CN1646146A - 治疗血管疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗患有或者有可能患有内膜增生和/或动脉硬化的病人的方法。所述治疗包括给药病人含有一氧化碳的药物组合物。

Description

治疗血管疾病的方法
相关申请的参考
本发明要求2002年2月13日提交的美国临时申请No.60/356,718的优先权，其全文内容包含在本文中作为参考。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府的支持下进行的，美国国立卫生研究院(NIH)许可号为HL55330，HL60234，HL67040，HL58688，HL53458，HL60234，HL5785405，和AI42365。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明总体涉及治疗血管疾病。
背景技术
血红素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1(HO-1))催化血红素降解的第一步。HO-1通过氧化作用裂解b型血红素分子的α-内消旋碳桥以产生等摩尔量的胆绿素(biliverdin)IXa，一氧化碳(CO)，和游离铁。然后，胆绿素通过胆绿素还原酶被转化成胆红素，游离铁则螯合成铁蛋白(其生成是游离铁诱导的)。
CO被认为是一种重要的信号分子(Verma等，Science 259：381-384，1993)。据称一氧化碳是脑内的神经信使分子(Id.)和下丘脑内的神经内分泌调节物(Pozzoli等，Endocrinology 735：2314-23171994)。和一氧化氮一样，CO是平滑肌的松弛剂(Utz等，Biochem Pharmacol.47：195-201，1991；Christodoulides等，Circulation 97：2306-9，1995)并且抑制血小板聚集(Mansouri等，Thromb Haemost.48：286-8，1982)。一些模型吸入低水平的CO后显示抗炎效果。
内膜增生是指血管内膜增厚，它是一种由于继发血管损伤造成的病理过程，可继发于例如血管成形术，分流手术(bypass surgery)或者器官移植。内膜增生会持续限制这些治疗性介入的成功。
发明简述
本发明部分基于这样的发现：CO可预防动物主动脉移植和颈动脉球囊损伤(balloon injury)后的动脉硬化性损伤和内膜增生。
相应的，一方面本发明提供治疗病人内膜增生的方法。所述方法包括鉴定患有或易患内膜增生(例如由于血管成形手术或者移植手术造成，或者由除移植手术以外的手术或病情造成的内膜增生)的病人，以及给药病人一种药物组合物，它包含有效治疗病人的内膜增生的量的一氧化碳。
本发明还提供了对病人进行血管成形术的方法。所述方法包括对病人进行血管成形术，并在此之前、期间和/或之后对病人给药一种药物组合物，所述组合物包含有效治疗病人的内膜增生的量的一氧化碳。所述血管成形术可以是任何血管成形手术，例如球囊血管成形术(balloon angioplasty)；激光血管成形术(laser angioplasty)；动脉粥样斑块切除术(artherectomy)，例如，定向式(directional)动脉粥样斑块切除术，旋转式(rotational)动脉粥样斑块切除术，或吸出式(extraction)动脉粥样斑块切除术；和/或任何使用支架的血管成形手术，或者这些手术的任意组合。
本发明还提供了治疗(例如预防或减轻)病人的血管再狭窄(restenosis)的方法。所述方法包括提供含有包含一氧化碳气体的压缩气体的容器，鉴定患有或易患血管再狭窄的病人，释放容器内的压缩气体形成含有一氧化碳气体的环境(atomosphere)，并将病人暴露于该环境，其中环境中一氧化碳的量足以治疗病人的再狭窄。
本发明另一方面提供了治疗病人的血管再狭窄的方法。所述方法包括鉴定患有或易患血管再狭窄的病人，并给药病人一种药物组合物，所述组合物包含有效治疗病人的再狭窄的量的一氧化碳。血管再狭窄可以由任何血管成形手术造成，如球囊血管成形术；激光血管成形术；动脉粥样斑块切除术，例如，定向式动脉粥样斑块切除术，旋转式动脉粥样斑块切除术，或吸出式动脉粥样斑块切除术；和/或任何使用支架的血管成形术，或这些手术的任意组合。
本发明还提供了对病人进行血管手术的方法，例如移植手术。所述方法包括(a)对病人进行血管手术(例如，移植手术)，和(b)在(a)之前，期间或以后，对病人给药药物组合物，该组合物包含有效治疗病人动脉硬化(例如内膜增生)的量的CO。
另一方面，本发明提供了抑制平滑肌细胞增生的方法。所述方法包括提供平滑肌细胞，和给药所述平滑肌细胞有效量的CO以便抑制平滑肌细胞的增生。可在体内或体外进行。
还提供了对病人进行血管成形术的方法，包括提供能够将一氧化碳给药病人的血管成形术器械(例如本文所述的器械)，将该器械定位于需要进行血管成形术的血管，使用所述器械进行血管成形术，并且在进行血管成形术之前，期间或以后使用该器械对该血管给药足量的CO治疗内膜增生，从而对病人进行血管成形手术。所述器械可以是任何能够用于血管成形手术的器械，例如本文所述的器械。可选或此外，该器械可涂覆CO释放剂，例如水凝胶，油或膏，它可释放CO或CO释放性化合物。
本发明另一方面提供了一种容器，所述容器包含医用级别的压缩CO气体。该容器带有说明该气体可用于减轻患者的(例如人类患者)再狭窄，动脉硬化，和/或内膜增生，和/或说明它可用于血管成形手术的标签。CO气体可以与氮气，或与一氧化氮和氮气，或与含有氧气的气体混合。所述混合物中CO气体的浓度至少约0.025％，例如至少约0.05％，0.10％，0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。
本发明还提供了一种试剂盒，它包含血管成形术器械(例如，球囊血管成形术器械；激光血管成形术器械；动脉粥样斑块切除术器械；和/或支架)以及含有CO(例如液体和/或气体CO组合物)的容器。所述血管成形术器械能够将一氧化碳给药病人。所述试剂盒进一步包含在对病人进行血管成形术的方法中使用该一氧化碳组合物的说明。
本发明另一方面提供了血管成形术器械(例如，球囊血管成形术器械，激光血管成形术器械，动脉粥样斑块切除术器械，和支架，例如，本文所述的器械)，它能够在血管成形手术前，期间和/或以后立刻将CO给药病人和/或血管。在一个实施方案中，所述血管成形器械包括CO组合物。在另一实施方案中，所述器械是一种球囊血管成形器械，包括有很多个开口(aperture)的可膨胀部分(inflatable member)(例如球囊(balloon))，和与可膨胀部分连接的含有CO(例如液体或气体CO组合物)的储器(reservoir)，其中CO可从储器通过可膨胀部分递送到血管。
本发明还涉及CO在生产治疗或预防所述病情的药物中的用途，所述病情例如内膜增生，再狭窄和/或动脉硬化。所述药物可用于进行血管成形手术和/或移植手术的方法中。该药物可以是本文所述的任何形式，例如液体或气体CO组合物。
除非另有限定，本文所用所有技术和科学用语都和本发明的领域的普通技术人员所理解的一样。适宜的方法和材料见下文，但与本文的方法和材料类似或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明。所有公开出版物，专利申请，专利和其它本文涉及的对比文件的全文内容都包含在文中作参考。如有抵触，本说明书，包括定义将作为指导。所述材料，方法和实施例均只做举例而不是限制。
本发明的其它特征和优点从以下的说明和权利要求显而易见。
附图说明
图1A是同基因移植的(syngenlically transplanted)主动脉移植物的显微照片(50X放大率)，它显示了同基因移植对移植物的影响。
图1B是同种异体基因移植的(allogeneically tronsplanted)主动脉移植物的显微照片(50X放大率)，它显示了同种异体基因移植对移植物的影响。
图1C同种异体基因移植的主动脉移植物的显微照片(50X放大率)，它显示了受体暴露于CO时同种异体基因移植对移植物的影响。
图1D是同基因移植的主动脉移植物的显微照片(200X放大率)，它显示了同基因移植对移植物的影响。
图1E是同种异体基因移植的主动脉移植物的显微照片(200X放大率)，它显示了同种异体基因移植对移植物的影响。
图IF同种异体基因移植的主动脉移植物的显微照片(200X放大率)，它显示了受体暴露于CO时同种异体基因移植对移植物的影响。
图1G是柱图，它显示同基因移植到暴露于空气的受体(Syng.)，同种异体基因移植到暴露于空气的受体(Allo.)，和同种异体基因移植到暴露于CO的受体(Allo.+CO)的主动脉移植物内膜(initma)的平均相对面积(任意单位)。
图1H是柱图，它显示同基因移植到暴露于空气的受体(Syng.)，同种异体基因移植到暴露于空气的受体(Allo.)，和同种异体基因移植到暴露于CO的受体(Allo.+CO)的主动脉移植物中层(media)的平均相对面积(任意单位)。
图1I是柱图，它显示同基因移植到暴露于空气的受体(Syng.)，同种异体基因移植到暴露于空气的受体(Allo.)，和同种异体基因移植到暴露于CO的受体(Allo.+CO)的主动脉移植物的内膜/中层面积比。
图2A是柱图，它显示同基因移植到暴露于空气的受体(Syngeneic)，同种异体基因移植到暴露于空气的受体(Allogeneic)，和同种异体基因移植到暴露于各种浓度的CO(CO 250ppm；CO 500ppm；和CO 750-1000ppm)的受体CO的主动脉移植物外膜(adventitia)的活化白细胞的聚集(通过计数总核数来测定)。
图2B是一组柱图，它显示同基因移植到暴露于空气的受体(Syng.)，同种异体基因移植到暴露于空气的受体(Allog.)，和同种异体基因移植到暴露于CO的受体(Allo.+CO)的主动脉移植物外膜中CD45，ED1，MHCII，和CD54阳性细胞的聚集。
图2C是一组柱图，它显示同基因移植到暴露于空气的受体(Syng.)，同种异体基因移植到暴露于空气的受体(Allog.)，和同种异体基因移植到暴露于CO的受体(Allo.+CO)的主动脉移植物外膜中CD3，CD4，和CD8阳性细胞的聚集。
图3A是颈动脉样品的显微照片(10X放大率)，显示球囊血管成形术对动脉的影响。
图3B是颈动脉样品的显微照片(10X放大率)，显示球囊血管成形术对预暴露于CO的受试者的动脉的影响。
图3C是颈动脉样品的显微照片，显示球囊血管成形术对动脉的影响。
图3D是颈动脉样品的显微照片，显示球囊血管成形术对预暴露于CO的受试者的动脉的影响。
图3E是柱图，它显示了当受试动物预暴露于空气(对照)或250ppm CO(CO)时，接受球囊血管成形术的颈动脉内膜的平均相对面积(任意单位)。
图3F是柱图，它显示了受试动物预暴露于空气(对照)或250ppm CO(CO)时，接受球囊血管成形术的颈动脉中层的平均相对面积(任意单位)。
图3G是柱图，它显示了受试动物预暴露于空气(对照)或250ppm CO(CO)时，接受球囊血管成形术的颈动脉的内膜/中层面积比。
图4A是线图，显示了大鼠SMC的增生，所述大鼠SMC分别为：未转导的(○，中层)，用Lac.Z重组腺病毒转导的(□；LacZ Rec.Ad.)和用HO-1重组腺病毒转导的(●；HO-1 rec.Ad.)。
图4B是线图，显示了大鼠SMC在存在CO(●；1000ppm)和不存在CO(□)CO的条件下的增生。
图4C是柱图，显示从野生型(WT)或HO-1缺陷(ho-l-/-)小鼠中分离的SMC在存在(CO)和不存在(空气)CO的条件下的增生。
图4D是Western印迹，显示了CO暴露(0，4，5，16，和24小时)对小鼠SMC中p21和β-肌动蛋白的表达的影响。
图4E是柱图，显示CO对从野生型小鼠(WT)，p21Cip1缺陷小鼠(p21-/-)和p53(p53-/-)缺陷小鼠中分离的小鼠SMC的影响。灰色柱表示细胞暴露于室内大气，而黑色柱表示细胞暴露于CO(250ppm)。
图4F是柱图，显示球囊损伤的颈动脉的内膜/中层面积比，所述动脉来自暴露于空气(Air)或一氧化碳(CO)的野生型小鼠(C57B16/5129；wt)和p21-/-小鼠。
图5A是柱图，显示了暴露于空气(Air)和暴露于CO(250ppm，8h或16h)对小鼠SMC的平均细胞cGMP含量的影响。
图5B是柱图，显示了暴露于空气(Air)，CO(250ppm)和CO加鸟苷酸环化酶抑制剂1H(1，2，4)，Oxadiazolo(4，3-a)喹噁啉(Quinoxalin)-1(CO/ODQ)的小鼠SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图5C是Western印迹的组图，它显示了8-溴鸟苷-3′-5′-环单磷酸钠盐(8-Br-cGMP)对p21Cip1表达的影响。
图5D是柱图，显示了在存在(8Br-cGMP；8Br-cGMP(p21-/-))和缺乏(Air)cGMP类似物8Br-cGMP的条件下，从野生型(wt)和p21Cip1(p21-/-)缺陷型小鼠中分离的SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图5E是Western印迹的组图，显示了与SMC中的总p38 MAPK，ATF-2，JNK，和ERK相比，CO(250ppm)对磷酸化p38 MAPK(p-p38)，ATF-2(p-ATF-2)，JNK(p-JNK)和ERK(p-ERK)的表达的影响。
图5F是柱图，显示了暴露于空气(Air)，250ppm CO(CO)和CO加p38MAPK抑制物SB203580(CO/SB)的小鼠SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图5G是Western印迹的组图，显示了空气(Air)，CO(250ppm；CO))，SB203580和DMSO对小鼠SMC中p21Cip1表达的影响。
图6A是Western印迹的组图，显示了8-Br-cGMP对小鼠SMC中p38MAPK表达的影响。
图6B是柱图，显示了暴露于空气(Air)，CO加8-Br-cGMP(8-Br-cGMP)，和CO加8-Br-cGMP加SB203580(8-Br-cGMP+SB203580)的小鼠SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图7A流式细胞图，显示空气(Air)和CO(250ppm)暴露对大鼠主动脉SMC的细胞周期的影响。
图7B是线图，显示空气(□)和CO(■)对SMC增生的影响。
图8是柱图，显示了暴露于空气(灰柱)或CO(250ppm；黑柱)24小时的野生型(wt)，p21-/-，和p53-/-小鼠SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图9A是金属丝损伤(wire injury)14天后的野生型小鼠颈动脉切片的显微照片(20x放大率)。受试动物在金属丝损伤前暴露于室内空气1小时。
图9B是金属丝损伤14天后的野生型小鼠颈动脉切片的显微照片(20x放大率)。受试动物在金属丝损伤前暴露于CO(250ppm)1小时。
图9C是金属丝损伤14天后的p21-/-小鼠颈动脉切片的显微照片(20x放大率)。受试动物在金属丝损伤前暴露于室内空气1小时。
图9D是金属丝损伤14天后的p21-/-小鼠颈动脉切片的显微照片(20x放大率)。受试动物在金属丝损伤前暴露于CO(250ppm)1小时。
图9E是柱图，显示了暴露于空气(对照)或250ppm CO(CO)的野生型(wt)和p21-/-小鼠的金属丝损伤颈动脉内膜的平均相对面积(任意单位)。
图9F是柱图，显示了暴露于空气(对照)或250ppm CO(CO)的野生型(wt)和p21-/-小鼠的金属丝损伤颈动脉中层的平均相对面积(任意单位)。
图9G是柱图，显示了暴露于空气(对照)或250ppm CO(CO)的野生型(wt)和p21-/-小鼠的金属丝损伤颈动脉的内膜/中层比值。
图10是柱图，显示了用空气(Air)，CO(250ppm；CO)和CO加SB203580(CO/SB)处理的p21-/-小鼠SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图11A是柱图，显示了用空气(Air)或CO(250ppm；CO)处理野生型(wt)，enos-/-，和inos-/-缺陷小鼠的SMC对[3H]胸腺嘧啶的吸收。
图11B是柱图，显示了颈动脉球囊损伤前暴露于室内空气(白柱)或NO(黑柱，1小时；250ppm)的Sprague-Dawley大鼠的颈动脉的平均内膜和中层面积，以及内膜/中层面积比值。
图12A是Western印迹的组图，显示了用或未用血清(分别为加血清和不加血清)处理而且用或未用CO(分别为空气和CO)处理24或48小时的SMC中PAI-1的表达。肝＝没用内毒素(LPS)处理的大鼠肝组织匀浆的全细胞(whole cell)裂解物。肝+LPS＝用内毒素(LPS)处理的大鼠肝组织匀浆的全细胞裂解物。TNF-α＝对照，其中将TNF-α加入细胞培养来刺激PAI-1的表达。
图12B是Western印迹图，显示了移植后56天之时，未移植(对照)，移植(Allo.+Air)，和经CO-处理并移植(Allo.+CO)的主动脉中PAI-1的表达。
图12C是图12B的Western印迹中聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色，显示了移植后56天之时，未移植(对照)，移植(Allo.+Air)，和经CO-处理并移植(Allo.+CO)的主动脉中PAI-1的表达。
图13A-13B显示能够在血管成形手术中的任何阶段将CO给药病人的球囊血管成形术器械的实例。
图13C-13D显示了球囊血管成形术器械的备选实施方案。
图14A-14B显示了能够在血管成形手术的任何阶段将CO给药病人的支架的实例。
图15显示了一种设计用于在血管成形手术中将CO给药病人的具有多个球囊的球囊血管成形术器械。
图16显示了能够在血管成形手术中将CO给药病人的动脉粥样斑块切除术(atherectomy)器械的实例。
发明内容
本文术语“一氧化碳”(或“CO”)描述了气态的，压缩成液态的，或者溶解于水溶液中的一氧化碳分子。本文术语“一氧化碳组合物组合物″或“包含一氧化碳的药物组合物”用于描述可给药病人或血管的含有一氧化碳的气体或液体组合物，例如，接受血管成形手术，分流手术，移植，或者任何其他可能/将要导致内膜增生和/或动脉硬化的手术的病人(或血管)。熟练医师知道在具体应用中优选何种形式的药物组合物，例如气体，液体，或既有气体也有液体。
术语″内膜增生″是本领域已知术语，用于本文指血管内膜细胞的增生，例如平滑肌细胞。熟练的医师知道内膜增生可由任意多种因素造成，例如对内膜机械的，化学的和/或免疫的损伤。通常在接受例如球囊血管成形术或血管手术，例如，涉及静脉移植的血管手术(例如，移植手术)的病人中可以观察到内膜增生。“动脉硬化”，“动脉硬化损伤”“动脉硬化斑”和“动脉硬化病情”也是本领域已知术语，用于本文指动脉壁的增厚和硬化。本文术语“脉管系统”指人或非人机体的血管系统(或其部分)并包括例如动脉，小动脉，静脉，微静脉，和毛细血管等血管。术语″血管再狭窄″指血管成形术后动脉的再狭窄。
术语″血管成形术″是本领域已知术语，指任何单独或组合的涉及血管重构的手术，例如扩张病人脉管系统的狭窄区以恢复狭窄区区界以外的足够血流。这种方法包括经皮管腔内血管成形术(percutaneous transluminalangioplasty)(PTA)，所述方法使用具有可扩张的末端的导管(catheter)，即可充气的球囊(称为″球囊血管成形术″)；激光血管成形术；吸出式动脉粥样斑块切除术；定向式动脉粥样斑块切除术；旋转式动脉粥样斑块切除术；支架术；和任何其它用于重构例如动脉等血管的方法。
本文术语“有效量”和“有效地治疗”指一段时间内(包括急性或慢性给药以及定期的或连续的给药)所用的一氧化碳的量或浓度，所述量或浓度在其给药用来产生目的效果或生理结果的背景下是有效的。本发明所用有效量一氧化碳包括例如防止或减轻例如血管成形手术等手术后内膜增生的量。一氧化碳有效量还包括防止或减轻病人(例如移植病人)动脉硬化的量。本文术语“治疗”描述了延缓一种病情例如内膜增生和/或动脉硬化的有害作用的开始被延迟，抑制或缓解。
在气体的情况下，有效量的CO通常在约0.0000001％到约0.3％重量之间，例如0.0001％到约0.25％重量，优选CO重量至少约0.001％，例如至少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％。优选的CO范围包括0.002％到约0.24％，约0.005％到约0.22％，约0.01％到约0.20％，和约0.02％到约0.1％。在CO溶液的情况下，有效量通常在约0.0001到约0.0044g CO/100g溶液，例如至少约0.0001，0.0002，0.0004，0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020.0.0021，0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或0.0042g CO/100g水溶液。优选的范围包括，例如约0.0010到约0.0030g CO/100g液体，约0.0015到约0.0026gCO/100g液体，或者约0.0018到约0.0024g CO/100g液体。熟练的医师应理解根据应用的情况可使用这些范围外的量。
本文术语“病人”描述根据本发明提供的方法对其进行治疗的动物，人或非人。本发明涉及兽医学和非兽医学应用。该术语包括但不限于哺乳动物，例如人，其它灵长类，猪，啮齿类例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，仓鼠，牛，马，猫，狗，绵羊和山羊。
本文所用术语“移植”是总称，用于描述将器官或组织转移到病人体内的方法。术语“移植”在本领域定义为将活体组织或细胞从供体转移到受体，并保持被转移的组织或细胞在受体中的功能完整性(见例如The MerkManual，Berkow，Fletcher and Beers，Eds.，Merck Research Laboratories，Rahway，N.J.，1992)。该术语包括本领域任何已知种类的移植。移植通过部位以及供体和受体之间的遗传关系分类。该术语包括例如自体移植(autotransplantation)(将病人身体的一个位置的细胞或组织取出并转移到同一病人身体的相同或另一位置)，同种异体移植(allotransplantation)(相同物种成员间的移植)，和异种移植(xenotransplantation)(不同物种成员间的移植)。
术语“供体”或“供体病人”用于文中指动物(人或非人)，从该动物可以获得器官或组织用于移植到受体病人。术语“受体”或“受体病人”指器官或组织被转移至其中的动物(人或非人)。
术语“器官排斥”，“移植排斥”和“排斥(rejection)”是本领域已知术语，用于文中作为总称，描述受体中器官，组织或细胞的排斥过程。该定义包括，例如临床中通常鉴定的三种主要排斥模式：超急性排斥(hyperacuterejection)，急性排斥(acute rejection)，和慢性排斥(chronic rejection)(见例如Oxford Textbook of Surgery，Morris and Malt，Eds.，Oxford University Press(1994))。
术语″器官″用于本文中作为总称描述动物中具有特定功能的任何解剖学部位或元件(member)。该术语进一步包括器官的实质部分，例如从器官获得的相连组织(cohesive tissue)。这种器官包括但不限于肾，肝，心，肠，例如大肠或小肠，胰腺和肺。该定义还包括脉管系统，例如静脉和动脉，以及骨骼。
被认为具有发生内膜增生或动脉硬化的危险的个体尤其可从本发明受益，主要是由于预防性CO治疗可以在对病人进行手术前给药或者在没有任何内膜增生或动脉硬化斑的证据之前给药。“有危险的”个体包括其血管内膜已经或将受到任何类型的机械，化学和/或免疫损伤的病人，例如即将或已经经过移植手术和/或血管成形术的病人。熟练的医师可理解通过该领域任何已知的方法例如内科医师的诊断可确定病人有内膜增生或动脉硬化的危险。
制备气体组合物
CO组合物可以是气体组合物。可用于本发明的方法中的压缩气体(compressed gas)或加压气体(pressurized gas)，可自任何商业来源获得，并可位于任何类型的适合储存压缩气体的容器(vessel)中。例如，压缩或加压气体可以自任何提供医用压缩气体例如氧气的来源获得。本文术语“医用级”气体，指适合给药本文所定义的病人的气体。提供用于本发明的方法的加压气体包括CO时，可使得所需终组合物中的所有气体(例如，CO，He，NO，CO2，O2，N2)在同一容器内，除NO和O2不能储存在一起的情况。可选的，本发明的方法可使用多个含有单一气体的容器进行。例如，可提供含或不含其它气体的含一氧化碳的单个容器，其含有的气体可选地与其它容器中含有的气体组合，所述其它容器例如含有氧气，氮气，二氧化碳，压缩空气，或任何其它适合的气体或其混合物的容器。
根据本发明给药病人的气体组合物通常含有0％-约79％重量的氮气，约21％-约100％重量的氧气和约0.0000001％-约0.3％重量(相当于约1ppb或0.001ppm-约3,000ppm)CO。优选气体组合物中氮气量是约79％重量，氧气量是约21％重量且CO量是约0.0001％-约0.25％重量。优选CO的量是至少约0.001％，例如，至少约0.005％，0.01％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。CO的优选范围包括0.005％-约0.24％，约0.01％-约0.22％，约0.015％-约0.20％，和约0.025％-约0.1％重量。注意到根据应用情况，具有大于0.3％(例如1％或更高)CO浓度的气体CO组合物可短期使用(例如一次或数次呼吸)。
可用气体CO组合物产生包含CO气体的环境(atmosphere)。包含适当水平的CO气体的环境可通过如下方式产生：提供含有包含CO气体的加压空气的容器并将所述加压气体从容器中释放到室或空间内，在该室或空间内形成包括CO气体的环境。可选地，所述气体可被释放到使气体在呼吸面罩或呼吸管内达到最高浓度的一种仪器中，从而在呼吸面罩或呼吸管中创造出包含CO气体的环境，使得病人成为该室内唯一暴露于非常高水平的CO的人。
环境中CO的水平可通过本领域已知的任何方法检测或监测。这种方法包括电化学检测，气相色谱，放射性同位素计数，红外吸收，比色法，和基于选择性膜的电化学方法(见例如Sunderman等，Clin.Chem.28：2026-2032，1982；Ingi等，Neuron 16：835-842，1996)。亚百万分数级(亚-ppm)Co水平可通过例如，气相色谱和放射性同位素计数检测。此外，本领域已知亚-ppm范围内的CO水平可通过中红外气体传感器(midinfrared gassensor)在生物组织中检测(见例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol 280：H482-H488，2001)。CO传感器和气体检测仪可自多种商业来源获得。
制备液体组合物
包含CO的药物组合物也可以是液体组合物。液体可通过本领域已知的任何使气体溶于液体的方法制成包含CO的药物组合物。例如，所述液体可以置于所谓的“CO2温育箱”中并暴露于持续的CO气流，优选由二氧化碳平衡，直到液体中CO达到所需的浓度。另一实施例中，CO气体可直接″吹入(bubbled)″液体中，直到液体中CO达到所需的浓度。溶解于给定水溶液中的CO量随温度的降低而增加。在另一实施例中，适宜的液体可流经允许气体进行扩散的管道系统(tubing)，该管道系统在包含CO的环境(例如利用例如体外膜氧合器(extracorporeal membrane oxygenator)的仪器)中运行。CO扩散进入液体产生液体CO组合物。
大多数情况下，这种意图被引入活体动物体内的液体组合物，当其被引入动物体内时，温度是或约37℃。
液体可以是本领域熟练技术人员已知的任何适合给药病人的液体(参见，例如Oxford Textbook of Surgery，Morris and Malt，Eds.，Oxford UniversityPress(1994))。通常，液体是水溶液。溶液的实例包括磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，柠檬酸盐溶液，和威斯康星大学(University of Wisconsin)(UW)溶液(Oxford Textbook of Surgery，Morris and Malt编，Oxford University Press(1994))。在本发明的一个实施方案中，液体是林格氏液(Ringer′s solution)，例如，乳酸盐林格氏溶液，或任何可输注入病人体内的其它液体。在另一实施方案中，液体包括血液，例如全血。
任何适合的液体可通过气体扩散器饱和到给定的CO浓度。可选地，可用经质量控制含有给定水平的CO的预制溶液。可通过使用带有与CO分析仪连接的透气但不透液的膜的仪器对剂量进行精确控制。可将溶液饱和到所需有效浓度并保持在这些浓度。
用CO组合物治疗病人和血管
本发明涉及在病人进行血管成形术，移植手术，血管手术，或者任何其它导致/增加病人的内膜增生，血管再狭窄和/或动脉硬化危险的手术之前，其间或以后将CO组合物给药病人和/或其脉管系统的一部分。可以通过本领域已知给药病人气体和/或液体的任何方法，用气体和/或液体CO组合物来系统性治疗病人，所述方法例如通过吸入气体和静脉或动脉内给药液体。通过系统治疗，病人脉管系统的基本上全部都可用CO治疗。病人脉管系统的一部分例如特定的静脉或动脉可通过直接将气体或液体CO组合物给药静脉或动脉进行治疗。本发明不限于对病人和/或其部分脉管系统给药CO组合物的任何特定模式，以下详述了各种治疗。
系统地递送气体CO
气体CO组合物可系统地递送给病人，例如患有或易患内膜增生(例如血管再狭窄和/或动脉硬化)的病人。气体CO组合物通常通过嘴或鼻道吸入肺内给药，在肺内CO很容易吸收到病人的血流内。治疗性气体组合物中所用活性化合物(CO)的浓度有赖于CO的吸收，分布，灭活和排出(通常通过呼吸)速率以及本领域熟练技术人员已知的其它因素。还应理解，对于任何具体受试者而言，具体的剂量方案应根据个体需要和管理或监督组合物给药者的职业经验随时间进行调整，而且前述的浓度范围只是示例性的，而不是为限制所要求的组合物的范围或实践。本发明还涉及急性，亚急性和慢性给药CO。CO可在足以治疗病情并显示所需药理学或生物学效应的一段时间内递送给病人(包括不定地给药)。
以下是一些可用于对病人给药气体CO组合物的方法和器械的实例。
呼吸机(ventilator)
可购买医用级CO(可有多种浓度)，所述CO与空气或其它含有氧气的气体混合于压缩气体标准罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述气体为非活性(non-reactive)的，而本发明方法所需浓度远远低于可燃范围(空气中10％)。在医院中，推定要将气体递送到床边，在那里使之与氧气或室内空气在混合器(blender)内混合，达到所需的ppm浓度。病人通过呼吸机吸入气体混合物，呼吸机的流率根据病人的舒适程度和需要设定。通过肺图(即呼吸速率，潮气量等)可确定该流率。可将防止病人不必要地接受超过所需量的一氧化碳的自动防故障机制(fail-safe mechamism)设计在递送系统中。病人的CO水平可通过研究以下指标进行监测：(1)静脉血中可测的碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin)(COHb)，和，(2)从呼吸机侧部收集的呼出CO。可根据病人的健康状况和标志物调节CO暴露。如果有必要，还可通过吸入100％的氧气洗出CO。CO是不被代谢的，因此除很小一部分被转化成CO2，无论吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治疗性递送CO而不导致随后的低氧。
面罩和幕(Tent)
含有CO的气体混合物如上述方法制备，从而允许病人通过面罩或幕被动吸入。吸入浓度可改变，并通过简单地换成吸入100％的O2进行洗涤。在面罩或幕或在其附近监测CO水平，并用自动防故障机制防止吸入过高浓度的CO。
便携式吸入器(Portable inhaler)
压缩CO可被包装入便携式吸入器并吸入经过计量的剂量，例如使得不住院的受体接受间歇性治疗。可将不同浓度的CO包装到容器中。该仪器可简单到只是带有开-关阀和病人可根据标准方案或需要吸入CO的管子并含有稀释CO的小储罐(例如低于5kg)。
静脉内人工肺(Intravenous Artificial Lung)
设计为递送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中气体交换的导管器械)可用于CO递送。该导管植入后，定位于一根大静脉中并可系统性递送所需浓度的CO或将其递送到局部位点。所述递送可以是短时间内递送高浓度CO到血管成形手术位点的局部递送(所述高浓度在血流中迅速稀释)，或者相对较长的时间内暴露于较低浓度的CO。人工肺的实例在例如，Hattler等，Artif.Organs 18(11)：806-812(1994)；和Golob等，ASAIO J.，47(5)：432-437(2001)中描述。本文术语″血管内一氧化碳递送器械″指一种导管器械，例如人工肺(或改良的人工肺)，所述导管能够长期(包括不确定地)定位于血管中并将CO系统地和/或局部地递送给病人。
正常气压小室(Normobaric chamber)
在某些情况下，需要将病人整体暴露于CO。病人须位于充满CO的密闭舱中，该舱内充满的CO的水平不会导致病人有危险，或者该水平造成可接受的危险性但不会对暴露的旁观者造成危险。完成暴露后，用空气(例如，21％O2，79％N2)充满该舱，并使用CO分析仪分析样品，以保证在允许病人离开暴露系统前没有任何CO存留。
系统性递送液体CO组合物
本发明还涉及，可产生用于系统性递送给病人的液体CO组合物，所述递送采用例如静脉内或动脉内输注等方法。例如，液体CO组合物，如CO饱和的林格氏溶液，可以在血管成形手术或移植手术之前，期间和/或以后输注给病人。可选或此外，被CO部分或完全饱和的全(或部分)血可输注入病人。本发明还涉及使用能够递送CO气体或液体剂型的试剂(例如CO释放性胶(CO releasing gum)，乳膏(cream)，软膏剂(ointment)或膜片(patch)。
递送CO到脉管系统的一部分
原位治疗
除系统治疗以外，还可直接将一氧化碳组合物用于病人脉管系统中患有或易患内膜增生和/或动脉硬化的任何部分。通过本领域已知的任何将气体给药病人的脉管系统的方法，可以将气体组合物直接应用于病人脉管系统的一部分，例如受影响的动脉。例如在血管成形术(例如球囊血管成形术)或外科(例如移植)手术之前，期间或以后，可通过类似于上述的静脉内人工肺的器械将CO递送到动脉。另一实施例中，任何进行血管成形手术的器械可经改造，从而在进行血管成形术时通过该器械给药CO到病人的脉管系统。以下详细描述了这种器械。
液体CO组合物也可直接应用于病人脉管系统的一部分。液体CO组合物可通过本领域已知的任何将液体给药病人的脉管系统的方法给药。例如，液体CO组合物可在手术前，期间，和/或以后给药到具体的静脉(例如通过静脉注入)或者动脉(例如通过动脉内注入)。另一实施例中，如上述，血管成形术中的任何器械均可经改造在进行血管成形手术时将液体CO组合物给药静脉或动脉。
体外治疗(ex vivo treatment)
本发明还涉及利用CO组合物防止或减轻移植的脉管系统中的内膜增生和/或动脉硬化，所述移植的脉管系统例如单个血管(静脉或动脉移植物)或者维持与可移植的器官(例如肾，肝，心或肺)的连接的血管。可选或除上述原位暴露外，还可在活体外(ex vivo)将脉管系统暴露于CO组合物。例如，将单个血管或器官及与其相连的脉管系统移植到受体病人以前，可将所述脉管系统暴露于含有一氧化碳的环境，和/或暴露于液体一氧化碳组合物，例如其中溶有一氧化碳的灌注液，保存液或洗涤液。
将脉管系统在活体外暴露于气体CO组合物可在任何适合产生包括适当水平的CO气体的环境的小室(chamber)或区域进行。这样的小室包括，例如温育箱，和用于将器官保存在防腐液中的小室。另一实施例中，适宜的小室是其内部环境只有加入的气体的小室，使得一氧化碳的浓度可建立并保持给定的浓度和纯度，例如密封小室。例如，CO2温育箱可用来将脉管系统暴露于一氧化碳组合物，其中的一氧化碳气体从含有该气体的容器中以连续气流的方式供给。
将脉管系统在活体外暴露于液体CO组合物可在任何小室或空间中进行，只要该小室或空间具有足以使该脉管系统完全或部分浸没在液体CO组合物中的相应容积。脉管系统也可以通过置于任何适宜的容器中而暴露给这样的组合物，并使液体CO组合物“洗过”或流经所述脉管系统，使得所述脉管系统暴露于CO组合物的连续流。另一实施例中，脉管系统可浸没于不包含CO的介质或溶液中，并置于小室中，使得所述介质或溶液可通过暴露于本文所述含有CO的环境而成为CO组合物。另一实施例中，脉管系统可浸没于不包括CO的液体中，而CO可直接“吹入”该液体。
器械
本发明涉及使用一种器械将CO给药到病人的脉管系统，该器械可用于进行血管成形手术并将CO给药病人的脉管系统。可在进行血管成形术时(例如，进行血管成形术之前立刻，其间或以后立刻)通过和/或利用该器械或其上的CO递送涂层给药CO。这样的器械包括用于球囊血管成形术的器械(“球囊血管成形术器械“)，用于激光血管成形术的器械(″激光血管成形术器械″)，和用于动脉粥样斑块切除术的器械(″动脉粥样斑块切除术器械″)，例如，吸出式动脉粥样斑块切除术；定向式动脉粥样斑块切除术；旋转式动脉粥样斑块切除术；和支架。本文的″血管成形术器械″是任何可用来对病人进行血管成形术的器械。
图13A到13D显示了用于在进行血管成形手术时对病人给药CO(例如液体或气体CO组合物)的具有可膨胀部分(例如，球囊)的导管器械的实例。在图13A中，导管1303位于血管1301的狭窄区1302内。可膨胀部分1304为已放气状态。可膨胀部分包括至少一个开口1305，通过该开口可将CO在术中给药血管。可将CO从含有CO的储器(未显示)中提供给可膨胀部分(例如，使可膨胀部分充气)，所述CO例如包含一氧化碳的药物组合物。所述器械可选地由导丝1306引导至目的位点。
图13B中，导管1303带有充气状态的可膨胀部分1304。通过开口1305将CO给药到血管1301。在一个实施方案中，所述可膨胀部分充有CO气体，或者包含CO的混合气体，使得在可膨胀部分1304充气时和/或充气后，足以治疗内膜血管增生的量的CO流出开口1305并递送到血管1301。
图13C显示了导管器械的另一个实施方案，其中导管1303包括至少一个管腔1307，用来在血管成形手术时将CO递送到血管1301。图13D显示了另一实施方案，其中中央管腔(central lumin)1307将CO递送到血管1301的多个位点。含有CO的储器(未显示)可以和管腔1307连接，使得一剂CO可从储器中通过管腔1307给药到血管。
可选或此外，可膨胀部分1304可涂覆CO释放涂层，例如含有CO组合物的水凝胶，使得狭窄区1302通过，例如与可膨胀部分接触而将CO给药到狭窄区1302。
图14A到14B显示了用于将CO给药病人的支架的实例。术语“支架”是本领域已知术语，指通常由金属丝(wire)制成的带网眼的导管(mesh tube)，用于使血管保持开放状态(open position)，例如最近在血管成形术中重构的血管。图14A中显示的支架1402处于塌陷状态。支架包在球囊导管1404以外，在图14A中为放气状态。图14B中显示的支架1402和球囊导管1404处于扩张/充气的状态。球囊导管1404充气时，支架1402扩张，固定在该位置，并形成图14B显示的支撑架(scaffold)，从而使血管处于开放状态。本发明的一个实施方案中，支架1402涂覆CO释放性涂层，例如释放CO的水凝胶，使得足以治疗内膜增生的CO的量在一定的时间内释放到血管中，所述时间例如支架保持原位的时间。
图15显示了具有两个可膨胀部分1504的导管1502。可膨胀部分1504可用来隔离狭窄区1505，使得CO给药到可膨胀部分1504之间的狭窄区1506。导管1502在可膨胀部分1504充气之前插入血管1508中。然后，可膨胀部分1504使用导管1502内部的充气/放气管1510充气。充气状态的可膨胀部分1504堵塞接受治疗的血管区的血流。导管近端的流入管(Intakeducts)1512允许血液流入并经过导管1502到达导管远端流出管(outletducts)1514。这允许在动脉1506的局部位点接受治疗的同时血流持续在动脉1508中流动。可通过给药供应管1516(administering supply tube)将CO引入隔离区。充气的可膨胀部分1504提供了隔离的治疗区，在其中可将适当水平的CO给药血管。此外，纤维探头(fiber probes)(未显示)可固定于导管1502的外套(casing)，通过纤维探头可将该位点暴露于电磁辐射。可以在电磁辐射治疗该位点之前，期间和/或以后给药CO到该位点。
图16显示了能够在进行动脉粥样斑块切除术时将CO给药病人的器械的实例。动脉粥样斑块切除术涉及从血管壁1604切除并去掉斑块1602。导管1606位于动脉1604内。可弯曲的导丝(guide)1608用于使该器械通过治疗区1610。然后将旋转切割刀片(Rotating cutting blades)1612伸出导管1606外。旋转切割刀片1612跟随可弯曲导丝1608并沿斑块1602进行切割。旋转切割刀片1612吸出切除的斑块碎片，使其进入到导管1606的近端。通过导管1606内的给药管1614可将CO引入治疗区。给药管1614可固定于导丝1608。可通过导管1606经过给药管1614远端的至少一个孔1616给药CO。除通过给药管1614给药CO以外，管(duct)1620和1622可置于切割刀片1612的壁内。可通过流出管1620提供一氧化碳。治疗结束时，流入管1622可吸出CO。可在去除斑块之前，期间和/或以后给药CO。
除上所述，熟练医师还应理解任何本领域已知可用于进行血管成形手术的器械可经改造而在使用时将CO给药病人。这种器械的实例见于例如，美国专利6,409,716，5,985,307，6,508,787，5,709,875和6,450,989。此外，熟练医师还应认识到任何这样的器械可涂敷能够释放有效剂量的CO的CO释放剂，例如油，油膏或水凝胶，使得CO在该器械/涂层与血管接触时释放到血管。
血红素加氧酶-1和其它化合物的应用
本文还涉及随同一氧化碳的给药而诱导或表达血红素加氧酶-1(HO-1)。HO-1可通过在病人体内诱导或表达HO-1而供给病人，或者直接给药病人外源性HO-1。本文术语“诱导”指使用细胞本身编码蛋白例如，HO-1的内源性(例如非重组的)基因，造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中上述蛋白的生成增加。
HO-1可通过本领域任何已知的方法在病人体内诱导。例如HO-1的产生可通过氯化血红素(hemin)，铁卟啉，或钴卟啉诱导。各种非血红素(non-heme)制剂包括重金属，细胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，内毒素和热休克也强烈诱导HO-1表达(Otterbein等，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.279：L1029-L1037，2000；Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；和Tenhunen等，J.Lab.Clin.Med.75：410-421，1970)。多种导致氧化压力的制剂和条件可高度诱导HO-1，所述制剂和条件包括过氧化氢，谷胱甘肽耗竭物，UV辐射和氧过多(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；and Keyse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：99-103，1989)。“包含HO-1诱导物的药物组合物”指包括任何能够在病人体内诱导HO-1的试剂的药物组合物，例如任何上述的试剂，例如氯化血红素，铁卟啉，和/或钴卟啉。
通过基因转移可增加细胞中HO-1的表达。本文术语“表达”指通过内源性给予基因(例如重组基因)造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或铁蛋白。HO-1或铁蛋白优选是作为受体的同一物种的(例如人，小鼠，大鼠等)，从而最小化任何免疫反应。可通过组成型启动子(例如巨细胞病毒启动子)或组织特异的启动子(例如用于哺乳动物细胞的乳清(milk whey)启动子或用于肝细胞的白蛋白启动子)驱动表达。编码HO-1或铁蛋白的适宜基因治疗载体(例如逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒(AVV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人类免疫缺陷病毒(HIV)，小鼠极小病毒，乙型肝炎病毒，流感病毒，单纯疱疹病毒-1型，和慢病毒)可通过口服，吸入或注入给药到适宜治疗内膜增生的位点。类似的，编码HO-1或去铁铁蛋白的质粒可作为例如裸露的DNA的形式，位于脂质体中的形式，或位于微颗粒中的形式给药。
此外，外源性HO-1蛋白可通过本领域已知的任何方法直接给药病人。外源性HO-1可直接给药，作为上述在病人体内诱导或表达HO-1的方法的补充或可选方法。所述HO-1蛋白可在脂质体内，和/或作为融合蛋白例如TAT融合蛋白(见例如，Becker-Hapak等，Methods 24：247-256，2001)的形式给药病人。
可选或此外，HO-1的任何代谢产物例如胆红素，胆绿素，铁，和/或铁蛋白可与一氧化碳联合，或者替代一氧化碳对病人给药，以防止或治疗内膜增生。此外，本发明涉及将除了铁蛋白以外的铁结合分子，例如去铁敏(desferoxamine，DFO)，铁右旋糖苷(iron dextran)，和/或去铁铁蛋白，给药病人。在本发明中，还可抑制催化任何这些产物降解的酶(例如胆绿素还原酶)以创造/增强所需的效果。
本发明的方法中也可以使用在给药化合物(例如CO释放性化合物)后，将CO释放到机体的化合物，例如二锰十羰基，三羰基二氯钌(II)二聚体，和二氯甲烷(例如，在400-600mg/kg之间的剂量，例如，约500mg/kg)，也可以使用碳氧血红蛋白以及供给CO的血红蛋白替代物。
可以以任何方式给药病人上述任何物质，例如通过口服，静脉内，或动脉内给药。上述任何化合物可局部和/或系统地给药病人，并且可以联合给药。
以下实施例举例说明了本发明，所述实施例不应理解为从任何方面限制本发明。
实施例1  CO抑制动脉硬化，内膜增生的形成和SMC的增生
动物  雄性(250-350g)棕色挪威大鼠(Brown Norway rats)(RT1n)用作主动脉移植供体，雄性(250-350g)Lewis大鼠(RT11)用作受体。Dawley(400-450g)大鼠用于球囊损伤模型中。成熟雄性C57BL/6，C57/S 129，p21-/-和p53-/-裸鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。mkk3(-/-)裸鼠按Lu等(EMBO.18：1845-1857(1999))所述的方法产生。inos-/-和enos-/-小鼠在University ofPittsburgh喂养。
主动脉移植模型  主动脉移植如Shimizu等(Nat Med.7：738-741(2001))所述进行。简言之，从供体收集3-4cm的降主动脉并植入受体的肾动脉和主动脉分叉处之间。天然腹主动脉的两端均被缝合。
球囊损伤模型  球囊血管成形术如Murakami等(Atherosclerosis 157：361-368(2001))所述进行。简言之，将2Fr.动脉栓子切除术导管(2Fr.arterialembolectomy catheter)(Baxter，Chicago，IL)插入颈总动脉，并通过给球囊充气直到5个大气压5分钟造成损伤。冲洗动脉，并缝合颈外动脉，保证颈总动脉和颈内动脉的血液回流。血管壁的损伤和随后的病理分析是在治疗组是盲组的条件下进行的。
CO暴露  如Otterbein等(Nat Med 6：422-428(2000))所述将CO递送到动物。移植供体和受体如下暴露于CO(250ppm)，在移植前暴露两天，移植后立刻暴露56天。在球囊损伤模型中，大鼠没接受预处理或损伤前暴露于CO(250ppm)一小时。手术后在室温下圈养大鼠两周。
细胞  如Laubach等(Proc Natl Acad Sci USA 92：10688-9(1995))所述分离原代小鼠和大鼠平滑肌细胞(SMC)并进行培养。如Duckers等(Nat Med.7：693-698(2001))所述从HO-1-/-小鼠中分离小鼠SMC。
细胞处理和试剂  鸟苷酸环化酶抑制剂1H(1，2，4)oxadiazolo(4，3-a)喹噁啉(quinoxalin)-1(ODQ；Calbiochem-Novabiochem，San Diego，CA；10-100uM)和p38 MAPK抑制物吡啶咪唑(pyridinyl imidazol)SB203580(Calbiochem；5-20uM)溶于DMSO。cGMP类似物8-溴-cGMP钠盐(8-Br-cGMP；Sigma-Aldlich，St.Louis，MO；10-100uM)和PKG抑制物(10-100μM；AlexisBiochemicals)溶于水。
细胞计数和[3H]胸腺嘧啶掺入  如Peyton等(Blood 99：4443-4448(2002))所述分离大鼠和小鼠SMC并培养。如Petkova等(JBiol.Chem.276：7932-7936(2001))所述进行增生试验。为研究[3H]胸腺嘧啶掺入，使细胞血清饥饿(serum starved)过夜然后用含有5μCi/ml[3H]胸腺嘧啶的10％的血清刺激(New England Nuclear，Boston MA)。[3H]胸腺嘧啶掺入通过闪烁光谱分析测定并表示为平均计数/分钟/孔。
组织形态学分析  分别在56天和14天收集主动脉移植物和颈动脉。固定，包埋血管并全部连续切片(5μ)。每三张切片用苏木精和伊红(H&E)染色用于组织形态学分析。在两种模型中，使用Zeiss显微镜(Axioskop，IowaCity，Iowa)，RT color SPOT(Diagnostic Instrument，Inc.，Saint Joseph，MI)和Windows NT(Compaq Computer)利用Adobe Photoshop version 5.5软件，采用25x的放大率，以1520×1080像素的分辨率取像每张切片的一个或两个图像。利用数字显像软件计算8到10个所取像的面积的相应像素数。采用SPSS软件第10版对每组的24-48个切片进行统计学分析。
免疫染色和细胞群组织形态学分析  移植后56天收获移植物。检测大鼠白细胞群，使用的抗大鼠白细胞共抗原(LCA，CD45；OX-1)(Serotec，HarlanBioproducts，Indianapolis，IN)；CD3(G4.1 8)，CD4(OX-3 5)，CD8(OX-8)，巨噬细胞(CD68，ED-1)，ICAM-1(CD54；1A29)，和II类主要组织相容性(OX-6)均从Becton Dickinson Biosciences，(San Diego，CA)获得。抗-PAI-1mAb自America Diagnostica(Greenwich，CT)获得。从每个移植的主动脉获得8-10个图像，并使用以上详述的方法进行分析。
细胞提取和Western印迹分析  细胞蛋白提取物经电泳(10-12.5％聚丙烯酰胺凝胶)并转移到硝酸纤维素膜上(BioRad，Hercules，CA)。使用兔多克隆抗体(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)检测总的和磷酸化形式的ERK，JNK和p38 MAPK以及ATF-2。抗α肌动蛋白(Sigma；St.Louis，MO)。使用兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)检测p21Cip1。按补充方法中所述检测第一抗体。
统计分析  差异的显著性通过使用方差分析(ANOVA)确定。
一氧化氮(NO)暴露  大鼠暴露于250ppm或500ppm NO 1小时。NO气体(1％，在N2中)与空气在与CO实验中所用仪器相同的暴露仪器中混合。仪器腔内的浓度通过NO分析仪(Interscan)监测。暴露后，如上述进行球囊血管成形术。对照动物暴露于空气。造成球囊损伤的手术对实验大鼠是盲性的。上述步骤的2周后分析颈动脉。
小鼠动脉损伤  解剖与Lindner等(Circ Res.73：792-796(1993))所述的相似，并使用0.018英寸的导丝(Cook，Bloomington，IN)进行，将该导丝通过颈外动脉切开术插入颈总动脉中，旋转360度三次然后取出共连续三次。
cGMP免疫试验  使用EIA(Biomol，Plymouth Meeting，PA)定量cGMP的细胞水平。在存在或不存在CO(250ppm)的条件下温育SMC，并按产品说明分析细胞裂解物的cGMP含量。
细胞计数  细胞按5×103细胞/孔接种并在含有10％FCS，青霉素和庆大霉素(Life Technologies)的高葡萄糖DMEM中培养过夜。使细胞血清饥饿额外48小时(0％血清)并在诱导细胞增生前(10％FCS；Life Technology)暴露于CO(大鼠和小鼠SMC暴露于250ppm的CO)。每天使用Neubauer血球计计数。使用锥虫蓝(trypan blue)评估生存力。
重组腺病毒  重组β-半乳糖甘酶腺病毒自University of Texas SouthwestMedical Center，Dallas，TX获得。表达大鼠HO-1 cDNA的重组HO-1腺病毒在Brouard等(JExp Med.192：1015-1026(2000))中描述。如Brouard等(Id.)所述，感染大鼠SMC使得感染复数(MOI)为每个细胞400空斑形成单位(PFU/细胞)。
流式细胞计数  大鼠主动脉SMC通过胰蛋白酶(0.025％胰蛋白酶/0.01％EDTA)(Life Technology)消化收获，用磷酸盐缓冲的盐水(PBS，pH7.2)和0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich Co)洗涤，并和碘化丙锭(1ug/ml，1h，RT)一起温育。使用安装了Cell Quest软件(Becton Dickinson，Palo Alto，CA)的FACsort评估荧光标记。每种试验重复三次。
组织形态分析  在移植模型中，移植后56天收获移植物。使用10％的福尔马林固定主动脉，并包埋于石蜡中，然后全部连续切片(5μ)。每三张切片的十个样品置于一张载玻片上，总共24到30张。每三张载玻片用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织形态学分析。在球囊损伤模型中，损伤后14天对动物进行安乐死，并收集动脉用于形态学分析。使用PBS和多聚甲醛(2％)灌注大鼠颈动脉并固定在原位。在4℃低聚甲醛(2％)中固定血管2小时，并在4℃的30％蔗糖溶液中低温保护过夜。在2-甲基丁烷中快速冷冻血管并切得7μm的冷冻切片。
对免疫印迹进行第一抗体检测  使用偶联辣根过氧化物酶的抗兔IgG第二抗体(Pierce，Rockford，IL，USA)检测第一抗体。根据产品说明使用增强的化学发光实验(Enhanced ChemiLuminescence assay)(Amersham LifeScience Inc.，Arlington Heights，IL，USA)显示过氧化物酶，并以光射线照片(photoradiographs)(BiomaxTMMS，Eastman Kodak，Rochester，NY)的形式储存。有显示的地方，剥脱该处的膜(62.5mM Tris.HCl pH6.8，2％SDS和100mM β-巯基乙醇，30分钟，50℃)。磷酸化的p38标准化成p38的总量，在同一张膜上检测。
其它试剂(Miscellaneous Reasents)使用兔抗小鼠多克隆抗iNOS和eNOS抗体(Becton Dickinson，Biosciences，San Diego，CA)检测小鼠iNOS和eNOS。
CO抑制移植相关动脉硬化的发展
图1A-1I显示了CO治疗抑制通常与慢性移植排斥相关的内膜增生。图1A-1F是移植56天后各主动脉移植物样品的显微照片。为得到这些数据，将棕色挪威大鼠的主动脉(Brown Norway aortas)移植到棕色挪威大鼠(图1A和1D)，暴露于空气的Lewis大鼠(图1B和IE)，和暴露于CO的Lewis大鼠(250ppm；图1C和1F)。移植56天后收获样品并使用改良的弹性组织-masson三色原(modified elastic tissue-masson trichrome)(elastic；图1A-1C)或苏木精和伊红(H&E；图1D-1E)染色。弹性染色放大50x(图1A-1C)而H&E染色放大200x(图1D-1E)。显示的样品代表每组分析的3-6只动物。图1G-1I是柱图，显示了内膜和中层区相应的平均(±标准偏差)相对面积，是根据从移植到棕色挪威大鼠(Syng.；n＝6)，暴露于空气的Lewis大鼠(Allo.；n＝6)或暴露于CO的Lewis大鼠(250ppm)(Allo.+CO；n＝3)的棕色挪威大鼠主动脉获得的样品计算出的。*P＜0.001对(versus)Allo.+CO。
移植到Lewis大鼠的棕色挪威大鼠主动脉节段产生了动脉硬化损伤，与慢性移植物排斥一致(图1B和IE)。所述损伤出现在移植后20-30天，50-60天时更为明显；所有分析都是在移植后56天进行的。损伤的特征是内膜增生，中层SMC丢失，和外膜白细胞聚集(图1B和IE)。这些特征在受体的血管中没有观察到，而且在同基因移植物中也没有观察到损伤(图1A和1D)。与移植到暴露于空气的受体的主动脉(图1C，IF，1G，1H，和1I)相比，移植到在移植后立刻(且此后持续56天)暴露于CO(250ppm)的受体的主动脉中的内膜增生明显(p＜0.001)受到抑制(比对照降低61.4±2.9％)。
图2A-C是柱图，显示了CO抑制活化白细胞对移植物的浸润。为获得图2A-2C中的结果，对移植56天后的主动脉移植物进行免疫细胞化学分析。棕色挪威大鼠主动脉被移植到棕色挪威大鼠(同基因的)，未处理的Lewis大鼠(同种异体基因)或暴露于CO(250-1000ppm)的Lewis大鼠体内。移植后56天收集样品。图2A显示了移植到棕色挪威受体(同基因)，未处理的Lewis受体(同种异基因)，和暴露于各种浓度的CO(CO 250ppm，CO 500ppm，和CO 750-1000ppm)的Lewis受体中的棕色挪威大鼠主动脉外膜的细胞核平均数±(标准偏差(n＝3-6))(*＝P＜0.001对Allo.)。图2B显示了移植到挪威大鼠受体(Syng.)，未处理的Lewis大鼠受体(Allo.)，和暴露于CO的Lewis大鼠受体(Allo.+CO)中的棕色挪威大鼠主动脉外膜中的CD45(*P＜0.002对Allo.)，CD68(Mφ/ED1；*P＜0.001对Allo.)，MHC II和CD54(ICAM-1)阳性细胞(*P＜0.001对Allo.)的平均数±(标准偏差(n＝6))。图2C显示了移植到棕色挪威大鼠受体(Syng.)，未处理的Lewis受体(Allo.)，和暴露于CO(CO 250ppm)的Lewis受体中的棕色挪威大鼠主动脉外膜中CD3，CD4，和CD8阳性细胞(*P分别小于0.02，0.001，0.096对Allo.)的平均数±(标准偏差(n＝6))。
暴露于CO的受体中白细胞在移植的主动脉中的聚集受到抑制(见图2A-2C)。在同基因移植物中没有观察到白细胞聚集。CO抑制移植物被活化白细胞(CD45+)浸润的能力是剂量依赖性的，升高的CO水平(250-1000ppm)导致白细胞浸润减少；在700-1000ppm的CO中观察到最大效果(52±20％抑制，相对于空气处理的对照图2A)。CO显著抑制以下细胞的聚集：CD45+/CD68+单核细胞/巨噬细胞(M)(65±24％的抑制，相对于空气处理的对照)，CD45+/CD3+T细胞(57±22％的抑制，相对于空气处理的对照)，包括CD4+(″辅助细胞(helper)″)和CD8+(″细胞毒(cytotoxic)″)细胞(图2C)。CO还抑制与M活化相关的前炎性基因(pro-inflammatory genes)的表达，包括主要组织相容抗原II类(MHC II)和细胞内粘附分子1(CD54/ICAM-1)(图2B)。
CO抑制球囊损伤后内膜增生的发展
图3A-3G显示了CO抑制与球囊损伤有关的血管损伤的发展。图3A-3D是球囊血管成形手术14天后分析的免疫细胞化学染色的颈动脉的显微照相(10x放大率)。为获得图3A-3D的数据，球囊损伤前将大鼠暴露于空气(图3A和3C)或CO(1小时；250ppm；图3B和D)。球囊损伤后所有动物均暴露于室内空气。球囊损伤后两周，使用苏木精和伊红(H&E)染色样品。显示了来自室内空气的样品(图3A和3C)和来自CO预处理大鼠的样品(图3B和3D)。图3E，3F，和3G是柱图，显示图3A-3D中分析的样品的内膜和中层区的平均(±标准偏差(n＝8；*P＜0.001对对照))相对面积。
大鼠颈动脉在球囊损伤后14天出现了内膜增生(图3A和3C；以及图3E-3G)。与暴露于空气的对照动物相比(n＝8-10；p＜0.001)，球囊损伤前暴露于CO(250ppm)一小时(然后CO暴露就不再继续)的大鼠体内的内膜增生被抑制了74±8％(图3B和3D以及图3E-3G)。
CO抑制SMC增生
图4A-4F显示了CO阻断SMC增生而且p21Cip1参与CO的体外抗增生效应。图4A是线图，显示了大鼠SMC的增生，所述增生未被转导(○；Medium)，或被Lac.Z(□；LacZ Rec.Ad.)或HO-1(●；HO-1 rec.Ad.)重组腺病毒转导。显示的结果是每组n＝3孔的平均值±标准偏差(*P＜0.001对LacZ和非转导的)。图4B是线图，显示了大鼠SMC在存在或不存在CO(●；1000ppm)的条件下的增生。显示的结果是平均值±标准偏差(n＝3孔每组；P＜0.001对空气，□)。图4C是柱图，显示了从野生型(WT)或HO-1缺陷型(ho-1-/-)小鼠分离的SMC在存在或不存在CO(250ppm)的条件下的增生(n＝6孔/组；#P＜0.006对空气，*P＜0.001)。图4D是Western印迹，显示暴露于CO(250ppm)后小鼠SMC中p21和β-肌动蛋白的表达。图4E是柱图，显示了从野生型(wt)，p21Cip1(p21-/-)或p53(p53-/-)缺陷小鼠中分离的小鼠SMC的增生。灰色柱代表暴露于室内空气的细胞，黑色柱代表暴露于CO(250ppm)的细胞。显示的结果是6个独立实验之一的平均值±标准偏差(n＝3 *P＜0.001对空气)。图4F是柱图，显示p21Cip1的内源性表达在控制小鼠动脉损伤后的内膜增生程度中起关键作用。野生型(C57/B16/S129)或p21-/-小鼠在颈动脉损伤前暴露于室内空气或CO(1小时；250ppm)，然后暴露于室内空气。损伤后两周收获样品并进行分析。以任意单位表示内膜和中层相对面积比值的平均值±标准偏差(n＝4)(*P＜0.001对空气)。
图7A-7B进一步显示CO阻断SMC增生。图7A是处理24小时后标准温育(空气)相对于CO(250ppm)的大鼠主动脉SMC的细胞周期分析。结果代表的是3个独立实验。图7B是线图，显示存在(■；CO，250ppm)或不存在(□；空气)CO 6天的条件下SMC的增生。实验的第3天，使用血清刺激SMC。CO暴露后，在经CO处理的SMC中增生的增加到第6天就停止。结果代表3个独立实验，每个实验重复3次(*P＜0.01对空气)。
图8是柱图，显示CO阻断自野生型(wt)和p53-/-小鼠分离的SMC的增生，但不阻断从p21-/-小鼠分离的SMC的增生。该图表示了[3H]胸腺嘧啶掺入试验的结果，该实验用于评估暴露于空气(灰柱)或CO(250ppm，黑柱)24小时的野生型(wt)，p53-/-和p21-/-小鼠SMC的细胞增生(每分钟计数，cpm)。结果显示为平均值±标准差(n＝3；*P＜0.05对空气)。
图9A-9G显示了CO抑制野生型(C57/B 16/S129)和p21-/-小鼠中与金属丝损伤相关的血管损伤的发展。图9A-9D是金属丝损伤14天后免疫细胞化学染色的颈动脉的显微照相(20x放大率)。金属丝损伤前小鼠暴露于室内空气(图9A和9C)或CO(1小时；250ppm；图9B和9D)。所有动物在损伤后都暴露于室内空气。金属丝损伤后两周，使用苏木精和伊红(H&E)染色样品。显示了野生型(图9A和9B)以及p21-/-(图9C和9D)小鼠的样品。图9E，9F，和9G是柱图，显示了图9A-9D的显微照相中，对应内膜和中层区的平均(±标准偏差(n＝4*P＜0.001对对照))相对面积，且显示了内膜：中层比值。
CO抑制体外SMC增生
体外系统用于评估SMC在存在或不存在CO的条件下的生长，以描绘CO抑制内膜增生的机制。培养基中重新加入血清，使血清饥饿的SMC增生(图7B)；不暴露于血清的对照SMC在实验的5天中显示最小程度的增生。HO-1重组腺病毒的表达或者暴露于CO抑制SMC的增生(图4A和4B)。在类似的系统中，血红蛋白“清除”CO可抑制HO-1的抗增生效应，表明很可能HO-1所产生的CO造成HO-1的抗增生效应。细胞周期分析显示CO处理的SMC聚集在G0/G1期(图7A)。暴露于血清后，缺乏HO-1的小鼠(ho-1-/-)在暴露于血清时，SMC增生比野生型小鼠的SMC增生更快(图4C)，表明暴露于血清的SMC中内源性HO-1的表达抑制平滑肌细胞的增生。CO显著抑制ho-1-/-小鼠SMC的增生，表明CO在很大程度上导致了HO-1的抗增生作用。通过锥虫蓝和碘化丙锭排除分析估计发现，抑制SMC增生和细胞死亡没有关系。CO的抗增生效应是可逆的，停止CO暴露则允许SMC再次开始增生(图7B)。
CO的体外抗增生效应有赖于p21 Cip1
暴露于CO的SMC上调p21Cip1蛋白的表达(图4D)，这与过度表达HO-1的SMC类似。该效应是暂时性的，CO暴露4小时后p21Cip1的表达显著增加，16小时达最高，24小时后又回到基础水平(图4D)。p21Cip1缺陷小鼠(p21-/-)SMC的增生不被CO抑制(图4E)，表明p21Cip1表达是CO抗增生效应所需的。尽管已确定p53在调节p21Cip1表达中的作用，CO诱导p21Cip1表达和抑制p53-/-或野生型小鼠的SMC的增生的程度相似(图4E和图8)。因此，CO的体外抗增生效应有赖于p21Cip1的表达，而与p53无关。
p21 Cip1 参与CO的体内抗增生效应
p21Cip1在血管壁损伤后表达，很可能起调节SMC增生和发展内膜增生的作用。调查了小鼠动脉损伤后内源性p21Cip1表达对内膜增生发展起的作用。在空气处理的p21-/-小鼠中观察到的内膜增生比野生型小鼠显著三倍(n＝4；314±41.8％，p＜0.001)，表明p21Cip1的内源性表达对控制小鼠动脉损伤后的内膜增生程度起关键作用(图4F)。相反，CO(250ppm)预处理一小时抑制野生型(C57/S129)和p21-/-C57/S 129)小鼠的内膜增生分别达80.9±7.2％(n＝4，p＜0.001)和86.2±14％(n＝4，p＜0.001)，相对于空气处理的对照(图4F；图9A-9G)。因此，在该体内小鼠模型中，CO通过不依赖p21Cip1表达的机制抑制内膜增生。
CO的抗增生效应需要鸟苷酸环化酶的活化和cGMP的产生，并通过 p38MAPK的活化显示该作用
图5A-5G显示CO通过产生cGMP和活化p38 MAPK阻断SMC的增生。图5A是柱图，显示了暴露于空气或CO(250ppm，8h或16h)的小鼠SMC中细胞性cGMP的含量的平均值(±标准偏差(n＝3))。图5B是柱图，显示了[3H]胸腺嘧啶掺入试验的结果，该实验用于评估存在或不存在鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ的条件下暴露于CO的小鼠SMC的细胞增生(每分钟计数；cpm)。显示的结果是平均值±标准偏差(n＝3；*P＜0.05对空气和CO/ODQ)。图5C是暴露于cGMP类似物8Br-cGMP的p21Cip1小鼠SMC的Western印迹。然后探测膜的β-肌动蛋白以保证相等的加样量。显示的结果代表3个独立的实验。图5D是柱图，显示从野生型(wt)和p21Cip1缺陷小鼠(P21-/-)分离的SMC在存在或不存在cGMP类似物8Br-cGMP的条件下，[3H]胸腺嘧啶的掺入。结果显示为平均值±标准偏差(n＝4；*P＜0.05对空气和8Br-cGMP)。图5E是暴露于CO(250ppm)的磷酸化p38 MAPK(p-p38)，ATF-2(p-ATF-2)，JNK(p-JNK)和ERK(p-ERK)的Western印迹组图。膜随后用抗总p38MAPK，ATF-2，JNK和ERK的抗体探测，以确保等量加样。这些印迹代表三个独立的实验。图5F是柱图，显示存在或不存在p38 MAPK抑制物SB203580的条件下，暴露于CO(250ppm)的小鼠SMC中的[3H]胸腺嘧啶掺入。结果显示为4个独立实验的平均值±标准偏差(p＜0.005；对空气和CO/SB处理的细胞)。图5G是存在或不存在作为载体(vehicle)的p38 MAPK抑制物SB203580或DMSO的条件下，暴露于CO(250ppm)的小鼠SMC中的p21Cip1的Western印迹组图。用β-肌动蛋白抗体探测同一膜以保证相等的加样量。显示的结果代表3个独立的实验。
图6A-6B显示CO通过需要cGMP生成的机制活化p38 MAPK。图6A是暴露于cGMP类似物8Brc-GMP的小鼠SMC的磷酸化p38 MAPK的Western印迹组图。然后用总p38的抗体探测膜以保证加样量相等。图6A的印迹组图代表三个独立的实验。图6B是柱图，显示存在或不存在cGMP类似物8BrcGMP的条件下暴露于CO(250ppm)的小鼠SMC的[3H]胸腺嘧啶掺入。结果显示为4个独立实验的平均值±标准偏差。
图10是柱图，显示CO不抑制p21-/-小鼠SMC的增生。柱图代表[3H]胸腺嘧啶掺入实验的结果，该实验用来评估存在和不存在p38 MAPK抑制物SB203580(SB)的条件下，使用CO(250ppm)处理的p21-/-小鼠的SMC中的细胞增生(每分钟计数；cpm)。
将SMC暴露于CO可增加细胞内cGMP水平(图5A)。CO抑制SMC增生和上调p21Cip1表达的能力在1H(1，2，4)Oxadiazolo(4，3-a)喹噁啉-1(ODQ)抑制鸟苷酸环化酶活性的情形下被削弱(图5B)。不可降解的cGMP类似物8-溴鸟苷3′-5′-环化单磷酸钠盐(8Br-cGMP)抑制SMC增生(图5D)和增加p21Cip1表达(图5C)的水平与CO相当。8Br-cGMP对增生的抑制在来自P21-/-小鼠的SMC中被削弱(Fig.5D)。因此可见CO的抗增生效应通过鸟苷酸环化酶的活化，cGMP的聚积和p21Cip1的表达/活化来介导。cGMP依赖型激酶(PKGα和β)的活化似乎是CO抑制SMC增生所需的，因为PKG的抑制物能破坏CO的抗增生作用。
研究了SMC中CO的抗增生效应是否涉及p38 MAPK信号传导通路的活化。CO活化SMC中的p38 MAPK(图5E)，CO对内皮细胞和单核细胞/巨噬细胞也有同样的作用。p38 MAPK磷酸化/活化在暴露于CO后4小时达高峰，然后又回到基线水平(图5E)。将SMC暴露于CO也和ATF-2的活化相关，ATF-2是一种转录因子，它最常通过p38 MAPK信号转导通路被激活(图5E)。p38α和β同I型的选择性抑制剂吡啶基咪唑SB203580抑制p38MAPK的活化，阻断CO上调p21Cip1表达的能力(图5G)并抑制CO的抗增生效应(图5F)。此外，CO不抑制从有丝分裂原活化型蛋白激酶激酶3(mkk3-/-)缺陷的小鼠中分离的细胞的增生，所述激酶是活化p38α和p38β的上游激酶。SB203580不调控CO对p21-/-小鼠SMC的增生的效应(图10)。这些数据表明，p38 MAPK活化对CO导致的上调p21Cip1和CO抑制SMC的增生很重要。CO不调节细胞外调控型激酶1和2(ERK-1和-2)的活化(图5E)，表明该信号转导通路不涉及CO的抗增生效应。CO诱导iun-活化型激酶1和2(JNK-1和-2)的活化(图5E)。
由于CO诱导SMC中cGMP的生成(图5A)和p38 MAPK的活化(图5E)，研究了这两种信号转导通路的相互关系。当cGMP的产生被ODQ阻断时，CO对p38 MAPK的活化被破坏。将SMC暴露于8Br-cGMP可活化p38MAPK(图6A)，8Br-cGMP的抗增生效应在SB203580存在时被破坏(图6B)。与这些发现一致，8Br-cGMP上调p21Cip1的能力被SB203580抑制。
CO的抗增生效应不需要表达一氧化氮合酶
图11A-11B显示了NO不参与CO的抗增生效应。图11A是柱图，显示了存在或不存在CO(250ppm)的条件下小鼠SMC中[3H]胸腺嘧啶的掺入，所述SMC从野生型(wt)和enos-/-以及inos-/-缺陷的小鼠分离。结果显示为平均值±标准偏差(n＝6-8，*P＜0.001对wt)。图11B是柱图，显示了颈动脉球囊损伤前，来自暴露于室内空气(白柱)或NO(黑柱；1小时；250ppm)的Sprague-Dawley大鼠的颈动脉的平均中层和内膜面积。所有的动物在损伤后均暴露于室内空气。损伤后两周，取出颈动脉并切片，使用苏木精和伊红(H&E)染色。计算相应于内膜和中层区的面积。结果是每个处理组3只大鼠的40张代表性切片的平均值±标准偏差。
暴露于CO(250或10,000ppm)不同时间长短的SMC经过Western印迹没有显示诱导NOS同工型。与来自野生型小鼠的SMC相比，来自缺乏一氧化氮合酶(eNOS/NOS-3；nos-3-/-)的组成性/内皮细胞同工型或者诱导型同工型(iNOS/NOS-2；nos-2-/-)的小鼠的SMC暴露于血清时对胸腺嘧啶的吸收显著增加(图11A)。暴露于CO显著抑制了来自野生型，nos-2-/-或nos-3-/-小鼠的SMC的增生(分别抑制51±12.9％和51±25％和54+11％；p＜0.001对经空气处理的对照)(图11A)。这些数据表明，CO的抗增生效应可在不存在iNOS或eNOS的条件下出现。类似地，在与用于CO类似的条件下(250ppm；1小时预处理)，NO不调节球囊损伤诱导的内膜增厚。给药500ppm NO会致死。
CO不抑制SMC中的纤维蛋白溶酶原激活物抑制物1型(PAI-1)
图12A，12B和12C显示，CO增加PAI-1蛋白的表达水平。图12A是使用或未使用CO(250ppm)处理24或48小时的SMC中PAI-1的Western印迹分析的组图。使用或未使用内毒素(LPS)处理的大鼠肝匀浆的全细胞裂解物作为对照。α-肌动蛋白用来测定蛋白负荷。图12B是56天以后，未移植的(对照)，移植的(Allo.+Air)，以及CO处理的移植的(Allo.+CO)主动脉中PAI-1的Western印迹分析的组图。图12C是用于产生图12B的Western印迹的考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶，显示了每个泳道上加的蛋白量相同。
CO抑制M中PAI-1的表达，这是CO预防小鼠肺缺血灌注伤的保护作用的关键。Western印迹显示将SMC暴露于血清不改变PAI-1的表达(图12A)。CO治疗稍增加PAI-1蛋白，表明CO的抗增生效应与PAI-1的下调无关。类似地，免疫组织学和Western印迹检测发现，经过CO处理的移植的同种异体基因主动脉中PAI-1蛋白的表达和没有CO时移植的同种异体基因主动脉中PAI-1蛋白的表达类似(图12B)。这表明，CO调节与慢性移植排斥相关的血管损伤的能力可能直接和PAI-1的表达有关。
CO在大多数细胞类型中可通过血红素加氧酶家族的酶分解血红素这一生理过程产生。诱导型酶HO-1的表达是对损伤的保护性反应，可限制与炎性反应相关的有害效应。HO-1的保护效应是广泛的，包括抑制动脉粥样硬化形成和内膜增生，并可在多种情形下被CO模仿。目前的研究表明CO具有直接的血管保护特性。持续暴露于低浓度的CO(250ppm)可抑制内膜增生的发展和与抑制物动脉硬化(图1A-1I)相关的由活化白细胞造成的移植物浸润(图1A-1I和2A-2C)。损伤前暴露于CO(250ppm)仅1小时就可抑制大鼠与颈动脉血管成形术损伤相关的内膜增生(图3A-3G)。
SMC中HO-1的抗增生效应的生理学可能性(relevance)最早是在肺上皮细胞中描述的，HO-1缺陷小鼠的SMC在体外和体内比野生型SMC的增生更快支持了该可能性。现有的数据证明CO抑制SMC增生的方式和HO-1类似。
cGMP的产生和p21Cip1的表达对与CO的效应是必要的，并且它们是相关的。CO上调p21Cip1表达和抑制SMC增生的能力有赖于鸟苷酸环化酶的活化(图5A-5G)。CO上调p21Cip1(图4A-4F)和CO的抗增生能力有赖于p21Cip1的表达，而该效应在p21Cip1-/-SMC中不显示(图6A-6B)。8Br-cGMP抑制SMC增生的能力在来自p21Cip1缺陷小鼠的SMC中受到损害(图5A-5G)，表明cGMP在体外通过上调p21Cip1抑制SMC的增生。
cGMP和p38 MAPK对CO的效应的各自贡献似乎是细胞类型特异的。现有数据证实SMC中CO的抗增生效应与两种信号转导通路均无关(图5A-5G)。CO需要cGMP来活化p38 MAPK，这对于CO上调p21Cip1和抑制SMC增生是必需的。据称CO和NO一样，通过cGMP和cGMP依赖型蛋白激酶的活化来活化p38 MAPK，这与对PKGα和/或β的抑制可抑制CO的抗增生效应一致。现有的数据提示CO的抗增生效应与NO相差甚远，并没有依赖关系。应注意在暴露于HO-1或CO的细胞中没有报道cGMP，p38MAPK和p21Cip1的联系。
SMC通过血管损伤表达p21Cip1，而且SMC中重组腺病毒介导的p21Cip1表达可抑制血管损伤后内膜增生。现有的数据显示了p21Cip1的生理性表达与内膜增生有关：动脉损伤后，p21-/-小鼠的内膜增生比野生型对照组高3倍(图4F)，该数据强有力地支持了CO对SMC内p21Cip1表达的诱导(图5D)对血管损伤后内膜增生的抑制有贡献的观点。
用p21-/-小鼠来评估p21Cip1表达对CO抑制p21-/-小鼠动脉损伤后内膜增生的能力。与空气处理的相应对照组相比，CO预处理一小时足以抑制p21-/-小鼠或野生型小鼠内膜增生的80％(图4F)。这些数据的一种解释是，CO体内抑制新内膜增生的能力与SMC内的p21Cip1无关。在小鼠中，与大鼠不同，存在明显的炎症/血栓形成过程，该过程可能会导致内膜增生。由于CO潜在的抗炎效应，也可能CO通过抑制炎症抑制小鼠体内的内膜增生，这一抑制炎症的过程基本肯定与p21Cip1无关。
由于一些研究中已知单核细胞-巨噬细胞中CO抑制PAI-1以及PAI-1在血管损伤后内膜增生的发病中的重要性，研究了类似的PAI-1抑制是否出现在本系统中。移植后56天没有观察到PAI-1蛋白表达水平的降低(图12B)。
实施例2.在血管成形术和移植手术期间处理病人的方案
以下实施例显示了血管成形术中处理病人的方案和在移植手术期间使用一氧化碳治疗处理供体，器官和/或受体的方案。在移植手术中可使用任何一种或几种以下方法。
血管成形术
对病人进行血管成形手术以前，其间和/或以后可将CO系统地或局部地给予病人。给药的剂量可以从10ppm到1000ppm(例如，约100ppm到约800ppm，约150ppm-约600ppm(例如，约150ppm)，或约200ppm-约500ppm(例如，约250ppm-约500ppm))。例如，可将CO间断或连续给药病人，在手术进行前0-20天开始，例如，至少在手术前约30分钟开始，例如，约1，2，3，5，7，或10小时，或约1，2，4，6，8，10，12，14，18，或20天，或大于20天开始。可选或此外，可将CO在手术期间给予病人，例如通过实施血管成形术的器械或通过吸入来给药。可选或此外，可将CO在术后给药病人，例如手术完成后立刻，并在手术完成后持续约1，2，3，5，7，或10小时，或约1，2，5，8，10，20，30，50，或60天，或不定期。
移植
供体的处理
收获器官或组织前，可使用吸入的一氧化碳(250ppm)处理供体一小时。处理的给药可从10ppm-1000ppm，时间从一小时到六小时，或者从开始可能处理脑死亡(尸体)供体到器官被取出的时间的整个阶段。宣布脑死亡后应尽快进行处理。在一些应用中，需要在脑死亡前进行处理。
对于非人动物(例如猪)用作异种移植供体的情况，如需要可用相对高水平的吸入的一氧化碳处理活动物，只要由此产生的碳氧血红蛋白不损害待移植器官的生存力和功能。例如，可使用大于500ppm(例如，1000ppm或更高，甚至达10,000ppm，特别是短时间使用)的浓度。
器官的原位处理
从供体收获器官前，可以在该器官仍在供体体内时将该器官内充满不含红细胞的溶液，例如缓冲液或介质。目的是使用用CO饱和溶液冲洗该器官，并保持在一氧化碳的环境中，使得一氧化碳的含量保持饱和。冲洗可进行至少10分钟，例如1小时，几小时或更长。较理想的是，该溶液将可能的最高浓度的一氧化碳到递送器官的血管。
器官或组织的处理
器官或组织从供体取出后到移植给受体以前，可保存在包含一氧化碳的介质中。这可通过将器官或组织保存在含有CO的介质中进行，或者通过灌注这种介质进行。由于这种情况出现在活体外而不是动物体内，可使用非常高浓度的CO气体(例如，10,000ppm)使该介质被CO饱和。
受体的处理
可用一氧化碳处理受体。移植手术以前任何一天均可开始处理，例如移植手术当天手术开始前至少一小时。可选地，可以于再灌注受体器官前30分钟开始。可持续至少30分钟，例如一小时。可将10ppm到3000ppm的一氧化碳剂量递送不同时间，例如分钟或小时，并可在移植当天和移植后给药。例如，受体可在三次连续10秒的呼吸中吸入例如3000ppm浓度的一氧化碳。可选地，受体可在延长的时间里吸入例如200ppm，例如20天。碳氧血红蛋白浓度可指导对病人的适宜一氧化碳给药。通常，受体的处理不应导致碳氧血红蛋白水平升高到被认为可能给需要移植的病人造成危险的程度。
本文描述了本发明的一些实施方案。然而应理解可进行各种修饰而不偏离本发明的精神和范围。相应地，其它实施方案也在以下的权利要求的范围内。

Claims (49)

1.在病人体内进行血管成形术的方法，所述方法包括：
(a)对病人进行血管成形术；且
(b)在(a)之前，期间或以后给予病人一种药物组合物，所述组合物包含有效治疗病人内膜增生的量的一氧化碳。
2.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括球囊血管成形术。
3.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括激光血管成形术。
4.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括定向式动脉粥样斑块切除术。
5.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括旋转式动脉粥样斑块切除术。
6.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括吸出式动脉粥样斑块切除术。
7.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括支架手术。
8.权利要求1的方法，其中所述血管成形术包括球囊血管成形术和支架手术。
9.治疗病人血管再狭窄的方法，所述方法包括：
(a)提供含有加压气体的容器，所述加压气体包含一氧化碳气体；
(b)鉴定患有或者易患血管再狭窄的病人；
(c)释放所述容器内的加压气体，形成含有一氧化碳气体的环境；和
(d)将病人暴露于所述环境，该环境中一氧化碳的量足以治疗病人的血管再狭窄。
10.一种包含医用级别的压缩一氧化碳气体的容器，所述容器带有标签，其表明该气体可用于减轻病人的血管再狭窄。
11.权利要求10的容器，其中的一氧化碳气体与含有氧气的气体混合。
12.权利要求11的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.025％。
13.权利要求11的容器，其中混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.05％。
14.权利要求11的容器，其中混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.10％。
15.权利要求11的容器，其中混合物中一氧化碳气体的浓度至少约1.0％。
16.权利要求11的容器，其中混合物中一氧化碳气体的浓度至少约2.0％。
17.一种包含医用级别的压缩一氧化碳气体的容器，所述容器带有标签，其表明该气体可用于减轻病人的动脉硬化。
18.权利要求17的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.025％。
19.权利要求17的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.05％。
20.权利要求17的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.10％。
21.权利要求17的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约1.0％。
22.权利要求17的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约2.0％。
23.一种包含医用级别的压缩一氧化碳气体的容器，所述容器带有标签，其表明该气体可和血管成形术联合用于病人。
24.权利要求23的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.025％。
25.权利要求23的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.05％。
26.权利要求23的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约0.10％。
27.权利要求23的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约1.0％。
28.权利要求23的容器，其中的混合物中一氧化碳气体的浓度至少约2.0％。
29.治疗病人的血管再狭窄的方法，包括：
(a)鉴定患有或者易患血管再狭窄的病人；和
(b)给予病人一种药物组合物，所述药物组合物包含可有效治疗病人的血管再狭窄的量的一氧化碳。
30.权利要求29的方法，其中血管再狭窄由球囊血管成形术造成。
31.权利要求29的方法，其中血管再狭窄由激光血管成形术造成。
32.权利要求29的方法，其中血管再狭窄由定向式动脉粥样斑块切除术造成。
33.权利要求29的方法，其中血管再狭窄由旋转式动脉粥样斑块切除术造成。
34.权利要求29的方法，其中血管再狭窄由吸出式动脉粥样斑块切除术造成。
35.权利要求29的方法，其中血管再狭窄由支架手术造成。
36.治疗病人内膜增生的方法，包括：
(a)鉴定患有或者易患内膜增生的病人，所述内膜增生并非由移植手术造成的内膜增生；和
(b)给予病人一种药物组合物，所述药物组合物包含可有效治疗病人的内膜增生的量的一氧化碳。
37.权利要求36的方法，其中内膜增生由球囊血管成形术造成。
38.权利要求36的方法，其中内膜增生由激光血管成形术造成。
39.权利要求36的方法，其中内膜增生由定向式动脉粥样斑块切除术造成。
40.权利要求36的方法，其中内膜增生由旋转式动脉粥样斑块切除术造成。
41.权利要求36的方法，其中内膜增生由吸出式动脉粥样斑块切除术造成。
42.权利要求36的方法，其中内膜增生由支架手术造成。
43.对病人进行血管成形术的方法，所述方法包括：
(a)提供能够将一氧化碳给予病人的血管成形术器械；
(b)将该器械定位在需要进行血管成形术的血管；
(c)使用该器械进行血管成形术；和
(d)在(c)之前，期间或以后，使用该器械将足以治疗内膜增生的量的一氧化碳给予所述血管。
44.一种试剂盒，包括：
(a)血管成形术器械；和
(b)含有一氧化碳组合物的容器。
45.权利要求44的试剂盒，其中血管成形术器械能够将一氧化碳给予病人。
46.权利要求44的试剂盒，进一步包含：
(c)在对病人进行血管成形术的方法中使用一氧化碳组合物的说明。
47.权利要求44的试剂盒，其中的一氧化碳组合物是液体组合物。
48.权利要求44的试剂盒，其中一氧化碳组合物是气体组合物。
49.一种血管成形术器械，包括：
包含多个开口的可膨胀的部分；和
包含一氧化碳气体的储器，它与可膨胀部分相连接，在该可膨胀部分膨胀时将气体供给该可膨胀部分。
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