CN1494918A - 一种治疗癌症的药物组合物及制备方法 - Google Patents
一种治疗癌症的药物组合物及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属生物制剂技术领域。本发明公开了能够抑制肿瘤生长的药物组合物。本发明的组合物含有有效量的卡介菌多糖核酸以及药用稀释剂、辅助剂或稳定剂。本发明的组合物可广泛用于增强肿瘤治疗标准方法如手术,放化疗等的药效,并改善健康状态。
Description
技术领域
本发明属生物制剂技术领域。具体涉及一种治疗癌症的药物组合物。
背景技术
癌症是人类第二大杀手,美国每年超过五十五万人死于癌症,而新诊断的病人超过一百二十万人。美国女性得癌症的一生风险为30%,男性更高达50%。在中国,虽然不同肿瘤的发生频率有明显差异,但总体的癌症死亡率与美国接近,每年超过二百二十万人死于癌症,而新诊断病人超过六百万(2001年癌症现状和数据,美国癌症协会)。
癌症的治疗手段,主要包括手术,化疗药物,放疗药物,激素药物,免疫治疗药物及另类疗法包括中药等,手术是早期癌症治疗的首选方法,而放化疗药物则是普遍使用的药物,据统计,约80%以上的癌症病人会在其就医过程中接受不同程度的放化疗。
这些现行治疗方法,对某些类型的肿瘤,有着显著的效果,如联合使用化疗药物对于小儿白血病的疗效有较理想的效果,但对大多数癌症特别是实体瘤患者,目前使用的治疗方法和药物仍然不理想,而且各自有其局限性。例如,手术治疗对早期诊断病人而且肿瘤尚未转移的病人是首选方法,但由于诊断手段和医保条件的限制,很多病人在确诊时已到晚期,或肿瘤已转移,这时就难以进行手术治疗。此外,手术并不能完全保证原位肿瘤根除,而外围肿瘤有可能失控发作,导致肿瘤复发或机体死亡。
化疗和放疗药物对肿瘤虽有一定疗效,但这些药物对机体一些正常组织细胞具强烈的杀伤效果,造成严重的毒副作用,据统计,用过化疗药物的病人的死亡原因中,有近40%的死因与化疗药物使用有关。卡介菌多糖核酸是一种从卡介菌中提取的以多糖和核酸为主要组份的免疫调节剂,这种制剂能够激活机体免疫力,增强自然杀伤细胞,毒性淋巴T细胞和巨噬细胞活性,诱导MHC II分子表达,并增加干扰素,白介素2和其受体的表达(王慧等,湖南医学院学报,13:117-121,1988;赵伟强等,湖南医科大学学报,15;34-37,1990;刘紫庭等,临床尿泌外科杂志,10:48-49,1995;方建珍等,免疫学杂志,9:175-177,1993)。
卡介菌多糖核酸对细胞免疫体系有增强和调节效果,被用以治疗免疫系统平衡紊乱或低下所造成的病症,如哮喘,老年性慢性支气管炎,过敏和感冒等(王慧等,中华结核和呼吸杂志,12:20-23,1989;马维勇等,医学理论与实践,14:2-4,2001;金一平等,上海免疫学杂志,14:5-8,1994)。
卡介菌多糖核酸制品对肿瘤的治疗有一些初步研究,张杰玉等研究了卡介菌多糖核酸在S180肿瘤中的作用,表明使用卡介菌多糖核酸对S180肿瘤有一定的抑制作用,并可延长荷S180肿瘤的小鼠存活期(张杰玉等,湖北医科大学学报,18:305-307,1997)。
化疗药物使用往往导致骨髓抑制和免疫力降低,罗秋平等(湖南医科大学学报,21:281-284,1996)在小鼠中发现,使用卡介菌多糖核酸后可对环磷酰胺造成的免疫抑制有一定程度的保护作用,并建议使用卡介菌多糖核酸加速恢复化疗对机体免疫体系造成的伤害。
卡介菌多糖核酸对肿瘤的治疗虽然研究有限,但卡介菌或其他卡介菌提取物对肿瘤的治疗有大量报导。
如活卡介菌灌注治疗浅表皮性膀胱癌,被大量临床研究证明为最有效的治疗方法(Lamm,Clinical Infect.Diseases,31:S86-90,2000)。
又比如细菌核酸组份被认为对卡介菌治疗肿瘤的效果起关键作用,MY-1是从卡介菌中提取的以核酸为主要组份的制剂,可以诱导干扰素表达,增强自然杀伤细胞,并对肿瘤有明显抑制效果(Yamamoto et al.Jpn.J.Cancer Res,79:866-873,1988;Tokunagaet al.,JNCI,72:955-962,1982;Yamamoto et al.,Microbiol.Immunol.,36:983-997,1992)。
此外,从微细菌中提取的细胞壁骨架对于免疫系统同样有调节作用(Chatterjee & Khoo,Glycobiol.,8:113-120,1998),其中红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂被用于临床治疗恶性胸腹水。从卡介菌中提取的糖制剂MTP-PE,在动物和临床试验中有一定效果(Pak &Fidler,Biotherapy,3:55,1991)。
从卡介菌及其衍生物的研究来看,多糖和核酸组份均有增强免疫和抗癌的功能,而卡介菌多糖核酸兼具多糖和核酸的功效,并将蛋白含量控制很低,免除或降低了过敏和免疫反应,可作为一项重要的免疫调节剂长期使用。
目前卡介菌多糖核酸的临床使用主要局限在免疫功能的调节,而卡介菌多糖核酸对肿瘤的治疗效果,与标准治疗方法包括手术,化疗,放疗,免疫疗法,抗血管增生疗法等是否可以产生协同作用,对肿瘤转移过程的影响,系统用药和局部用药的效果差别,对癌症病人的免疫系统调节以及对生活质量的改善等问题并没有经过系统研究和也没有确切的结论。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述不足之处,设计能有效增强癌症标准治疗方法、疗效的药物组合物。
本发明提供了一种治疗癌症的药物组合物,该组合物包括卡介菌多糖核酸和药用辅料。
癌症的标准治疗方法,定义为在医院常规使用的治疗方法,这些方法可能是物理性的操作或方法,如手术,伽马刀,热疗,激光等,也可能是药物方法,包括化疗药物(主要指具有细胞毒性的小分子化合物),放射线药物(放疗),激素或生长因子拮抗药物,抗体药物,免疫治疗药物,抗血管增生药物,中成药物等。
本专利定义的对于癌症治疗标准方法的改善,包含两个方面的内容,第一是药效学的增加,例如手术后降低病人的复发和转移比例,或者与药物治疗联合使用后更多的病人对标准治疗方法产生更好的效果,或者同样数目的病人,但反应的效果增加。
第二方面的内容是在药效学标准不变的前提下,对标准治疗方法毒副作用的改善,特别是对化疗和放疗这种极易造成对机体损伤的药物,其表现包括体重降低的改善,免疫力和造血系统的保护和恢复,并发感染的降低等等。
本发明所定义的卡介菌多糖核酸是按照《中国生物制品规程》(2000)以热酚法工艺生产精制,多糖组份含量70-80%,核酸组份含量10-20%,蛋白含量低于1%,使用时将卡介菌多糖核酸用药物标准的稀释液,稳定剂,或辅剂配制。多糖和核酸均被证明具有抗癌效应,两种组份比例的改变对于本发明所提出的用法和范围不产生根本的影响,因此卡介菌多糖核酸中多糖和核酸不同比例可被视为具有类似效应。
本发明的药物组合物以卡介菌多糖核酸为主要组份,用药物稀释剂和稳定剂配制,通过非肠胃用药方法使用,可对多种肿瘤的生长,转移和侵润形成抑制作用,并可改善荷肿瘤对象的健康状况。
本发明研究了单独使用卡介菌多糖核酸对各种肿瘤的抑制作用,包括路易斯肺癌,黑色素瘤和肾癌。通过对这些肿瘤的形成,生长和瘤重多方面考察证明卡介菌多糖核酸对这些肿瘤均有不同程度的抑制作用。其中黑色素瘤和肾癌是对免疫治疗方法如干扰素和白介素2较为敏感的肿瘤,对卡介菌多糖核酸也较为敏感,而路易斯肺癌是实体瘤中对药物不敏感的肿瘤,属于难以治疗的肿瘤范畴,对卡介菌多糖核酸敏感度较差。
文献中报导国卡介菌多糖核酸对S-180肿瘤的抑制作用(张杰玉等,湖北医科大学学报,18:305-307,1997)。在实体瘤模型中,卡介菌多糖核酸腹腔用药,剂量为12.5毫克/公斤(每只小鼠250微克),隔日一次,共七次,对S-180皮下肿瘤有显著抑制效果。同样的用药方法对S-180腹水瘤小鼠的存活期有显著延长作用。
相比之下,卡介菌的纯核酸组份MY-1对小鼠IMC肿瘤和豚鼠L10肝癌有显著抑制作用,并有部分动物肿瘤完成消失,但用药方法采用了瘤内注射,剂量为10毫克/公斤(Tokunaga et al.,JNCI,72:955-962,1982;Yamamoto et al.,Microbiol.Immunol.,36:983-997,1992)。
由于动物模型,肿瘤类型对药物的敏感度,以及用药方法的不同,直接的药效比较难以进行,但值得指出的是,本发明所使用药物剂量低于1毫克/公斤,或者低于0.5毫克/公斤,采用皮下或肌肉注射。本发明剂量远远低于文献中所用剂量(10-12.5毫克/公斤),这种低剂量和系统用药的方法在临床上具有更为广泛和更安全的使用范围。
以免疫增强或激活为机制的药物,往往对剂量敏感度较大,比如白介素2,在小鼠模型中高剂量治疗肿瘤效果非常出色,但由于人体对白介素2的耐受力要显著低于小鼠,造成最终白介素2的使用受到局限。因此本发明所发现的低剂量用法对于药物能够在人体中得到类似结果提供了更大的空间。
根据长期临床试验的结果,卡介菌及其衍生物,包括多糖或核酸组份,往往在局部用药时产生较为理想的效果,并有可能激活适应性免疫反应,对肿瘤的转移和再侵润产生抵抗效果。本发明给对象的用药方法,采用皮下或肌肉注射等系统用药方法,如采用局部用药,可望显著增加局部药物浓度,达到更为可观的治疗效果。
本发明还公布了一种能够与手术联合使用,避免或减少手术后肿瘤复发和转移的药物组合物。此药物组合物以卡介菌多糖核酸为主要组份,用药物稀释剂和稳定剂配制,通过非肠胃用药方法使用,与手术治疗方法配合使用,可达到抑制肿瘤复发和转移的效果。
手术是肿瘤治疗重要的方法之一,而现代造影技术如CT,核磁共振等为手术治疗提供了更可靠的依据。但是由于技术手段的局限以及对肿瘤间的互动效果不完全了解,卫星肿瘤的切除,原发瘤的转移,以及手术造成的创伤对肿瘤的作用便不可能完全避免,因此往往需要药物与手术同时使用以避免肿瘤的复发和转移。
免疫治疗特别适用于最小剩余肿瘤,如手术切除的情形,此时使用如卡介菌多糖核酸之类的免疫增强剂,可以减少肿瘤复发,增强免疫力,防止并发感染。
本发明将卡介菌多糖核酸制剂与手术结合,首先将皮下种植的路易斯肺癌手术切除,造成肿瘤自发性肺部转移,手术后接受卡介菌多糖核酸制剂系统治疗,不仅可以抑制肿瘤原位复发,还可以对肿瘤的肺部转移形成显著抑制。因此,卡介菌多糖核酸在癌症病人手术时使用,可以预防肿瘤复发和转移,并且通过激活自然杀伤细胞的手段增强病人免疫力,减少并发感染的产生。
本发明还公布了一种能够与癌症药物治疗方法,包括化疗,放疗等方法联合使用的药物组合物,这种药用组合物以卡介菌多糖核酸为主要组份,用药物稀释剂和稳定剂配制,通过非肠胃用药方法使用,可以达到增强癌症药物治疗方法药效的作用。这种药物组合物可以用于生产能够辅助现有癌症标准药物的新药物,并达到增强癌症标准治疗药物疗效的结果,并可以改善化放疗药物毒副作用,具体表现在体重的变化,血液组份的变化,并发感染,以及免疫力变化等。
化疗和放疗是癌症治疗的重要的手段,主要依据肿瘤细胞繁殖比一般正常细胞快的特点,对核酸合成造成抑制和阻断,从而对正在进行分裂的细胞造成杀伤,但不幸的是,人体中有多种细胞生长代谢很快,与肿瘤的生长速度相差无几,如骨髓细胞,消化道粘膜细胞及毛囊细胞等,因此放化疗药物对这些细胞具有强烈的毒性,造成了化疗和放疗药物最常见的毒副作用,骨髓抑制,恶心和呕吐,和脱发等。
改变这种状况的方法之一是寻找对肿瘤更特异的药物,随着对肿瘤发生生物学和细胞信号的了解,有越来越多的这类药物得到开发,但大规模的临床应用仍需假以时日。
另外有种方法是采用化学或其他方法,对正常细胞进行保护,避免造成对正常组织的伤害。Amfostine是一种对正常细胞提供保护的化学药物,目前已经上市用以保护化放疗造成的毒副作用。由于药物的保护作用,化放疗药物的剂量可以提高,从而增加了药效(Spencer& Goa,Drugs,50:1001-1031,1995),但Amfostine本身对肿瘤并没有抑制作用,因此对药效的增强较为有限。
罗秋平等(湖南医科大学学报,21:281-284,1996)研究了卡介菌多糖核酸对环磷酰胺造成的小鼠免疫抑制所产生的作用,证明环磷酰胺对特异抗体的产生,脾细胞总数,巨噬细胞功能等均产生显著抑制,而卡介菌多糖核酸则可以对这些效果产生相应的保护作用。但是这项试验采用了正常小鼠,而在荷肿瘤小鼠中与化疗药物对肿瘤的影响仍然不清楚。
本发明将卡介菌多糖核酸制剂通过肌肉注射或皮下注射方法与化疗药物如环磷酰胺和丝裂霉素等同时使用,确认了卡介菌多糖核酸对化疗药物治疗肿瘤的效果有增强作用,作用表现在抑制肿瘤形成,生长和肿瘤重量等各个方面。本发明还证明,卡介菌多糖核酸可以有效防止由于化疗毒副作用而导致的机体体重降低和免疫抑制(表现为脾重降低)。
在路易斯肺癌模型中,小剂量(25毫克/公斤)和大剂量(100毫克/公斤)的环磷酰胺导致小鼠体重显著降低,但小剂量环磷酰胺对肿瘤的抑制效果不明显,卡介菌多糖核酸(20-200微克/公斤)与环磷酰胺同时使用,可以显著增加对肿瘤的抑制效率,并对环磷酰胺造成的小鼠体重降低有显著保护作用。大剂量环磷酰胺造成了荷肿瘤小鼠脾脏萎缩及严重的体重降低,而卡介菌多糖核酸的使用可以有效维持脾脏重量并减少小鼠体重降低。
在B16黑色素瘤模型中,丝裂霉素(5毫克/公斤)对荷肿瘤小鼠造成显著的体重和脾重降低,并造成一只小鼠死亡,而与化疗同时使用卡介菌多糖核酸可有效保护小鼠体重和脾重的降低,并对丝裂霉素的抑瘤作用产生增强效果。BA009对超致死剂量的丝裂霉素造成的荷瘤小鼠体重严重降低也具有显著的保护效果。
由于其他化疗药物和放疗药物对机体造成的损伤机理类似,因此可以预见卡介菌多糖核酸对丝裂霉素和环磷酰胺产生的保护作用和协同效果同样可以在与其他化疗或放疗药物使用时实现,因此卡介菌多糖核酸可以广泛用于辅助化放疗治疗肿瘤,并达到增强抑癌效果,改善毒副作用的效果。
晚期肿瘤病人的身体状况往往衰减状态,如消瘦,免疫力低下等等,这种状态在小鼠肾癌模型中表现较为突出,荷肾癌小鼠随着肿瘤的生长,很快体重下降,解剖后可发现主要脏器如肝,肾,脾等均有衰竭(失重)现象。卡介菌多糖核酸对肿瘤病人生活质量的改善还表现在于单独使用卡介菌多糖核酸制剂对荷肾癌小鼠的体重和脾重降低有显著保护作用,对其他脏器的衰竭也有一定保护作用。
本发明确立了卡介菌多糖核酸单独使用对肿瘤有显著抑制作用,并第一次提出并证明了卡介菌多糖核酸可以增强肿瘤标准治疗方法如手术,放化疗等的抗癌效果,防止肿瘤复发和转移,并可改善生活质量和健康状况(体重和脾重降低等)。
本发明还确立了系统使用卡介菌多糖核酸的有效剂量,这种有效剂量远远低于文献所报导的剂量。
本发明的另一目的是提供了上述治疗癌症的药物组合物的制备方法,将精制卡介菌多糖核酸用生理氯化钠溶液溶解,浓度在1-5毫克/毫升,121℃灭菌20分钟,并加入0.01mM到5mM的金属络合物,包括EDTA,HEDTA或EGTA中的一种或几种的组合,搅拌均匀即为卡介菌多糖核酸溶液,其成分为:生理氯化钠溶液,卡介菌多糖组份0.7-4毫克/毫升,卡介菌核酸组份0.1-1毫克/毫升,金属络合物0.01-5毫摩尔。该方法是本发明确定了卡介菌多糖核酸对肿瘤治疗的效果,并阐述了卡介菌多糖核酸在肿瘤治疗各方面的作用和用途,提出用卡介菌多糖核酸制剂辅助手术,放化疗药物等,用以改善生活质量,增加疗效。
附图说明
图1 BA009对B16F10黑色素瘤形成的影响
B16F10黑色素瘤细胞皮下种植在C57BL6小鼠背部,并分别以溶媒和BA009治疗,每天观察肿瘤出现状况。图中显示的是种植肿瘤后不同时间未出现肿瘤的小鼠比例。
图2 BA009对B16F10黑色素瘤生长的影响
B16F10黑色素瘤细胞皮下种植在C57BL6小鼠背部,并分别以溶媒和BA009治疗,每天观察肿瘤指数并计算肿瘤体积。图中显示的是种植肿瘤后不同时间的平均肿瘤体积。数据显示为平均值±标准方差。
图3 BA009和低剂量环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠体重的影响
路易斯肺癌细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并用BA009和环磷酰胺治疗,小鼠体重每天测定。图中显示了在肿瘤种植后不同时间点荷瘤小鼠体重与治疗前相比的变化百分比的平均值。溶媒为磷酸生理盐水缓冲液,CTX为环磷酰胺治疗组,20,40和80组均用环磷酰胺治疗,并分别用20,40和80微克/公斤BA009治疗。
图4 BA009和丝裂霉素对B16F10黑色素瘤形成的影响
B16F10黑色素瘤细胞皮下种植在C57BL6小鼠背部,并分别以溶媒,丝裂霉素(MMC)和BA009治疗,每天观察肿瘤出现状况。图中显示的是种植肿瘤后不同时间未出现肿瘤的小鼠比例。溶媒为100微升含1毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液,MMC为丝裂霉素治疗组,100和200均同样使用丝裂霉素,并分别用100和200微克/公斤BA009治疗。
图5 BA009和丝裂霉素对B16F10黑色素瘤生长的影响
B16F10黑色素瘤细胞皮下种植在C57BL6小鼠背部,并分别以溶媒,丝裂霉素BA009治疗,每天观察肿瘤指数并计算肿瘤体积。图中显示的是种植肿瘤后不同时间点的平均肿瘤体积。溶媒为100微升含1毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液,MMC为丝裂霉素治疗组,100和200均同样使用丝裂霉素,并分别用100和200微克/公斤BA009治疗。
图6 BA009和丝裂霉素对B16F10黑色素瘤瘤重的影响
B16F10黑色素瘤细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并分别以溶媒,丝裂霉素和BA009治疗,治疗完成后将肿瘤解剖称重,图中显示的是不同治疗组解剖后得到肿瘤的平均瘤重。数据显示为平均值±标准方差。溶媒为100微升含1毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液,MMC为丝裂霉素治疗组,100和200均同样使用丝裂霉素,并分别用100和200微克/公斤BA009治疗。
图7 BA009和丝裂霉素对荷B16F10黑色素瘤小鼠体重的影响
B16F10黑色素瘤细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并分别以溶媒,丝裂霉素和BA009治疗,每天观察治疗过程中荷瘤小鼠体重。图中显示的是不同时间点各治疗组荷瘤小鼠与治疗前相比体重变化百分比的平均值。溶媒为100微升含1毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液,MMC为丝裂霉素治疗组,100和200均同样使用丝裂霉素,并分别用100和200微克/公斤BA009治疗。
图8 BA009和高剂量环磷酰胺对路易斯肺癌生长的影响
路易斯肺癌细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并用溶媒,BA009和环磷酰胺治疗,每天测定肿瘤指标并计算肿瘤体积。图中显示了在肿瘤种植后不同时间点各治疗组肿瘤体积的平均值。溶媒为含0.5毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液,CTX为环磷酰胺治疗组,BA009采用200微克/公斤BA009治疗,共用组为同时使用BA009和环磷酰胺治疗。
图9 BA009和高剂量环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠体重的影响
路易斯肺癌细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并用溶媒,BA009和环磷酰胺治疗,每天测定治疗过程中荷瘤小鼠体重。图中显示了在肿瘤种植后不同时间点各治疗组荷瘤小鼠与治疗前相比体重变化百分比的平均值。溶媒为含0.5毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液,CTX为环磷酰胺治疗组,共用组为同时使用BA009和环磷酰胺治疗。
图10 BA009对B16F10黑色素瘤生长的影响
B16F10黑色素瘤细胞皮下种植在C57BL6小鼠背部,并分别以溶媒和BA009治疗,每天观察肿瘤指数并计算肿瘤体积。图中显示的是种植肿瘤后不同时间的平均肿瘤体积。数据显示为平均值±标准方差。
图11 解剖后B16F10黑色素瘤图象
B16F10黑色素瘤细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并分别以溶媒和BA009治疗,治疗完成后将肿瘤解剖,图中显示的是不同治疗组解剖后得到的肿瘤图象。上半部为溶媒组肿瘤,下半部为BA009组肿瘤。
图12 BA009和超致死剂量丝裂霉素对荷B16F10黑色素瘤小鼠体重的影响
B16F10黑色素瘤细胞种植在C57BL6小鼠背部皮下,并分别以溶媒,超致死剂量的丝裂霉素和BA009治疗,每天观察治疗过程中荷瘤小鼠体重。图中显示的是不同时间点各治疗组荷瘤小鼠与治疗前相比体重变化百分比的平均值。溶媒为100微升磷酸生理盐水缓冲液,MMC为丝裂霉素治疗组,共用组为同时使用BA009和丝裂霉素治疗。丝裂霉素组和共用组小鼠在第10天前全部死亡。
具体实施方式
实施例1 卡介菌多糖核酸制剂的制备
卡介菌多糖核酸粉剂由成都生物制品所提供,质量标准按照中国《生物制品规程》检定,含多糖76%,核酸13%,蛋白含量0.1%。
配制卡介菌多糖核酸制剂时,将适量粉剂溶于生理盐水磷酸缓冲液,可包含或不含络合剂(包括EDTA,EGTA,HEDTA等),用0.2um滤器消毒过滤。具体的药物使用在动物试验中说明。
多糖组份的测定采用蒽酮法,并按照《生物制品规程》规定的试验方法进行,用葡萄糖作为标准品。核酸测定采用OD260光吸收方法,并按照核酸浓度(ng/ul)=50×OD260公式计算。
实施例2 卡介菌多糖核酸对B16黑色素瘤的抑制
2.1.动物模型
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自HARLAN公司,饲养与百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
B16F10黑色素瘤细胞购自ATCC,在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,置于摄氏37度的二氧化碳培养箱中,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射小鼠时,将细胞消化,用生理磷酸缓冲液洗涤两次,计数,并将细胞稀释到每100微升一百万细胞。
将小鼠背部毛发剔除,在皮下注射一百万细胞(100微升),随机分组并在耳朵上做记号。
2.2.药物及观察
待测药物为在本发明实施例1中制备的卡介菌多糖核酸制剂,每剂含卡介菌多糖核酸400微克/100微升。
十八只注射肿瘤细胞后的小鼠,按每组9只小鼠随机分成两组,一组为BA009组(BA009为本发明卡介菌多糖核酸制剂的代码,以下同),另一组为溶媒组。BA009组在皮下注射待测药物,剂量20微克/公斤,溶于100微升溶媒,自肿瘤种植后第3日起,每天一次,连续十天,在溶媒组小鼠的皮下注射100微升溶媒(含1毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液),每天一次,连续十天。
每日观察小鼠的体重和肿瘤生长状况,并在肿瘤长出后用游标卡尺测量肿瘤的指数(长和宽),肿瘤体积按照(长×宽2×0.5)的公式计算。停药后2天将小鼠杀死解剖,观察各主要脏器并称重。统计学分析采用EXCEL软件中的T试验,指数为双尾,不等方差。
2.3.结果
图1显示了BA009对B16F10黑色素瘤肿瘤形成的影响。经10天20ug/kg BA009治疗后,50%小鼠出现肿瘤的时间被延迟了14%。
图2显示了BA009对黑色素瘤生长的作用,表明BA009对皮下种植的黑色素瘤有显著抑制效果。
表1列出了经过BA009治疗欧对黑色素瘤瘤重的影响,表明BA009对黑色素瘤瘤重明显抑制作用,并具显著性差异。
表1 BA009对黑色素瘤重量的抑制作用
组 | 剂量ug/kg | 小鼠数 | 瘤重(mg)x±sd | 抑瘤率% | p |
溶媒 | 9 | 434±169 | |||
BA009 | 20 | 9 | 154±73 | 64.5 | <0.001 |
瘤重表示为平均值±标准方差。
表2列出了BA009对荷B16黑色素瘤小鼠脾脏重量的影响,表明经BA009治疗后,小鼠脾脏重量显著性增加。
表2 BA009对荷黑色素瘤小鼠脾重的影响
组 | 剂量ug/kg | 小鼠数 | 脾重(mg)x±sd | p |
溶媒 | 9 | 104±11 | ||
BA009 | 20 | 9 | 146±15 | <0.001 |
BA009治疗对荷黑色素瘤小鼠体重和包括心,肺,肝,肾在内的其他脏器重量没有显著影响。
实施例3 BA009和低剂量化疗药物环磷酰胺对路易斯肺癌的作用
3.1.动物模型
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自HARLAN公司,饲养于百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
路易斯肺癌(LEWIS LUNG CARCINOMA)细胞购自ATCC,在添加10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中,置于摄氏37度CO2培养箱中,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射小鼠时,将细胞消化,磷酸缓冲液生理盐水(PBS)洗涤,计数,并将细胞用PBS稀释到百万细胞每100微升。
将小鼠背部毛发剔除,在背部下方皮内注射一百万细胞(100微升),随机分组并在耳朵上做记号。
3.2.药物和观察
待测药物BA009为在本发明实施例1中制备的稳定化的卡介菌多糖核酸制剂。化疗药物为环磷酰胺,购自美国SIGMA化学试剂公司。
50只小鼠注射肿瘤细胞后,按每组10只小鼠随机分成五组,第一组为溶媒组,第二组为环磷酰胺组,第三组为20微克/公斤BA009与环磷酰胺共用,第四组为40微克/公斤BA009与环磷酰胺共用组,第五组为80微克/公斤BA009与环磷酰胺共用组。BA009给药方法为腿肌肉注射,自肿瘤注射之日起,每天一次,连续十天,在对照组小鼠的腿肌内注射溶媒对照,每天一次,连续十天,环磷酰胺给药方法为皮下注射,剂量25毫克/公斤,自肿瘤注射第三天开始,每天一次,连续十天。
每日观察小鼠的体重和肿瘤生长状况,并在肿瘤长出后用游标卡尺测量肿瘤的长宽,肿瘤体积按照长×宽×宽×0.5的公式计算。停药后第1天将小鼠杀死解剖,观察肿瘤及主要脏器并称重。统计学分析采用T试验。
3.3.观察结果
表3中显示了BA009和环磷酰胺对路易斯肺癌形成的影响。低剂量环磷酰胺对路易斯肺癌的形成影响不明显,但环磷酰胺与BA009联合使用时,肿瘤的形成明显延迟,这种延迟与BA009的剂量呈量效关系。
表3 BA009和环磷酰胺对路易斯肺癌形成的影响
组别 | 小鼠数 | TD50(天) | 抑制率(%) |
溶媒 | 9 | 3.5 | |
环磷酰胺 | 9 | 3.5 | 0 |
20 | 9 | 4.5 | 28 |
40 | 9 | 5.2 | 49 |
80 | 9 | 6.1 | 74 |
TD50为50%的小鼠出现肿瘤所需要的天数,抑制率按照下公式计算,[(治疗组TD50-对照组TD50)/对照组TD50×100]。
表4列出了BA009和环磷酰胺对路易斯肺癌肿瘤肿量的影响。低剂量环磷酰胺对瘤重略有抑制,其抑瘤作用与BA009共用后显著增强,并且抑制效率与BA009的剂量呈量效关系。
表4 BA009和环磷酰胺对路易斯肺癌瘤重的影响
组别 | 小鼠 | 瘤重(g)(x±sd) | 抑制率(%) | p比溶媒 | P比环磷酰胺 |
溶媒 | 9 | 0.20±0.07 | |||
环磷酰胺 | 9 | 0.18±0.08 | 13.7 | >0.05 | |
20 | 9 | 0.16±0.06 | 23.0 | >0.05 | >0.05 |
40 | 9 | 0.14±0.09 | 32.2 | >0.05 | >0.05 |
80 | 9 | 0.12±0.09 | 41.0 | <0.05 | >0.05 |
表5显示了BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠脾重的影响。低剂量环磷酰胺对小鼠脾重无显著影响,而BA009治疗后,小鼠脾重显著增加,并与BA009剂量呈量效关系。
表5 BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠脾重的影响
组 | 小鼠 | 脾重(g)x±sd | p比溶媒 | p比环磷酰胺 |
溶媒 | 9 | 0.08±0.01 | ||
环磷酰胺 | 9 | 0.09±0.02 | <0.01 | |
20 | 9 | 0.11±0.02 | <0.01 | <0.05 |
40 | 9 | 0.12±0.01 | <0.0001 | <0.001 |
80 | 9 | 0.13±0.03 | <0.001 | <0.01 |
图3显示了BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠体重变化的影响。使用环磷酰胺导致小鼠体重显著下降,BA009治疗对环磷酰胺导致的小鼠体重降低有显著保护作用,并与BA009剂量呈量效关系。
表6列出了BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠在第9天的定量关系。环磷酰胺显著抑制小鼠体重,而BA009治疗对环磷酰胺的体重降低作用有统计学显著并且是BA009剂量依赖性的保护作用。
表6 BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠体重变化的影响。
组 | 小鼠数 | %BWCx±sd | p比溶媒 | p比环磷酰胺 |
Vehicle | 9 | 107.0±3.6 | ||
环磷酰胺 | 9 | 97.2±2.9 | <0.0001 | |
20 | 9 | 102.1±3.2 | <0.01 | <0.01 |
40 | 9 | 102.7±3.5 | <0.05 | <0.01 |
80 | 9 | 104.0±3.9 | >0.05 | <0.001 |
%BWC为与治疗前相比的小鼠体重变化百分比。
BA009或环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠的其他脏器包括心,肝,肺,肾等没有显著影响。
实施例4 卡介菌多糖核酸对路易斯肺癌自发性转移的抑制
4.1.动物模型
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自HARLAN公司,饲养与百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
路易斯肺癌(LEWIS LUNG CARCINOMA)细胞购自ATCC,在添加10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中培养,置于摄氏37度CO2培养箱中,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射小鼠时,将细胞消化,用磷酸缓冲液生理盐水(PBS)洗涤两次,计数,并将细胞稀释到每100微升一百万细胞。
将小鼠背部毛发剔除,在皮内注射一百万细胞(100微升),随机分组并在耳朵上做记号。肿瘤种植20天后,将小鼠用乙醚麻醉,将肿瘤完全切除,伤口缝合。
4.2.药物治疗和观察
18只手术去除肿瘤后的小鼠,按每组9只小鼠随机分成两组,一组为溶媒组,另一组为BA009组。BA009组在皮下注射BA009,剂量40微克/公斤,溶于100微升溶媒,自手术之日起,每天一次,连续十天,溶媒组小鼠皮下注射100微升溶媒(含0.5毫摩尔HEDTA的磷酸生理盐水缓冲液),自手术之日起,每天一次,连续十天。
每日观察小鼠的体重和肿瘤生长状况,手术2周后将小鼠杀死解剖,观察原位肿瘤,肺部转移及主要脏器并称重。统计学分析采用EXCEL软件中T检验功能,指数为双尾和不等方差。
4.3.结果
表7显示了BA009对路易斯肺癌自发性肺转移的影响,表明BA009可以显著降低肺部肿瘤转移。
表7 BA009对路易斯肺癌自发性转移的影响
组 | 小鼠数 | 肺转移小鼠数(%) | 抑制率% |
溶媒 | 9 | 6(67) | |
BA009 | 9 | 3(33) | 50 |
表8显示了BA009对小鼠肺重的影响,表明BA009对肿瘤转移而造成的小鼠肺重增加有显著抑制作用。
表8 BA009对小鼠肺重的影响
组 | 小鼠数 | 肺重(mg)(x±sd) | 抑制率% | p |
溶媒 | 9 | 303.3±119.4 | ||
BA009 | 9 | 216.7±48.7 | 28.6 | <0.05 |
BA009治疗对路易斯肺癌自发转移小鼠体重和包括心,肺,肝,肾在内的其他脏器重量没有显著影响。
实施例5 卡介菌多糖核酸对肾癌的抑制
5.1.动物模型
6-8周龄雌性BALB/C小鼠购自HARLAN公司,饲养于百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
Renca小鼠肾癌细胞由美国国立癌症研究院提供,在添加10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中,置于摄氏37度CO2培养箱中培养,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射细胞时,将细胞消化,用磷酸缓冲液生理盐水(PBS)洗涤,计数,并将细胞用PBS稀释到每100微升一百万细胞。
将小鼠背部毛发剔除,在背部下方两边皮内各注射一百万细胞(100微升),随机分组并在耳朵上做记号。
5.2.用药物及观察
BA009为在本发明实施例1中制备的卡介菌多糖核酸制剂,干扰素(阿尔法2A)和白介素2产品为沈阳三生药业公司出产的商品。
30只小鼠注射肿瘤细胞后,按每组5只小鼠随机分成六组,如下所述;
溶媒:肌注100微升含1毫摩尔EDTA/1毫摩尔的磷酸生理盐水缓冲液;
BA009:肌注100微升溶媒含100微克/公斤BA009;
干扰素:皮注100微升溶媒含300,000IU干扰素;
干扰素+BA009:共用干扰素和BA009;
白介素2:皮注100微升溶媒含30,000IU白介素2;
白介素2+BA009:共用白介素2和BA009。
自肿瘤种植之日起用药,每天一次,连续十天。每日观察小鼠体重和肿瘤生长状况,并在肿瘤长出后用游标卡尺测量肿瘤的长宽,肿瘤体积按照(长×宽×宽×0.5)的公式计算。停药后第6天将小鼠杀死解剖,观察肿瘤及主要脏器并称重。统计学分析采用EXCEL软件中T检验功能,指数为双尾和不等方差。
5.3.观察结果
表9显示了BA009,干扰素和白介素2对解剖后肾癌瘤重的影响。结果表明,BA009,干扰素和白介素2均对瘤重产生抑制作用,BA009的抑瘤效果(57%)比干扰素(28%)或白介素2(43%)要好。BA009与干扰素或白介素2共用对抑制肾癌没有产生显著协同效应。
表9 BA009,干扰素和白介素2对肾癌瘤重的影响
组 | 瘤数 | 鼠数 | 瘤重(mg)(x±sd) | 抑瘤率% | p |
溶媒 | 10 | 5 | 606.0±413.4 | ||
BA009 | 10 | 5 | 256.3±254.3 | 57.2 | <0.05 |
IFN | 10 | 5 | 433.8±70.1 | 28.4 | >0.05 |
IFN+BA009 | 10 | 5 | 288.0±154.3 | 52.5 | <0.05 |
IL2 | 10 | 5 | 343.8±185.7 | 43.3 | >0.05 |
IL2+BA009 | 10 | 5 | 247.0±209.2 | 59.2 | <0.05 |
表10显示了BA009,干扰素和白介素2对荷肾癌小鼠体重变化的影响。第15天体重变化的结果表明,随着肾癌的形成的生长,荷瘤小鼠体重显著降低,BA009,干扰素和白介素2对荷瘤小鼠体重降低均有显著保护作用,但BA009与干扰素或白介素2合用未产生协同效应。
表10 BA009,干扰素和白介素2对荷肾癌小鼠体重的影响
组 | 鼠数 | %体重变化(x±sd) | p |
溶媒 | 5 | 85.5±4.6 | |
BA009 | 5 | 93.2±2.0 | <0.05 |
IFN | 5 | 95.5±4.2 | <0.01 |
IFN+BA009 | 5 | 91.8±5.4 | >0.05 |
IL2 | 5 | 92.3±4.5 | <0.05 |
IL2+BA009 | 5 | 94.4±2.8 | <0.01 |
表11显示了BA009,干扰素和白介素2对荷肾癌小鼠脾重的影响。溶媒组有一只小鼠出现严重的肺,肾,脾和肝脏转移,从分析中剔除。结果表明,荷肾癌小鼠脾重显著下降,干扰素对脾重下降保护不显著,BA009和白介素2均产生了显著性脾重保护作用。BA009与干扰素或白介素2共用未产生协同效应。
表11 BA009,干扰素和白介素2对荷肾癌小鼠脾重的影响
组 | 鼠数 | 脾重(mg)x±sd | p |
溶媒 | 4 | 65.0±10.0 | |
IFN | 5 | 86.7±34.4 | >0.05 |
BA009 | 5 | 116.0±32.1 | <0.05 |
IFN+BA009 | 5 | 110.0±23.5 | <0.01 |
IL2 | 5 | 112.0±24.9 | <0.01 |
IL2+BA009 | 5 | 112.0±17.9 | <0.01 |
表12显示了BA009,干扰素和白介素2对荷肾癌小鼠其他脏器的影响。数据表示为平均值±标准方差。溶媒组有一只小鼠出现严重的肺,肝,脾和肾脏转移,所以从此分析中剔除。结果表明,荷肾癌小鼠心,肾和肝脏出现一定程度减轻,显示健康状况恶化,BA009,干扰素,白介素2及BA009与干扰素或白介素2共用对主要脏器重量有改善作用。
表12 BA009,干扰素和白介素2对荷肾癌小鼠主要脏器的影响
组 | 鼠数 | 心重(mg)x±sd | 肝重(mg)x±sd | 肾重(mg)x±sd | 肺重(mg)x±sd |
Vehicle | 4 | 90.0±0.0 | 688.0±79.3 | 187.5±20.6 | 113.0±9.6 |
BA009 | 5 | 98.0±8.4 | 700.0±88.8 | 208.0±19.2 | 114.0±11.4 |
IFN | 5 | 98.0±4.5 | 774.0±34.4 | 212.0±14.8 | 112.0±8.4 |
IFN+BA009 | 5 | 102.0±8.4 | 764.0±50.3 | 204.0±20.7 | 112.0±8.4 |
IL2 | 5 | 100.0±10.0 | 768.0±122.6 | 210.0±31.6 | 118.0±8.4 |
IL2+BA009 | 5 | 98.0±8.4 | 764.0±41.6 | 208.0±8.4 | 112.0±11.0 |
实施例6 卡介菌多糖核酸对B16黑色素瘤的抑制及与丝裂霉素化疗
药物的协同作用
6.1.动物模型
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自HARLAN公司,饲养于百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
B16F10黑色素瘤细胞购自ATCC,在添加10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中,置于摄氏37度CO2培养箱中,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射小鼠时,将细胞消化,用磷酸缓冲液生理盐水(PBS)洗涤两次,计数,并将细胞用PBS稀释到每100微升一百万细胞。
将小鼠背部毛发剔除,在背部下方两边皮内各注射一百万细胞(100微升),随机分组并在耳朵上做记号。
6.2.用药物及观察
BA009为本发明实施例1中制备的稳定化的卡介菌多糖核酸制剂,丝裂霉素由上海华联制药有限公司提供。
20只小鼠注射肿瘤细胞后,按每组5只小鼠随机分成四组,每只小鼠荷两个肿瘤,分别测定,各组用药方法为:
溶媒组:肌注100微升含0.1毫摩尔EDTA的磷酸生理盐水缓冲液;
丝裂霉素:静注100微升溶媒,含5毫克/公斤丝裂霉素;
100组:肌注100微升含100微克/公斤BA009,丝裂霉素共用;
200组:肌注100微升含200微克/公斤BA009,丝裂霉素共用。
BA009和溶媒给药方法为腿肌肉注射,自肿瘤种植之日起,每天一次,连续十天,丝裂霉素给药方法为尾静脉注射,剂量5毫克/公斤,在肿瘤种植后第二天注射一次。
每日观察小鼠的体重和肿瘤生长状况,并在肿瘤长出后用游标卡尺测量肿瘤的长宽,肿瘤体积按照(长×宽×宽×0.5)的公式计算。停药后第6天将小鼠杀死解剖,观察肿瘤及主要脏器并称重。统计学分析采用EXCEL软件中的T检验功能,指标为双尾和不等方差。
6.3.观察结果
图4显示了BA009和丝裂霉素对B16黑色素瘤形成的影响。结果表明,丝裂霉素对50%小鼠出现黑色素瘤的抑制率为45%,而BA009与丝裂霉素合用,抑制率可达到84%。
图5显示了BA009和丝裂霉素对B16黑色素瘤生长的影响。结果表明,丝裂霉素对黑色素瘤生长有显著性抑制,BA009与丝裂霉素共用可显著增强抑瘤效果。
图6显示了BA009和丝裂霉素对B16黑色素瘤瘤重的影响,数据显示在表13中。结果表明,丝裂霉素对黑色素瘤瘤重有显著性抑制,与BA009合用,抑瘤率显著增强,并与BA009剂量成正比关系。
表13 BA009和丝裂霉素对B16黑色素瘤瘤重的影响
组 | 瘤数 | 鼠数 | 瘤重(mg)(x±sd) | 抑瘤率% | p比溶媒 | p比MMC |
溶媒 | 10 | 5 | 1303.0±507.1 | |||
MMC | 8 | 4 | 477.5±357.6 | 63.4 | <0.01 | |
100 | 10 | 5 | 268.8±117.4 | 79.4 | <0.0001 | >0.05 |
200 | 10 | 5 | 173.0±136.9 | 86.7 | <0.0001 | <0.05 |
表14显示了BA009和丝裂霉素对荷瘤小鼠脾重的影响。结果表明,丝裂霉素造成荷瘤小鼠脾重显著性下降,而BA009(100或200ug/kg)对丝裂霉素引起的小鼠脾重下降有显著性保护作用。
表14 BA009和丝裂霉素对荷瘤小鼠脾重的影响
组 | 鼠数 | 脾重(mg)x±sd | p比溶媒 | p比MMC |
溶媒 | 5 | 148.0±21.7 | ||
MMC | 4 | 77.5±20.6 | <0.01 | |
100 | 5 | 132.0±46.0 | >0.05 | >0.05 |
200 | 5 | 130.0±23.5 | >0.05 | <0.01 |
图7显示了BA009和丝裂霉素对荷瘤小鼠体重的影响。结果表明,丝裂霉素导致了荷瘤小鼠体重显著性降低,并有一只小鼠死亡。100微克/公斤BA009对体重保护不明显,而200微克/公斤BA009对丝裂霉素引起的小鼠体重下降具显著性保护作用。
BA009或丝裂霉素对荷黑色素瘤小鼠的其他脏器包括心,肝,肺,肾等没有显著影响。
实施例7 BA009对手术后路易斯肺癌原位复发和自发转移的作用
7.1.动物模型
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自HARLAN公司,饲养与百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
路易斯肺癌(LEWIS LUNG CARCINOMA)细胞购自ATCC,在添加10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中培养,置于摄氏37度CO2培养箱中,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射小鼠时,将细胞消化,用磷酸缓冲液生理盐水洗涤,计数,并将细胞用稀释到每100微升一百万细胞。
部毛发剔除,在皮内注射一百万细胞(100微升),待肿瘤生长到平均体积200-300立方毫米时(10天),将小鼠用乙醚麻醉,将肿瘤完全切除,伤口缝合,将小鼠随机分为两组。
7.2.用药物及观察
BA009为在本发明实施例1中制备的稳定化的卡介菌多糖核酸制剂,每100微升含卡介菌多糖核酸200微克。
二十七只荷肿瘤小鼠在手术去除肿瘤后随机分为两组,溶媒组13只小鼠,BA009组14只小鼠,在腿肌肉注射100微升BA009,剂量200微克/公斤,自手术之日起,每天一次,连续十二天,溶媒组小鼠在腿肌肉注射100微升溶媒(含1毫摩尔EGTA的磷酸生理盐水缓冲液),每天一次,连续十二天。
每日观察小鼠的体重和肿瘤生长状况,手术后两周将小鼠杀死解剖,观察原位肿瘤,肺部转移及主要脏器并称重。统计学分析采用EXCEL软件中的T检验功能,指标为双尾和不等方差。
7.3.结果
表15列出了BA009对路易斯肺癌原位复发的抑制作用。结果表明,BA009对手术后路易斯肺癌的原位复发具显著性抑制。
表15 BA009对路易斯肺癌原位复发的作用
组 | 鼠数 | 无瘤小鼠(%) | 瘤重(mg)x±sd | 抑制率% | P |
溶媒 | 13 | 1(7.7) | 628.5±303.2 | ||
BA009 | 14 | 4(28.6) | 233.6±188.2 | 62.8 | <0.001 |
表16显示了BA009对路易斯肺癌自发转移小鼠肺重的作用。路易斯肺癌转移后肺脏重量显著增加,BA009对路易斯肺癌自发转移小鼠肺重有明显抑制作用。
表16 BA009对路易斯肺癌自发转移小鼠肺重的影响
组别 | 鼠数 | 肺重(mg)x±sd | p值 |
溶媒 | 13 | 194.6±74.7 | |
BA009 | 14 | 144.3±9.4 | <0.05 |
BA009对路易斯肺癌自发转移小鼠的其他脏器包括心,肝,肺,肾和脾没有显著影响。
实施例8 BA009和高剂量环磷酰胺对路易斯肺癌的作用
8.1.动物模型
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自HARLAN公司,饲养于百药药业有限公司动物房,清洁级别为实验室级别,小鼠食物购自HARLANTEKLAD公司,水和食物充分供应,动物房灯光每12小时交替。
路易斯肺癌细胞购自ATCC,在添加10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中,置于摄氏37度CO2培养箱中,细胞每2-3天传代一次,用EDTA-胰酶消化传代。在注射小鼠时,将细胞消化,用磷酸缓冲液生理盐水(PBS)洗涤,计数,并将细胞用PBS稀释到百万细胞每100微升。将小鼠背部毛发剔除,在背部下方两边皮内各注射一百万细胞(100微升),随机分组并在耳朵上做记号。
8.2.药物和观测
BA009为在本发明实施例1中制备的稳定化的卡介菌多糖核酸制剂,每剂含卡介菌多糖核酸200微克/100微升。化疗药物为环磷酰胺,购自美国SIGMA化学试剂公司。
20只小鼠注射肿瘤细胞后,按每组5只小鼠随机分成四组,第一组命名为溶媒组,溶媒为含0.1毫摩尔EDTA和1毫摩尔HEDTA的磷酸生理盐水缓冲液,第二组为化疗药治疗组(环磷酰胺组),第三组为卡介菌多糖核酸单独治疗组(BA009组),第四组为化疗和卡介菌多糖核酸共用组。卡介菌多糖核酸给药方法为腿肌肉注射,剂量200微克/公斤,自肿瘤注射之日起,每天一次,连续十天,在对照组小鼠的腿肌内注射一剂溶媒对照,每天一次,连续十天,环磷酰胺给药方法为皮下注射,剂量100毫克/公斤,自肿瘤注射第三天开始,隔天一次,共注射四次。
每日观察小鼠的体重和肿瘤生长状况,并在肿瘤长出后用游标卡尺测量肿瘤的长宽,肿瘤体积按照(长×宽×宽×0.5)的公式计算。停药后第6天将小鼠杀死解剖,观察肿瘤及主要脏器并称重。统计学分析采用ECEL软件中的T检验功能,指标为双尾和不等方差。
8.3.观察结果
图8显示了BA009和高剂量环磷酰胺对路易斯肺癌生长的影响。结果表明,环磷酰胺和BA009单独使用对路易斯肺癌均产生抑制作用,BA009与环磷酰胺共用时可显著增加抑瘤效果。
表17显示了BA009和环磷酰胺对路易斯肺癌瘤重的影响。结果表明,环磷酰胺对路易斯肺癌的抑制率为70%,BA009为41%。BA009与环磷酰胺合用,抑瘤率可达到81.9%。
表17 BA009和环磷酰胺对路易斯肺癌瘤重的影响
组 | 瘤数 | 鼠数 | 瘤重(mg)(x±sd) | 抑瘤率% | p比溶媒 | p比CTX |
溶媒 | 10 | 5 | 443.0±160.0 | |||
CTX | 10 | 5 | 133.0±72.4 | 70.0 | <0.001 | |
BA009 | 8 | 4 | 260.0±60.0 | 41.3 | <0.01 | |
共用 | 10 | 5 | 80.0±31.3 | 81.9 | <0.0001 | <0.05 |
表18显示了BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠脾重的影响。结果表明,环磷酰胺造成小鼠脾重显著下降,BA009对环磷酰胺造成的小鼠脾重下降有显著保护作用。
表18 BA009和环磷酰胺对荷瘤小鼠脾重的影响
组 | 鼠数 | 脾重(mg)x±sd | p比溶媒 | p比CTX |
溶媒 | 5 | 144.0±25.1 | ||
CTX | 5 | 90.0±23.5 | <0.01 | |
BA009 | 4 | 175.0±20.8 | >0.05 | |
共用 | 5 | 172.0±60.6 | >0.05 | <0.05 |
图9显示了BA009和环磷酰胺对荷瘤小鼠体重的影响。结果表明,环磷酰胺导致小鼠体重显著下降,而BA009对环磷酰胺造成的小鼠体重下降有显著性的保护作用。
BA009和环磷酰胺对荷路易斯肺癌小鼠的其他脏器包括心,肝,肺,和肾没有显著影响。
实施例9 BA009与超致死剂量丝裂霉素对B16黑色素瘤的作用
9.1.动物模型
B16F10黑色素瘤细胞购自ATCC(CRL-6475),在添加10%胎牛血清的含高葡萄糖(4.5mg/ml)的DMEM培养基中培养,置于二氧化碳培养箱,每2-3天用胰酶-EDTA消化传代。注射小鼠前,将细胞消化,用磷酸生理盐水缓冲液洗涤两次,细胞计数,并将细胞稀释至每毫升一千万细胞。
6-8周龄雌性C57BL6小鼠购自Harlan SD公司,在具通风设备的动物房中饲养,灯光定时为每12小时转换,标准小鼠饲料和水自由供给。注射肿瘤前,将小鼠背部毛发剔除,并在皮下注射100微升的含细胞溶液,细胞数目为一百万。
9.2.治疗和观察
四十只注射肿瘤细胞后的小鼠随机分为四组,每组有十只小鼠,各组治疗药物和方法如下:
溶媒组:皮注100微升含0.5毫摩尔HEDTA/0.5毫摩尔EGTA的磷酸生理盐水缓冲液,qldx10
丝裂霉素:静注100微升含5mg/kg丝裂霉素的溶媒,qx1
BA009:皮注100微升含40ug/kgBA009的溶媒,qldx10
共用组:BA009和丝裂霉素共用
溶媒和BA009治疗自肿瘤种植之日起,每天一次,连续10天。丝裂霉素(由上海华联制药有限公司提供)治疗自肿瘤种植之日起,每天一次,连续八天。经丝裂霉素治疗小鼠包括共用组由于药物毒性在第11天前全部死亡。
小鼠的体重和肿瘤大小每天观察记录。肿瘤指数(长和宽)通过游标卡尺测量,肿瘤体积由[(长×宽2)/2]计算。用药完成后第6天,将小鼠杀死并解剖,观察主要脏器并秤重保存。
统计学分析采用EXCEL软件中的T检验功能,指数为双尾,不等方差。
9.3.结果
图10显示了BA009对B16黑色素瘤的作用,表明BA009可显著抑制黑色素瘤的生长。
图11和表19分别列出了BA009对解剖后黑色素瘤重量的影响。BA009的抑瘤率为77.5%。
表19 BA009对解剖后黑色素瘤瘤重的影响
组 | 小鼠 | 瘤重(mg)(x±sd) | 抑瘤率% | P |
溶媒 | 12 | 2800.0±1148.8 | ||
BA009 | 10 | 630.0±307.5 | 77.5 | <0.0001 |
图12显示了BA009对超致死剂量丝裂霉素对荷黑色素瘤小鼠体重的影响。超致死剂量丝裂霉素自第3天起导致小鼠体重显著下降,而40微克/公斤的BA009对丝裂霉素造成的小鼠体重下降自第4天起产生显著的保护效应(图中显示为*号)。用丝裂霉素的小鼠在第10天前全数死亡。
Claims (9)
1.一种治疗癌症的药物组合物,其特征在于该药物组合物包括有效剂量的卡介菌多糖核酸,药用辅料及稳定剂,其中卡介菌多糖核酸的多糖组分含量70-80%;核酸组分含量10-20%;蛋白含量0.1-0.99%。
2.一种根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述稳定剂为一种或几种阳离子络合剂,包括EDTA,EGTA或HEDTA中的一种或几种的组合。
3.一种根据权利要求1和2所述的药物组合物,其特征在于向对象提供该药物组合物后,能够达到抑制肿瘤生长或转移的效果。
4.一种根据权利要求1至2所述的药物组合物,其特征在于向接受手术治疗的癌症对象提供该药物组合物后,能够达到增加手术疗效的效果。
5.一种根据权利要求1至2所述的药物组合物,其特征在于向接受细胞毒性药物治疗的对象提供该药物组合物,能够达到增强细胞毒性药物疗效的效果。
6.一种根据权利要求1至2所述的药物组合物,其特征在于向接受细胞毒性药物治疗的对象提供该药物组合物,能够达到减少细胞毒性药物毒副作用的效果,其中毒副作用的表现为骨髓抑制,体重降低和脏器毒性中的一种或几种。
7.一种根据权利要求1至2所述的药物组合物,其特征在于向对象提供该药物组合物后,能够达到改善对象健康状况或增加存活率的效果。
8.一种根据权利要求3至7所述的药物组合物,其中所述的对象是包括人在内的哺乳动物。
9.一种如权利要求1所述的一种治疗癌症的药物组合物的制备方法,其特征在于将精制卡介菌多糖核酸用生理氯化钠溶液溶解,浓度在1-5毫克/毫升,121℃灭菌20分钟,并加入0.01mM到5mM的金属络合物,包括EDTA,HEDTA或EGTA中的一种或几种的组合,搅拌均匀即为卡介菌多糖核酸溶液,其成分为:生理氯化钠溶液,卡介菌多糖组份0.7-4毫克/毫升,卡介菌核酸组份0.1-1毫克/毫升,金属络合物0.01-5毫摩尔。
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