核酸注射液可显著降低小鼠左右耳重量差以及胸腺指数，而中、低剂量卡介菌多糖核酸注射液对此无明显影响；氢化可的松也可显著降低小鼠左右耳重量差、胸腺指数和脾脏指数(表9)。

表9卡介菌多糖核酸注射液对二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应的影响(n＝8～12)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs生理盐水对照组

4.对速发型(I型)变态反应的影响

4.1大鼠同种被动皮肤过敏反应

4.1.1方法

试验分为五组：生理盐水对照组、马来酸氯苯那敏阳性对照组(5mg/kg)组、三个剂量(0.1，0.2，0.4mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射液组(n＝10)。

抗血清制备：取体重90～100g大鼠6只，天花粉蛋白以4％氢氧化铝凝胶配成5mg/ml的混悬液，给大鼠4个足跖注射各0.1ml，共0.4ml。于致敏后14天，颈总动脉插管采血，离心(3000rpm，15min，4℃)分离血清，置-20℃保存备用。

被动皮肤致敏及抗原攻击：大鼠乙醚麻醉后剪去背部脊柱两侧毛(每侧约3cm×3cm)，将1∶20，1∶40稀释的抗血清皮内注射于大鼠背部，每一稀释度注射两点，每点0.1ml。48h后进行抗原攻击，即静脉注射0.5％伊文思蓝溶液1ml(内含天花粉蛋白1mg)。20min后断头处死动物，翻转背部皮肤，剪下蓝斑皮肤，每点以5ml丙酮生理盐水溶液(3∶7V/V)浸泡48h，离心(3000rpm，15min，4℃)，取上清液，590nm波长下测定光密度值，计算蓝斑抑制百分率。

卡介菌多糖核酸注射液组大鼠在抗原攻击前3周，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸注射液(0.1ml/100g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行抗原攻击。生理盐水和马来酸氯苯那敏对照组抗原攻击前1h后肢股部肌内注射生理盐水和马来酸氯苯那敏，给药体积为0.1ml/100g。

4.1.2结果

与生理盐水组比较，卡介菌多糖核酸注射液可剂量依赖性地抑制大鼠皮肤蓝斑形成，表现为吸光度显著降低；马来酸氯苯那敏也可显著抑制蓝斑形成(表10)。

表10卡介菌多糖核酸注射液对大鼠同种被动皮肤过敏反应的影响(n＝10)

^**P＜0.01vs生理盐水对照组。

4.2小鼠耳异种被动皮肤过敏反应

4.2.1方法

试验分为五组：生理盐水对照组、马来酸氯苯那敏阳性对照组(5mg/kg)、三个剂量(0.15，0.30，0.60mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射液组(n＝10)。

抗血清制备：同前。

被动皮肤致敏及抗原攻击：取小鼠，两只耳廓各注射大鼠抗血清20μl。48h后进行抗原攻击，即尾静脉注射0.5％伊文思蓝溶液0.25ml(内含天花粉蛋白0.25mg)。30min后脱臼处死动物，剪下耳廓置于试管内，加入1N KOH溶液0.75ml，37℃水浴24h，再加入3.5ml磷酸丙酮混合液(0.2M H₃PO₄溶液和丙酮按5∶13V/V混合)，涡旋器震荡提取，离心(3000rpm，15min，4℃)，取上清液，640nm波长下测定光密度值，计算蓝斑抑制百分率。

卡介菌多糖核酸注射液组小鼠在抗原攻击前3周，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸注射液(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行抗原攻击。生理盐水和马来酸氯苯那敏对照组抗原攻击前1h后肢股部肌内注射生理盐水和马来酸氯苯那敏，给药体积为0.1ml/10g。

4.2.2结果

与生理盐水组比较，卡介菌多糖核酸注射液可剂量依赖性地抑制小鼠耳廓蓝斑形成，表现为吸光度显著降低；马来酸氯苯那敏也可显著抑制蓝斑形成(表11)

表11卡介菌多糖核酸注射液对小鼠异种被动皮肤过敏反应的影响(n＝10)

^**P＜0.01vs生理盐水对照组。

综上所述：小鼠间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射液，可剂量依赖性地抑制二甲苯所致耳廓肿胀和耳异种被动皮肤过敏反应，高剂量时也可显著抑制2，4-二硝基氟苯诱导的迟发性变态反应。大鼠间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射液，可剂量依赖性地抑制角叉菜胶所致足跖肿胀和同种被动皮肤过敏反应。结果提示，卡介菌多糖核酸注射液具有抗炎、抗过敏作用。

实施例七卡介菌多糖核酸注射液治疗慢性特发性荨麻疹的临床研究

1.病例选择：

慢性特发性荨麻疹共180例，男女各半，病程5个月-12年，平均2年6个月，平均年龄5-65岁。

2.治疗方法：

对照组给予克敏胶囊、比特力片及止痒剂等常规治疗，连续使用8周，观察4周；治疗组在上述常规治疗基础上加用卡介菌多糖核酸注射液(规格0.5mg/支)，每次肌肉注射2支，每周2次，连续使用8周，观察4周。

观察期内记录复发次数和复发时间。

3.治疗标准：

临床治愈——皮疹完全消退、自觉症状消失。

显效——皮疹消退≥70％，自觉症状明显减轻。

有效——皮疹消退≥30％，自觉症状有所减轻。

无效——皮疹和自觉症状不变。

4.结果：在基础用药的基础上，使用卡介菌多糖核酸注射液治疗慢性特发性荨麻疹共180例，结果治疗组有效率93.0％，对照组有效率61％，两组有效率比较有高度显著性差异(P＜0.05)，更为重要的是，同对照组相比，治疗组复发次数明显减少，复发周期明显延长(P＜0.05)。

表12卡介菌多糖核酸注射液治疗慢性特发性荨麻疹的180例临床观察

*P＜0.05

5.结论

卡介菌多糖核酸注射液，通过增强细胞免疫、剌激网状内皮系统，激活单核巨噬细胞功能，从而改善患者免疫功能，增强机体抗过敏的能力，达到治疗疾病的目的。

实施例八卡介菌多糖核酸注射液联合盐酸西替利嗪治疗慢性荨麻疹临床研究

1.试验方法

对照组：基础用药的基础上采用生理盐水，每次一支(0.5ml)，隔日一次；

试验组：基础用药减半的基础上采用卡介菌多糖核酸注射液，每次一支(0.5ml)，隔日一次；

疗程：每个病人连续应用18支药物或安慰剂，计36天，观察36天基础用药：慢性荨麻疹患者口服盐酸西替利嗪(商品名：西可韦)，每日一次，每次10mg，连续十日，同时口服泼尼松，每日一次，每次30mg，连续36天。基础用药和临床试验用药均在试验开始时应用。

2.病例入组

依据试验方案设定标准，计收治慢性荨麻疹患者323人。随机分组后，试验组160人，对照组163人。

3.治疗标准：

临床治愈——皮疹完全消退、自觉症状消失。

显效——皮疹消退≥70％，自觉症状明显减轻。

有效——皮疹消退≥30％，自觉症状有所减轻。

无效——皮疹和自觉症状不变。

4.检测方法

双抗体夹心ABC-ELISA法检测外周血IFN-γ和IL-4水平，采用酶免疫吸附法检测血清总IgE水平。

5.检测结果及结果分析

在基础用药的基础上，使用卡介菌多糖核酸注射液治疗慢性特发性荨麻疹共320例，结果治疗组有效率87.6％，对照组有效率39.6％，两组有效率比较有高度显著性差异(P＜0.05)，更为重要的是同对照组相比，治疗组复发次数明显减少，复发周期明显延长(P＜0.05)，同时基础用药明显减少。

表13卡介菌多糖核酸注射液治疗慢性特发性荨麻疹的320例临床观察

^*P＜0.05

治疗前两组组间的血清干扰素和IL-4水平相近，无统计学差异。治疗后实验组血清干扰素水平明显升高，与治疗前相比差异极为显著(P＜0.0001)；但安慰剂组治疗前后血清干扰素水平变化不明显。

治疗后实验组IL-4水平较治疗前明显降低，差异极为显著(P＜0.0001)；对照组治疗后IL-4水平较治疗前也有所下降，P＜0.01。见表14

表14患者治疗前后血清γ-干扰素和IL-4水平(pg/ml)

治疗前实验组和对照间的血清IgE水平相近，无统计学差异。治疗后实验组血清IgE水平明显降低，与治疗前相比差异极为显著(P＜0.0001)；但安慰剂组治疗前后血清IgE水平变化不明显。见表15。

表15患者治疗前后血清IgE水平

S^*偏态分布的秩和检验

从有关的血清免疫学指标检测结果分析表明：卡介菌多糖核酸注射液能显著升高人血清γ-干扰素水平，显著降低白介素-4水平，明显降低血清IgE水平，提示卡介菌多糖核酸注射液可调节慢性荨麻疹患者免疫功能特别是细胞免疫功能。

综合临床研究表明：卡介菌多糖核酸注射液或同其它药物(或方法)联合作用可显著提高治疗的有效率，同时可延长疾病的复发周期、减少激素等药物的使用量。

Claims (8)

1.一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗慢性特发性荨麻疹的药物中的应用，其中该卡介菌多糖核酸提取物含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于10％的水分，其中多糖质量百分含量为70-78％，核酸质量百分含量为12-20％，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为0-0.5％，苯酚的残留量为零，杂菌数为0-20个/克；所述卡介菌多糖核酸提取物通过以下步骤制备： 

(a).对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物； 

(b).采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液； 

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物； 

(d).通过K-PRIME40II凝胶层析过滤系统和GH-25凝胶介质的凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。 

2.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗慢性特发性荨麻疹的药物中的应用，其特征在于所述的治疗慢性特发性荨麻疹的药物包括卡介菌多糖核酸注射剂。 

3.根据权利要求2所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗慢性特发性荨麻疹的药物中的应用，其特征在于所述的卡介菌多糖核酸注射剂含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg/ml～100μg/ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，苯酚的残留量和杂菌数为零。 

4.根据权利要求3所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗慢性特发性荨麻疹的药物中的应用，其特征在于所述卡介菌多糖核酸注射剂中的药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠含量为9mg/ml。 

5.一种用于治疗慢性特发性荨麻疹的卡介菌多糖核酸注射剂，含有卡介菌多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其特征在于其中多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml、核酸含量为50μg/ml～100μg/ml、卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，苯酚的残留量为零，杂菌数为零；所述的卡介菌多糖核酸注射剂通过以下步骤制备： 

(a).培养卡介菌，并收获卡介菌培养物； 

(b).采用物理方法破碎所述卡介菌培养物，得到卡介菌多糖核酸混悬液； 

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法处理所述卡介菌多糖核酸混悬液，得到卡介菌多糖核酸混合物； 

(d).通过凝胶柱层析法分离所述卡介菌多糖核酸混合物，得到卡介菌多糖核酸提取液，并对所述卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物； 

(e).将卡介菌多糖核酸提取物稀释于含药学上可接受的辅料的注射用水中，混匀，使最终溶液中的多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg/ml～100μg/ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，将该溶液过滤后湿热灭菌分装，即得卡介菌多糖核酸注射剂。 

6.根据权利要求5所述的用于治疗慢性特发性荨麻疹的卡介菌多糖核酸注射剂，其特征在于所述的药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠在所得卡介菌多糖核酸注射液中的含量为9mg/ml。 

7.根据权利要求5所述的用于治疗慢性特发性荨麻疹的卡介菌多糖核酸注射剂，其特征在于步骤(e)还包括在过滤前用pH值调节剂将pH值调节至6.0～7.2。 

8.根据权利要求7所述的用于治疗慢性特发性荨麻疹的卡介菌多糖核酸注射剂，其特征在于所述pH值调节剂包括氢氧化钠和盐酸。