CN1658889A - 治疗肠梗阻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗患者的肠梗阻的方法，包括将包含一氧化碳的药物组合物给药患者。

Description

治疗肠梗阻的方法
相关申请的参考
本发明要求2002年4月15日提交的美国临时申请60/372,652的优先权，其全文内容包含在本文中作为参考。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府的支持下进行的，美国国立卫生研究院(NIH)许可号为HL55330，HL60234，GM58241，GM53789和AI42365。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及治疗胃肠道疾病。
背景技术
一氧化碳(CO)气体在高浓度时是有毒的。然而，现在认识到它是一种重要的信号分子(Verma等，Science259：381-384，1993)。已有提示表明一氧化碳作为脑内的神经元信使分子(Id.)和下丘脑内的神经内分泌调节因子起作用(Pozzoli等.，Endocrinology 735：2314-2317，1994)。和一氧化氮(NO)一样，一氧化碳是平滑肌的松弛剂(Utz等，Biochem Pharmacol.47：195-201，1991；Christodoulides等，Circulation 97：2306-9，1995)并且抑制血小板的聚集(Mansouri等，Thromb Haemost.48：286-8，1982)。在一些模型中，吸入低水平的一氧化碳显示具有抗炎效果。
肠梗阻(ileus)是一种特征为缺乏肠运动性的疾病，并且是肠阻塞(obstruction)的一种更常见的形式(见，例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。通常，肠梗阻见于整个肠道(例如大肠和小肠)，但有时只涉及肠道的一个或多个节段。腹部手术过程中的肠操作经常导致肠梗阻。
已经提出了多种治疗肠梗阻的药物方法(见例如，美国专利5,362,756(非多托嗪(fedotozine))；5,929,035(神经肽)；6,214,843(pyrazolopyridine)；和5,958,407(例如拮抗型蛋白酶活化的受体-2))。
发明内容
本发明部分基于这样的发现：给药CO可减轻肠梗阻。
相应地，一方面本发明涉及治疗患者的肠梗阻的方法，所述方法包括鉴定患有或可能患肠梗阻的患者，以及给药该患者包含有效量或浓度的一氧化碳的药物组合物。
肠梗阻可以是胃肠道任何部分的肠梗阻，例如胃，小肠和/或结肠。肠梗阻可以由任何导致肠梗阻的因素引起，例如腹部手术如移植手术(例如小肠移植(SITx))或除移植手术以外的腹部手术(即涉及剖腹术和不涉及剖腹术的腹部手术，例如腹腔镜手术)，矫形手术(例如髋部手术)；分娩；肠缺血；腹膜后血肿，腹腔内脓毒症；腹膜内炎症，例如急性阑尾炎，胆囊炎(choecystitis)，胰腺炎；脊柱骨折；输尿管绞痛；胸部损伤；基底肺炎(basalpneumonia)；肋骨骨折；心肌梗死；代谢障碍；或者这些疾病的任何组合。
药物组合物可通过本领域已知的任何将气体，液体和/或固体给药患者的方法给药患者，例如通过吸入，吹入，输注，注射，和/或摄取。例如，在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物通过吸入给药患者。在另一实施方案中，所述药物组合物通过口服给药患者。在另一实施方案中，将所述药物组合物直接给药患者的腹腔。
所述方法还可包括给药所述患者除CO以外的以下治疗中的至少一种：在患者体内诱导HO-1或铁蛋白；在患者体内表达重组HO-1或铁蛋白；以及将包含HO-1，胆红素，胆绿素，铁蛋白，去铁敏(desferoxamine)，铁葡聚糖，或去铁铁蛋白的药物组合物给药该患者。
本发明另一方面涉及治疗患者的手术后肠梗阻的方法。所述方法包括：鉴定患有术后肠梗阻的患者，并将包含治疗患者肠梗阻有效量的一氧化碳的药物组合物给药该患者。所述肠梗阻可以是胃肠道的任何一部分，例如，胃，小肠，和/或大肠(例如结肠)的肠梗阻。所述药物组合物可通过本文所述的任何途径给药患者，例如通过吸入(气体组合物)；口服；和/或直接给药至患者的腹腔。
本发明还涉及治疗患者的肠梗阻的方法，所述患者患有或可能患不是由腹部手术造成的肠梗阻，例如由本文所述的除腹部手术以外的任何因素造成的肠梗阻。该方法包括鉴定患有或可能患不是由腹部手术造成的肠梗阻的患者，以及给药该患者包含治疗患者肠梗阻有效量的一氧化碳的药物组合物。
本发明另一方面涉及治疗患者的肠梗阻的方法，其包括以下步骤：提供包含含有一氧化碳气体的加压气体的容器，鉴定患有或可能患肠梗阻的患者，将加压气体从所述容器中释放出来以形成包含一氧化碳气体的环境，以及将所述患者暴露于该环境，所述环境中一氧化碳的量足以治疗患者的肠梗阻。
本发明另一方面涉及对患者进行手术的方法。所述方法包括鉴定需要手术的患者，并且在进行手术之前，期间和/或以后使患者吸入足以治疗患者肠梗阻的量的一氧化碳气体。
所述手术可以是任何导致和/或使患者可能患肠梗阻的手术。例如，所述手术可涉及对例如胃和/或肠，例如小肠或大肠(例如结肠)的胃肠道的操作(例如，接触(直接或间接))，还可以是涉及剖腹术或不涉及剖腹术(例如涉及腹腔镜的手术)的手术。在特定的实施方案中，所述手术可以是移植手术或非移植手术，例如涉及腹部的任何器官或组织的手术，例如泌尿生殖系统(例如肾，输尿管，和/或膀胱；和生殖器官(例如子宫，卵巢，和/或输卵管))；消化系统(例如，胃，小肠，大肠(例如结肠)，阑尾，膀胱，肝，脾，和/或胰腺)；淋巴系统；呼吸系统(例如肺)；膈；治疗腹腔内任何器官或组织的癌症的手术；子宫内膜手术；和矫形手术，例如髋部手术。
另一方面，本发明提供了包含医用级压缩CO气体的容器。所述容器带有表明该气体可用来治疗肠梗阻的标签，例如患者(例如人类患者)体内的手术造成的肠梗阻(例如涉及肠操作的手术)。CO气体可以与氮气混合，与一氧化氮和氮气混合，或者与含氧的气体混合。CO气体在混合物中的浓度可以是至少约0.025％，例如至少约0.05％，0.10％，0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。
本发明另一方面提供了治疗患者的肠梗阻的方法，该方法包括鉴定患有或可能患肠梗阻的患者，以及给予所述患者以下治疗中的任何一种和CO治疗的联合治疗：诱导患者体内的HO-1或铁蛋白；在患者体内表达重组HO-1或铁蛋白；以及将包含HO-1，胆红素，胆绿素，铁蛋白或去铁铁蛋白的药物组合物给药所述患者。还涉及CO以及以上列出的任何一种药剂在制备治疗或预防肠梗阻的药物中的用途。
本发明还涉及CO在制备治疗或预防本文所述的疾病例如肠梗阻的药物中的用途。所述药物也可用在治疗患者的肠梗阻和/或治疗移植手术中的供体，器官，和/或受体的方法中。所述药物可以是本文所述的任何形式，例如液体或气体CO组合物。
除非另有限定，本文的所有技术和科学术语具有的含义和本发明所属领域的熟练技术人员通常所理解的一样。适宜的方法和材料在下文中描述，但与其类似或对等的方法和材料也可用于本发明的实践和检测中。所有公开出版物，专利申请，专利，和其它本文提到的参考文件的全文内容都包含在本文中作为参考。如果有冲突，以本说明书，包括其中的定义在内为准。所述材料，方法和实施例只作为举例，而不是意图作为限制。
本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下说明中详述。本发明的其它特征，目的，和优点从说明书和附图，以及权利要求书中明显可见。
附图说明
图1是线图，显示了小肠移植(SITx)以及CO处理对自发的和氨甲酰甲胆碱刺激的小肠环肌的收缩性的影响。▲＝对照；◇＝对照+CO；X＝SITx；■＝SITx+CO。
图2A是柱图，其显示CO对对照动物(未接受SITx的动物)的肠转运(intestinal transit)的影响。实心柱＝对照；条纹柱＝对照+CO(250ppm)；stom＝胃；sb＝小肠。
图2B是柱图，显示CO对经过SITx的动物的肠转运的影响。实心柱＝对照；条纹柱＝对照+CO(250ppm)；stom＝胃；sb＝小肠；和col＝结肠。
图2C是柱图，显示了CO显著改善经过SITx的大鼠中的肠转运。该图总结了算出的转运几何中心的大小(calculated transit geometric centermeasurement)。对照＝暴露于空气的对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；SITx＝接受SITx并暴露于空气的动物；SITx+CO＝接受SITx并暴露于CO的动物。
图3是柱图，显示SITx之后，CO对白细胞募集到肠肌层的影响。对照＝暴露于空气的对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；SbTx＝接受SITx并暴露于空气的动物；SbTx+CO＝接受SITx并暴露于CO的动物。
图4A是线图，显示SITx之后的各时间点粘膜和肌层中IL-6 mRNA的表达，所述表达是通过RNase保护实验测定的。■＝肌肉；○＝粘膜。
图4B是线图，显示SITx之后的各时间点粘膜和肌层中IL-1βmRNA的表达，所述表达是通过RNase保护实验测定的。■＝肌肉；○＝粘膜。
图5是一组柱图，显示CO对再灌注后四小时的肠移植物肌外层中一氧化氮合酶(iNOS)，IL-6，IL-1β和IL-10的表达的作用，其是通过实时RT-PCR分析测定的。正常＝暴露于空气的对照动物；正常+CO＝暴露于CO的对照动物；SITx＝接受SITx并暴露于空气的动物；SITx+CO＝接受SITx并暴露于CO的动物。
图6是一组柱图，显示再灌注后一小时(SITx+CO(1hr)和四小时(SITx+CO(4hr))，CO对经受SITx的动物的血清中IL-6和硝酸盐/亚硝酸盐浓度的影响。正常＝暴露于空气的对照动物；正常+CO＝暴露于CO的对照动物；SITx(1hr)和SITx(4hr)＝分别是再灌注后一小时和四小时测定的、经受SITx的动物。
图7A是柱图，显示使用实时两步RT-PCR分析测定的肠操作(IM)对肌层提取物中的HO-1表达的影响。在剖腹术后3小时(IM 3h)，6小时(IM 6h)，12小时(IM 12h)，和24小时(IM 24h)分析样品。术后3-6小时出现了峰值HO-1表达。数据代表相对于对照±SEM的平均倍数增长，n＝6。*P＝0.001；**P＝0.0001。
图7B是肌层整体封装(muscularis whole mount)的图，显示IM以后浸润肌层的多形核白细胞中的HO-1样免疫反应性。
图7C是肌层整体封装的图，显示IM以后浸润肌层的巨噬细胞样细胞中的HO-1样免疫反应性。
图7D是肌层整体封装的图，显示IM以后浸润肌层的含颗粒细胞中的HO-1样免疫反应性。
图像下半部分的模糊的免疫荧光位点是焦点平面以下的细胞。
图7E是肌层整体封装的图，显示对照动物的肌层中HO-1样免疫反应性的缺乏。
图8A是柱图，显示吸入的CO(暴露24小时)对没有接受IM的小鼠的肠转运的影响。stom＝胃；sb＝小肠；和col＝结肠。实心柱＝没有暴露于CO的动物；条纹柱＝暴露于CO的动物。大多数荧光信号位于盲肠和近段结肠中。
图8B是柱图，显示吸入的CO(暴露24小时)对接受IM的小鼠的肠转运的影响。stom＝胃；sb＝小肠；和col＝结肠。实心柱＝没有暴露于CO的动物；条纹柱＝暴露于CO的动物。IM以后，转运被明显延迟。吸入CO导致标记的葡聚糖的更远侧的分布(IM-CO)。
图8C是柱图，显示几何中心(Geometric Center)(GC)计算的结果。
数字越高对应标记葡聚糖的更远侧的分布。对照＝对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；IM＝接受IM的动物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的动物。与对照相比，*IM组中的GC显著降低，P＜0.0001；n＝6。+吸入CO(IM+CO)导致与IM相比，GC明显升高，P＝0.001；n＝6。
图9A是代表性的图形(trace)，显示CO对自发收缩活动的影响。对照：未接受手术的小鼠的节律性收缩。对照+CO：对照小鼠吸入一氧化碳(CO)24小时，对自发收缩性没有影响。IM：对小肠进行手术操作后，节律性收缩性消失。IM+CO：接受操作的动物经CO处理后，节律性恢复。
图9B是线图(剂量-反应曲线)，显示CO对没有接受IM的动物的环形平滑肌带(strip)的强直性收缩的强度的影响。所述收缩是通过将所述肌带暴露于浓度渐增的氨甲酰甲胆碱(0.1-300μmol/L)诱导的。对照动物吸入CO对氨甲酰甲胆碱诱导的收缩活性没有影响。■＝对照；▲＝对照+CO。
图9C是线图(剂量-反应曲线)，显示CO对接受IM的动物的环肌带(strip)的强直性收缩的强度的影响。所述收缩是通过将所述肌带暴露于浓度渐增的氨甲酰甲胆碱(0.1-300μmol/L)诱导的。环肌对氨甲酰甲胆碱反应而收缩的能力在IM后明显被削弱。CO的吸入将收缩活性恢复到对照水平(IM+CO)。■＝IM；▲＝IM+CO。
图10是柱图，显示CO的吸入对浸润对照小鼠和肠操作(IM)之后的小鼠的肠肌层的髓过氧化物酶(MPO)阳性白细胞的数目的影响。对照＝对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；IM＝接受IM的动物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的动物。数据表示为平均值±SEM。*P＜0.0001；n＝4。
图11A是柱图，显示手术麻醉和IM对IL-6 mRNA表达的时间过程的影响，用实时两步RT-PCR进行分析的结果。在3小时(IM 3h)，6小时(IM 6h)，12小时(IM 12h)，和24小时(IM 24h)分析样品。表达在术后3和6小时达到峰值。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P＜0.0001。
图11B是柱图，显示CO吸入对术后3小时(IM+CO 3hr)和6小时(IM+CO6hr)的IL-6 mRNA的表达的影响。IM 3hr和IM 6hr＝3小时和6小时的IM对照动物。数据表示为平均值±SEM。
图11C是柱图，显示CO吸入对IL-6蛋白从术后24小时采集的肌层提取物中的释放的影响。IL-6蛋白的释放被CO吸入明显降低。对照＝对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；IM＝接受IM的动物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的动物。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P＜0.0001，且相对于IM+P＝0.001；n＝6。
图12A是柱图，显示手术麻醉和IM对IL-1βmRNA表达的时间过程的影响，用实时两步RT-PCR进行分析的结果。在3小时(IM 3h)，6小时(IM 6h)，12小时(IM 12h)，和24小时(IM 24h)分析样品。表达在术后6小时达到峰值。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。
图12B是柱图，显示CO吸入对术后3小时(IM+CO 3hr)和6小时(IM+CO6hr)的IL-1βmRNA的表达的影响。CO显著抑制峰值IL-1βmRNA表达。IM 3hr和IM 6hr＝3小时和6小时的IM对照动物。数据表示为平均值±SEM。*P＝0.001对IM小时，n＝6。
图12C是柱图，显示CO吸入对IL-1β蛋白从术后24小时采集的肌层提取物中的释放的影响。IL-1β蛋白释放由于CO吸入明显降低。对照＝对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；IM＝接受IM的动物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的动物。数据表示为平均值±SEM。ND＝未检测到。*相对于对照P＝0.0001，相对于IM+P＝0.001；n＝6。
图13A是柱图，显示手术麻醉和IM对iNOS mRNA表达的时间过程的影响，用实时两步RT-PCR进行分析的结果。在3小时(IM 3h)，6小时(IM 6h)，12小时(IM 12h)，和24小时(IM 24h)分析样品。术后6小时出现峰值表达。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。
图13B是柱图，显示CO吸入对术后3小时(IM+CO 3hr)和6小时(IM+CO6hr)的iNOS mRNA的表达的影响。IM 3hr和IM 6hr＝3小时和6小时的IM对照动物。数据表示为平均值±SEM。+P＝0.001对IM 6小时，n＝6。
图13C是柱图，显示CO吸入对总亚硝酸盐从术后24小时采集的肌层提取物中的释放的影响。总亚硝酸盐的释放被认为是iNOS活性的标志。吸入CO明显抑制手术诱导的亚硝酸盐从被操作肌层中的释放的增加。亚硝酸盐的类似降低也可通过在存在选择性iNOS抑制物L-Nil(30μM；IM+L-Nil)的条件下，通过保温肌层提取物实现。对照＝对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；IM＝接受IM的动物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的动物。*相对于对照P＝0.0001，相对于IM+P＝0.001；n＝6。数据表示为平均值±SEM。
图14A是柱图，显示手术麻醉和IM对COX-2 mRNA表达的时间过程的影响，用实时两步RT-PCR进行分析的结果。在3小时(IM 3h)，6小时(IM 6h)，12小时(IM 12h)，和24小时(IM 24h)分析样品。术后3-12小时出现峰值表达。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。
图14B是柱图，显示CO吸入对术后3小时(IM+CO 3hr)和6小时(IM+CO6hr)的COX-2 mRNA的表达的影响。IM 3hr和IM 6hr＝3小时和6小时的IM对照动物。数据表示为平均值±SEM。
图14C是柱图，显示对照动物吸入CO显著增加处理后3小时(CO 3hr)的COX-2 mRNA的表达。CO 6hr＝处理后6小时的表达。数据表示为平均值±SEM。*P＝0.01。
图14D是柱图，显示CO吸入对PGE2蛋白从术后24小时采集的肌层提取物中的释放的影响。PGE2蛋白的释放被认为是COX-2活性的标志。吸入CO明显增加蛋白从对照肌层中的释放，但对手术诱导的PGE2从操作的肌层中的释放增加没有影响。对照＝对照动物；对照+CO＝暴露于CO的对照动物；IM＝接受IM的动物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的动物。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P＝0.01且**P＝0.0001；n＝6。
图15A是柱图，显示手术麻醉和IM对IL-10 mRNA表达的时间过程的影响，用实时两步RT-PCR进行分析的结果。在3(IM 3h)，6(IM 6h)，12(IM12h)，和24(IM 24h)小时分析样品。术后3-6小时出现峰值表达。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P≤0.001，n＝6。
图15B是柱图，显示CO吸入对术后3小时(IM+CO 3hr)和6小时(IM+CO6hr)的IL-10 mRNA的表达的影响。吸入CO增加手术后3小时的IL-10信息(message)，但不增加手术后6小时的IL-10信息。IM 3hr和IM 6hr＝3小时和6小时的IM对照动物。数据表示为平均值±SEM。+p＝0.001相对于IM 3小时；n＝6。
图15C是柱图，显示对照动物吸入CO明显增加处理后3小时(CO 3hr)和6小时(CO 6h)的IL-10 mRNA的表达。数据表示为平均值±SEM。*相对于对照P≤0.001，n＝6。
图16A是柱图，显示在手术(IM)后3小时和6小时，对手术麻醉和IM对HO-1 mRNA表达的时间过程的影响进行实时两步RT-PCR分析的结果。吸入CO明显增加术后3小时(IM+CO 3hr)的HO-1 mRNA的表达，但不增加术后6(IM+CO 6hr)小时的HO-1 mRNA的表达。IM 3hr和IM 6hr＝3小时和6小时的IM对照动物。数据表示为平均值±SEM。+p＜0.001对IM 3hr；n＝6。
图16B是柱图，显示对照动物吸入CO对处理后3小时(CO 3hr)和6小时(CO 6h)的HO-1 mRNA的表达的影响。对照动物吸入CO增加处理后6小时的HO-1 mRNA的表达。*相对于对照P＜0.05，n＝6。
发明详述
本文术语“一氧化碳”(或“CO”)描述了气态的，加压成液态的，或者溶解于水溶液中的分子一氧化碳。本文术语“一氧化碳组合物″或“包含一氧化碳的药物组合物”用于描述可给药患者和/或器官例如小肠的、含有一氧化碳的气体或液体组合物。熟练医师知道在具体应用中，优选何种形式的药物组合物，例如气体，液体，或气体和液体的形式。
本文术语“有效量”和“有效地治疗”指一段时间内(包括急性或慢性给药以及定期的或连续的给药)给药一定量或浓度的一氧化碳，所述量或浓度在其给药用来产生目的效果或生理结果的背景下是有效的。本发明所用有效量的一氧化碳包括例如防止或减轻诸如小肠移植等手术后的肠梗阻的量。
在气体的情况下，有效量的CO通常在约0.0000001％到约0.3％重量之间，例如0.0001％到约0.25％重量，优选CO重量至少约0.001％，例如至少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％。在CO溶液的情况下，有效量通常在约0.0001到约0.0044g CO/100g溶液，例如至少约0.0001，0.0002，0.0004，0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020.0.0021，0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或0.0042g CO/100g水溶液。优选的范围包括，例如约0.0010到约0.0030gCO/100g液体，约0.0015到约0.0026g CO/100g液体，或者约0.0018到约0.0024g CO/100g液体。熟练的医师应理解根据应用的情况可使用这些范围外的量。
本文术语“患者”描述根据本发明提供的方法对其进行治疗的动物，人或非人。本发明明确涉及兽医学应用。该术语包括但不限于哺乳动物，例如人，其它灵长类，猪，啮齿类例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，仓鼠，牛，马，猫，狗，绵羊和山羊。本文术语“治疗”是指延缓病情的发生，抑制，预防或缓解疾病的影响，所述疾病例如肠梗阻。术语“供体”或“供体患者”用于文中指患者(人或非人)，从该患者可以获得器官或组织用于移植到受体患者。术语“受体”或“受体患者”指器官或组织被转移至其中的患者(人或非人)。
本文术语“肠梗阻”通常指胃肠道的部分或完全麻痹或运动障碍。肠梗阻可以出现在整个胃肠道，或者可以只涉及胃肠道的一个或几个部分，例如，胃，小肠或结肠。熟练的医师将理解肠梗阻可以由很多因素造成，包括，例如手术(例如任何涉及剖腹术的手术)，例如小肠移植(SITx)；或者任何涉及腹腔镜的手术)；肠缺血；腹膜后血肿；腹腔内脓毒症；腹膜内炎症；急性阑尾炎；胆囊炎；胰腺炎；输尿管绞痛；胸部损伤；基底肺炎；心肌梗死；代谢障碍，例如导致钾的水平降低的代谢障碍；药物，例如长期使用鸦片制剂；和外伤，例如脊柱和肋骨骨折(见例如Oxford Textbook ofSurgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。该术语还包括产后肠梗阻，其是产后期妇女的常见疾病，例如阴道分娩(“自然分娩”)或手术辅助的分娩以后。本文术语“手术后肠梗阻”指任何手术例如腹部手术以后患者经历的肠梗阻。术语“非手术介入”指不涉及手术的医学治疗。术语“不涉及手术的病情导致的肠梗阻”指由除手术以外的因素例如本文所述的因素导致的肠梗阻。
认为可能出现肠梗阻的个体尤其可从本发明受益，主要是因为在出现任何肠梗阻的证据以前，就可以开始预防性治疗。“可能患”的个体包括，例如需要腹部手术(医学上必要的或可选的)的患者，和/或患有前一段落所述的任何病情或损伤的个体。熟练的医师应理解通过本领域已知的任何方法，可确定患者可能患肠梗阻，例如通过医师的诊断。
本文所用术语“移植”是总称，用于描述将器官或组织(例如小肠)转移到患者体内的过程。术语“移植”在本领域定义为将活体组织或细胞从供体转移到受体，并保持被转移的组织或细胞在受体中的功能完整性(见例如The Merk Manual，Berkow，Fletcher and Beers，Eds.，Merck ResearchLaboratories，Rahway，N.J.，1992)。该术语包括本领域已知的所有种类的移植。移植通过部位以及供体和受体之间的遗传关联分类。该术语包括例如自体移植(autotransplantation)(将病人身体的一个位置的细胞或组织取出并转移到同一病人身体的相同或另一位置)，同种异体移植(allotransplantation)(相同物种成员间的移植)，和异种移植(xenotransplantation)(不同物种成员间的移植)。
制备气体组合物
CO组合物可以是气体一氧化碳组合物。可用于本发明的方法中的压缩气体(compressed gas)或加压气体(pressurized gas)，可自任何商业来源获得，并可位于任何类型的适合保存压缩气体的容器(vessel)中。例如，压缩或加压气体可以自任何提供医用压缩气体例如氧气的来源获得。本文术语“医用级”气体，指适合给药本文所定义的患者的气体。提供用于本发明的方法的加压气体包括一氧化碳时，可使得所需的最终组合物中的所有气体(例如，CO，He，NO，CO2，O2，N2)在同一容器内，除NO和O2不能保存在一起的情况。可选的，本发明的方法可使用多个含有单一气体的容器进行。例如，可提供含或不含其它气体的含一氧化碳的单个容器，其含有的气体可选地与室内空气或其它容器中含有的气体混合，所述其它容器例如含有氧气，氮气，二氧化碳，压缩空气，或任何其它适合的气体或其混合物的容器。
根据本发明给药患者的气体组合物通常含有0％-约79％重量的氮气，约21％-约100％重量的氧气和约0.0000001％-约0.3％重量(相当于约1ppb或0.001ppm-约3,000ppm)的CO。优选气体组合物中氮气量是约79％重量，氧气量是约21％重量且CO量是约0.0001％-约0.25％重量。CO的量优选是至少约0.001％，例如，至少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。CO的优选范围包括约0.005％-约0.24％，约0.01％-约0.22％，约0.015％-约0.20％，和约0.025％-约0.1％重量。注意到根据应用情况，具有大于0.3％(例如1％或更高)的CO浓度的气体CO组合物可短期使用(例如一次或数次呼吸)。
可用气体CO组合物产生包含CO气体的环境(atmosphere)。包含适当水平的CO气体的环境可通过例如以下方式产生：提供含有包含CO气体的加压空气的容器，并将所述加压气体从容器中释放到室或空间内，在该室或空间内形成包括CO气体的环境。可选地，所述气体可被释放到使气体在呼吸面罩或呼吸管内达到最高浓度的一种仪器中，从而在呼吸面罩或呼吸管中创造出包含CO气体的环境，使得患者成为该室内唯一暴露于明显水平的CO的人。
环境中CO的水平可通过本领域已知的任何方法检测或监测。这种方法包括电化学检测，气相色谱，放射性同位素计数，红外吸收，比色法，和基于选择性膜的电化学方法(见例如Sunderman等，Clin.Chem.28：2026-2032，1982；Ingi等，Neuron 16：835-842，1996)。亚百万分数级(sub-parts per million)CO水平可通过例如，气相色谱和放射性同位素计数检测。此外，本领域已知亚-ppm范围内的CO水平可通过中红外气体传感器(midinfrared gas sensor)在生物组织中检测(见例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol 280：H482-H488，2001)。CO传感器和气体检测仪可自多种商业来源获得。
制备液体组合物
包含CO的药物组合物也可以是液体组合物。液体可通过本领域已知的任何使气体溶于液体的方法制成CO组合物。例如，所述液体可以置于所谓的“CO2温育箱”中并暴露于持续的CO气流，优选由二氧化碳平衡，直到液体中CO达到所需的浓度。另一实施例中，CO气体可直接″吹入(bubbled)″液体中，直到液体中CO达到所需的浓度。溶解于给定水溶液中的CO量随温度的降低而增加。在另一实施例中，适宜的液体可流经允许气体进行扩散的管道系统(tubing)，该管道系统在包含CO的环境(例如利用如体外膜氧合器(extracorporeal membrane oxygenator)的仪器)中运行。CO扩散进入液体产生液体CO组合物。
很可能地，这种用于引入活动物体内的液体组合物，当其被引入动物体内时，温度是或约37℃。
液体可以是本领域熟练技术人员已知的任何适合给药患者，或保存和/或洗涤和/或灌注目的器官的液体(参见，例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。通常，所述液体是水溶液。适合的溶液的实例包括磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，柠檬酸盐溶液，和威斯康星大学(University of Wisconsin)(UW)溶液(Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。在本发明的一个实施方案中，液体是林格氏液(Ringer′s solution)，例如，乳酸盐林格氏溶液，或任何可输注入患者体内的其它液体。在另一实施方案中，液体包括血液，例如全血。
任何适合的液体可通过气体扩散器饱和到给定的CO浓度。可选地，可用经质量控制含有给定水平的CO的预制溶液。可通过使用带有与CO分析仪连接的透气但不透液的膜的仪器对剂量进行精确控制。可将溶液饱和到所需有效浓度并保持在这些水平。
用CO组合物治疗患者
可用本领域已知的任何将气体和/或液体给药患者的方法使用一氧化碳组合物治疗患者。一氧化碳组合物可给药诊断为，或者确定可能患肠梗阻的患者，例如手术患者，包括接受了SITx的患者。本发明还涉及将液体或气体一氧化碳系统地给药患者(例如通过吸入和/或摄取)，以及将所述组合物局部地给药患者的胃肠道(例如通过摄取，吹入，和/或导入腹腔)。
系统地递送气体CO
气体CO组合物可系统地递送给患者，例如手术患者或者小肠移植供体和/或受体。气体CO组合物通常通过嘴或鼻道吸入肺内给药，在肺内CO直接显示其作用或者很容易地被吸收到患者的血流内。治疗性气体组合物中所用活性化合物(CO)的浓度有赖于CO的吸收，分布，灭活和排出(通常通过呼吸)速率以及本领域熟练技术人员已知的其它因素。还应理解，对于任何具体受试者而言，具体的剂量方案应根据个体需要和实施或监督组合物给药的人员的职业判断随时间进行调整，而且前述的浓度范围只是示例性的，而不是为限制所要求的组合物的范围或实践。本发明还涉及CO的急性，亚急性和慢性给药，所述给药方式有赖于例如患者肠梗阻的严重性或持续性。CO可在足以治疗病情并显示预期药理学或生物学效应的一段时间内(包括不定时地给药)递送给患者。
以下是一些可用于对患者给药气体CO组合物的方法和器械的实例。
呼吸机(ventilator)
可购买医用级CO(可有多种浓度)，所述CO与空气或其它含有氧气的气体混合于加压气体标准罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述气体为非反应活性(non-reactive)的，而本发明方法所需浓度远远低于可燃范围(空气中10％)。在医院中，推定要将气体递送到床边，在那里使之与氧气或室内空气在混合器(blender)内混合，达到所需的ppm浓度。患者通过呼吸机吸入气体混合物，呼吸机的流率根据患者的舒适程度和需要设定。通过肺图(即呼吸速率，潮气量等)可确定该流率。可将防止患者不必要地接受超过所需量的一氧化碳的自动防故障机制(fail-safe mechamism)设计在递送系统中。患者的CO水平可通过研究以下指标进行监测：(1)静脉血中可测的碳氧血红蛋白(COHb)，和，(2)从呼吸机侧部收集的呼出CO。可根据患者的健康状况和标志物调节CO暴露。如果有必要，还可通过吸入100％的氧气洗出CO。CO是不被代谢的，因此除很小一部分被转化成CO2，无论吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治疗性递送CO而不导致随后的低氧状况。
面罩和幕(Tent)
含有CO的气体混合物如上述方法制备，从而允许患者通过面罩或幕被动吸入。吸入浓度可改变，并通过简单地换成吸入100％的O2进行洗涤。可用自动防故障机制在面罩或幕或在其附近监测CO水平，所述自动防故障机制可防止吸入过高浓度的CO。
便携式吸入器(Portable inhaler)
加压CO可被包装入便携式吸入器并吸入经过计量的剂量，例如使得不住院的受体接受间歇性治疗。可将不同浓度的CO包装到容器中。该仪器可简单到只是带有开-关阀和管子的含有稀释CO的小储罐(例如低于5kg)，从所述管子中，患者可根据标准方案或需要吸入CO。
静脉内人工肺(IntravenouS Artificial Lung)
设计为递送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中气体交换的导管器械)可用于CO递送。该导管植入后，定位于一根大静脉中并可系统性递送所需浓度的CO或将其递送到局部位点。所述递送可以是短时间内递送高浓度CO到手术位点例如邻近小肠的局部递送(所述高浓度在血流中迅速稀释)，或者相对较长的时间内暴露于较低浓度的CO(见例如，Hattler等，Artif.Organs 18(11)：806-812(1994)；和Golob等，ASAIO J.，47(5)：432-437(2001))。
正常气压小室(Normobaric chamber)
在某些情况下，需要将患者整体暴露于CO。患者须位于充满CO的密闭舱中，其中CO的水平不会对患者造成危险，或者该水平造成可接受的危险但不会使旁观者处于被暴露的危险。完成暴露后，用空气(例如，21％O2，79％N2)充满该舱，并使用CO分析仪分析样品，以保证在允许患者离开暴露系统前没有任何CO存留。
系统性递送液体CO组合物
本发明还涉及，可产生用于系统地递送给患者的液体CO组合物，例如输注到患者体内。例如，液体CO组合物，如CO饱和的林格氏溶液，可以在外科手术之前，期间和/或以后输注给患者。可选或此外，被CO部分或完全饱和的全(或部分)血可输注入患者。本发明还涉及能够递送可用的CO气体或液体剂型的试剂(例如CO释放性胶，乳膏，软膏剂或膜片)。
使用一氧化碳对胃肠道进行局部治疗
可选或此外，一氧化碳组合物还可直接给药胃肠道，例如整个胃肠道的内部和/或外部，或者其任何部分。气体组合物可通过本领域已知的将气体吹入患者的方法，直接给药患者的胃肠道，所述患者例如手术患者或者小肠移植供者或受者。例如，在内窥镜和腹腔镜操作中，气体如二氧化碳通常被分别吸入患者的胃肠道和腹腔从而辅助检查(见例如Oxford Textbookof Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。熟练医师将理解类似的方法可以用于将一氧化碳组合物直接给药患者的胃肠道。认为本发明可用来辅助预防腹腔镜和内窥镜检查例如结肠镜和食管胃十二指肠镜检查导致的肠梗阻。
液体CO组合物也可局部给药患者的胃肠道。液体CO组合物可通过本领域已知的任何将液体给药患者的方法给药。和气体组合物一样，液体CO组合物可直接给药患者胃肠道的内部和/或外部。例如，液体形式可经口服给药，例如通过使病人摄取液体一氧化碳组合物的胶囊化或非胶囊化剂型。另一实例中，液体，例如含有溶解的CO的盐水溶液，可以分别在内窥镜和腹腔镜手术中注入患者的胃肠道和腹腔。SITx时，原位暴露可以通过本领域已知的任何方法进行，例如从供者体内取出器官之前，使用液体一氧化碳组合物在原位冲洗该器官(见例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。
活体外小肠移植器官的保存(preservation)
一氧化碳组合物可用来治疗接受胃肠道的任何部分的移植，例如小肠移植(SITx)的患者。在移植手术的情况下，一氧化碳组合物可用来在器官采集，保存，和移植过程的任何步骤处理供体，受体和/或器官本身。胃肠器官可以从供体采集，根据本发明使用一氧化碳组合物在活体外(ex vivo)处理该器官，并将其移植到受体内。可选地或此外，该器官可以在原位处理，即还在供体内时处理。可选地，一氧化碳组合物可以在手术之前，期间，和/或以后，例如使用受体的血液灌注该器官以后给药该受体。所述一氧化碳组合物可以在从供体采集器官以前或采集过程中给药供体。
小肠(或其一部分)在活体外暴露给一氧化碳可以通过将小肠暴露于含有一氧化碳气体的环境，和/或暴露于液体一氧化碳组合物，例如其中溶有一氧化碳的灌注液，保存液或洗涤液实现。
将小肠暴露于气体一氧化碳组合物可在任何适合产生包含适当水平的CO气体的环境的小室(chamber)或区域中进行。这样的小室包括，例如孵箱，和用于将器官保存在保存液中的小室。适宜的小室是其内部环境只有加入该小室的气体的小室，使得一氧化碳的浓度可建立并保持给定的浓度和纯度，例如密封小室。例如，CO2温育箱可用来将器官暴露于一氧化碳组合物，其中的一氧化碳气体从含有该气体的容器中以连续气流的方式供给。
将器官在活体外暴露于液体一氧化碳组合物可通过本领域已知的任何方法进行。例如所述暴露可在任何小室或空间中在活体外进行，只要该小室或空间具有足以使该器官完全或部分浸没在一氧化碳组合物中的容积。另一实例中，也可以通过将所述器官置于任何适宜的容器中而暴露给一氧化碳组合物，并使液体一氧化碳组合物“洗过”所述器官，使得所述器官暴露于一氧化碳组合物的连续流。
另一实施例中，所述器官可用一氧化碳组合物灌注。术语“灌注”是本领域已知的术语，并且和液体例如一氧化碳组合物流经该器官的血管相关。就胃肠道而言，该术语包括使用一氧化碳组合物冲洗肠腔。在活体外和原位灌注器官的方法是本领域已知的。可通过例如连续低温自动灌注(continuous hypothermic machine perfusion)在活体外使用一氧化碳组合物灌注该器官(见Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。可选地，在原位或活体外灌注中，使用一氧化碳组合物灌注所述器官之前，可以用洗涤液，例如不含一氧化碳的UW溶液灌注该器官，以从该器官中去除供体的血液。进行该过程可以避免供体血红蛋白竞争一氧化碳。此外，洗涤液还可以是一氧化碳组合物。
在另一实例中，所述器官可以被置于，例如浸没在不包含一氧化碳的介质或溶液中，并将其置于小室内，使得所述介质或溶液可通过暴露于本文所述的含有一氧化碳的环境而制成一氧化碳组合物。另一实例中，所述器官可以浸没在不含有一氧化碳的液体中，而一氧化碳可以被“吹入”该液体中。
小肠可以通过本领域熟练技术人员已知的任何方法从供体中采集并移植(见例如，Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，OxfordUniversity Press(1994))。本领域熟练技术人员已知移植和/或采集器官用于移植的方法随具体情况而不同，例如供体/受体的年龄。
本发明所述的将器官暴露于液体一氧化碳组合物的上述方法之一或全部，例如洗涤，浸没，或灌注，可被用于给定的手术，例如单SITx手术。
血红素加氧酶-1和其它化合物的应用
本文还涉及随同一氧化碳的给药而诱导或表达血红素加氧酶-1(HO-1)。在SITx的情况下，HO-1可随一氧化碳的给药而在器官内，器官供体体内，受体或所有三者中诱导。例如，HO-1可以在供体内(例如去除该器官以前或该过程中)，在所述离体器官中，和/或在受体内在移植前，移植过程中，或移植后诱导。在其它(即非移植相关的)很可能造成肠梗阻的介入治疗的情况下，HO-1在介入治疗前不久，期间或之后不久被诱导。本文术语“诱导”指使用细胞本身编码蛋白的基因例如，HO-1的内源性(例如非重组的)基因，造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中上述蛋白的生成增加。
HO-1可通过本领域任何已知的方法在患者体内诱导。例如HO-1的产生可通过氯高铁血红素(hemin)，铁原卟啉，或钴原卟啉诱导。各种非血红素(non-heme)制剂包括重金属，细胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，内毒素和热休克也强烈诱导HO-l表达(Otterbein等，Am.J.Physiol.Lung CellMol.Physiol.279：L1029-L1037，2000；Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharma一氧化碳1.Toxi一氧化碳1.37：517-554，1997；和Tenhunen等，J.Lab.Clin.Med.75：410-421，1970)。多种导致氧化物应激的制剂和条件可高度诱导HO-1，所述制剂和条件包括过氧化氢，谷胱甘肽耗竭物，UV辐射和氧过多(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharma一氧化碳1.Toxi一氧化碳1.37：517-554，1997；and Keyse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：99-103，1989)。“包含HO-1诱导物的药物组合物”指包括任何能够在患者体内诱导HO-1的试剂的药物组合物，例如任何上述的试剂，例如氯高铁血红素，铁原卟啉，和/或钴原卟啉。
通过基因转移可增加细胞中HO-1的表达。本文术语“表达”指通过外源给药基因(例如重组基因)造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或铁蛋白。HO-1或铁蛋白优选是与受体的同一物种的(例如人，小鼠，大鼠等)，从而最小化任何免疫反应。可通过组成型启动子(例如巨细胞病毒启动子)或组织特异的启动子(例如用于哺乳动物细胞的乳清蛋白启动子或用于肝细胞的白蛋白启动子)驱动表达。编码HO-1或铁蛋白的适宜基因治疗载体(例如逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人类免疫缺陷病毒(HIV)，小鼠极小病毒，乙型肝炎病毒，流感病毒，单纯疱疹病毒-1型，和慢病毒)可通过口服，吸入或注入，在诱导肠梗阻的手术以前，期间和/或以后的任何时间(例如诱发肠梗阻的操作前24小时或即刻)给药至肠壁，肠腔，或腹腔。类似的，编码HO-1或去铁铁蛋白的质粒可作为例如裸露的DNA的形式，位于脂质体中的形式，或位于微颗粒中的形式给药。
此外，外源性HO-1蛋白可通过本领域已知的任何方法直接给药患者。外源性HO-1可直接给药，作为上述在患者体内诱导或表达HO-1的方法的补充或替换，。所述HO-1蛋白可在脂质体内，和/或作为融合蛋白例如TAT融合蛋白(见例如，Becker-Hapak等，Methods 24：247-256，2001)的形式给药患者。
可选或此外，HO-1的任何代谢产物例如胆红素，胆绿素，铁，和/或铁蛋白可与一氧化碳联合给药，以防止或治疗肠梗阻。此外，本发明涉及将除铁蛋白以外的铁结合分子，例如去铁敏(desferoxamine，DFO)，铁右旋糖苷(iron dextran)，和/或去铁铁蛋白，给药患者。本发明还涉及可抑制催化任何这些产物降解的酶(例如胆绿素还原酶)以创造/增强所需的效果。上述任何物质均可给药，例如经口服，静脉内，腹膜内，或直接给药肠内或肠外。
本发明的方法中也可以使用在给药化合物后，将CO释放到机体的化合物(例如释放CO释放的化合物，如光可激活的的释放CO的化合物)，例如二锰十羰基，三羰基二氯钌(II)二聚体，和二氯甲烷(例如，在400-600mg/kg之间的剂量，例如，约500mg/kg)，也可以使用碳氧血红蛋白以及供给CO的血红蛋白替代物。
可以以任何方式给药患者上述任何物质，例如通过口服，静脉内，或动脉内给药。上述任何化合物可局部和/或系统地给药患者，并且可以联合给药。
本发明还涉及通过将CO给药患者治疗肠梗阻与对患者的肠道进行功能性刺激联合，所述对肠道的刺激例如通过给药患者粪便软化剂，轻泻剂，和/或润滑剂；和/或通过静脉内水合作用(intravenous hydration)和/或鼻胃减压(nasogastric decompression)。CO可以和任何其它已知的治疗肠梗阻的方法或化合物联合给药。
以下实施例说明了本发明的一部分，所述实施例不应理解为从任何方面限制本发明。
实施例1一氧化碳对移植诱导的肠梗阻的保护作用
动物
近亲交配的雄性LEW(RT1)大鼠体重200-300克，购自Harlan SpragueDawley，Inc.(Indianapolis，IN)，并保存在University of Pittsburgh的层流动物设备。使用标准饮食随意地喂养动物。
小肠移植
为确定CO是否抗御小肠移植相关的肠梗阻，在同基因Lewis大鼠中进行同位SITx。具有腔静脉引流的SITx是使用前述方法进行的。整个供体小肠从Treitz韧带到回盲瓣在血管蒂上分离，所述血管蒂由门静脉和带有主动脉的一个节段的肠系膜上动脉组成。使用5m1冷的林格氏(Ringer’s)乳酸溶液通过该主动脉节段灌注该移植物，并用含有0.5％新霉素-硫酸盐(Sigma，St.Louis，MO)的20ml冷盐水溶液灌注肠腔。使用10-0 NovafilTM缝线进行移植物主动脉和受体的肾下主动脉之间，以及移植物门静脉和受体腔静脉之间的端-侧吻合。冷缺血时间(cold ischemic time)为1小时。整个受体的肠被去除，并通过近端和远端端-端肠吻合恢复整个连续性。术后3天给予受体动物20mg/天预防性的头孢羟唑酯钠。手术后3小时给予移植受体喂水，在术后24小时喂食。
实验分组
四组动物在本研究中被检查，其中两组接受了SITx。第一组由未接受手术的正常大鼠组成。第二组动物暴露于CO且没有接受手术。第三组中，进行了同基因SITx，并将受体置于室温。第四组由SITx受体组成，其在手术前被置于CO小室中1小时，随后在手术以后立刻暴露于CO直到处死。在第三组和第四组中，正常LEW大鼠作为供体。
CO暴露
所述动物暴露于250ppm浓度的CO。简言之，空气中1％的CO和空气(21％氧气)在不锈钢混合柱(cylinder)中混合，然后以12L/min的流速导入3.70ft3玻璃暴露小室中。使用CO分析仪(Interscan，Chatsworth，CA)，连续测定小室中CO的水平。CO浓度一直保持在250ppm。在暴露的过程中给所述动物提供食物和水。
功能研究
CO治疗对于被移植的移植物的肠运动障碍的作用在体内和体外评价。手术后24小时或48小时采集组织，这个时间显示是移植诱导的运动障碍出现高峰的时间点。在体内，环肌机械活性如前述测定(Eskandari等.，Am.J.Physiol.273(3 Pt 1)：G727-34(1997))。大鼠被麻醉并在术后24小时通过放血被杀死。中空肠的一个节段被钉在SygaardTM覆盖的解剖盘上，所述解剖盘含有预先氧处理的Krebs-Ringer-重碳酸盐缓冲液(KRB；137.4mM Na+，5.9mM K+，2.5mM Ca2+，1.2mM Mg2+，134mM Cl-，15.5mM HCO3 -，1.2mM H2PO4 -，和11.5mM葡萄糖)，所述缓冲液使用97％O2/3％CO2平衡。沿肠系膜边缘打开小肠，并使用细剪(fine forceps)去除粘膜。沿与环肌层平行的方向剪下全层肌肉带(1×6mm)。肌肉带置于连续浇盖了预先氧处理的KRB并保持在37℃的小室(standard horizontal mechanical organchamber)中。每个肌肉带的一个末端和固定的柱(post)结扎在一起，另一端和等大的力量传感器(WPI，Sarasota，FL)连接。使肌肉带平衡1小时，随后其逐渐伸长直到最大自发收缩出现(L0)。第二次平衡30分钟以后，收缩性-反应曲线通过将组织暴露于浓度渐增的毒蕈碱激动剂氨甲酰甲胆碱(0.3-300μM)10分钟产生，然后洗涤10分钟。收缩活性通过总和曲线下的面积而计算，通过将肌肉带的重量和长度转化成组织的平方毫米(1.03mg/mm2)而标准化，然后报道为g/s/mm2。
术后48小时，在对照和操作的动物中，通过评估荧光标记的葡聚糖(Molecular Probes)的肠分布测定肠转运(intestinal transit)。通过吸入异氟醚使动物稍镇定，并口服标记的葡聚糖(200μl，浓度为6mg/ml，溶解在盐水中)。给药后两小时，将该动物处死，并收集从胃到远端结肠的整个肠道。打开胃，小肠(分成等长的10个节段)，盲肠，和结肠(3个节段，近段，中段和远段)的内容(contents)，置于2ml的盐水中，并强力涡旋以释放各节段中存在的葡聚糖。沉淀肠组织和乳糜后，等分量的上清在读板仪上读数两次(CytoFluor II；激发波长530nm，发射波长590nm)，来定量每个肠节段的荧光信号。随后，绘制荧光信号的中值柱形图，以显示实验组之间标记的葡聚糖的分布的改变。通过计算几何中心(GC)进行统计分析测定肠转运。
形态学研究
小肠移植物在10％的缓冲福尔马林中固定，并在石蜡中包埋。制作4μm的切片并使用苏木精和伊红染色。
髓过氧化物酶组织化学
肌肉全层包埋物是从术后24小时采集的中段小肠制备的。肠段浸在SylgaardTM覆盖的玻璃盘的KRB中，并沿肠系膜边缘在不拉伸的情况下固定。该节段的长度和宽度使用游标卡尺测定。随后沿肠系膜边缘打开结肠，并拉伸到长度的150％和宽度的250％。使用精细镊(fine forceps)去除粘膜和粘膜下层，余下的组织在100％的变性乙醇中固定30分钟。使用PBS洗涤数次后，使用Hanker-Yates试剂来检测显示髓过氧化物酶(MPO)活性的多形核嗜中性粒细胞(PMN’s)(Sheibani等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)：367-70(1981))。使用Gel/MountTM(Biomedia Corp.，Foster City，CA)在载玻片上制作组织的标本，加上盖玻片并通过光学显微镜(Nikon FXA，Fryer，Huntley，IL)以200×的放大率进行检查。浸润肌外层的MPO阳性PMN的数目通过肠系膜和肠系膜游离缘(anti-mesenteric border)之间集中的五到六个相邻视野的平均计数确定。
分子生物研究
RNase保护实验(RPA)
为研究细胞因子mRNA在粘膜和肌层中表达的序列(sequential)分析，根据生产说明使用RiboquantTM试剂盒(Pharmingen)进行RNase保护实验。放射标记的反义RNA多探针是使用体外转录试剂盒和大鼠细胞因子多重探针模板组(multi-probe template set)(rCK-1)合成的，该多探针包括细胞因子(白介素(IL)-1a，IL-1β3，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，TNF-a，TNF-β和IFN-γ)以及管家基因(L32和GAPDH)。32P标记的探针(8.0×105cpm)和样品RNA(5μg)在56℃杂交12-16小时，而且包括反义RNA探针在内的单链RNA通过使用RPA试剂盒(Pharmingen)消化。被保护的探针加样在40％的聚丙烯酰胺凝胶上。使用PhosphorImagerTM系统(Molecular Dynamics，Krefeld，Germany)进行放射自显影。使用NIH Image进行mRNA带的放射活性的定量，根据GAPDH标准化，并表达为细胞因子/GAPDH的比值(n＝3-4)。
SYBR green实时RT-PCR
吸入CO对移植诱导的促炎基因和抗炎基因的表达的影响通过RT-PCR在肌肉提取物中测定。从正常肠和移植后4小时的移植物中采集肌外层，并在液氮中急速冷冻。该时间点落在最大炎症介导物表达的的范围内，即腹部切开后3-6小时之间。使用前述的硫氰酸胍酚-氯仿提取法(Eskandari等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)：367-370(1997))进行总RNA提取。RNA碎片(pellet)重悬于RNA-安全的(secure)重悬液(Ambion Inc.，Austin，TX)中，然后通过使用DNase I(DNA-Free试剂盒，Ambion Inc.，Austin，TX)处理去除可能存在的污染的DNA。每个样品的等分量(5μg)的总RNA通过分光光度法(波长250nm)定量，且以40ng/μl的浓度进行等分。峰值mRNA表达通过SYBR Green两步，实时RT-PCR定量两次。GAPDH被用作内源参照物。使用随机六聚物(PE applied Biosystems，Foster City，CA)和Super Script IITM(Life Technologies，Rockville，MD)，对等分量的RNA进行第一链(first-strand)互补DNA(cDNA)合成。引物序列根据文献获得或者根据公开的序列设计(表1)。使用SYBR Green PCR核心反应试剂(Core Reagents)(PE Applied Biosystems)制备PCR反应混合物。每种样品都使用产品说明推荐的条件估测两次。所述反应在50℃保温2分钟，以活化尿嘧啶N’-糖基化酶，随后在95℃保温12分钟，以活化Amplitaq GoldTM聚合酶，然后在ABI PRISM7700序列检测系统(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)上，以95℃，15秒和60℃，1分钟进行循环，共40次。实时PCR的数据被绘制成ΔRn荧光信号对循环数的图。给logΔRn循环图的中段-线性部分(mid-linear portion)设定任意的阈值。阈值循环(CT)被限定为ΔRn与该阈值交叉时的循环数。mRNA表达的定量可根据GAPDH标准化，并使用比较CT法(Schmittgen等.，J.Biochem.Biophys.Methods 46(1-2)：69-8(2000))相对于对照进行计算。
为了排除对污染基因组DNA的PCR扩增，RT阴性对照(含有未被逆转录的RNA的样品)包括在每次的PCR反应中。对每次反应进行熔解曲线分析，以保证对特定产物进行扩增。此外，还对所述引物进行凝胶电泳以确定不存在非特异条带，以及确定扩增子大小正确。检测靶cDNA的PCR扩增的效率以测定稀释的共线性(colinearity)。对cDNA的连续3倍稀释，平行三份重复进行。通过用CT值对相对输入拷贝数作图产生标准曲线。标准曲线的斜率为-3.2±0.3，校正系数为0.99被认为是可接受的，其相应的效率是100±10％。
表1引物总结
引物 序列5’到3’ SEQ IDNO 来源
 GAPDH  ATGGCACAGTCAAGGCTGAGACGCTCCTGGAAGATGGTGAT  12  NM_017008
 IL-6  GCCCTTCAGGAACAGCTATGATGTCAACAACATCAGTCCCAAGA  34  M26744
 IL-1β  CACCTCTAAGCAGAGCACAGGGGTTCCATGGTGAAGTCAAC  56  Li&Wang，BrainResearchProtocols 2000；5，211-217。
 TNFα  GGTGATCGGTCCCAACAAGGACACGCTGGCTCAGCCACTC  78  Fink等，NatureMed 1998；4：1329-1333。
 ICAM-1  CGTGGCGTCCATTTACACCTTTAGGGCCTCCTCCTGAGC  910  NM_012967
 iNOS  GGAGAGATTTTTCACGACACCCCCATGCATAATTTGGACTTGCA  1112  NM_012611
 COX-2  CTCTGCGATGCTCTTCCGAGAAGGATTTGCTGCATGGCTG  1314  AF233596
 IL-10  TGCAACAGCTCAGCGCAGTCACAGCTTTCGAGAGACTGGAA  1516  Harness等，JNeurol.Sci.2001；187，7-16。
HO-1的Northern印迹
如上述进行Northern印迹(Camhi等.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.13：387-398(1995))。简言之，如上述从组织中提取10μg总RNA，并在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，然后通过毛细作用转移到尼龙膜上。随后在65℃，将所述尼龙膜在杂交缓冲液中(1％牛血清白蛋白(BSA)，7％SDS，0.5MPO4缓冲液，pH 7.0，和1mM EDTA)预杂交2小时，然后使用32P标记的大鼠HO-1 cDNA，32P标记的大鼠L-铁蛋白，或32P标记的大鼠H-铁蛋白寡核苷酸探针在65℃杂交24小时。随后在65℃在缓冲液A(0.5％BSA，5％SDS，40mM PO4缓冲液，pH 7.0，和1mM EDTA)中洗涤两次，每次15分钟，然后在65℃在缓冲液B(1％SDS，40mM PO4缓冲液，pH 7.0和1mM EDTA)中洗涤三次，每次15分钟。
HO-1 cDNA探针
全长大鼠cDNA(pHO1)由Tohoku大学(Sendai，Japan)的S.Shibahara博士提供。pHO1被克隆到pBluescript载体中，并用HindIII进行消化以将0.9kb HO-1 cDNA插入物从pBluescript载体中分离出来。为了控制不同样品中RNA量的差异或加样误差，印迹和相应于18S rRNA的寡核苷酸探针杂交。与18S rRNA互补的24个碱基对的寡核苷酸(5’-ACGGTATCTGATCGTCTTCGAACC-3′；SEQ ID NO：17)是通过使用DNA合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)合成的。使用购自BoehringerMannheim(Mannheim，Germany)的随机引物试剂盒用[32P]CTP标记HO-1cDNA。所有寡核苷酸探针都用末端去氧核苷酰转移酶(Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)在3’端用[32P]ATP进行标记。将放射自显影信号和得自同一印迹的18S rRNA进行比较。
血清细胞因子水平的确定
灌注后1，4和24小时顺序取得血清样品，并保存在-80℃直到进行评估。血清细胞因子(包括IL-6，IL-10，和TNFα)的浓度是通过使用酶联免疫测定(ELISA)试剂盒(R&D，Cambridge，MA)如产品说明所述测定的。
血清亚硝酸盐/硝酸盐水平的测定
为了监测NO代谢的稳定终产物，使用可购得的检验试剂盒(R&D，Cambridge，MI)测定1，4和24小时的血清亚硝酸盐/硝酸盐水平，并根据产品说明进行定量。在该试验系统中，使用硝酸盐还原酶将硝酸盐还原成亚硝酸盐，且样品中亚硝酸盐的浓度随后使用Griess反应测定。
肌肉细胞培养
术后24小时，对照大鼠和移植后大鼠的小肠被取出(在无菌条件下)。结肠保留在原位。将小肠转移到含有Hank’s平衡盐溶液(Sigma，St.Louis，MO)和200U/ml的青霉素G和200μg/ml的链霉素(HBSS)的无菌碎裂机(breaker)中。如上述分离肌层，并在无菌纱布上点样。测定样品的湿重，等分组织，每份150-200毫克。在HBSS中洗涤该组织两次。如上述将各等分试样转移到35毫米的有孔培养板中，该板含有3ml含有青霉素/链霉素的无血清DMEM，并在5％的CO2孵箱中在37℃保温24小时。保温一段时间后，在液氮中冷冻1ml的上清等分试样，并保存在-80℃。细胞因子蛋白水平通过ELISA测定，并根据组织湿重标准化。根据产品说明使用可购得的ELISA试剂盒。
数据分析
结果表示为平均值加或减平均值的标准误(SEM)。在适合的条件下，使用s检验(student’s test)或方差分析(ANOVA)进行统计学分析。概率水平p≤0.05被认为是统计学上显著的。
CO抑制与SITx相关的肠功能障碍的发生
在体外器官浴(organ bath)试验中研究SITx和使用CO治疗对于自发和氨甲酰甲胆碱刺激的小肠环肌收缩的作用。再灌注移植后的肠移植物后24小时采集组织。对照小肠的肌肉带(strip)出现有规律的收缩(数据未显示)。使用CO处理24小时对未接受手术的对照大鼠的自发收缩没有影响(数据未显示)。SITx以后，自发收缩活性消失(数据未显示)。CO治疗恢复了移植后大鼠的自发收缩活性(数据未显示)。
将氨甲酰甲胆碱(0.3-300μM)加入水浴浇注液中引发了浓度依赖的强直性收缩。图1显示了对氨甲酰甲胆碱剂量递增产生反应的整合后的收缩反应对获得的组织面积进行标准化。在对照动物中，收缩力在10-300μM的氨甲酰甲胆碱的范围内是浓度依赖的，其峰值力量为对100μM的氨甲酰甲胆碱起反应而产生的3.5±0.7g/mm2/s。使用CO处理对未接受手术的动物的收缩力没有影响(峰值收缩力量3.2±0.5g/mm2/s)。与对照相比，SITx导致整个剂量反应曲线的收缩力量降低，并在氨甲酰甲胆碱的浓度大于10μM时具有统计学显著性。在氨甲酰甲胆碱的浓度为100μM时，峰值收缩力量降低了49％，为1.7±0.4g/mm2/s。使用CO处理防止了SITx对整个剂量-反应曲线的抑制作用，使峰值收缩力量恢复到对照的水平(3.6±0.7g/mm2/s)。
术后48小时，通过评估口服的，荧光素标记的葡聚糖的肠分布测定对照动物和移植后动物的肠转运。图2A-2B是转运柱图，显示口服2小时后，不可吸收的FITC标记的葡聚糖沿胃肠道(从胃到结肠)的分布。经口喂养2小时后，来自未接受手术的对照大鼠和使用CO处理的对照大鼠的每个肠节段中荧光的中值柱图在图2中绘制。在这两组中，大多数荧光标记位于小肠节段9和10，以及盲肠中。这和移植后的大鼠中观察到的分布模式相反(图2B)，其中的荧光标记主要见于胃，一些标记进入了近端小肠。在使用CO处理的移植动物中，标记的分布更远，总体来说主要在小肠节段6，7和8中。几何中心计算结果的统计分析在表2C中总结，显示了吸入CO显著提高接受了小肠移植的大鼠的肠转运。
白细胞募集
小肠肌层中的细胞炎性事件通常出现在SITx后24小时。通过Hanker-Yates组织化学测定的髓过氧化物酶(MPO)活性，用来定量来自对照动物和移植动物，经过和没有经过CO处理的组织中的白细胞浸润。在未经手术的对照大鼠和CO处理的对照大鼠中，MPO阳性细胞很少见(数据未显示)。SITx导致白细胞明显被募集到肠肌层(数据未显示)。每200×视野的细胞计数在图3中总结，其显示了CO处理降低了MPO阳性细胞的平均数目；然而，所述降低没有统计学显著性(p＝0.08，n＝6)。
粘膜和肌层中细胞因子的序列分析
RNase保护实验显示，SITx导致IL-6和IL-1βmRNA的明显上调，其峰值在移植后的移植物中持续3-6小时(图4A和4B)。相应地，再灌注后4小时分析炎症介质mRNA水平。
分子炎性反应
图5是一组柱图，其显示了再灌注四小时后，肠移植物的肌外层中CO对一氧化氮合酶(iNOS)，IL-6，IL-1β，和IL-10的表达的影响。实时PCR分析显示肠移植物的肌外层中，促炎细胞因子mRNA表达明显增加，(IL-6(3400倍))和IL-1β(38倍))。TNFα也明显上调，但程度较低(3倍)。ICAM-1的基因表达增加了14倍，其中ICAM-1是在循环炎性细胞的募集中起重要作用的粘附分子。在使用CO处理的受体大鼠中，平均相对IL-6和IL-1β的表达降低(分别降低40％和50％)，而TNFα和ICAM-1的表达不变。由于移植组间的大的标准偏差，CO处理的大鼠中IL-6 mRNA的表达的降低不具有统计学显著性(p＝0.046，n＝6)，而IL-1β的表达明显降低(p＝0.084，n＝6)。移植后移植物的肌层中，可诱导形式的环加氧酶(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的基因表达也明显上调(分别为5倍和48倍)。这两种酶的平均相对mRNA表达在CO处理的大鼠中降低大约50％。iNOS表达的降低仍不十分显著(p＝0.060，n＝6)，而COX-2的表达的降低非常显著(p＝0.26，n＝6)。单独吸入CO对于任何一种所研究的介质的表达没有影响。
图6是一组柱图，显示了再灌注后1和4小时，接受肠移植物的动物中，CO对血清IL-6和硝酸盐/亚硝酸盐浓度的影响。为了产生这些数据，在移植后的各时间点采集血清样品，并保存在-80℃直到对其进行评估时。血清IL-6浓度使用大鼠酶联免疫测定(ELISA)试剂盒(R&D，Cambridge，MA)。血清亚硝酸盐/硝酸盐水平，NO代谢的稳定终末产物，使用可购得的检验试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI)测定。在该实验系统中，使用硝酸盐还原酶将硝酸盐还原成亚硝酸盐，并随后使用Griess反应测定样品的亚硝酸盐浓度。接受SITx并使用空气处理的动物中的血清IL-6和亚硝酸盐/硝酸盐水平随时间增加。接受SITx并使用CO处理的动物(SITx+CO)显示血清IL-6以及亚硝酸盐/硝酸盐的水平明显降低。
显示CO防止移植诱导的肠功能障碍的数据列在下表1中。SITx后早期(＜48小时)，肠移植物的肠转运明显延缓，肌肉收缩力明显降低，且出现大量炎性浸润。这些改变在用CO处理的受体中下降。与没有用CO处理的SITx动物相比，用CO处理的SITx动物中的血清IL-6浓度(再灌注后4小时)明显降低。CO通过下调促炎细胞因子IL-6和IL-1，防止肠移植炎症和与SITx相关的I/R损伤。
表2：CO抑制与SITx相关的肠功能障碍
肠转运 收缩力(g/s/mm2) 炎性浸润(/200×视野) IL-1βmRNA(％GAPDH) IL-6mRNA(％GAPDH) 血清IL-6(pg/ml)
正常 正常 2.5±0.1 4.2±1.1 0 0.8±0.1 273
SITx 延迟 1.0±0.3 37±8.4 12.2±2.7 41.9±3.8 6042
SITx+CO 正常 3.0±0.4 21±3.2 6.6±0.1 22.3±1.8 1439
实施例2：CO抑制与小肠的手术操作相关的肠梗阻的发生
动物
C57B16野生型雄性小鼠(20-25g)得自Harlan(Indianapolis，IN)。小鼠圈养在无病原体的装置中，保持12小时的昼/夜循环，并随意地用可购得的啮齿动物食物和自来水喂养。
实验分组和操作步骤
年龄相当的小鼠被分成四个实验组：自然 对照组(对照)；使用CO处理的对照组(对照+CO)；接受小肠手术操作(IM)的小鼠；和接受手术操作并使用CO处理的小鼠(IM+CO)。
手术操作  通过吸入异氟醚麻醉小鼠，并从腹中线剖开腹部。将小肠从腹腔拉出，并使用湿润的无菌棉敷料沿其全长轻压。这一过程是为了刺激肠的“蠕动”，通常在临床腹腔手术中进行。将肠重新放回腹腔，并使用双层连续缝合关闭切口。手术的时间为大约15分钟，且所述动物在麻醉解除后20分钟内在其笼子周围自由移动。
CO吸入治疗  圈养笼子里的小鼠被置于持续通空气或者含有CO(250ppm)的空气的树脂玻璃小室中。提供取样口以持续监测小室内的一氧化碳浓度。动物可随意在任何时间吃食和喝水。剖腹术前1小时将小鼠暴露于CO或空气，转移出小室进行手术操作，然后返回小室24小时。没有接受手术的小鼠从小室中转移出相似长度的时间，然后返回小室中24小时。
形态学研究
MPO组织化学  肌肉全层包埋物是从术后24小时采集的中段小肠制备的。肠段浸在SylgaardTM覆盖的玻璃盘的KRB中，并沿肠系膜边缘在不拉伸的情况下固定。该节段的长度和宽度使用游标卡尺测定。随后沿肠系膜边缘打开结肠，并拉伸到长度的150％和宽度的250％。使用精细镊(fineforceps)去除粘膜和粘膜下层，余下的组织在100％的变性乙醇中固定30分钟。使用PBS洗涤数次后，使用Hanker-Yates试剂来处理组织以检测显示髓过氧化物酶(MPO)活性的多形核嗜中性粒细胞(PMN’s)(Sheibani等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)：367-70(1981))。使用Gel/MountTM(BiomediaCorp.，Foster City，CA)在载玻片上制作组织的标本，加上盖玻片并通过光学显微镜(Nikon FXA，Fryer，Huntley，IL)以200×的放大倍数进行检查。计数肠系膜边缘和肠系膜游离部边缘之间集中的五到六个相邻视野中的MPO阳性PMN的数目。
HO-1免疫组化如上述制备的肌肉全层包埋物在Zamboni’s固定剂中固定1小时，使用DMSO清洗。使用PBS洗涤数次后，使用含有10％的正常驴血清和0.1％的Triton-X的PBS处理所述组织。随后肌肉全层包埋物和兔抗大鼠HO-1抗体(1∶500，Stressgen，Vancouver，Canada)一同温育过夜，经洗涤后和驴抗兔IgG-Cy3偶联物(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.，West Grove，PA)一同保温2小时。如上述使用Gel/MountTM包埋组织，并通过荧光显微镜进行检测(Nikon Microphot-FXA，Huntley，IL)。
功能研究
小鼠被麻醉，并在使用CO或室内空气24小时小室处理的最后，通过放血处死小鼠。体外环肌的机械活性如上Eskandari等(Am.J.Physiol.273：G727-G734(1997))所述测定。简言之，中段小肠的一个节段被钉在SygaardTM覆盖的解剖盘上，所述解剖盘含有预先氧处理(preoxygenate)的Krebs-Ringer-重碳酸盐缓冲液(KRB；137.4mM Na+，5.9mM K+，2.5mM Ca2+，1.2mM Mg2 +，134mM Cl-，15.5mM HCO3 -，1.2mM H2PO4 -，和11.5mM葡萄糖)，并通入97％O2/3％CO2使pH为7.4。沿肠系膜边缘打开小肠，并使用精密剪(fine forceps)去除粘膜。沿与环肌层平行的方向剪下的全层肌肉带(1×6mm)置于标准水平机械器官小室(standard horizontal mechanicalorgan chamber)中，并连续倾注保持在37℃的预先氧处理的KRB。每个肌肉带的一个末端和固定的柱(post)结扎在一起，另一端和等大的力量传感器(WPI，Sarasota，FL)连接。使肌肉带平衡1小时，随后其逐渐伸长到L0(出现最大自发收缩的长度)。基线出现30分钟后，收缩性-反应曲线通过将组织暴露于浓度渐增的毒蕈碱激动剂氨甲酰甲胆碱(0.3-300μM)10分钟产生，然后洗涤10分钟。收缩活性通过总和曲线下的面积计算。通过将肌肉带的重量和长度转化成组织的平方毫米(1.03mg/mm2)而使应答标准化，然后报告为g/s/mm2。术后24小时，在对照和操作的动物中，通过评估不可吸收的荧光标记的葡聚糖(分子量70,000)的肠分布测定肠转运。通过吸入异氟醚使动物稍镇定，并口服标记的葡聚糖(100μl，25mg/mlCO储存液)。给药后九十分钟，将该动物处死，并收集从胃到远端结肠的整个肠道。胃，小肠(分成等长的10个节段)，盲肠，和结肠(3个节段等长)在1ml的盐水中切碎，并强力混合以释放各节段中存在的葡聚糖。沉淀肠组织和乳糜后，等分量的澄清上清在读板仪上读数两次(CytoFluor II；激发波长530nm，发射波长590nm)，来定量每个肠节段的荧光信号。通过计算几何中心(GC＝∑(每个节段的总荧光信号百分比×节段数))测定信号在胃肠道中的分布，以进行实验组之间的定量统计比较。
SYBR green实时RT-PCR
促炎基因和抗炎基因的表达通过实时RT-PCR测定。小肠肌外层在术后四个时间点采集(3，6，12，和24小时)，并在液氮中急速冷冻。使用Eskandari等(Id)所述的硫氰酸胍酚-氯仿提取法进行总RNA提取。RNA沉淀物重悬于RNA-安全(secure)的重悬液(Ambion Inc.，Austin，TX)，然后通过使用DNase I(DNA-Free Kit，Ambion Inc.，Austin，TX)处理去除可能存在的污染DNA。每个样品的等分量(5μg)的总RNA通过分光光度法(波长250nm)定量。峰值mRNA表达通过SYBR Green两步，实时RT-PCR定量两次。β-肌动蛋白被用作内源参照物。使用随机六聚物(PE applied Biosystems，Foster City，CA)和Super Script IITM(Life Technologies，Rockville，MD)，对等分量的RNA(40ng)进行第一链(first-strand)互补DNA(cDNA)合成。引物序列根据文献获得或者根据公开的序列设计(表3)。使用SYBRGreen PCR核心反应试剂(Core Reagents)(PE Applied Biosystems)制备PCR反应混合物。每种样品都使用产品说明推荐的条件估测两次。实时PCR的数据被绘制成ΔRn荧光信号对循环数的图。给logΔRn图中段-线性部分设定任意的阈值。阈值循环(CT)被限定为ΔRn与阈值交叉时的循环数。mRNA表达的定量可根据β-肌动蛋白标准化，并使用比较CT法(Schmittgen等.，J.Biochem.Biophys.Methods 46(1-2)：69-8(2000))相对于对照进行计算。
表3：引物总结
引物  来源  序列5’到3’  SEQID NO  产物大小(bp)
β-肌动蛋白  Overbergh等  AGAGGGAAATCGTGCGTGAC CAATAGTGATGACCTGGCCGT  1718  138
IL-6  GenBankM20572  TCAATTCCAGAAACCGCTATGACACCAGCATCAGTCCCAAGA  1920  78
IL-1β  GenBankM15131  CAGGTCGCTCAGGGTCACACAGAGGCAAGGAGGAAACACA  2122  75
TNFα  GenBankM37897  CACAAAGCAGCCTTGCAGAA AGAGCAGGCAGCATAGCAGTG  2324  68
ICAM-1  GenBankX13356  CTCACTGGCAGGAAATCATCCACCTCGTGGAGACGCTTTACA  2526  67
 iNOS  GenBank NM010927  GTGACGGCAAACATGACTTCAG GCCATCGGGCATCTGGTA  2728  74
 COX-2  GenBank NM011198  CTGGGACCCAACCCTCTGA ACGGTGTGTACCACACGGC  2930  71
为了排除对污染基因组DNA的PCR扩增，RT阴性对照(含有未被逆转录的RNA的样品)包括在每次的PCR反应中。对每次反应进行熔解曲线分析，以保证对特定产物进行扩增。此外，还对所述引物进行凝胶电泳以确定不存在非特异带，以及确定扩增子大小正确。检测靶cDNA的PCR扩增的效率以测定连续稀释物的共线性(colinearity)。对cDNA的逐级3倍稀释重复三次。通过用CT值对相对输入拷贝数作图产生标准曲线以验证引物。标准曲线的斜率为-3.2±0.3，校正系数为0.99被认为是可接受的，其相应的效率是100±10％。
从肠肌层释放的介质的分析
蛋白和一氧化氮测定术后4或24小时，对照小鼠和接受肠操作的小鼠的小肠在无菌条件下被取出。结肠保留在原位。将小肠转移到含有Hank’s液平衡的盐水溶液(Sigma，St.Louis，MO)和200U/ml的青霉素G和200μg/ml的链霉素(HBSS)的碎裂机中，冲洗肠腔，并将组织转移到含HBSS的第二个碎裂机中。如上述采集肌层，用于实时RT-PCR。整个采集过程中，组织保持在在3-5℃的无菌条件下。将分离的肌层在无菌纱布上点样，测定样品的湿重以获得40-60毫克的等分试样。在HBSS中洗涤该组织两次。如上述将各等分试样转移到35毫米孔的培养板中，该板含有3ml含有青霉素/链霉素的无血清DMEM，并在5％的CO2孵箱中在37℃保温24小时。加入培养基的药物试剂在使用前过滤灭菌。
保温一段时间后，在液氮中冷冻等分量的培养基，并保存在-80℃。使用可购得的ELISA试剂盒(R&D，Cambridge，MA)，根据产品说明测定分泌到培养基中的IL-6，IL-1β，PGE2和IL-10蛋白的水平。释放到培养基中的一氧化氮(NO)通过测定NO代谢的稳定终末产物估计。硝酸盐/亚硝酸盐水平使用可购得的检验试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI)在术后24小时测定，并根据产品说明定量。在该实验系统中，使用颗粒化的镉将硝酸盐还原成亚硝酸盐，并随后使用Griess反应测定样品的总亚硝酸盐浓度。所有测定都根据组织湿重标准化。
吸入的CO抑制术后肠梗阻的发生
总体观察
所有动物都很快从手术中恢复。没有与手术或者CO暴露方案相关的死亡或发病。尽管小鼠出现了肠梗阻，术后喂养和日常行为正常，并且麻醉恢复后，几个小时内就恢复了经口摄取食物和水。
HO-1的表达
图7A-7E是柱图和照片，显示了鼠小肠的手术操作后，肠肌层中血红素加氧酶(HO)-1的表达。为研究内源性HO-1产物的潜在抗炎保护作用，通过SYBR green实时RT-PCR测定HO-1 mRNA表达的改变。图7A显示了未接受手术的对照小鼠和操作小鼠在剖腹术后3，6，12和24小时采集的肠肌层中，HO-1 mRNA的表达模式。剖腹术后3小时，HO-1 mRNA的表达相对于对照明显增加了35倍，其峰值表达出现在术后6小时，为45倍。尽管表达水平在6小时以后有所降低，直到术后24小时测定的终时间点，表达仍保持升高(22倍)。
也研究了HO-1 mRNA的增加是否导致手术操作后的肠肌层中蛋白的表达。HO-1的免疫组化对从没有接受手术的小鼠采集的肌肉全层和从接受小肠操作术后24小时的小鼠采集的中段空肠肌肉全层包埋物进行。在操作的动物中，在大量浸润的多形核白细胞中观察到HO-1免疫活性(图7B)，并在与巨噬细胞形态相似的细胞中观察到HO-1免疫活性(图7C)。有时，发现含有多个胞浆颗粒的细胞(粒细胞)也显示强的HO-1免疫反应性(图7D)。弱HO-1免疫活性也见于分散在肌肉层中的不典型细胞群中。在未接受操作的对照小鼠的肌肉全层中没有检测到HO-1免疫反应性(图7E)。HO-1的免疫染色的特异性通过最初抗体的缺失确定(未显示)。
功能研究
通过评估口服荧光素标记的葡聚糖的胃肠分布，测定术后24小时对照和操作动物中的肠转运。图8A-8C是柱图，显示了口服给药1.5小时后，从不可吸收的荧光素标记的葡聚糖的分布测定的转运研究的结果。自然对照小鼠和CO处理的小鼠的每个肠节段中存在的荧光的中值柱图绘制在图8A中。在自然动物中，标记的葡聚糖在摄取葡聚糖90分钟后，主要分布在末端小肠，盲肠，和远端结肠中。单独吸入CO的治疗(250ppm)导致转运的轻微的不明显的改变，其中所述标记主要分布在盲肠和结肠中。图8B对比了接受了肠操作，进行或未进行CO处理的小鼠中的荧光信号的分布。小肠操作后，所述荧光信号被限制在胃和小肠的近端3个节段。动物用CO处理时，所述标记在整个胃肠道较远端分布。几何中心(GC)的计算结果总结在图8C中用于统计比较。GC的值越高，荧光信号的分布越靠远端，并对应于更快的转运。该图中的值显示CO加速未操作的小鼠中的肠转运，但GC值没有统计学显著性。此外，如前所示GC显示肠操作后转运显著减慢，但这种转运的延长在使用CO吸入处理的小鼠中明显改善。
小肠手术操作后24小时，在体外器官浴试验中研究了CO对自发的和氨甲酰甲胆碱刺激的小肠环肌收缩的影响，在该时间点肠梗阻显示已形成。图9A-9C显示了这种小肠环形平滑肌带的机械活性。图9A是一组代表性的图形，显示了小肠环肌的自发收缩。来自自然小鼠小肠的肌肉带出现有规律的收缩(图9A；对照)，且使用CO处理没有作用(图9A；对照+CO)。IM以后，自发收缩活性被明显抑制(图9A；IM)。然而，在使用CO处理的IM小鼠中，节律性明显改善(图9A；IM+CO)。将毒蕈碱激动剂氨甲酰甲胆碱(0.3-300μM)加入浇注液激发了浓度依赖的强制性收缩。将收缩曲线下的面积进行总和，并根据肌肉带表面积进行标准化，以获得环肌收缩力的测定值。图9B和9C是线图，显示了标准化的收缩力。在对照小鼠中，峰值收缩力(3.5±0.7g/s/mm2)是对100μM的氨甲酰甲胆碱反应产生的(图9B)。单独的CO对对照收缩力(3.2±0.7g/s/mm2)没有作用。手术操作导致与对照相比，整个剂量-反应曲线的收缩力量的降低，当氨甲酰甲胆碱的浓度大于10μM时，具有统计学显著性(图9C)。这些小鼠中，100μM的氨甲酰甲胆碱产生的峰值收缩力降低了49％(1.7±0.4g/s/mm2)。吸入CO(250ppm)完全防止了手术操作的抑制效应(3.6±0.7g/s/mm2)。
MPO组织化学
小肠的手术操作通常导致大量肌层内的细胞炎性反应。使用Hanker-Yates组织化学检测髓过氧化物酶(MPO+)的活性，用来定量对照的和操作的，进行和未进行CO处理的动物的组织中的白细胞浸润。图10是柱图，总结了该研究所用的四个实验组中，浸润肠肌层的MPO+阳性细胞的数据。在200×的放大倍数下进行白细胞计数。在没有进行手术的对照动物中，MPO+细胞非常少。手术麻醉和肠操作导致在24小时浸润肌层的MPO+细胞的数目增加了250倍。有趣的是，CO吸入治疗对各组中白细胞浸润的程度没有影响。
促炎细胞因子表达
图11A-11C是柱图，显示了吸入CO对IL-6的表达的影响。该图显示了小肠操作后IL-6基因表达的时间过程，以及吸入的CO对于IL-6基因和蛋白表达的影响。使用实时RT-PCR进行的时间过程分析显示了手术后3和6小时，IL-6 mRNA相对于自然对照小鼠增加了300倍(图11A)。12小时后，表达迅速降低，在24小时降低到了相对于对照组的50倍的增加。吸入CO对3和6小时的时间点的操作诱导的基因表达没有影响(图11B)。在细胞培养基中保温后，测定从分离的肌层中释放的IL-6蛋白(图11C)。IL-6蛋白在肠操作后24小时大量升高，并且与PCR数据相比，CO处理的小鼠中，蛋白释放明显降低了70％。
还研究了促炎细胞因子IL-1β。IL-1β基因表达的时间过程如图12A-12B所示。IL-1β的测定被天然对照小鼠和使用CO处理的对照小鼠中的肌外层中的mRNA水平低于序列分析仪的检测能力这一观察复杂化。因此，术后6小时采集的来自操作的小鼠的样品被连续稀释，并且将循环阈值(CT)的值根据没有稀释的样品中测定的β-肌动蛋白进行标准化。随后使用IL-1β的最低浓度计算对照ΔCT值，在该浓度CT降低到线性范围以内。随后计算余下的实验组的基因表达相对于所述对照组的改变，且因此在对其实际倍数增加的估计上是保守的。从这些计算发现，对手术麻醉和肠操作反应的IL-1βmRNA的表达在手术后3小时，相对于对照增加了38倍。最大表达的出现稍晚于较早报道的IL-6较早的表达，在术后6小时和12小时达到170倍和150倍，并在24小时再次降低到40倍(图12A)。在使用CO处理的动物中，IL-1β在6小时的时间点的表达降低了60％(图12B)。从术后24小时采集的肌外层中释放的IL-1β蛋白在细胞培养基中再保温24小时后测定(图12C)。与RT-PCR相关，没有IL-1β蛋白可在任一对照组中检测出，而100mg提取的组织所产生的蛋白的浓度在肠操作后升高。该反应在使用CO吸入处理的小鼠中明显降低了60％。
环加氧酶-2和可诱导的一氧化氮合酶表达
活化的固有(resident)巨噬细胞和浸润白细胞合成并释放来自环加氧酶可诱导的同种型的前列腺素，COX-2，以及来自一氧化氮合酶(iNOS)的可诱导形式的一氧化氮(NO)，上述物质对小肠平滑肌收缩器有直接且有效的抑制作用。
操作后iNOS表达的时间图显示在图13A-13C中。时间过程分析显示，基因表达在小肠操作后3和6小时明显增加(图13B)。6小时处的峰值表达在CO处理的动物中降低了60％(图14B)。天然小鼠暴露于CO对iNOS的表达没有影响(倍数增加：对照，1.06±0.18；CO 3小时，1.04±0.19；CO 6小时；1.26±0.19)。测定从术后24小时采集的肌层提取物中释放到培养基的总亚硝酸盐，作为对NO产生的估计(图13C)。如PCR数据所预测的，亚硝酸盐的测定值在肠操作后明显增加，并且用CO处理小鼠使该增加降低了75％。该反应类似的减弱通过将肌层提取物在存在选择的iNOS抑制物，L-Nil(50μM)，的条件下保温实现，表明iNOS是手术诱导的NO产生增加的来源。
图14A-14D是柱图，显示了吸入CO对COX-2表达的影响。该图显示了IM诱导的COX-2表达的时间图。时间过程分析显示COX-2基因表达在术后3-6小时增加了8-10倍，并且在24小时内保持升高(图14A)。CO处理对3或6小时时间点的基因表达无影响(图14B)。术后3小时，未手术的对照小鼠CO吸入本身导致相对小的(2.5倍)COX-2信号的诱导(图14C)。PGE2从术后24小时采集的肌层提取物中的释放作为COX-2活性的标志物被测定(图14D)。与PCR的数据一致，单独吸入CO和小肠操作都导致PGE2的释放明显增加。尤其是对PGE2而言，用CO处理操作的小鼠对IM诱导的这种前列腺类物质释放没有影响。
抗炎基因表达
IL-10是一种多效细胞因子，在胃肠道中具有重要的保护和抗炎效应。图15A-15C显示CO吸入对IL-10表达的影响。该图显示了IL-10表达随时间变化的图形。术后3和6小时，对肠操作反应的基因表达相对于对照增加了12倍。随后表达降低，但在24小时内与对照表达相比，仍保持升高大约4倍(图5A)。在3小时的时间点，在CO处理的操作动物中，IL-10基因表达比对照增加到43倍，比单独的操作引起的反应高300％(图15B)。在对照小鼠中，单独的CO吸入足以诱导IL-10表达的明显增加(图15C)。
吸入的CO对HO-1基因表达的作用也被评估。图6A-16B显示了CO吸入对HO-1表达的影响。图16A对比了术后3小时和6小时，IM诱导的基因表达(见图7D)，以及CO处理的操作小鼠中IM诱导基因的表达。吸入CO也使术后3小时的HO-1基因表达比单独操作增加到300％的水平(图16B)。在这种情况下，未接受手术的对照小鼠只吸入CO诱导了尽管明显但小的HO-1基因表达的增加，但只是在6小时的时间点。
本实施例提供了吸入低浓度的CO(250ppm)显著降低术后肠梗阻的特征性肠运动障碍的体内和体外证据。该数据显示了CO能在基因和蛋白的表达水平起作用，从而选择性调节促炎和抗炎途径的具体元件，使得肠功能明显改善。
术后肠梗阻是腹部手术目前实际上不能避免的后果，并且可从短期的张力缺乏到可持续数天的严重的麻痹性肠梗阻。麻痹性肠梗阻的特征是肠淤滞，细菌过量生长，和体液电解质紊乱，导致很高的发病率并通常导致死亡。将小鼠通过吸入暴露于CO改善了操作诱导的自发环形平滑肌收缩力的抑制，恢复了该肌肉对胆碱能激动剂产生反应而收缩的能力，并明显降低了肠转运的损害。获得总体收缩功能的改善而不明显降低炎性细胞的浸润，表明CO对炎性级联元件而不是与白细胞募集相关的那些元件起作用。为了评估CO对炎性级联的影响，通过实时RT-PCR评估促炎和抗炎介质基因的表达。
增加的促炎细胞因子IL-6和IL-1水平在人和动物的急性和慢性肠炎症，包括术后肠梗阻中持续表达。IL-6活化各种细胞类型以诱导化学引诱物和粘附分子的合成，并由此在发动白细胞募集和外渗到肠肌层中起核心作用。在该实施例中，吸入CO不改变术后3和6小时测定的早期手术诱导的IL-6基因表达的增加，这一发现和CO缺乏对炎性细胞浸润的程度的影响一致。然而，在CO处理的小鼠中，术后24小时测定的IL-6蛋白从分离的肠肌层中的释放降低了60％，从5000pg/ml到2000pg/ml，表明CO对IL-6表达具有转录后效应。该持续的蛋白释放水平与自然对照(150pg/ml)相比，仍然是显著升高的，使得很难估计这对IL-6促炎信号有怎样的影响。然而最近的研究显示，IL-6可能还具有重要的抗炎性质，表明IL-6的持续表达对于诱导特定保护性途径是必要的。这些可能包括抑制TNFα，IL-1β和巨噬细胞炎性蛋白-2的能力，以及增加IL-1受体拮抗剂和TNF-可溶的受体在体外的水平。因此，IL-6介导的促炎途径的抑制，以及在炎症级联的后期IL-6介导的抗炎途径的启动，可能导致术后24小时所见的肠收缩力的改善。
IL-1β在术后肠梗阻中起的作用还没有很好的定论，但内源性IL-1β显示抑制大鼠肠平滑肌对胆碱能激动剂以及对电刺激的收缩反应，表明其通过改变神经元通路显示其抑制效果。此外，IL-1活性的免疫中和作用极大地降低了结肠炎鼠模型中疾病的严重性，表明这种细胞因子在肠炎症中也起重要的启动作用。在CO处理的操作小鼠中，IL-1β基因表达显著降低，术后6小时手术诱导的基因表达降低了75％，且术后24小时测定的蛋白表达也相应降低。因此，预期IL-1β的促炎活性，以及其可能的对神经肌肉器的抑制作用将被明显减弱。总的来看，这些发现表明CO吸入的保护作用至少部分通过靶向IL-6和IL-1β介导的促炎级联反应中的选择性元件的机制而出现，所述级联反应不依赖于白细胞募集，或者在白细胞募集被完全启动以后出现。
尽管浸润白细胞的数目在CO处理的小鼠中没有改变，细胞因子的数据表明，存在细胞因子的CO依赖性功能抑制，其中所述细胞因子通常由白细胞产生。因此，研究了对白细胞来源的运动活跃的平滑肌介质NO和PGE2的调节，所述介质可作为CO抑制的其它靶点。已显示COX-2产生的前列腺类物质和iNOS产生的一氧化氮对肠平滑肌收缩力具有有效的抑制作用，而且对COX-2酶的抑制或来源于白细胞的iNOS基因的选择性敲除明显增加了对术后肠梗阻发生的抵抗性。在本实施例中，对iNOS和COX-2基因表达的研究显示，这两者在肠操作后显著升高。手术诱导的iNOS基因表达和NO产生中的增加在CO处理的动物中大约降低了75％，表明CO在基因转录的水平起作用以调节iNOS的表达。在体外还显示，NOS的活性，以及NOS的内皮同种型和神经元同种型，可直接被CO抑制，可能是通过CO与存在于NOS蛋白上的血红素基团的结合产生的。总的来看，降低的基因表达和/或酶活性造成的NO释放降低预期明显地造成CO吸入诱导的肠功能的改善。与iNOS相反，CO吸入对手术诱导的COX-2 mRNA表达或PGE2释放没有影响，如保温的肌层(术后24小时采集)的培养基中测定的那样。有趣的是，天然小鼠吸入CO导致术后3小时COX-2 mRNA的表达升高2.5倍，且24小时后PGE2的释放相应地增加。CO诱导的COX-2以前没有报道，这一增加的活性的功能后果是未知的。CO处理的对照小鼠没有显示功能损害或者促炎介质的升高，表明在这种情况下，COX-2的诱导在促炎能力中不起作用。
CO吸入的显著效果之一是对与抗炎途径相关的基因：IL-10和HO-1的表达。尽管这两种基因都在肠操作后诱导，在CO处理的操作动物中，表达增加了300％。在术后3小时而不是6小时的时间点观察到这一增加，表明CO暴露导致这些基因的早期诱导，这一概念由显示天然动物单独吸入CO明显诱导IL-10和HO-1的结果支持。这些介质在术后肠梗阻中的作用以前没有被描述。然而，IL-10是多效的细胞因子，对淋巴样细胞和髓样细胞具有广泛的生物效应谱。其已知的功能之一就是抑制促炎介质的产生；包括肿瘤坏死因子α(TNFα)，IL-6，IL-1，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，以及活化的单核细胞/巨噬细胞产生的一氧化氮。近来，发现IL-10通过拮抗L-精氨酸的细胞吸收以及iNOS本身的催化活性抑制LPS激活的鼠巨噬细胞的NO产生，从而极大地促使NO对肠平滑肌的抑制作用的减弱。此外，还逐步发现，对HO-1介导的途径的诱导，在多种急性和慢性炎性条件下具有重要的抗炎作用的细胞保护作用。目前有证据表明，这两种介质的表达是相关的。公开的发现表明，暴露于CO提高IL-10基因的表达和从LPS-刺激的巨噬细胞中的蛋白释放。近期，内源性IL-10被发现可诱导小鼠巨噬细胞中的IL-10，且HO-1的诱导是IL-10对脂多糖诱导的TNFα的产生的抑制效应所需的。HO-1的早期诱导导致增加的内源性CO产出，预期可促成外源性使用气体的效果。此外，HO-1活性具有细胞保护和抗氧化性质，所述性质是由胆绿素和胆红素的氧化还原循环过程中的自由基清除造成的。因此，增加的IL-10产生和增强的HO-1活性将协同起作用，通过下调促炎介质表达，增强CO的组织利用度，和提供对自由基应激的保护，在炎性级联反应的发生早期抑制该反应。
总之，本文的数据表明，CO吸入的保护作用通过靶向促炎和抗炎途径中的选择性元件发生。CO在基因和蛋白的水平起作用，导致IL-10和HO-1的诱导，IL-1β的下调，和iNOS的抑制。这些效应在一起造成对小肠肌层内手术诱导的炎性反应的调节，导致术后功能的改善。
实施例3：CO抑制小鼠和猪的小肠手术操作相关的肠梗阻的发生
通过对小肠的轻柔操作在小鼠中诱导肠梗阻。作切口暴露小鼠的腹腔，小肠操作是通过轻柔地戳和刺小肠进行的(见例如Schwarz等.，Gastroenterology 121(6)：1354-1357(2001))。切口随后被关闭，且24小时后进行分析。小鼠在肠操作前一小时通过吸入暴露于CO(250ppm和500ppm)，并且在整个24小时的恢复期也通过吸入暴露于CO(250ppm和500ppm)。通过测定环形肌带对氨甲酰甲胆碱(0.3-300μM)反应的收缩在体外测定肠收缩力，并通过从口服荧光素标记的葡聚糖的分布测定肠转运以及如上述实施例1所述计算几何中心。HO-1和IL-10 mRNA从肌外层提取物的表达是通过SYBR green实时RT-PCR测定的，如实施例1所述。平滑肌收缩的有效抑制物一氧化氮(NO)的释放，通过测定血清总亚硝酸盐估测，也在上述实施例1中描述。
与对照相比(2.2±0.5g/s/mm2)，对氨甲酰甲胆碱(100μM)反应产生的峰值收缩力被IM明显降低(1.1±0.2g/s/mm2)。IM诱导的收缩抑制在IM+CO小鼠中被阻止(1.9±0.5g/s/mm2)。小肠转运在CO处理的小鼠中也得到改善(几何中心；对照＝11.0±0.5，IM＝2.7±0.2，IM+CO＝6.3±0.8)。RT-PCR数据显示，IM后，相对于对照IM诱导在6小时时的峰值HO-1表达(45倍)，和IL-6(300倍)以及IL-10(13倍)在3小时的表达明显增加。在IM-CO小鼠中，HO-1表达峰值出现较早，即IM后3小时，相对于对照其表达水平较高(150倍)。IL-10在3小时的表达在IM-CO小鼠中也较高(35倍)。血清亚硝酸盐在IM后增加(18.3±3.6μM)对对照(2.4±1.0μM)，并在IM-CO后降低(6.0±1.6μM)。
因此，CO在体外和体内都减轻手术诱导的肠运动障碍，其机制可能涉及抗炎细胞因子IL-10的诱导和降低的NO产生。HO-1的早期诱导(其表达比单独IM增加了300％)将增加CO的可利用度，增强其抗炎效果。
类似的实验可在猪模型中进行。通过轻微操作小肠(IM)诱导肠梗阻。IM前将猪暴露于CO(250ppm)或空气(对照)3小时。通过观察置于小肠内的钢性球形物(steel ball bearing)的肠转运，评估体内的胃肠道功能。发现CO可改善肠操作后的肠转运。
实施例4：剖腹术前使用低浓度的CO(250-75ppm)预治疗3小时，防止术后肠梗阻
本实施例显示了短期释放的低浓度CO可防止术后肠梗阻的发生。
肠梗阻通过对小肠的轻微操作(IM)诱导。剖腹术前，将大鼠暴露于空气中的浓度递减的CO(250，125，75，30ppm)1小时或3小时(n＝6)。将结果与使用先前已建立的方案获得的结果进行对比，所述方案即剖腹术前暴露于250ppm的CO 1小时，术后暴露24小时。通过从口服喂养的荧光素标记的葡聚糖在整个胃肠道的分布测定肠转运，评估体内的胃肠功能。测定标记的葡聚糖的中值分布，用于通过计算几何中心(GC)进行统计学比较。
经过手术操作的大鼠和没有经过手术的对照相比，其几何中心明显降低(GC分别为对照＝9.8±0.4，IM＝5.8±0.4)，表明肠转运明显减慢。尽管将未接受手术的大鼠暴露于250ppm 24小时导致肠转运轻微延缓(GC：8.8±0.4)，1小时的预治疗后，使用250ppm的CO进行24小时的处理，导致接受手术操作的大鼠的肠转运明显改善(GC：8.2±0.4)。仅在术前使用250ppm对操作的大鼠进行1小时的预处理，在预防手术诱导的转运抑制中的效果较差(GC：7.2±0.3)，而预处理3小时产生的效果和24小时的预处理的效果等同(GC：8.6±0.3)。通过使用如125和75ppm这样低的浓度进行预处理获得相似的改善(GC分别为：8.6±0.4和8.8±0.1)。当CO浓度进一步降低到30ppm，这种保护效应降低(GC：7.0±0.2)。
本实施例显示了获得对术后肠梗阻的完全保护效应无需延长地暴露于CO。将低浓度的CO在术前期掺入麻醉气体中，可提供侵入性最小的技术，其可协助降低易感患者的肠梗阻，从而加速术后恢复并将缩短住院期。
实施例5：治疗肠梗阻的方案
以下实施例显示了在手术前，其间，和/或以后治疗患者的方案，所述手术例如移植(例如SITx)或非移植手术(例如可导致肠梗阻的手术)。所述实施例包括治疗肠梗阻的方案，例如由移植和非移植手术造成的肠梗阻，以及使用CO处理移植手术中的供体，其胃肠道或其胃肠道的一部分例如小肠，和受体的其它方案。以下方法中的任何一种或多种都可用于给定的手术方法中。
患者的处理
对患者进行手术以前，其间和/或以后，或者患者被诊断为肠梗阻(例如由手术造成或由不涉及手术的情况造成的肠梗阻)后，可将一氧化碳系统地或局部地给予患者。患者可吸入的CO的浓度可以从10ppm到1000ppm，例如，约100ppm到约800ppm，约150ppm-约600ppm，或约200ppm-约500ppm。优选的浓度包括，例如，约30ppm，50ppm，75ppm，100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或约1000ppm。例如，可将一氧化碳间断或连续给药患者，在手术进行前0-20天开始，例如，至少在手术前约30分钟开始，例如，手术前约1，2，3，5，7，或10小时，或约1，2，4，6，8，10，12，14，18，或20天，或大于20天开始。可选或此外，可将一氧化碳在手术期间给予患者，例如通过局部和/或通过吸入来给药。可选或此外，可将一氧化碳在术后给药患者，例如手术完成后立刻，并在手术完成后持续约1，2，3，5，7，或10小时，或约1，2，5，8，10，20，30，50，或60天，或不定期，直到正常肠运动恢复。
移植方法
供体的处理
收获器官或其部分前，可使用吸入的一氧化碳(250ppm)处理供体一小时。处理的给药的剂量可从10ppm-1000ppm，时间从一小时到六小时，或者从开始可能处理脑死亡(尸体)供体到器官被取出的时间的整个阶段。对于人类供体，宣布脑死亡后应尽早进行处理。在一些应用中，需要在脑死亡前进行处理。
对于非人动物(例如猪)用作异种移植供体的情况，如需要可用相对高水平的吸入的一氧化碳处理活动物，只要由此产生的碳氧血红蛋白不损害待移植器官的生存力和功能。例如，可使用大于500ppm(例如，1000ppm或更高，甚至达10,000ppm，特别是短时间使用)的浓度。
器官的原位处理
从供体收获器官前，可以在该器官仍在供体体内时将该器官内充满溶液，例如缓冲液或介质。目的是使用用一氧化碳饱和的溶液冲洗该器官，并保持在一氧化碳的环境中，使得一氧化碳的含量保持饱和。冲洗可进行至少10分钟，例如1小时，几小时或更长。较理想的是，该溶液将可能的最高浓度的一氧化碳递送到器官的细胞。
器官的活体外(ex vivo)处理
器官如小肠从供体取出后到移植给受体以前，可保存在包含一氧化碳的介质中。这可通过将器官或组织保存在含有一氧化碳的介质中进行，或者通过灌注这种介质进行。由于这种情况出现在活体外而不是动物体内，可使用非常高浓度的一氧化碳气体(例如，10,000ppm)使该介质被一氧化碳饱和。
受体的处理
可用一氧化碳处理受体。可在移植手术当天手术开始前至少30分钟开始处理。可选地，可以于再灌注受体器官前30分钟开始。可持续至少30分钟，例如一小时。可将10ppm到3000ppm的一氧化碳剂量递送不同时间，例如数分钟或数小时，并可在移植当天和移植后数天给药。例如，受体可在三次连续10秒的呼吸中吸入例如3000ppm浓度的一氧化碳。可选地，也可以采用规律呼吸而不是深呼吸(breath holding)的方式间断或连续地递送较低浓度的气体，递送较长时间。碳氧血红蛋白浓度可指导对患者适当地给药一氧化碳。通常，受体的处理不应导致碳氧血红蛋白水平升高到被认为可能给需要移植的患者造成危险的程度。
应理解，虽然发明详述描述了本发明，前述说明意图列举但不是限制所附权利要求限定的范围。其它方面，优点，和改动也在以下权利要求书的范围内。

Claims (24)

1.治疗患者的肠梗阻的方法，所述方法包括：
鉴定患有肠梗阻的患者；和
将包含治疗患者的肠梗阻的有效量的一氧化碳的药物组合物给药该患者。
2.权利要求1的方法，其中所述肠梗阻是小肠的肠梗阻。
3.权利要求1的方法，其中所述肠梗阻是结肠的肠梗阻。
4.权利要求1的方法，其中所述肠梗阻是胃的肠梗阻。
5.权利要求1的方法，其中所述肠梗阻是手术后肠梗阻。
6.权利要求1的方法，其中所述肠梗阻是产后肠梗阻。
7.权利要求1的方法，其中所述药物组合物通过吸入给药患者。
8.权利要求1的方法，其中所述药物组合物是液体形式的，并且通过口服给药患者。
9.权利要求1的方法，其中将所述药物组合物直接给药至患者的腹腔。
10.治疗患者的肠梗阻的方法，所述方法包括：
鉴定患有由于各种腹部手术导致的肠梗阻或者有患该肠梗阻危险的患者，所述腹部手术选自：泌尿生殖系统的手术；消化系统的手术；淋巴系统的手术；呼吸系统的手术；膈的手术；治疗癌症的手术；子宫内膜手术；或矫形手术；和
将包含治疗患者肠梗阻有效量的一氧化碳的药物组合物给药所述患者。
11.权利要求10的方法，其中所述肠梗阻是小肠的肠梗阻。
12.权利要求10的方法，其中所述的肠梗阻是结肠的肠梗阻。
13.权利要求10的方法，其中所述药物组合物通过吸入给药患者。
14.权利要求10的方法，其中所述药物组合物是液体形式的，并且通过口服给药患者。
15.权利要求10的方法，其中将所述药物组合物直接给药至患者的腹腔。
16.治疗患者的肠梗阻的方法，所述方法包括：
鉴定患有或者可能患不是由手术造成的肠梗阻的患者；和
将包含治疗患者肠梗阻有效量的一氧化碳的药物组合物给药所述患者。
17.治疗患者的肠梗阻的方法，所述方法包括：
(a)提供含有包含一氧化碳气体的加压气体的容器；
(b)鉴定患有肠梗阻的患者；
(c)从所述容器中释放加压气体，以形成含有一氧化碳气体的环境；和
(d)将所述患者暴露于该环境，其中环境中一氧化碳的量足以治疗患者的肠梗阻。
18.含有压缩的医用级一氧化碳气体的容器，所述容器带有表明该气体可用来治疗患者的肠梗阻的标签。
19.权利要求18的容器，其中所述一氧化碳气体和含氧的气体混合。
20.权利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳气体的浓度至少约0.025％。
21 权利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳气体的浓度至少约0.05％。
22 权利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳气体的浓度至少约0.10％。
23.权利要求19的容器，其中的混合物中的一氧化碳气体的浓度至少约1.0％。
24.权利要求19的容器，其中的混合物中的一氧化碳气体的浓度至少约2.0％。
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