HRP20040972A2 - Methods of treating ileus - Google Patents
Methods of treating ileusInfo
- Publication number
- HRP20040972A2 HRP20040972A2 HR20040972A HRP20040972A HRP20040972A2 HR P20040972 A2 HRP20040972 A2 HR P20040972A2 HR 20040972 A HR20040972 A HR 20040972A HR P20040972 A HRP20040972 A HR P20040972A HR P20040972 A2 HRP20040972 A2 HR P20040972A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- carbon monoxide
- patient
- surgery
- ileus
- hours
- Prior art date
Links
- 208000008384 ileus Diseases 0.000 title claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 78
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 145
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 145
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 128
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 70
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 64
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 42
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 41
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 10
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 124
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 104
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 91
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 81
- 108010018924 Heme Oxygenase-1 Proteins 0.000 description 69
- 102000002737 Heme Oxygenase-1 Human genes 0.000 description 69
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 58
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 58
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 41
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 40
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 40
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 32
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 32
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 26
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 26
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 26
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000003570 air Substances 0.000 description 21
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- NZUPCNDJBJXXRF-UHFFFAOYSA-O bethanechol Chemical compound C[N+](C)(C)CC(C)OC(N)=O NZUPCNDJBJXXRF-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 20
- 229960000910 bethanechol Drugs 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 19
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 19
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 19
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 18
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 description 18
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 description 18
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 18
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 17
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 14
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 14
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 14
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 13
- 206010054048 Postoperative ileus Diseases 0.000 description 13
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 12
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 12
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 12
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 12
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 11
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 11
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 11
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 11
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 10
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 10
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 10
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 10
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 9
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 8
- 239000008246 gaseous mixture Substances 0.000 description 8
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010057270 haemoferritin Proteins 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 7
- 102000000546 Apoferritins Human genes 0.000 description 6
- 108010002084 Apoferritins Proteins 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010003320 Carboxyhemoglobin Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 5
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 5
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 4
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 4
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 4
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 4
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 4
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000006595 Griess deamination reaction Methods 0.000 description 3
- 101150109636 Inos gene Proteins 0.000 description 3
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 3
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 3
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 3
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 3
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002357 laparoscopic surgery Methods 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000000472 muscarinic agonist Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036977 tonic contraction Effects 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- AQTFKGDWFRRIHR-UHFFFAOYSA-L 3-[18-(2-carboxylatoethyl)-8,13-bis(ethenyl)-3,7,12,17-tetramethylporphyrin-21,24-diid-2-yl]propanoate;cobalt(2+);hydron Chemical compound [Co+2].[N-]1C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C)C(=C4)[N-]3)C=C)=N2)C=C)=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C1C(CCC(O)=O)=C(C)C4=N1 AQTFKGDWFRRIHR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010058040 Abdominal sepsis Diseases 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 206010003011 Appendicitis Diseases 0.000 description 2
- 208000007204 Brain death Diseases 0.000 description 2
- KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O Chemical compound CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N 0.000 description 2
- 101150071146 COX2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100083253 Caenorhabditis elegans pho-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021333 Ileus paralytic Diseases 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 2
- 201000005081 Intestinal Pseudo-Obstruction Diseases 0.000 description 2
- 206010022680 Intestinal ischaemia Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010058360 Retroperitoneal haematoma Diseases 0.000 description 2
- 208000027790 Rib fracture Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 239000000064 cholinergic agonist Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009989 contractile response Effects 0.000 description 2
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004921 distal colon Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- -1 eg gaseous Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 230000007661 gastrointestinal function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003871 intestinal function Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- MVZXTUSAYBWAAM-UHFFFAOYSA-N iron;sulfuric acid Chemical compound [Fe].OS(O)(=O)=O MVZXTUSAYBWAAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 201000007620 paralytic ileus Diseases 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 229940127293 prostanoid Drugs 0.000 description 2
- 150000003814 prostanoids Chemical class 0.000 description 2
- 229950003776 protoporphyrin Drugs 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001020 rhythmical effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 206010041569 spinal fracture Diseases 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- AMFYRKOUWBAGHV-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrazolo[4,3-b]pyridine Chemical compound C1=CN=C2C=NNC2=C1 AMFYRKOUWBAGHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010017500 Biliverdin reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006322 Breath holding Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010014418 Electrolyte imbalance Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000016761 Haem oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108050006318 Haem oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010058490 Hyperoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000008133 Iron-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035210 Iron-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 1
- 102100022397 Nitric oxide synthase, brain Human genes 0.000 description 1
- 101710111444 Nitric oxide synthase, brain Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 102000032628 PAR-2 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010070503 PAR-2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 101001079613 Rattus norvegicus Heme oxygenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012840 University of Wisconsin (UW) solution Substances 0.000 description 1
- 108700042768 University of Wisconsin-lactobionate solution Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 239000003994 anesthetic gas Substances 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 102000004558 biliverdin reductase Human genes 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYHHJVKGDCZCCL-UHFFFAOYSA-J carbon monoxide;dichlororuthenium Chemical compound [O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].Cl[Ru]Cl.Cl[Ru]Cl JYHHJVKGDCZCCL-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 230000008828 contractile function Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004395 cytoplasmic granule Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QFEOTYVTTQCYAZ-UHFFFAOYSA-N dimanganese decacarbonyl Chemical group [Mn].[Mn].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-].[O+]#[C-] QFEOTYVTTQCYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000008144 emollient laxative Substances 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 230000009454 functional inhibition Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000222 hyperoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003767 ileocecal valve Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 230000003886 intestinal anastomosis Effects 0.000 description 1
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 1
- 208000003243 intestinal obstruction Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008141 laxative Substances 0.000 description 1
- 229940125722 laxative agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000001363 mesenteric artery superior Anatomy 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940053050 neomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000010004 neural pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 238000013310 pig model Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008741 proinflammatory signaling process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000006577 protective pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- ICZOIXFFVKYXOM-UHFFFAOYSA-M sodium;7-[(2-formyloxy-2-phenylacetyl)amino]-3-[(1-methyltetrazol-5-yl)sulfanylmethyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CN1N=NN=C1SCC1=C(C([O-])=O)N2C(=O)C(NC(=O)C(OC=O)C=3C=CC=CC=3)C2SC1 ICZOIXFFVKYXOM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Reference za srodne prijave
Ova prijava ima prednost ispred U.S. privremene prijave broj 60/372,652, koja je podnesena 15. travnja 2002., a ovdje je u cijelosti uključena kao referenca.
Izjava o istraživanju sponzoriranom od Vlade
Ovaj izum je napravljen uz potporu Vlade prema odobrenjima Nacionalnog Instituta za Zdravlje, brojevi HL55330, HL60234, GM58241 i GM53789 i AI42365. Vlada ima određena prava na ovaj izum.
Područje izuma
Ovaj izum se odnosi na liječenje gastrointestinalnih poremećaja.
Pozadina
Ugljik monoksid (CO) je plin otrovan u visokim koncentracijama. Ipak, sada se prepoznaje kao važna signalna molekula (Verma i sur, Science 259:381-384,1993). Također se misli da ugljik monoksid djeluje kao neuronska prijenosna molekula u mozgu (Id.), te kao neuro-endokrini modulator u hipotalamusu (Pozzoli i sur., Endocrinology 735:2314-2317, 1994). Poput dušikovog oksida (NO), ugljik monoksid opušta glatke mišiće (Utz i sur., Biochem Pharmacol. 47:195-201, 1991; Christodouiides i sur., Circulation 97:2306-9, 1995) i inhibira aregaciju krvnih pločica (Mansouri i sur., Thromb Haemost. 48:286-8,1982). Pokazalo se da udisanje niskih razina ugljik monoksida ima antiinflamatorne učinke kod nekih modela.
Ileus je poremećaj karakteriziran nedostatkom motiliteta crijeva, te je jedan od češćih oblika intestinalne opstrukcije (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Cesto, ileus se javlja duž intestinalnog trakta (npr. i u debelom i tankom crijevu), ali ponekad može uključivati samo jedan ili nekoliko njegovih segmenata. Manipulacija intestinalnim traktom za vrijeme operacije abdomena često vodi k nastanku ileusa.
Predloženi su razni farmaceutski pristupi za liječenje ileusa (vidi, npr. U.S. patente brojeve 5,362,756 (fedotozin); 5,929,035 (neuropeptidi); 6,214,843 (pirazolopiridin); i 5,958,407 (npr. antagonistički proteinaza-aktivirani receptor-2)).
Sažetak
Predstavljeni izum se temelji, jednim dijelom, na otkriću da primjena CO može ublažiti ileus.
Prema tome, s jedne strane, izum predstavlja postupak liječenja ileusa kod pacijenta, a uključuje identificiranje pacijenta koji pati od ileusa ili postoji rizik za ileus, te davanje pacijentu farmaceutske smjese koja sadrži učinkovitu količinu ili koncentraciju ugljik monoksida.
Ileus može biti ileus bilo kojeg dijela gastrointestinalnog trakta, npr. želuca, tankog crijeva i/ili kolona. Ileus može nastati iz bilo kojeg faktora koji uzrokuje ileus, npr. operacija, npr. operacija abdomena kao što je transplantacija (npr. transplantacija tankoga crijeva (SITx)) ili neka druga abdominalna operacija osim transplantacije (npr. abdominalna operacija koja uključuje ili ne uključuje laparotomiju, npr. laparoskopski postupci); ortopedske operacije (npr. operacija kuka); porođaj; intestinalna ishemija; retroperitonealni hematom, intraabdominalna sepsa, intraperitonelana upala, npr. akutni apendicitis, upala žučnog mjehura, pankreatitis; prijelomi kralješnice; kolike mokraćnoga trakta; lezije toraksa; upala pluća; prijelomi rebara; infarkt miokarda; metabolički poremećaji; ili iz bilo koje njihove kombinacije.
Farmaceutska smjesa se pacijentu može dati bilo kojim postupkom poznatim u struci za primjenu plinova, tekućina, i/ili krutina pacijentu, npr. preko inhalacije, upuhivanja , infuzije, injekcije, i/ili gutanja. Npr. u jednom ostvarenju predstavljenoga izuma, farmaceutska smjesa se daje pacijentu inhalacijski. U drugom ostvarenju, farmaceutska smjesa se daje pacijentu oralno. U još jednom ostvarenju, farmaceutska smjesa se daje izravno u abdominalnu šupljinu pacijenta.
Postupak dalje može uključivati davanje pacijentu najmanje jednog od sljedećih postupaka dodatno uz CO: uvođenje HO-1 ili feritina kod pacijenta; ekspresiju rekombinantnog HO-1 ili feritina kod pacijenta; i davanje pacijentu farmaceutske smjese koja sadrži HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin, desferoksamin, željezo dekstran, ili apoferitin.
S druge strane, izum se odnosi na postupak liječenja postoperacijskog ileusa kod pacijenta. Postupak uključuje identificiranje pacijenta koji pati od postoperacijskog ileusa, te davanje pacijentu farmaceutske smjese koja sadrži količinu ugljik monoksida koja je učinkovita za liječenje ileusa kod pacijenta. Ileus može biti ileus bilo kojeg dijela gastrointestinalnog trakta, npr. želuca, tankog crijeva i/ili debelog crijeva (npr. kolona). Farmaceutska smjesa se pacijentu može dati bilo kojim ovdje opisanim postupkom, npr. preko inhalacije (plinovite smjese), oralno; i/ili izravnom primjenom u abdominalnu šupljinu pacijenta.
Izum također predstavlja postupak liječenja ileusa kod pacijenta koji pati od ileusa ili postoji rizik za ileus, a koji nije uzrokovan abdominalom operacijom, npr. ileus uzrokovan bilo kojim ovdje opisanim faktorom osim abdominalane operacije. Postupak uključuje identificiranje pacijenta koji pati od ileusa ili postoji rizik za ileus, a koji nije uzrokovan abdominalom operacijom, te davanje pacijentu farmaceutske smjese koja sadrži količinu ugljik monoksida koja je učinkovita za liječenje ileusa kod pacijenta.
S druge strane, izum predstavlja postupak liječenja ileusa kod pacijenta, a uključuje korake izrade nosača koji uključuje plin pod pritiskom, a koji sadrži plinoviti ugljik monoksid, identificiranje pacijenta koji pati od ileusa ili postoji rizik za ileus, oslobađanje komprimiranog plina iz nosača da bi stvorila atmosfera koja uključuje plinoviti ugljik monoksid, i izlaganje pacijenta toj atmosferi, pri čemu je količina ugljik monoksida u atmosferi dovoljna za liječenje ileusa kod pacijenta.
S opet druge strane, izum omogućuje postupak izvođenja operacije na pacijentu. Postupak uključuje identificiranje pacijenta kojemu je potrebna operacija, te navođenje pacijenta prije, za vrijeme i/ili nakon operacije da udiše količinu plina ugljik monoksida koja je dovoljna za liječenje ileusa kod pacijenta.
Operacija može biti bilo koja operacija koja uzrokuje ileus i/ili dovodi pacijenta u rizik od ileusa. Npr. operacija može uključivati manipulaciju (npr. diranje (izravno ili posredno)) gastrointesinalnog trakta, npr. želuca i/ili crijeva, npr. tankog ili debelog crijeva (npr. kolona), t može biti operacija koja uključuje ili ne uključuje laparotomiju (npr. operacije koje uključuju laparoskopiju). U određenim ostvarenjima, operacija može, ali i ne mora biti transplantacija, npr. operacija koja uključuje bilo koji organ ili tkivo u abdomenu, npr. operacija urogenitalnog sustava (npr. bubrega, uretre, i/ili mjehura; i reproduktivnih organa (npr. maternice, jajnika, i/ili jajovoda)); probavnog sustava (npr. želuca, tankog crijeva, debelog crijeva (npr. kolona), slijepog crijeva, žučnog mjehura, jetre, slezene, i/ili gušterače); limfnog sustava, dišnog sustava ( npr. pluća, ošit); operacija kao liječenje tumora ili bilo kojeg organa ili tkiva unutar abdomena; operacija endometrija; i ortopedske operacije, npr. operacija kuka.
S druge strane, izum predstavlja posudicu koja sadrži komprimirani CO plin medicinske klase. Posuda može na sebi imati oznaku koja označava da se plin može koristiti za liječenje ileusa, npr. ileusa koji je posljedica operacije (npr. intestinalna manipulacija koja uključuje operaciju) kod pacijenta (npr. ljudskog pacijenta). CO plin može biti u smjesi s plinom dušika, s plinom dušik oksida i dušika, ili s plinom koji sadrži kisik. CO plin može biti prisutan u smjesi pri koncentraciji od najmanje oko 0.025%, npr. pri najmanje od oko 0.05%, 0.10%, 0.50%, 1.0%, 2.0%, 10%, 50% ili 90%.
S druge pak strane, izum predstavlja postupak liječenja ileusa kod pacijenta, a uključuje identificiranje pacijenta koji pati od ileusa ili postoji rizik za ileus, te primjenu pacijentu najmanje jednog od sljedećih postupaka dodatno uz CO liječenje: uvođenje HO-1 ili feritina kod pacijenta; ekspresiju rekombinantnog HO-1 ili feritina kod pacijenta; i davanje pacijentu farmaceutske smjese koja sadrži HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin, ili apoferitin. Također se razmatra upotreba CO, i bilo kojeg gore navedenog sredstva, za pripremu lijeka za liječenje ili prevenciju ileusa.
Također je unutar izuma i upotreba CO u proizvodnji lijeka za liječenje ili prevenciju poremećaja koji je ovdje opisan, npr. ileus. Lijek se također može koristiti u postupku liječenja ileusa kod pacijenta i/ili za liječenje donora, organa, i/ili primatelja u postupcima transplantacije. Lijek može biti u bilo kojem ovdje opisanom obliku, npr. tekuća ili plinovita CO smjesa.
Ako nije drugačije definirano, svi ovdje korišteni tehnički i znanstveni pojmovi imaju isto značenje koje obično podrazumijeva stručnjak područja na koje se ovaj izum odnosi. Prikladni postupci i materijali su opisani poslije, iako se mogu za provedbu ili ispitivanje predstavljenoga izuma koristiti postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovdje opisani. Sve publikacije, patentne prijave, patenti, i ostale ovdje spomenute reference, su u svojoj cijelosti uključeni ovdje kao reference. U slučaju nesporazuma, prevladati će predstavljene specifikacije, uključujući definicije. Materijali, metode i primjeri su samo ilustrativni i ne ograničavaju.
Detalji jednog ili više ostvarenja izuma su predstavljeni uz priložene slike i opise, druge značajke, objekti i prednosti izuma biti će jasni iz opisa i slika, te iz zahtjeva.
Opis slika
Slika 1 prikazuje linijski graf koji ilustrira učinak transplantacije tankog crijeva (SITx, Small Intestine Transplantation) i liječenja s CO na spontanu i betanekol-stimuliranu kontraktilnost glatkog mišića tankog crijeva. ▲=kontrola; ◊- kontrola+CO; X=SITx; ■= SITx+CO.
Slika 2A prikazuje graf sa stupcima koji ilustrira učinak CO na intestinalni prijenos kod kontrolnih životinja (životinje nisu podvrgnute SITx). Crni stupci= kontrola; iscrtkani stupci= kontrola +CO (250 ppm); žel= želudac; tc= tanko crijevo; i kol= kolon.
Slika 2B prikazuje graf sa stupcima koji ilustrira učinak CO na intestinalni prijenos kod životinja koje su podvrgnute SITx. Crni stupci= SITx; iscrtkani stupci= SITx +CO (250 ppm); žel= želudac; tc= tanko crijevo; i kol= kolon.
Slika 2C prikazuje graf sa stupcima koji ilustrira kako CO značajno poboljšava intestinalni prijenos kod štakora koji su podvrgnuti SITx. Graf sažima izračunate geometrijske sredine mjerenja prijenosa. kontrola= kontrolne životinje izložene zraku; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; SITx= životinje koje su podvrgnute SITx i izložene zraku; SITx +CO= životinje koje su podvrgnute SITx i izložene na CO.
Slika 3 prikazuje graf sa stupcima koji ilustrira učinak CO na migraciju leukocita u intestinalnu muskulaturu nakon SITx. kontrola= kontrolne životinje izložene zraku; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; SITx= životinje koje su podvrgnute SlTx i izložene zraku; SITx +CO= životinje koje su podvrgnute SITx i izložene na CO.
Slika 4 je linijski graf koji ilustrira ekspresiju IL-6 mRNA u mukozi i muskularisu u različitim vremenskim razmacima nakon SITx, a mjereno je testom zaštite RNAze. ■= mišić; o= mukoza.
Slika 5 je set grafova sa stupcima koji ilustriraju učinak CO na sintazu dušikovog oksida (iNOS), IL-6, IL-1P i IL-10 ekspresiju u vanjskom muskularisu intestinalnog transplantanta 4 sata nakon uspostavljanja cirkulacije, a mjereno je RT-PCR analizom. normalno= kontrolne životinje izložene zraku; normalno+CO= kontrolne životinje izložene na CO; SITx= životinje koje su podvrgnute SITx i izložene zraku; SITx +CO= životinje koje su podvrgnute SITx i izložene na CO.
Slika 6 je set grafova sa stupcima koji ilustriraju učinak CO na serumske koncentacije IL-6 i nitrat/nitrita kod životinja koje su prošle SITx, a mjereno je 1 sat (SITx+CO (1 h)) i 4 sata (SITx+CO (4 h)) nakon uspostavljanja cirkulacije. normalno= kontrolne životinje izložene zraku; normalno+CO= kontrolne životinje izložene na CO; SITx (1 h) i SITx (4 h)= životinje koje su podvrgnute SITx, mjereno 1 i 4 sata nakon uspostavljanja cirkulacije.
Slika 7A je graf sa stupcima koji ilustrira učinak intestinalne manipulacije (IM) na ekspresiju HO-1 u ekstraktima muskularisa, a kako je utvrđeno uz dvostupanjsku RT-PCR analizu. Uzorci su analizirani 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), i 24 (IM 24h) sata nakon laparotomije. Pik HO-1 ekspresije se pojavio 3 do 6 sati nakon operacije. Podaci predstavljaju srednje povećanje nabiranja u odnosu na kontrolu±SEM, n=6. *P=0.001;**P= 0.0001.
Slika 7B je slika muskularisa sa cijelog objektnog stakalca koja prikazuje HO-1-sličnu imunoreaktivnost kod polimorfoleukocita koji su ušli u muskularis nakon IM.
Slika 7C je slika muskularisa sa cijelog objektnog stakalca koja prikazuje HO-1-sličnu imunoreaktivnost kod stanica nalik makrofagima koje su ušle u muskularis nakon IM.
Slika 7D je slika muskularisa sa cijelog objektnog stakalca koja prikazuje HO-1-sličnu imunoreaktivnost kod granuliranih stanica koje su ušle u muskularis nakon IM. Područje nejasne imunofluorescencije u donjem dijelu slike predstavlja stanice ispod ravnine žarišta.
Slika 7E je slika muskularisa sa cijelog objektnog stakalca koja prikazuje HO-1-sličnu imunoreaktivnost u muskularisu kontrolnih životinja.
Slika 8A prikazuje graf sa stupcima koji ilustrira učinke inhaliranog CO (izloženost 24 h) na intestinalni prijenos kod miševa koji nisu podvrgnuti IM. žel= želudac; tc= tanko crijevo; i kol= kolon. Crni stupci= životinje koje nisu izložene CO; iscrtkani stupci= životinje koje su izložene CO. Većina fluorescentnih signala je lokalizirana u slijepom crijevu i u proksimalnom kolonu.
Slika 8B je graf sa stupcima koji ilustrira učinke inhaliranog CO (izloženost 24 sata) na intestinatni prijenos kod miševa koji su podvrgnuti intestinalnoj manipulaciji (IM). žel= želudac; tc= tanko crijevo; i kol= kolon. Crni stupci= životinje koje nisu izložene na CO; iscrtkani stupci= životinje izložene na CO. Nakon IM, prijenos je znatno odgođen. Inhalacija CO je rezultirala distalnijom distribucijom označenog dekstrana (IM-CO).
Slika 8C je graf sa stupcima koji ilustrira računanje geometrijske sredine (GC). Veći brojevi odgovaraju distalnijoj distribuciji označenog dekstrana. kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; IM= životinje koje su podvrgnute IM; IM +CO= životinje koje su podvrgnute IM i izložene na CO. *U IM skupini, GC je izrazito smanjen u odnosu na kontrole, PO.0001; n=6. ] Inhalacija CO (IM+CO) je kao posljedicu imala znatan porast GC u odnosu na IM, P=0.001; n=6.
Slika 9A su reprezentativni tragovi koji prikazuju učinak CO na spontanu kontraktilnu aktivnost. Kontrola: karakteristike ritmičke kontrakcije kod neoperiranih miševa. Kontrola+CO: Inhalacija ugljik monoksida (CO) kroz 24 h kod kontrolnih miševa nije imala učinak na spontanu kontraktilnost. IM: Ritmička kontrakttlnost je nestala nakon operacijskog tretmana tankog crijeva. IM+CO: Ritmičnost je ponovno uspostavljena kod operiranih životinja tretiranih s CO.
Slika 9B je linijski graf (krivulja doza-učinak) koji prikazuje učinak CO na magnitudu toničkih kontrakcija kod vrpci kružnog glatkog mišića iz životinja koje nisu podvrgnute IM. Kontrakcije su inducirane izlaganjem vrpci sve većim koncentracijama betanekola (0.1 do 300 umol/L). Inhalacija CO kod kontrolnih životinja nije imala učinka na kontraktilnu aktivnost induciranu betanekolom. ■= kontrola; ▲=kontrola+CO.
Slika 9C je linijski graf (krivulja doza-učinak) koji prikazuje učinak CO na magnitudu toničkih kontrakcija kod vrpci kružnog glatkog mišića iz životinja koje su podvrgnute IM. Kontrakcije su inducirane izlaganjem vrpci sve većim koncentracijama betanekola (0.1 do 300 umol/L). Sposobnost kružnog mišića, da se kontrahira kao odgovor na betanekol, je značajno smanjena nakon IM. Inhalacijom CO je uspostavljena kontraktilna do kontrolnih razina (IM+CO). ■= IM; ▲=IM+CO.
Slika 10 je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na broj leukocita koji su pozitivni na mijeloperokstdazu (MPO), a koji su migrirali u intestinalni muskularis kontrolnih miševa i nakon intestinalne manipulacije (IM). kontrola= kontrolne životinje; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; IM= životinje podvrgnute IM; IM+CO= životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P<0.0001; n=4.
Slika 11A je graf sa stupcima koji prikazuje rezultate dvostupanjske RT-PCR analize učinaka operacijske anestezije i IM na vremenski period IL-6 mRNA ekspresije. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), i 24 (IM 24h) sata. Pik ekspresije se pojavio 3 do 6 sati nakon operacije. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P<0.0001 u odnosu na kontrolu.
Slika 11B je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na IL-6 mRNA ekspresiju nakon 3 (IM+CO 3h) i 6 (IM+CO 6h) sati poslije operacije. IM 3h i IM 6h= IM kontrolne životinje nakon 3 i 6 sati. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.
Slika 11C je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na oslobađanje IL-6 proteina iz ekstrakata muskularisa koji su dobiveni 24 h nakon operacije. Oslobađanje IL-6 proteina je znatno smanjeno inhalacijom CO. kontrola= kontrolne životinje; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; IM= životinje podvrgnute IM; IM+CO= životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P<0.0001 u odnosu na kontrolu; i ] P=0.001 u odnosu na IM; n=6.
Slika 12A je graf sa stupcima koji prikazuje rezultate dvostupanjske RT-PCR analize učinaka operacijske anestezije i IM na vremenski period IL-1p mRNA ekspresije nakon intestinale manipulacije (IM). Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), i 24 (IM 24h) sata. Pik ekspresije se pojavio 6 sati nakon operacije. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.001 i **P<0.0001 u odnosu na kontrolu, n=6.
Slika 12B je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na IL-1|3 mRNA ekspresiju nakon 3 (IM+CO 3h) i 6 (IM+CO 6h) sati poslije operacije. CO je znatno inhibirao pik IL-1p mRNA ekspresije. IM 3h i IM 6h= IM kontrolne životinje nakon 3 i 6 sati. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.001 u odnosu na IM, n=6.
Slika 12C je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na oslobađanje IL-1(3 proteina iz ekstrakata muskularisa koji su dobiveni 24 h nakon operacije. Oslobađanje IL-13 proteina je znatno smanjeno inhalacijom CO. kontrola= kontrolne životinje; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; IM= životinje podvrgnute IM; IM+CO= životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.001 u odnosu na kontrolu; i t P=0.001 u odnosu na IM; n=6.
Slika 13A je graf sa stupcima koji prikazuje rezultate dvostupanjske RT-PCR analize učinaka operacijske anestezije i IM na vremenski period iNOS mRNA ekspresije. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), i 24 (IM 24h) sata. Pik ekspresije se pojavio 6 sati nakon operacije. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.001; **P<0.0001 u odnosu na kontrolu, n=6.
Slika 13B je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na iNOS mRNA ekspresiju nakon 3 (IM+CO 3h) i 6 (IM+CO 6h) sati poslije operacije. IM 3h i IM 6h= IM kontrolne životinje nakon 3 i 6 sati. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. ] P=0.001 u odnosu na IM, n=6.
Slika 13C je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na ukupno oslobađanje nitrita iz ekstrakata muskularisa koji su dobiveni 24 h nakon operacije. Ukupno oslobađanje nitrita je utvrđeno kao indeks iNOS aktivnosti. Inhalacija CO je znatno inhibirala kirurški potaknuto povećano oslobađanje nitrita iz tretiranog muskularisa. Slično smanjenje nitrita je postignuto inkubacijom ekstrakata muskularisa u prisutnosti selektivnog iNOS inhibitora L-Nil (30 uM; IM+L-Nil). kontrola=kontrolne životinje; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; IM= životinje podvrgnute IM; IM+CO= životinje podvrgnute IM i izložene CO. *P=0.001 u odnosu na kontrolu; 1 P=0.001 u odnosu na IM; n=6. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.
Slika 14A je graf sa stupcima koji prikazuje rezultate dvostupanjske RT-PCR analize učinaka operacijske anestezije i IM na vremenski period COX-2 mRNA ekspresije. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), i 24 (IM 24h) sata. Pik ekspresije se pojavio 3-12 sati nakon operacije. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.001; **P=0.0001 u odnosu na kontrolu, n=6.
Slika 14B je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na COX-2 mRNA ekspresiju nakon 3 (IM+CO 3h) i 6 (IM+CO 6h) sati poslije operacije. IM 3h i IM 6h= IM kontrolne životinje nakon 3 i 6 sati. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.
Slika 14C je graf sa stupcima koji prikazuje kako je inhalacija CO kod kontrolnih životinja znatno povećala COX-2 mRNA ekspresiju 3 sata (CO 3h) nakon tretmana. CO 6h= ekspresija 6 sati nakon tretmana. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.01.
Slika 14D je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na oslobađanje PGE2 proteina iz ekstrakata muskularisa koji su dobiveni 24 h nakon operacije. Oslobađanje PGE2 proteina je utvrđeno kao indeks C0X-2 aktivnosti. Inhalacija CO je znatno povećala oslobađanje proteina iz kontrolnog muskularisa, ali nije imala učinak na kirurški potaknuto povećanje oslobađanja PGE2 iz tretiranog muskularisa. kontrola= kontrolne životinje; kontrola+CO= kontrolne životinje izložene na CO; IM= životinje podvrgnute IM; IM+CO= životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P=0.01 i **P=0.0001 u odnosu na kontrolu; n=6.
Slika 15A je graf sa stupcima koji prikazuje rezultate dvostupanjske RT-PCR analize učinaka operacijske anestezije i IM na vremenski period IL-10 mRNA ekspresije. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), i 24 (IM 24h) sata. Pik ekspresije se pojavio 3 do 6 sati nakon operacije. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P<0.001 u odnosu na kontrolu, n=6.
Slika 15B je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na IL-10 mRNA ekspresiju nakon 3 {IM+CO 3h) i 6 (IM+CO 6h) sati poslije operacije. Inhalacija CO je povećala poruku IL-10 nakon 3 sata, ali ne i nakon 6 sati poslije operacije. IM 3h i IM 6h= IM kontrolne životinje nakon 3 i 6 sati. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.t P=0.001 u odnosu na IM 3h; n=6.
Slika 15C je graf sa stupcima koji prikazuje kako je inhalacija CO kod kontrolnih životinja znatno povećala IL-10 mRNA ekspresiju 3 (CO 3h) i 6 (CO 6h) sati nakon tretmana. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. *P^0.001 u odnosu na kontroli; n=6.
Slika 16A je graf sa stupcima koji prikazuje rezultate dvostupanjske RT-PCR analize učinaka operacijske anestezije i IM na vremenski period HO-1 mRNA ekspresije 3 i 6 sati nakon operacije (IM). Inhalacija CO je znatno povećala HO-1 mRNA ekspresiju nakon 3 (IM+CO 3h), ali ne i nakon 6 (IM+CO 6h) sati poslije operacije. IM 3h i IM 6h= kontrolne životinje nakon 3 i 6 sati. ] P<0.001 u odnosu na IM 3h; n=6
Slika 16B je graf sa stupcima koji prikazuje učinak inhalacije CO na HO-1 mRNA ekspresiju nakon 3 (CO 3h) i 6 (CO 6h) sati poslije operacije. Inhalacija CO je kod kontrolnih životinja povećala HO-1 mRNA ekspresiju 6 sati nakon tretmana. *P<0.05 u odnosu na kontrolu; n=6.
Detaljan opis
Pojam "ugljik monoksid" (ili "CO"), kako je ovdje korišten, opisuje molekulski ugljik monoksid u plinovitom stanju, komprimiran u tekući oblik, ili otopljen u vodenoj otopini. Pojam "smjesa ugljik monoksida" ili "farmaceutska smjesa koja sadrži ugljik monoksid" se kroz ovu specifikaciju koristi da bi se opisala plinovita ili tekuća smjesa koja sadrži ugljik monoksid, a može se primijeniti na pacijentu i/ili na organu, npr. tankome crijevu. Stručnjak će prepoznati koji je oblik farmaceutske smjese, npr. plinoviti, tekući, ili i plinoviti i tekući, najprikladniji za određenu primjenu.
Pojmovi "efektivna količina" i "učinkovito za primjenu", kako su ovdje korišteni, odnose se na primjenu ugljik monoksida, i to kroz određeni vremenski period gdje je uključena akutna ili kronična primjena te periodična ili kontinuirana primjena, u količini iti koncentraciji koja je učinkovita u smislu da njena primjena uzrokuje željeni učinak ili fiziološki odgovor. Učinkovite količine CO za upotrebu u predstavljenome izumu uključuju, npr. količine koje sprečavaju ili smanjuju ileus nakon operacije, npr. transplantacije tankoga crijeva.
Za plinove, efektivne količine CO općenito su unutar raspona od oko 0.0000001% do oko 0.3%, težinski, npr. 0.0001% do oko 0.25%, težinski, poželjno najmanje oko 0.001%, npr. najmanje oko 0.005%, 0.010%, 0.02%, 0.025%. 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.08%, 0.10%, 0.15%, 0.20%, 0.22%, ili 0.24% CO težinski. Za tekuće otopine CO, efektivne količine općenito su unutar raspona od oko 0.0001 do oko 0.0044 g CO/100g tekućine, npr. najmanje oko 0.0001, 0.0002, 0.0004, 0.0006, 0.0008. 0.001, 0.0013, 0.0014, 0.0015, 0.0016, 0.0018, 0.0020, 0.0021, 0.0022, 0.0024, 0.0026, 0.0028, 0.0030, 0.0032, 0.0035, 0.0037, 0.0040, ili 0.0042 g CO/100g vodene otopine. Poželjni rasponi uključuju, npr. oko 0.0010 do oko 0.0030 g CO/100 g tekućine, oko 0.0015 do oko 0.0026 g CO/100 g tekućine, ili oko 0.0018 do oko 0.0024 g CO/100 g tekućine. Stručnjak će uvidjeti da se količine izvan ovih raspona mogu koristiti ovisno o aplikaciji.
Pojam "pacijent" se kroz ovu specifikaciju koristi da bi se opisala životinja, čovjek ili ne-čovjek, kojemu se daje tretman prema postupcima predstavljenoga izuma. Veterinarske primjene jasno su predviđene u predstavljenom izumu. Pojam uključuje, ali nije time ograničen, sisavce, npr. ljude, ostale primate, svinje, glodavce kao što su miševi i štakori, kuniće, zamorce, hrčke, krave, konje, mačke, pse, ovce i koze. Pojam "liječiti (liječenje)" se koristi da bi se opisalo odgađanje početka, inhibicija, prevencija, ili ublažavanje učinaka poremećaja, npr. ileusa. Pojam "donor" ili "pacijent donor", kako je ovdje korišten, odnosi se na pacijenta (ljudskog ili ne-ljudskog) od kojega se može uzeti organ ili tkivo u svrhu transplantacije pacijentu primaocu. Pojam "primalac" ili "pacijent primalac" se odnosi na pacijenta (ljudskog ili ne-ljudskog) kojemu se može prenijeti organ ili tkivo.
Pojam "ileus", kako je ovdje korišten, općenito se odnosi na parcijalnu ili potpunu paralizu ili nepokretnost gastrointestinalnog trakta. Ileus se može javiti duž gastrointestinalnog trakta, ili može uključivati samo jedan ili nekoliko njegovih dijelova, npr. želudac, tanko crijevo ili kolon. Stručnjak će vidjeti da ileus može biti uzrokovan zbog niza faktora koji uključuju, npr. operaciju (npr. bilo koja operacija koja uključuje laparotomiju, npr. transplantacija tankoga crijeva (SITx); ili bilo koja operacija koja uključuje laparoskopiju); intestinalnu ishemiju; retroperitonealni hematom; intraabdominalnu sepsu; intraperitonelanu upalu; akutni apendicitis; upalu žučnog mjehura; pankreatitis; kolike mokraćnoga trakta; lezije toraksa; upalu pluća; infarkt miokarda; metaboličke poremećaje, npr. one koji za posljedicu imaju smanjene razine kalija; lijekove, npr. produžena upotreba opijata; i traume, npr. prijelome kralješnice i rebara (vidi npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Pojam također uključuje postporođajni iteus, što je česti problem za žene u periodu nakon poroda, npr. nakon vaginalnog poroda ("prirodno rođenje djeteta") ili operacijski izvedenog poroda. Kako je ovdje korišten, pojam "postoperacijski ileus" se odnosi na ileus od kojeg pate pacijenti nakon bilo kojeg operacijskog zahvata, npr. operacije abdomena. Pojam "neoperacijske intervencije" se odnosi na medicinski tretman koji ne uključuje operaciju. Pojam "ileus uzrokovan stanjima koja ne uključuju operaciju" se odnosi na ileus koji je posljedica drugih faktora osim operacije, npr. faktora koji su opisani ovdje.
Pojedinci kod kojih postoji rizik od razvoja ileusa mogu posebno imati koristi od izuma, prvenstveno jer preventivni tretman može započeti prije nego što postoji bilo kakav znak ileusa. Pojedinci "kod kojih postoji rizik" uključuju npr. pacijente kojima je potrebna operacija abdomena, bilo da je medicinski potrebna ili izborna, i/ili pojedince koji pate od bilo kojeg poremećaja ili ozljeda, kako je opisano u prethodnom odlomku.
Stručnjak će vidjeti da se pacijent kod kojeg postoji rizik za razvoj ileusa, može odrediti bilo kojim postupkom poznatim u struci, npr. liječničkom dijagnozom.
Pojam "transplantacija" se kroz ovu specifikaciju koristi kao općeniti pojam za opisivanje postupka prijenosa organa ili tkiva (npr. tankog crijeva) u pacijenta. Pojam "transplantacija" se u struci definira kao prijenos živih tkiva ili stanica iz donora primaocu, s namjerom održavanja funkcionalnog integriteta transplantiranog tkiva ili stanica kod primaoca (vidi npr. The Merck Manual, Berkow, Fletcher i Beers, Eds., Merck Research Laboratories, Rahway, N.J., 1992). Pojam uključuje sve kategorije transplantanata poznatih u struci. Transplantanti se kategoriziraju prema mjestu i genetičkoj vezi između donora i primaoca. Pojam uključuje, npr. autotransplantaciju (uklanjanje i prijenos stanica ili tkiva s jednog mjesta pacijenta na isto ili drugo mjesto na istome pacijentu), alotransplantaciju (transplantacija između pripadnika iste vrste), i ksenotransplantaciju (transplantacija između pripadnika različitih vrsta).
Priprema plinovitih smjesa
CO smjesa može biti smjesa plinovitog ugljik monoksida. Komprimirani ili stlačeni plin, koristan u postupcima izuma, može se dobiti iz bilo kojeg komercijalnog izvora, i u bilo kojoj vrsti nosača prikladnog za držanje komprimiranog plina. Npr. komprimirani ili stlačeni plinovi se mogu dobiti iz bilo kojeg izvora koji dobavlja komprimirane plinove, kao što je kisik, za medicinsku primjenu. Pojam plina "medicinske klase", kako se ovdje koristi, odnosi se na plin koji je prikladan za primjenu kod pacijenata kako je ovdje definirano. Plin pod tlakom koji uključuje ugljik monoksid, a koji se koristi u postupcima predstavljenoga izuma, može biti takav da su svi plinovi za željenu konačnu smjesu (npr. CO, He, NO, CO2, O2, N2) u istoj posudi, osim što NO i O2 ne mogu biti pohranjeni zajedno. Po izboru, postupci predstavljenoga izuma se mogu izvesti uz korištenje više posuda koje sadrže pojedine plinove. Npr. jedna posuda može sadržavati ugljik monoksid, sa ili bez drugih plinova, a njezin sadržaj se može po izboru miješati sa sobnim zrakom ili sa sadržajem drugih posuda, npr. posuda koje sadrže kisik, dušik, ugljik dioksid, komprimirani zrak, ili bilo koji drugi prikladan plin ili njihove smjese.
Plinovite smjese koje se daju pacijentu prema predstavljenom izumu, obično sadrže 0% do oko 79% dušika po težini, oko 21% do oko 100% kisika po težini i oko 0.0000001% do oko 0.3% ugljik monoksida po težini (to odgovara oko 1 ppb ili 0.001 ppm do oko 3.000 ppm). Poželjno, količina dušika u plinovitim smjesama je oko 79% po težini, količina kisika je oko 21 % po težini i količina ugljik monoksida je oko 0.0001% do oko 0.25% po težini. Količina CO je poželjno najmanje oko 0.001%, npr. najmanje oko 0.005%, 0.010%, 0.02%, 0.025%. 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.08%, 0.10%, 0.15%, 0.20%, 0.22%, ili 0.24% po težini. Poželjni rasponi uključuju oko 0.005% do oko 0.24%, oko 0.01% do oko 0.22%, oko 0.015% do oko 0.20%, oko 0.08% do oko 0.20%, i oko 0.025% do oko 0.1% po težini. Zabilježeno je da se plinovite smjese ugljik monoksida koje imaju koncentracije ugljik monoksida veće od 0.3% (1% ili više), mogu koristiti u kratkom periodu (npr. jedan ili nekoliko udaha), ovisno o primjeni.
Plinovite smjese ugljik monoksida se mogu koristiti da se stvori atmosfera koja sadrži plin ugljik monoksid. Atmosfera koja sadrži odgovarajuće količine plina ugljik monoksida se može stvoriti, npr. upotrebom posude koja sadrži komprimirani plin koji uključuje plin ugljik monoksida, i oslobađanjem komprimiranog plina iz posude u komoru ili prostor gdje će nastati atmosfera koja uključuje plin ugljik monoksida unutar komore ili prostora. Alternativno, plinovi se mogu osloboditi u uređaj koji završava maskom za disanje ili cijevi za disanje, pri čemu se atmosfera koja uključuje plin ugljik monoksida stvara u maski ili cijevi za disanje, i tako je osigurano da je pacijent jedina osoba u sobi koja je izložena znatnim količinama ugljik monoksida.
Razine ugljik monoksida u atmosferi se mogu mjeriti ili pratiti uz korištenje bilo kojeg postupka poznatog u struci. Takvi postupci uključuju elektrokemijsku detekciju, plinsku kromatografiju, brojanje radioizotopa, infracrvenu apsorpciju, kolorimetriju i elektrokemijske metode koje se temelje na selektivnim membranama (vidi npr. Sunderman i sur, Clin. Chem. 28:2026-2032, 1982; Ingi i sur., Neuron 16:835-842,1996). Pod-dijelovi po milijunu razine ugljik monoksida se mogu detektirati, npr. plinskom kromatografijom i brojanjem radioizotopa. Dalje, poznato je u struci da se razine ugljik monoksida u sub-ppm rasponu mogu mjeriti u biološkom tkivu pomoću midinfracrvenog senzora plina (vidi npr. Morimoto i sur., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280:H482-H488, 2001). Senzori ugljik monoksida i uređaji za detekciju plina su široko dostupni iz mnogih komercijalnih izvora.
Priprema tekućih smjesa
Smjesa ugljik monoksida također može biti tekuća smjesa ugljik monoksida. Tekućina se može napraviti u smjesu ugljik monoksida bilo kojom metodom poznatom u struci kojom se plinovi mogu otopiti u tekućinama. Npr. tekućina se može staviti u tzv. "CO2 inkubator" i izložiti kontinuiranom protoku ugljik monoksida, poželjno uravnoteženog s ugljik dioksidom, sve dok se u tekućini ne postigne željena koncentracija ugljik monoksida. Kao drugi primjer navodimo da se ugljik monoksid može izravno uvoditi u tekućinu sve dok se u tekućini ne postigne željena koncentracija ugljik monoksida. Količina ugljik monoksida koja se može otopiti u određenoj vodenoj otopini, povećava se sa smanjenjem temperature. Kao još jedan primjer, prikladna tekućina se može propustiti kroz cijevi koje omogućuju difuziju plina, pri čemu cijevi prolaze kroz atmosferu koja sadrži ugljik monoksid (npr. korištenjem uređaja kao što je vantjelesni membranski oksigenator). Ugljik monoksid difundira u tekućinu tako da nastaje tekuća ugljik monoksid smjesa.
Vjerojatno je da će takva tekuća smjesa, koja je namijenjena uvođenju u živu životinju, biti na oko 37°C u trenutku kada će se uvoditi u životinju.
Tekućina može biti bilo koja tekućina poznata stručnjacima, a da je prikladna za davanje pacijentima, ili održavanje i/ili ispiranje i/ili perfuziju organa koji su od interesa (vidi npr. Oxford Textbook of Surgerv, Morris i Malt, Eds., CMord University Press (1994)). Općenito, tekućina će biti vodena otopina. Primjeri prikladnih otopina uključuju fiziološku otopinu puferiranu fosfatom (Phosphate Buffered Saline, PBS), Celsior™, Perfadex™, Collinsovu otopinu, otopinu citrata i otopinu Sveučilišta u Wisconsinu (UW) (Oxford Textbook of Surgerv, Morris i Malt, Eds., Oxford Universitv Press (1994). U jednom ostvarenju predstavljenoga izuma tekućina je Ringerova otopina, npr. Ringerova otopina s laktatom, ili bilo koja druga tekućina koja se može koristiti kao infuzija za pacijenta. U drugom ostvarenju tekućina uključuje krv, npr. punu krv.
Bilo koja prikladna tekućina se može zasititi do željene koncentracije ugljik monoksida preko plinskih difuzera. Alternativno, mogu se koristiti prije napravljene otopine koje su ispitane da kvalitetno sadrže određene razine ugljik monoksida. Točna kontrola doze se može postići mjerenjem s membranom propusnom za plin, a nepropusnom za tekućinu, koja je spojena na analizator ugljik monoksida. Otopine se mogu zasititi do željenih učinkovitih koncentracija i održavati na tim razinama.
Liječenje pacijenta sa smjesama ugljik monoksida
Pacijent se može liječiti sa ugljik monoksid smjesom bilo kojom metodom poznatom u struci za primjenu plinova i/ili tekućina pacijentu. Smjese ugljik monoksida se modu dati pacijentu s dijagnozom ileusa ili onome za kojeg je utvrđeno da postoji rizik od ileusa, npr. pacijentima koji idu na operaciju, uključujući pacijente koji se podvrgavaju na SITx. Izum razmatra sistemsku primjenu tekućih ili plinovitih ugljik monoksid smjesa pacijentima (npr. inhalacijom i/ili gutanjem), i topikalnu primjenu smjesa na pacijentov gastrointestinalni trakt (npr. gutanjem, upuhivanjem, i/ili uvođenjem u abdominalnu šupljinu).
Sistemska primjena uaiiik monoksida
Plinovite smjese ugljik monoksida se mogu pacijentu primijeniti sistemski, npr. operiranom pacijentu ili donoru i/ili primaocu pri transplantaciji tankog crijeva. Plinovite smjese ugljik monoksida se obično daju inhalacijom kroz usta ili nazalne puteve do pluća, gdje ugljik monoksid može izravno izazvati učinak ili se može brzo apsorbirati u krvotok pacijenta. Koncentracija aktivne tvari (CO), koja se koristi u terapijskim plinovitim smjesama, će ovisiti o brzinama apsorpcije, distribucije, inaktivacije i izlučivanja (općenito putem disanja) ugljik monoksida, kao i o drugim faktorima koji su poznati stručnjacima. Dalje će biti razumljivo da se za svaki posebni slučaj moraju s vremenom prilagoditi specifični režimi doziranja, a u skladu s individualnim potrebama i profesionalnom procjenom osobe koja daje ili nadgleda davanje smjese, i da su ovdje postavljeni rasponi koncentracija samo primjeri i nije im namjera ograničiti opseg ili izvođenje zahtjevane smjese. Akutna, subakutna i kronična primjena ugljik monoksida se također razmatraju u predstavljenom izumu, a ovisno o npr. ozbiljnosti iieusa kod pacijenta. Ugljik monoksid se može pacijentu dati kroz vrijeme (uključujući neodređeno) koje je dovoljno za liječenje stanja i izazivanje željenog farmakološkog ili biološkog učinka.
Slijede primjeri nekih postupaka i uređaja koji se mogu koristiti za davanje plinovitih ugljik monoksid smjesa pacijentima.
Ventilatori
Ugljik monoksid medicinske klase (koncentracije mogu varirati) se može kupiti miješan sa zrakom ili drugim plinom koji sadrži kisik, u standardnom tanku komprimiranog plina (npr. 21% O2, 79%N2). Nereaktivan je i koncentracije koje su potrebne za postupke predstavljenoga izuma su dosta ispod razine zapaljivosti (10% u zraku). U bolničkom okruženju će se vjerojatno plin postaviti uz krevet gdje će se miješati s kisikom ili okolnim zrakom u mješalici do željene koncentracije u ppm (parts per million, dijelovi na milijun). Pacijent udiše smjesu plinova kroz ventilator koji se postavi na brzinu protoka ovisno o potrebama i ugodi pacijenta. To se utvrđuje pulmonalnim grafovima (tj. brzina disanja, volumeni itd.). Mehanizmi za sigurnost od kvara se mogu ugraditi u sustav primjene, a radi sprečavanja da pacijent nepotrebno primi doze ugljik monoksida veće od potrebnih. Razina ugljik monoksida kod pacijenta se može pratiti motrenjem (1) karboksihemoglobina (COHb), koji se može mjeriti u venskoj krvi, i (2) mjerenjem izdahnutog ugljik monoksida koji je sakupljen iz bočnog otvora ventilatora. Izlaganje ugljik monoksidu se može podesiti na temelju pacijentovog zdravstvenog stanja i na temelju markera. Ako je potrebno, ugljik monoksid se može isprati iz pacijenta uključivanjem inhalacije 100% O2. Ugljik monoksid se ne metabolizira; tako, sve što se udahne će se konačno i izdahnuti osim vrlo malog postotka koji prelazi u CO2. Ugljik monoksid se također može miješati s bilo kojom razinom O2 da se osigura terapijska primjena ugljik monoksida bez posljedičnih stanja hipoksije.
Maska za lice i gaza
Plinovita smjesa koja sadrži ugljik monoksid se pripremi kao i gore da se omogući pasivna inhalacija pacijenta preko maske za lice ili gaze. Inhalirana koncentracija se može promijeniti i isprati jednostavnim prelaskom na 100% O2. Praćenje razina ugljik monoksida će se javiti uz ili blizu maske ili gaze s mehanizmom za sigurnost od kvara koji će spriječiti da se ne udahnu prevelike koncentracije ugljik monoksida.
Prijenosni inhalator
Komprimirani ugljik monoksid se može pakirati u prijenosne uređaje za inhaliranje i inhalirati u odmjerenoj dozi, npr. da se omogući liječenje s prekidima pacijentu koji nije u bolničkom okruženju. U spremnike se mogu pakirati različite koncentracije ugljik monoksida. Uređaj može biti jednostavan kao mali spremnik (npr. ispod 5 kg) prikladno razrijeđenog CO s on-off pregradom i cijevi kroz koju pacijent uzima udah CO prema standardnom režimu ili prema potrebi.
Intravenska umjetna pluća
Umjetna pluća (kateterski uređaj za izmjenu plinova u krvi) izrađena za O2 dopremanje i CO2 uklanjanje, se mogu koristiti za dopremanje ugljik monoksida. Kada se umetnuti kateter smjesti u jednu od većih vena sposoban je dopremiti ugljik monoksid u danim koncentracijama bilo za sistemsku ili lokalnu primjenu. Dopremanje može biti lokalno davanje visokih koncentracija ugljik monoksida kroz kratko vrijeme na mjesto zahvata, npr. u blizini tankog crijeva (ta visoka koncentracija će se brzo razrijediti u krvotoku), ili relativno dugo izlaganje nižim koncentracijama ugljik monoksida (vidi npr. Hattler i sur., Artif. Organs 18(11):806-812 (1994); i Golob i sur, ASAIO J„ 47(5): 432-437 (2001)).
Normobarična komora
U određenim slučajevima je poželjno izložiti cijelog pacijenta ugljik monoksidu. Pacijent se nalazi unutar hermetičke komore koja se napuni s ugljik monoksidom (u razini koja neće ugroziti pacijenta, ili u razini koja nosi prihvatljiv rizik bez rizika da će biti izloženi oni koji stoje pokraj. Kada je izlaganje gotovo, komora se može isprati s kisikom (npr. 21% O2, 79%N2) i analizatori ugljik monoksida mogu analizirati uzorke da se provjeri da nije zaostalo ništa ugljik monoksida prije nego što se pacijentu dopusti da izađe iz sustava izlaganja.
Sistemska primjena tekućih CO smjesa
Predstavljeni izum dalje razmatra kako se mogu napraviti tekuće CO smjese za sistemsku primjenu pacijentu, npr. infuzijom u pacijenta. Npr. tekuće CO smjese, kao što je CO zasićena Ringerova otopina, se mogu infuzijom uvesti u pacijenta prije, za vrijeme i/ili nakon operativnog zahvata. Alternativno ili dodatno, u pacijenta se može infuzijom uvesti CO-parcijalno ili potpuno zasićena puna (ili djelomična) krv. Predstavljeni izum također razmatra kako se mogu koristiti sredstva sposobna za primjenu doza CO plina ili tekućine (npr. gume koje oslobađaju CO, kreme, masti ili flasteri).
Topikalno liječenje gastrointestinalnog trakta s ugljik monoksidom
Alternativno ili dodatno, ugljik monoksid smjese se mogu primjeniti izravno na gastrointestinalni trakt, npr. u unutrašnjost i/ili vanjski dio cijelog gastrointestinalnog trakta, ili na bilo koji njegov dio. Plinovita smjesa se može izravno primjeniti u gastrointestinalni trakt pacijenta, npr. pacijentu koji ide na operaciju ili donoru ili primaocu kod transplantacije tankog crijeva, putem bilo kojeg postupka, poznatog u struci, za upuhavanje plinova u pacijenta. Npr. plinovi, npr. ugljik dioksid, se često upuhuju u gastrointestinalni trakt i abdominalnu šupljinu pacijenata da bi se olakšao pregled za vrijeme endoskopskih, odnosno laparoskopskih postupaka (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Stručnjak će vidjeti da se mogu koristiti slični postupci i za davanje smjesa ugljik monoksida izravno u gastrointestinalni trakt pacijenta. Podrazumijeva se da se predstavljeni izum može primjeniti kao pomoć pri prevenciji ileusa koji je posljedica laparoskopije i endoskopije, npr. kolonoskopije i oseofagogastroduodenoskopije.
Vodene ugljik monoksid smjese se također mogu primjeniti topikalno na gastrointestinalni trakt pacijenta. Vodeni oblici smjesa se mogu dati putem bilo kojeg postupka, poznatog u struci, za davanje tekućina pacijentima. Kao i plinovite smjese, vodene smjese se mogu primjeniti izravno u unutrašnjost i/ili vanjski dio gastrointestinalnog trakta. Npr. vodeni oblik se može dati oralno, npr. tako da pacijent proguta inkapsuliranu ili nekapsuliranu dozu vodene ugljik monoksid smjese. Kao drugi primjer, tekućine, npr. fiziološke otopine koje sadrže otopljeni CO, se mogu dati injekcijom u gastrointestinalni trakt i abdominalnu šupljinu pacijenata za vrijeme endoskopskih, odnosno laparoskopskih zahvata. U vezi sa SITx, in situ izlaganja se mogu izvesti putem bilo kojeg postupka poznatog u struci, npr. preko in situ ispiranja organa s tekućom ugljik monoksid smjesom prije uklanjanja iz donora (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., CMord University Press (1994)).
Održavanje organa ex vivo pri transplantaciji tankog crijeva
Smjese ugljik monoksida se mogu koristiti za liječenje pacijenta koji se podvrgavaju transplantaciji bilo kojeg dijela gastrointestinalnog trakta, npr. transplantaciji tankog crijeva (SITx). U smislu transplantacijskih zahvata, smjese ugljik monoksida se mogu koristiti za tretiranje donora, primalaca i/ili samog organa pri bilo kojem koraku uzimanja organa, spremanja i postupka transplantacije. Gastrointestinalni organ se može uzeti iz donora, tretirati sa smjesom ugljik monoksida ex vivo u skladu s predstavljenim izumom, i transplantirati u primaoca. Alternativno ili dodatno, organ se može tretirati in situ, dok je još u donoru. Po izboru, ugljik monoksid smjesa se može dati primaocu prije, za vrijeme i/ili nakon operacije: npr. nakon što je kroz organ uspostavljena cirkulacija s krvlju primaoca. Smjesa ugljik monoksida se može dati donoru prije ili za vrijeme postupka uzimanja organa iz donora.
Ex vivo izlaganja tankog crijeva (ili njegovog dijela) ugljik monoksidu se mogu izvesti izlaganjem tankog crijeva atmosferi koja sadrži ugljik monoksid plin, tekućoj smjesi ugljik monoksida, npr. protoku tekućine, otopini za čuvanje, otopini za ispiranje koja sadrži otopljeni ugljik monoksid, ili oboje.
Izlaganje tankog crijeva plinovitim smjesama ugljik monoksida se može izvesti u bilo kakvoj komori ili prostoru koji je prikladan za stvaranje atmosfere koja uključuje odgovarajuće količine plina ugljik monoksida. Takve komore uključuju, npr. inkubatore i komore napravljene u svrhu smještanja organa u otopinu za čuvanje. Prikladna komora može biti komora gdje su u unutrašnjoj atmosferi prisutni samo plinovi kojima se komora puni, tako da se koncentracija ugljik monoksida može utvrditi i održavati pri određenoj koncentraciji i čistoći, npr. kada je komora hermetički zatvorena. Npr. može se za izlaganje organa smjesi ugljik monoksida koristiti CO2 inkubator, gdje se u kontinuiranom protoku dovodi ugljik monoksid iz spremnika koji sadrži taj plin.
Izlaganje organa tekućoj smjesi ugijik monoksida može se izvesti ex vivo bilo kojom metodom poznatom u struci. Npr. izlaganje se može izvesti ex vivo u bilo kojoj komori ili prostoru s dovoljnim volumenom za potapanje organa, potpuno ili djelomično, u smjesu ugljik monoksida. Kao drugi primjer, organ se može izložiti ugljik monoksid smjesi tako da se organ stavi u bilo kakav prikladni spremnik i zatim se pusti da ugljik monoksid preplavi organ, tako da je organ izložen kontinuiranom protoku smjese ugljik monoksida.
Kao drugi primjer, organ se može "procirkulirati" sa smjesom ugljik monoksida. Pojam "uspostavljanja cirkulacije" je poznat u struci i odnosi se na prolaz tekućine, npr. smjese ugljik monoksida, kroz krvne žile organa. U odnosu na gastrointestinalni trakt, pojam uključuje puštanje smjese ugljik monoksida u intestinalni lumen. Postupci za uspostavljanje cirkulacije organa ex vivo i in situ su dobro poznati u struci. Organ se može procirkulirati s ugljik monoksid smjesama ex vivo, npr. kontinuiranom perfuzijom s hipotermičkim uređajem (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Po izboru, kod in situ ili ex vivo perfuzije, organ se može procirkulirati s otopinom za ispiranje, npr. UW otopinom bez ugljik monoksida, prije perfuzije sa smjesom ugljik monoksida, a da se ukloni krv donora iz organa. Takav postupak se može izvesti da bi se izbjegla kompeticija za ugljik monoksid od strane donorovog hemoglobina. Kao druga mogućnost, otopina za ispiranje može biti smjesa ugljik monoksida.
Kao idući primjer, organ se može smjestiti, npr. potopiti, u medij ili otopinu koja ne uključuje ugljik monoksid, i staviti se u komoru tako da se medij ili otopina mogu prevesti u smjesu ugljik monoksida putem izlaganja atmosferi koja sadrži ugljik monoksid, kako je ovdje opisano. Kao još jedan primjer, organ se može potopiti u tekućinu koja ne sadrži ugljik monoksid, i ugljik monoksid se zatim uvodi u obliku mjehurića u tekućinu.
Tanko crijevo se iz donora može izvaditi i transplantirati bilo kojom metodom poznatom stručnjacima (vidi, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Stručnjak će vidjeti da metode za transplantaciju, i/ili vađenje organa za transplantaciju, mogu varirati ovisno o mnogim okolnostima, kao što je dob donora/primaoca.
Predstavljeni izum razmatra kako se bilo koji ili svi gore navedeni postupci za izlaganje organa tekućoj smjesi ugljik monoksida, npr. ispiranjem, potapanjem ili perfuzijom, mogu koristiti za određeni zahvat, npr. za pojedini SITx zahvat.
Upotreba hemoksiaenaze-1 i ostalih spojeva
Također se u predstavljenom izumu razmatra indukcija ili ekspresija hemoksigenaze-1 (HO-1) povezano s davanjem ugljik monoksida. U smislu SITx, HO-1 se može po izboru inducirati u organu, donoru organa, primaocu ili sve troje, zajedno s primjenom ugljik monoksida. Npr. HO-1 se može inducirati u donoru, npr. prije ili za vrijeme uklanjanja organa, u organu ex vivo, i/ili u primaocu prije, za vrijeme ili nakon transplantacije. U odnosu na druge (tj. netransplantacijske) zahvate koji mogu lako rezultirati ileusom, HO-1 će se inducirati u crijevu kratko prije, za vrijeme ili ubrzo nakon zahvata. Kako je ovdje korišten, pojam "inducirati" znači izazvati povećanu proizvodnju proteina, npr. HO-1, u izoliranim stanicama ili stanicama tkiva, organa ili životinje uz korištenje staničnih vlastitih endogenih (npr. nerekombinantnih) gena koji kodiraju protein.
HO-1 se može inducirati u pacijentu bilo kojom metodom poznatom u struci. Npr. proizvodnja HO-1 se može inducirati heminom, željezo protoporfirinom, ili kobalt protoporfirinom. Mnoštvo ne-hemskih tvari, uključujući teške metale, citokine, hormone, dušikov oksid, COCl2, endotoksin i toplinski šok, su također jaki tnduktori HO-1 ekspresije (Otterbein i sur., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279: L1029-L1037, 2000; Choi i sur., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; i Tenhunen i sur., J. Lab. Clin. Med. 75:410-421, 1970). HO-1 se također jako inducira nizom tvari i stanjima koja stvaraju oksidativni stres, uključujući vodikov peroksid, uklanjače glutationa, UV zračenje i hiperoksiju (Choi i sur., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; i Keyse i sur., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:99-103, 1989). "Farmaceutska smjesa koja sadrži induktore HO-1" odnosi se na farmaceutsku smjesu koja sadrži bilo koju tvar koja može inducirati HO-1 kod pacijenta, npr. bilo koja gore opisana tvar, npr. hemin, željezo protoporfirin, i/ili kobalt protoporfirin.
HO-1 ekspresija u stanici se može povećati preko prijenosa gena. Kako se ovdje koristi, pojam "ekspresija" se odnosi na povećanje proizvodnje proteina, HO-1 ili feritina, u izoliranim stanicama ili stanicama tkiva, organa ili životinje uz korištenje egzogeno danog gena (npr. rekombinantni gen). HO-1 ili feritin je poželjno od iste vrste (npr. ljudske, mišje, štakori, itd.) kao i primalac, a u svrhu smanjenja svake imune reakcije. Ekspresija može biti vođena konstitutivnim promotorom (npr. sirutka promotor za mliječne stanice ili albumin promotor za stanice jetre). Odgovarajući vektor genske terapije (npr. retrovirus, adenovirus, adeno povezani virus (AAV), virus (npr. vakcina) vodenih kozica, virus humane imunodeficijencije (HIV), mišji virus, virus hepatitisa B, virus gripe, herpes simplex virus-1, i lentivirus) koji kodira HO-1 ili feritin se daje pacijentu oralno, inhalacijski, ili injekcijom u intestinalnu stijenku, intestinalni lumen, abdominalnu šupljinu u bilo koji trenutak prije, za vrijeme i/ili nakon zahvata koji može uzrokovati ileus, npr. oko 24 sata ili upravo prije zahvata koji može uzrokovati ileus. Slično, plazmidni vektori, kodirajući za HO-1 ili apoferitin, se mogu dati, npr. kao gola DNA, u liposomima ili u mikročesticama.
Dalje, egzogeni HO-1 protein se izravno može dati pacijentu bilo kojom metodom poznatom u struci. Egzogeni HO-1 se može izravno dati dodatno, ili kao alternativa indukciji ekspresije HO-1 kod pacijenta kako je opisano prije. HO-1 protein se pacijentu može dati, npr. u liposomima, i/ili kao fuzijski protein, npr. kao TAT-fuzijski protein (vidi npr. Becker-Hapak i sur., Methods 24:247-256, 2001).
Alternativno ili dodatno, bilo koji produkt metabolizma u kojem sudjeluje HO-1, npr. bilirubin, biliverdin, željezo i/ili feritin, se može dati pacijentu zajedno s ugljik monoksidom da bi se spriječio ili liječio ileus. Dalje, predstavljeni izum razmatra kako se mogu pacijentu dati željezo-vezujuće molekule druge osim feritina, npr. desferoksamin (DFO), željezo dekstran, i/ili apoferitin. Predstavljeni izum također razmatra kako se enzimi (npr. biliverdin reduktaza), koji kataliziraju razgradnju bilo kojeg od tih produkata, mogu inhibirati da bi se stvoro/potaknuo željeni učinak. Bilo što od gore navedenog se može primijeniti npr. oralno, intravenski, intraperitonealno, ili izravnom primjenom u unutrašnjost ili van crijeva.
Predstavljeni izum razmatra kako se spojevi koji oslobađaju CO u tijelu nakon primjene spoja (npr. CO-oslobađajući spojevi, npr. fotoaktivirajući CO-oslobađajući spojevi), npr. dimangan dekakarbonil, trikarbonil diklororutenij (II) dimer, i metilen klorid (npr. u dozi između 400 do 600 mg/kg, npr. oko 500 mg/kg), također mogu koristiti u postupcima predstavljenoga izuma, kao i zamjene karboksihemoglobina i CO-donirajućeg hemoglobina.
Primjena bilo koje gore navedene tvari može se dati pacijentu na bito koji način, npr. oralno, intravenski ili intraarterijski. Bilo koji od gornjih spojeva se može dati pacijentu lokalno i/ili sistemski, i u bilo kojoj kombinaciji.
Predstavljeni izum dalje razmatra liječenje ileusa davanjem CO pacijentu u kombinaciji s funkcionalnom stimulacijom pacijentovog intestinalnog trakta, npr. davanjem omekšivača stolice, laksativa, i/ili lubrikanata pacijentu; i/ili intravenskom hidratacijom i/ili nazogastričnom dekompresijom. CO se može dati u kombinaciji s bilo kojom poznatom metodom ili spojevima za liječenje ileusa.
Izum je ilustriran jednim dijelom primjerima koji slijede, a koji se ne smiju uzeti kao ograničavajući za izum u bilo kojem smislu.
Primjer 1. Protektivni učinak ugljik monoksida na ileus induciran transplantacijom
Životinje
Prirodno uzgojeni LEW (RT1) štakori težine 200-300 grama su kupljeni od Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) i držani na odjelu za životinje s laminamim protokom zraka, na Sveučilištu u Pittsburghu. Životinje su hranjene standardnom prehranom ad libitum.
Transplantacija tankog crijeva
Da bi se utvrdilo pruža li CO zaštitu od ileusa koji je povezan s transplantacijom tankog crijeva, izvedena je ortotopična SITx na singeničkim Lewis štakorima. SITx, sa drenažom šupljine, je izvedena uz upotrebu prije opisanih postupaka. Cijelo tanko crijevo donora od Treitzovog ligamenta do ileocekalnog zaliska je izolirano na vaskularnoj stapci koja se sastoji od portalne vene i gornje mezenterične arterije u dodiru sa segmentom aorte. Transplantant je procirkuliran preko segmenta aorte s 5 ml ohlađene laktatne Ringerove otopine, i intestinalni lumen je naplavljen sa 20 ml hladne fiziološke otopine koja sadrži 0.5% neomicin sulfata (Sigma, St. Louis, MO). S kraja na stranu anastomoze između aorte transplantanta i infrarenatne aorte primaoca, te između portalne vene transplantanta i vene cave primaoca, su izvedene s 10-0 Novafil™ koncem. Hladno ishemično vrijeme je bilo 1 sat. Uklonjeno je cijelo crijevo primaoca i enterični kontinuitet je uspostavljen proksimalnim i distalnim, s kraja na kraj, intestinalnim anastomozama. Životinje primaoci su primale 20 mg/dan cefamandol nafata radi prevencije, kroz 3 postoperativna dana. Transplantirani primaoci su dobili vodu 3 sata nakon operacije, i nahranjeni su 24 sata nakon operacije.
Eksperimentalne skupine
U ovome istraživanju su ispitane 4 skupine životinja, od kojih su 2 podvrgnute SITx. Skupina 1 se sastojala od neoperiranih normalnih štakora. Skupina 2 životinja je izložena CO bez operacije. U skupini 3 je izvedena singeneička SITx i primaoci su držani na sobnom zraku. Skupina 4 se sastojala od SITx primaoca koji su smješteni u CO komoru 1 sat prije operacije i zatim su ponovo izloženi na CO odmah nakon operacije, sve dok nisu žrtvovani. U skupinama 3 i 4 donori su bili normalni LEW štakori.
CO izlaganje
Životinje su izložene CO pri koncentraciji od 250 ppm. Kratko je 1% CO u zraku miješan sa zrakom (21% kisika) u cilindru za miješanje od nehrđajućeg čelika i zatim usmjeren u 3.70 ft3 staklenu komoru za izlaganje pri brzini protoka od 12 L/min. CO analizator (Interscan, Chatsvvorth, CA) je korišten za kontinuirano mjerenje razina CO u komori. Koncentracije CO su održavane na 250 ppm cijelo vrijeme. Životinje su dobivale hranu i vodu za vrijeme izlaganja.
Funkcionalna ispitivanja
Učinak CO tretmana na intestinalnu nepokretljivost kod transplantiranih kalema je određen i in vitro i in vivo. Tkiva su uzeta 24 ili 48 sati nakon operacije, a što se pokazalo kao vrijeme u kojem kulminira transplantacijom potaknuta nepokretljivost. In vitro mehanička aktivnost kružnog mišića je mjerena kako je prije opisano (Eskandari i sur., Am. J. Phvsiol. 273(3 Pt 1):G727-34 (1997)). Štakori su anestezirani i ubijeni iskrvarenjem 24 sata nakon operacije. Dio središnjeg jejunuma je pričvršćen u Sylgaard™ linijsku posudu za seciranje koja sadrži preoksigenirani Krebs-Ringerov bikarbonatni pufer (KRB; mM: 137.4 Na+, 5.9 K+, 2.5 Ca2+, 1.2 Mg2+, 134 Cl-, 15.5 HCO3-, 1.2 H2PO4-, i 11.5 glukoza) koji je uravnotežen s 97% O2/3% CO2. Crijevo je otvoreno duž mezenterične granice i mukoza je uklonjena skidanjem s finom pincetom. Vrpce muskularisa pune debljine (1 x6 mm) su izrezane paralelno prema sloju kružnog mišića. Vrpce mišića su postavljene u standardne horizontalne mehaničke komore organa, a kroz koje je kontinuirano proticao preoksigenirani KRB održavan na 37°C. Jedan kraj svake vrpce je pričvršćen za fiksirani držač, a drugi za izometrični transduktor sile (WPI, Sarasota, FL). Trake su ostavljene da se uravnotežuju kroz 1 sat, nakon čega su dodatno razvučene u dužinu na kojoj se javlja maksimalna spontana kontrakcija (Lo). Nakon drugog perioda uravnoteženja od 30 minuta, krivulje kontraktilnost-odgovor su dobivene izlaganjem tkiva povećanim koncentracijama muskarinskog agonista betanekola (0.3 do 300 uM) kroz 10 minuta, nakon čega slijedi period ispiranja od 10 minuta. Kontraktilna aktivnost je računata integriranjem područja ispod krivulje, normalizirana pretvaranjem težine i dužine vrpci u kvadratne milimetre tkiva (1.03 mg/mm2) i zabilježena je kao g/s/mm2.
Intestinalni prijenos je mjeren kod kontrolnih i tretiranih životinja 48 sati nakon operacije, a pomoću procjene intestinalne distribucije dekstrana koji je obilježen fluoresceinom (Molecular Probes). Životinje su lagano sedirane inhaliranjem izofturana i hranjene oralno s označenim dekstranom (200 μl 6 mg/ml u fiziološkoj otopini). Dva sata nakon primjene životinja je žrtvovana i uzeto je cijelo crijevo od želuca do distalnog kolona. Sadržaji želuca, tankog crijeva (podijeljeno u 10 dijelova jednake dužine), slijepog crijeva i kolona (3 segmenta; proksimaini, srednji i distalni) su otvoreni, stavljeni u 2 ml fiziološke otopine, i snažno miješani da se oslobodi dekstran prisutan u svakom segmentu. Nakon dobivanja kuglica intestinalnog tkiva i smjese, alikvoti supernatanta su mjereni u duplikatu na pločici čitača (CytoFluor II; valna duljina ekscitacije 530 nm i emisije 590 nm) radi kvantifikacije fluorescentnog signala u svakom segmentu crijeva. Srednji histogram signala fluorescencije je zatim crtan da se vide promjene u raspodjeli obilježenog dekstrana među eksperimentalnim skupinama. Intestinalni prijenos je utvrđen statističkom analizom računanjem geometrijske sredine (GC).
Morfološka ispitivanja
Histopatološka ispitivanja
Kalemi tankog crijeva su fiksirani u 10%-tnom puferiranom formalinu i položeni u parafin. Rezani su dijelovi debljine 4 um i zatim su napravljene mrlje s hematoksilinom i eozinom.
Histokemiia mijeloperoksidaze
Pripremljeni su puni uzorci muskularisa na objektnom stakalcu iz srednjeg tankog crijeva koje je uzeto 24 sata nakon operacije. Segmenti crijeva su uronjeni u KRB u Sylgaard™ staklenu linijsku posudu i pričvršćeni bez razvlačenja duž mezenteričke granice. Dužina i širina segmenata je izmjerena šestarom za mjerenje šupljina. Zatim je otvoren kolon duž mezenteričke granice i razvučen do 150% dužine i 250% širine. Mukoza i submukoza su uklonjene korištenjem fine pincete, i preostalo tkivo je fiksirano u 100% denaturiranom alkoholu kroz 30 minuta. Nakon nekoliko ispiranja s PBS, tkivo je tretirano Hanker-Yates reagensom za detekciju polimorfonuklearnih neutrofila (PMN) koji pokazuju mijeloperoksidaznu (MPO) aktivnost (Sheibani i sur., Am. J. Clin. Pathol. 75(3):367-70 (1981)). Tkiva su stavljena na staklene pločice uz korištenje Gel/Mount™ (Biomedia Corp., Foster City, CA), prekrivena i pregledena svjetlosnim mikroskopom (Nikon FXA, Fryer, Huntley, IL) pri povećanju od 200×. Broj MPO-pozitivnih PMN koji su infiltrirali vanjski muskularis je određen iz srednjih mjerenja dobivenih iz 5 do 6 susjednih optičkih polja centriranih između mezenteričnih i antimezenteričnih granica.
Molekularno biološka ispitivanja
Test RNAza zaštite (RPA)
Da bi se ispitala analiza sekvence ekspresije mRNA citokina u mukozi i muskularisu, izveden je test RNAza zaštite s Riboquant™ setom (Pharmingen) prema postupku proizvođača. Sintetizirane su radioobilježene anti RNA (RNA komplementarna mRNA, za nju se veže i inhibira dalju translaciju i sintezu proteina) višestruke probe uz korištenje in vitro transkripcijskog seta i seta sa citokinskim multi-probama štakora (rCK-1), koji uključuje probe za citokine (Interleukin (IL)-1a, IL-13, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, TNF-β i IFN-γ) i funkcionalne gene svih stanica (L32 i GAPDH). 32P-obilježene probe (8.0×105 cpm) i uzorak RNA (5 μg) su hibridizirani na 56°C kroz 12-16 sati, i jednolančane RNA, uključujući anti RNA probe, su razgrađene uz korištenje RPA Kit (Pharmingen). Zaštićene probe su napunjene na 40%-tni poliakrilamidni gel. Izvedena je autoradiografija uz korištenje Phosphorlmager™ sustava (Molecular Dvnamics, Krefeld, Njemačka). Kvantifikacija radioaktivnosti vrpci mRNA je izvedena sa NIH Image, normalizirana na GAPDH i izražena kao omjer citokint/GAPDH (n=3-4).
SYBR Green RT-PCR
Učinci inhalacije CO na transplantacijom induciranu ekspresiju proinflamatornih i antiinftamatornih gena su određeni u ekstraktima muskularisa pomoću RT-PCR. Vanjski muskularis je uzet iz normalnog crijeva i transplantiranih kalema 4 sata nakon operacije te zamrznut u tekućem dušiku. Ova vremenska točka pada unutar raspona maksimalne ekspresije medijatora upale, a koji je između 3 i 6 sati nakon abdominalne incizije. Ukupna RNA ekstrakcija je izvedena uz korištenje gvanidij-tiocijanat fenol-kloroform metode ekstrakcije kako je prije opisano (Eskandari i sur., Am. J. Clin. Pathol. 75(3):367-370 (1997)). Kuglice RNA su resuspendirane u RNA-sigurnoj otopini za resuspendiranje (Ambion Inc., Austin, TX), nakon čega slijedi uklanjanje potencijalno kontaminirajuće DNA pomoću tretiranja sa DNAzom I (DNA-Free Kit, Ambion Inc., Austin, TX). Jednaki alikvoti (5 μg) ukupne RNA iz svakog uzorka su kvantificirani spektrofotometrijom (valna duljina 250 nm) i izjednačeni na koncentraciju od 40 ng/ul. Pik mRNA ekspresije je određen u duplikatu pomoću SYBR Green dvostupanjske RT-PCR. GAPDH je korišten kao endogena referenca. Alikvotna RNA je podvrgnuta sintezi prvog lanca komplementarne DNA (cDNA) uz korištenje nasumičnth heksamera (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) i Super Script II™ (Life Technologies, Rockville, MD). Sekvence primera su dobivene iz literature ili napravljene u skladu s objavljenim sekvencama (Tablica 1). PCR reakcijska smjesa je pripremljena SYBR Green PCR Core reagensima (PE Applied Biosvstems). Svaki uzorak je procijenjen u duplikatu uz uvjete koje je preporučio proizvođač. Reakcija je inkubirana na 50°C kroz 2 minute da se aktivira uracii N'-glikozilaza i zatim kroz 12 minuta na 95°C da se aktivira Amplitaq Gold™ polimeraza, nakon čega slijedi 40 ciklusa na 95°C kroz 15 sekundi i na 60°C kroz 1 minutu na ABI PRISM 7700™ sustavu za detekciju sekvence (PE Applied Biosvstems, Foster City, CA). RT-PCR podaci su ucrtani kao ARn signal fluorescencije prema broju ciklusa. Arbitrarni prag je postavljen na srednji-linijski dio grafa log ARn ciklusa. Ciklus praga (CT) je definiran kao broj ciklusa u kojem ARn prelazi prag. Kvantitativno mjerenje mRNA ekspresije je normalizirano prema GAPDH i izračunato u odnosu na kontrolu uz korištenje komparativne Ct metode (Schmittgen i sur., J. Biochem. biophvs. methods46(1-2):69-8 (2000)).
Da se isključi PCR nastanak kontaminirajuće genske DNA, uključene su u svaku PCR reakciju RT-negativne kontrole (uzorci koji sadrže RNA koja nije reverzno transkribirana). Za svaku reakciju je izvedena analiza krivulje taljenja da se osigura nastanak specifičnog produkta. Dodatno, primeri su podvrgnuti gel elektroforezi da se potvrdi odsutnost nespecifičnih vrpci i da se potvrdi da su produkti ispravne veličine. Učinkovitost PCR-amplifikacije ciljne cDNA je pregledana radi mjerenja kolinearnosti razrjeđenja. Serijska trostruka razrjeđenja cDNA su izvedena u triplikatu. Standardne krivulje su dobivene ucrtavanjem Ct prema relativnom broju unešenih kopija. Nagibi standardnih krivulja -3.2±0.3 s koeficijentima korelacije 0.99 su smatrani prihvatljivima, s odgovarajućom učinkovitošću od 100±10%.
Tablica 1. Sažetak primera
[image]
Northern Blott za HO-1
Northern Blott je izveden kako je prije opisano (Camhi i sur., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 13:387-398 (1995)). Ukratko, 10 μg od ukupno ekstrahirane RNA iz tkiva, kako je gore opisano, se podvrgne elektroforezi u 1 % agar gelu i zatim prenese na najlonske membrane pomoću kapilarnosti. Najlonske membrane se zatim prehibridiziraju u hibridizacijskom puferu [1% goveđi serumski albumin (BSA), 7% SDS, 0.5 mM PO4 pufer, pH 7.0, i 1 mM EDTA] na 65°C kroz 2 sata, nakon čega slijedi hibridizacija s 32P-obilježenom probom HO-1 cDNA iz štakora, 32P-obilježenom L-feritin probom iz štakora, ili 32P-obilježenom H-feritin oligonukleotid probom iz štakora, na 65°C kroz 24 sata. Najlonske membrane su zatim isprane u puferu A (0.5% BSA, 5% SDS, 40 mM PO4 pufer, pH 7.0, i 1 mM EDTA) kroz 15 minuta dva puta na 65°C, za čim slijede ispiranja u puferu B (1% SDS, 40 mM PO4 pufer, pH 7.0, i 1 mM EDTA) kroz 15 minuta 3 puta na 65°C.
HO-1 cDNA proba
cDNA (pHO1) pune dužine iz štakora, je velikodušno omogućio Dr. S. Shibahara sa Tohoku Sveučilišta (Sendai, Japan). pHO1 je subklonirana u pBluescript vektor, i HindIII/ecoRI razgradnja je izvedena da se izolira 0.9-kb HO-1 cDNA van iz pBluescript vektora. Radi kontrole varijacije bilo količine RNA u različitim uzorcima, ili pogrešaka u punjenju, mrlje su hibridizirane s oligonukleotidnom probom koja odgovara 18S rRNA. Sintetiziran je oligonukleotid s 24 para baza (5'-ACGGTATCTGATCGTCTTCGAACC-31; SEK 1D BROJ: 17) komplementaran 18S rRNA, uz korištenje DNA sintetizatora (Applied Biosystems, Foster City, CA). HO-1 cDNA je obilježena s [32P] CTP uz korištenje seta s nasumičnim primerima od Boehringer Mannheim (Mannheim, Njemačka). Sve oligonukleotidne probe su označene s [32P] ATP na 3' kraju s terminalnom deoksinukleotidiltransferazom (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Autoradiografski signali su uspoređeni s 18S rRNA dobivenom iz iste mrlje.
Utvrđivanje serumskih razina citokina
Uzorci seruma su uzeti po redu nakon 1, 4 i 24 sata nakon reperfuzije i pohranjeni na -80°C sve do analize. Serumske koncentracije citokina, uključujući IL-6, IL-10 i TNFα, su određene uz korištenje setova imunotesta povezanog s enzimom (ELISA) iz štakora, a kako je opisao proizvođač (R&D, Cambridge, MA).
Mjerenje serumskih razina nitrit/nitrat
Radi praćenja stabilnih konačnih produkata NO metabolizma, mjerene su razine serumskog nitrit/nitrata nakon 1, 4 i 24 sata, uz korištenje komercijalno dostupnog test seta (Cayman, Ann Arbor, MI) i kvantificirane prema uputama proizvođača. U ovom testnom sustavu nitrat se reducira do nitrita uz korištenje nitratne reduktaze, i tako se zatim mjere koncentracije nitrita u uzorku preko Griessove reakcije.
Kultura mišićnih stanica
Tanko crijevo kontrolnih i transplantiranih štakora je uklonjeno (pod sterilnim uvjetima) 24 sata nakon operacije. Kolon je ostavljen in situ. Crijevo je preneseno u sterilnu čašu koja je bila napunjena Hankovom uravnoteženom slanom otopinom (Sigma, St. Louis, MO) s 200 U/ml penicilina G i 200 ug/ml streptomicina (HBSS). Muskularisi su izdvojeni kako je gore opisano i stavljeni na sterilnu gazu. Određena je vlažna težina uzoraka i napravljeni su alikvoti tkiva od 150-200 miligrama. Tkiva su dva puta isprana u HBSS. Alikvoti su preneseni u 35 mm pločice za kulture koje sadrže 3 ml DMEM bez seruma s penicilin/streptomicinom, kao gore, i zatim se inkubira kroz 24 sata u 5% CO2 inkubatoru na 37°C. Nakon perioda inkubacije 1 ml alikvoti supernatanta su smrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80°C. Razine citokin proteina su mjerene putem ELISA i normalizirane na vlažnu težinu tkiva. Korišteni su komercijalno dostupni ELISA setovi prema uputama proizvođača.
Analiza podataka
Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost pius ili minus standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Statistička analiza je izvedena preko student testa ili su bile prikladne analize varijacija (ANOVA). Razina vjerojatnosti od p^O.05 se smatra statistički značajnom.
CO suprimira razvoj intestinalne disfunkcije povezane sa SITx
Učinci SITx i tretmana s CO na spontanu i betanekol-stimuliranu kontraktilnost intesttnalnog kružnog mišića su proučavani u in vitro pokusima kupke organa. Tkiva su uzeta 24 sata nakon reperfuzije transplantiranog intestinalnog kalema. Vrpce mišića iz kontrolnog crijeva pokazivale su normalne kontrakcije (podaci nisu prikazani). Tretman s CO kroz 24 sata nije imao učinka na spontanu kontraktilnu aktivnost kod neoperiranih kontrolnih štakora (podaci nisu prikazani). Nakon SITx, spontana kontraktilna aktivnost je izgubljena (podaci nisu prikazani). CO tretman je vratio spontanu kontraktilnu aktivnost kod transplantiranih štakora (podaci nisu prikazani).
Dodatak betanekola (0.3 do 300 μM) u kupku superfuzata potaknuo je 0 koncentraciji ovisne tonične kontrakcije. Integrirani kontraktilni odgovori normalizirani prema području tkiva i dobiveni kao odgovori prema povećanim dozama betanekola, prikazani su na Slici 1. Kod kontrolnih životinja je snaga kontrakcije bila ovisna o koncentraciji u rasponu od 10 do 300 uM betanekola, s maksimalnom snagom 3.5±0.7 g/mm2/s u odgovoru na 100 μM betanekola. Tretman s CO nije imao učinka na kontraktilnost kod neoperiranih životinja (maksimalna snaga kontrakcije 3.2+0.5 g/mm2/s). SITx je doveo do smanjenja snage kontrakcije što je dobiveno kroz krivulju doza-učinak u usporedbi s kontrolama koje su dostigle statističku važnost pri koncentracijama betanekola većim od 10 μM. Pri 100 uM betanekola se maksimalna snaga kontrakcije smanjila za 49% na 1.7±0.4 g/mm2/s. Tretman s CO je spriječio inhibitorni učinak SITx kroz krivulju doza-učinak i vratio maksimalne snagu kontrakcije na kontrolne razine (3.6±0.7 g/mm2/s).
Intestinalni prijenos je mjeren kod kontrolnih i transplantiranih životinja 48 sati nakon operacije, procjenom intestinalne distribucije oralno davanog dekstrana koji je bio obilježen fluoresceinom. Slike 2A-2B su histogrami prijenosa koji ilustriraju raspodjelu neapsorbilnog FITC-obilježenog dekstrana duž gastrointestinalni trakt (od želuca do kolona) 2 sata nakon oralne primjene. Na Slici 2A je nacrtan srednji histogram fluorescencije u svakom dijelu crijeva, 2 sata nakon oralne primjene, kod neoperiranih kontrolnih štakora i kod kontrolnih štakora koji su tretirani s CO. U obje skupine se većina fluorescentnih oznaka nalazila u dijelovima 9 i 10 tankog crijeva, te u slijepom crijevu. To je u suprotnosti prema raspodjeli koja je opažena kod transplantiranih štakora (Slika 2B), gdje su fluorescentne oznake nađene prvenstveno u želucu, a neke oznake su ulazile u proksimalni dio tankog crijeva. Kod transplantiranih životinja koje su tretirane s CO, raspodjela oznaka je bila distalnija s time da su se prvenstveno nakupile u dijelovima 6, 7 i 8 tankog crijeva. Statističke analize rezultata računanja geometrijske sredine, sažete na Slici 2C, prikazuju kako je inhalacija CO značajno poboljšala intestinalni prijenos kod štakora koji su bili podvrgnuti transplantaciji tankog crijeva.
Mobilizacija leukocita
Stanični upalni događaji u muskularisu tankog crijeva su karakterizirani 24 sata nakon SITx. Da bi se izračunala infiltracija ieukocita u tkivima kontrolnih i transplantiranih životinja, sa i bez CO tretmana, korištena je mijeloperoksidazna (MPO) aktivnost, kako je utvrđena Hanker-Vatesovom histokemijom. Kod neoperiranih i CO tretiranih kontrolnih štakora MPO-pozitivne stanice su bile rijetke (podaci nisu prikazani). SITx je rezultirala značajnom mobilizacijom leukocita u intestinalni muskularis (podaci nisu prikazani). Brojevi stanica po 200× polju su sažeti na Slici 3, koja prikazuje kako je CO tretman smanjio srednji broj MPO pozitivnih stanica; ipak, ovo smanjenje nije dostiglo statističku važnost (p=0.08, n=6).
Analiza sekvence citokina u mukoznim i muskularnim slojevima
RNAza zaštitni test je pokazao da je SlTx uzrokovao značajno povećanje i IL-6 i IL-1p mRNA, s pikom 3-6 sati unutar transplantiranog kalema (Slike 4A i 4B). Sukladno tome, razine medijatora upale mRNA su analizirane 4 sata nakon reperfuzije.
Molekularni upalni odgovor
Slika 5 je set grafova sa stupcima koji ilustriraju učinak CO na sintazu dušikovog oksida (iNOS), IL-6, IL-1(3 i IL-10 ekspresiju u vanjskom muskularisu intestinalnog transplantanta 4 sata nakon uspostavljanja cirkulacije. RT-PCR analiza je pokazala značajni porast ekspresije proinflamatorne citokin mRNA (IL-6 (3400-namota) i IL-1p (38-namota) u vanjskom muskularisu intestinalnog transplantanta. TNFα je također porastao, ali u manjem stupnju (3-namota). ICAM-1 ekspresija gena, adhezijske molekule koja ima važnu ulogu u mobilizaciji cirkulirajućih upalnih stanica, je povećana 14-namota. U štakorima primaocima koji su tretirani s CO, srednja relativna IL-6 i IL-1β ekspresija su smanjene (za 40% i 50%), dok je ekspresija TNFα i ICAM-1 ostala nepromijenjena. Zbog velike standardne devijacije među transplantiranim skupinama, smanjenje IL-6 mRNA ekspresije kod CO tretiranih štakora nije postiglo statističku važnost (p=0.084, n=6), dok je IL-1β ekspresija znatno smanjena (p=0.046, n=6). Ekspresija gena inducibilnih oblika ciklooksigenaze (COX-2) i sintaze dušik oksida (iNOS) je također znatno povećana u muskularisu transplantiranih kalema (5-namota i 48-namota). Srednja relativna mRNA ekspresija oba enzima je smanjena za oko 50% kod CO tretiranih štakora. Ponovo, redukcija iNOS ekspresije nije bila dovoljno značajna (p=0.060, n=6), dok je redukcija COX-2 ekspresije bila dosta značajna (p=0.26, n=6). Sama inhalacija CO nije imala učinka na ekspresiju bilo kojih proučavanih medijatora.
Slika 6 je set grafova sa stupcima koji ilustriraju učinak CO na serumske koncentracije IL-6 i nitrat/nitrita kod životinja koje su primile intestinalne transplantante, a mjereno je 1 i 4 sata nakon uspostavljanja cirkulacije. Da bi se dobili ti podaci, uzeti su uzorci seruma u različitim vremenima nakon transplantacije, i pohranjeni su na -80°C sve do mjerenja. Serumske koncentracije IL-6 su utvrđene uz korištenje seta imunotesta povezanog s enzimom (ELISA) iz štakora (R&D, Cambridge, MA). Razine serumskog nitrit/nitrata, stabilnih konačnih produkata NO metabolizma, mjerene su uz korištenje komercijalno dostupnog test seta (Cayman, Ann Arbor, Ml). U ovom testnom sustavu nitrat se reducira do nitrita uz korištenje nitratne reduktaze, i tako se zatim mjere koncentracije nitrita u uzorku preko Griessove reakcije. Serumske razine IL-6 i nitrit/nitrata, kod životinja koje su podvrgnute SITx i tretirane sa zrakom, su se povećale s vremenom. Životinje koje su podvrgnute SITx i tretirane s CO (SITx+CO) imale su znatno niže serumske razine i IL-6 i nitrit/nitrata.
Podaci koji pokazuju da CO štiti od transplatacijom inducirane intestinalne disfunkcije su svrstani u Tablici 2, ispod. Kratko (<48 h) nakon SITx, intestinalni transplantatni su imali znatno odgođen intestinalni prijenos, smanjuju mišićnu kontraktilnost i masivne inflamatorne infiltracije. Te promjene su smanjene kod primaoca koji su tretirani s CO. Serumske koncentracije IL-6 (4 h nakon reperfuzije) su bile znatno niže za SITx sa CO, u usporedbi za SITx bez CO. CO je spriječio upalu intestinainog transplantanta i I/R povredu povezanu sa SITx, a tako što je smanjio proinflamatorne citokine IL-6 i IL-1.
Tablica 2: CO suprimira intestinalnu disfunkciiu povezanu sa SITx
[image]
Primjer 2. CO suprimira razvoj ileusa koji je povezan s operacijskim zahvatom tankoga crijeva
Životinje
C57B16 divlji tip mužjaka miševa je nabavljen od Hartan (Indianapolis, IN). Miševi su smješteni u nepatogeni prostor, izlagani su 12 satnom svjetlo/mrak ciklusu i hranjeni komercijalno dostupnom hranom za glodavce i vodom ad libitum.
Eksperimentalne skupine i operativni zahvati
Miševi iste dobi su podijeljeni u 4 eksperimentalne skupine: izvorne kontrole (kontrola); kontrola tretirana s CO (kontrola+CO); miševi podvrgnuti operativnom zahvatu na tankom crijevu (IM); te miševi podvrgnuti operativnom zahvatu i tretmanu s CO (IM+CO).
Operativni zahvat Miševi su anestezirani inhaliranjem izoflurana i abdomen je otvoren laparotomijom po sredini. Tanko crijevo je odvojeno i lagano stisnuto duž cijele svoje dužine korištenjem navlaženih sterilnih pamučnih aplikatora. Ovaj postupak je napravljen radi simulacije "kretanja" crijeva, a uobičajeno se izvodi za vrijeme abdominalnih operacija u kliničkom okruženju. Crijevo je vraćeno na prijašnje mjesto u abdominalnoj šupljini i rez je zatvoren sa dva sloja kontinuiranih šavova. Zahvat je trajao oko 15 minuta i životinje su se slobodno kretale unutar kaveza 20 minuta nakon uklanjanja anestetika.
CO inhalacijski tretman. Miševi smješteni u kaveze, su preseljeni u komore od pleksiglasa koje su kontinuirano ventilirane sa zrakom ili sa zrakom koji sadrži CO (250 ppm). Korišteno je uzimanje uzoraka radi kontinuiranog praćenja koncentracija ugljik monoksida unutar komore. Životinje su imale slobodan pristup hrani i vodi cijelo vrijeme. Miševi su izloženi CO ili zraku 1 sat prije laparotomije, premješteni radi operativnog zahvata i zatim vraćeni u komoru na još 24 sata. Miševi koji nisu išli na operaciju su maknuti iz komore na sličan vremenski period i zatim su vraćeni u komoru na još 24 sata.
Morfološka ispitivanja
MPO histokemija. Pripremljeni su puni uzorci muskularisa na objektnom stakalcu iz srednjeg jejunuma koji je uzet 24 sata nakon operacije. Segmenti crijeva su uronjeni u KRB u Sylgaard™ staklenu linijsku posudu (Midland, MI) i pričvršćeni bez razvlačenja duž mezenteričke granice. Dužina i širina segmenata je izmjerena šestarom za mjerenje šupljina. Zatim je otvoren jejunum duž mezenteričke granice i razvučen do 150% dužine i 250% širine. Mukoza je uklonjena korištenjem fine pincete, i preostalo tkivo je fiksirano u 100% denaturiranom alkoholu kroz 30 minuta. Nakon nekoliko ispiranja s PBS, tkivo je tretirano Hanker-Yates reagensom (Polysciences, Warrington, PA) za detekciju polimorfonuklearnih neutrofila (PMN) koji pokazuju mijeloperoksidaznu (MPO) aktivnost (Sheibani i sur., Am. J. Clin. Pathol. 75(3):367-70 (1981)). Tkiva su stavljena na staklene pločice uz korištenje Gel/Mount™ (Biomedia Corp., Foster City, CA), prekrivena i pregledena svjetlosnim mikroskopom (Nikon Microphot-FXA, Fryer, Huntley, IL) pri povećanju od 200×. PMN su brojani u 5 do 6 susjednih optičkih polja centriranih između mezenteričnih i antimezenteričnih granica.
HO-1 imunohistokemija. Pripremljeni su puni uzorci muskularisa na objektnom stakalcu kao gore i fiksirani u Zamboni fiksator kroz 1 sat, razbistren sa DMSO. Nakon nekoliko ispiranja s PBS, tkiva su tretirana s PBS koji sadrži 10% normalnog magarećeg seruma i 0.1% Triton-X. Puni uzorci na objektnom stakalcu su inkubirani preko noći sa anti-štakorskim HO-1 antitijelom iz zeca (1:500, Stressgen, Vancouver, Canada), isprani, i inkubirani 2 sata s anti-zečjim lgG-Cy3 konjugatom iz magarca (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Tkiva su stavljena na staklene pločice uz korištenje Gel/Mount™ kao gore, i pregledena fluorescentnim mikroskopom (Nikon Microphot-FXA, Huntlev, IL).
Funkcionalna ispitivanja
Miševi su anestezirani i ubijeni iskrvarenjem na kraju 24-satnog tretmana u komori s CO ili sobnim zrakom. In vitro mehanička aktivnost kružnog mišića je mjerena kako je prije opisano u Eskandari i sur. (Am. J. Physiol. 273:G727-G734 (1997)). Ukratko, dio srednjeg tankog crijeva je pričvršćen u Svlgaard™ (Midland, Ml) linijsku posudu za seciranje koja sadrži preoksigenirani Krebs-Ringerov bikarbonatni pufer (KRB; mM: 137.4 Na+, 5.9 K+, 2.5 Ca2+, 1.2 Mg2+, 134 Cr, 15.5 HCO3-, 1.2 H2PO4-, i 11.5 glukoza) s plinom 97% O2/3% CO2 radi uspostavljanja pH 7.4. Crijevo je otvoreno duž mezenterične granice i mukoza je uklonjena skidanjem s finom pincetom. Vrpce muskularisa pune debljine (1×6 mm) su izrezane paralelno prema sloju kružnog mišića i postavljene u standardne horizontalne mehaničke komore organa, a kroz koje je kontinuirano proticao preoksigenirani KRB održavan na 37°C. Jedan kraj svake vrpce je pričvršćen za fiksirani držač, a drugi za izometrični transduktor sile (WPI, Sarasota, FL). Trake su ostavljene da se uravnotežuju kroz 1 sat, nakon čega su dodatno razvučene u dužinu na kojoj se javlja maksimalna spontana kontrakcija (Lo). Nakon perioda snimanja od 30 minuta, krivulje kontraktilnost-odgovor su dobivene izlaganjem tkiva povećanim koncentracijama muskarinskog agonista betanekola (0.3 do 300 μM) kroz 10 minuta, nakon čega slijedi period ispiranja od 10 minuta. Kontraktilna aktivnost je računata integriranjem područja ispod krivulje. Odgovor je normaliziran prema količini tkiva pretvaranjem težine (1.03 mg/mm2) i dužine vrpci u kvadratne milimetre tkiva i zabilježen je kao g/s/mm2. Intestinaini prijenos je mjeren kod kontrolnih i tretiranih životinja 24 sata nakon operacije, a pomoću procjene intestinalne distribucije dekstrana (MW 70,000) koji je obilježen fluoresceinom i ne može se apsorbirati. Životinje su lagano sedirane s izofluranom i hranjene oralno s označenim dekstranom (100 ul 25 mg/ml u otopini). 90 minuta nakon primjene, životinja je žrtvovana i uzeto je cijelo crijevo od želuca do distalnog kolona. Sadržaji želuca, tankog crijeva (podijeljeno u 10 dijelova jednake dužine), slijepog crijeva i kolona (3 segmenta jednake dužine) su stavljeni u 1 ml fiziološke otopine i snažno miješani da se oslobodi dekstran prisutan u svakom segmentu. Nakon dobivanja kuglica intestinalnog tkiva i smjese, alikvoti bistrih supernatanta su mjereni u duplikatu na pločici čitača (CytoFluor II; valna duljina ekscitacije 530 nm i emisije 590 nm) radi kvantifikacije fluorescentnog signala u svakom segmentu crijeva. Distribucija signala duž gastrointestinalnog trakta je utvrđena računanjem geometrijske sredine (GC=Σ(postotak od ukupnog fluorescentnog signala u svakom segmentu × broj segmenta) radi kvantitativne statističke usporedbe između eksperimentalnih skupina.
SYBR Green RT-PCR
Ekspresija proinflamatornih i antiinflamatornih gena je određena pomoću RT-PCR. Vanjski muskularis tankog crijeva je uzet u 4 vremenska razmaka (3, 6,12 i 24 sata) nakon operacije i zamrznut u tekućem dušiku. Ukupna RNA ekstrakcija je izvedena uz gvanidij-tiocijanat fenol-kloroform metodII ekstrakcije kako je opisano u Eskandari i sur. (/d.). Kuglice RNA su resuspendirane u RNA-sigurnoj otopini za resuspendiranje (Ambion Inc., Austin, TX), slijedi uklanjanje potencijalno kontaminirajuće DNA tretiranjEM sa DNAzom I (DNA-Free Kit, Ambion Inc., Austin, TX). Jednaki alikvoti (5 μg) ukupne RNA iz svakog uzorka su kvantificirani spektrofotometrijom (valna duljina 250 nm). Pik mRNA ekspresije je određen u duplikatu SYBR Green dvostupanjske RT-PCR. β-aktin je korišten kao endogena referenca. Alikvotna RNA (40 ng) je podvrgnuta sintezi prvog lanca komplementarne DNA (cDNA) uz korištenje nasumičnih heksamera (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) i Super Script II™ (Life Technologies, Rockville, MD). Primeri su uzeti iz literature ili napravljeni u skladu s objavljenim sekvencama (Tablica 3). PCR reakcijska smjesa je pripremljena SYBR Green PCR Core reagensima (PE Applied Biosystems). Svaki uzorak je procijenjen u duplikatu uz uvjete koje je preporučio proizvođač. RT-PCR podaci su ucrtani kao ARn signal fluorescencije prema broju ciklusa. Arbitrarni prag je postavljen na srednji-linijski dio grafa log ARn ciklusa. Ciklus praga (Ct) je definiran kao broj ciklusa u kojem ARn prelazi prag. Kvantitativno mjerenje mRNA ekspresije je normalizirano prema (3-aktivnu i izračunato u odnosu na kontrolu uz korištenje komparativne CT metode.
Tablica 3. Sažetak primera
[image]
Da se isključi PCR nastanak kontaminirajuće genske DNA, uključene su u svaku PCR reakciju RT-negativne kontrole (uzorci koji sadrže RNA koja nije reverzno transkribirana). Za svaku reakciju je izvedena analiza krivulje taljenja da se osigura nastanak specifičnog produkta. Dodatno, primeri su podvrgnuti gel elektroforezi da se potvrdi odsutnost nespecifičnih vrpci i da se potvrdi da su produkti ispravne veličine. Učinkovitost PCR-amplifikacije ciljne cDNA je pregledana mjerenjem kolinearnosti serijskih razrjeđenja. Serijska trostruka razrjeđenja cDNA su izvedena u triplikatu za sve primere. Standardne krivulje su dobivene ucrtavanjem Ct vrijednosti prema relativnom broju unešenih kopija, za validaciju primera. Nagibi standardnih krivulja -3.2±0.3 s koeficijentima korelacije 0.99 su smatrani prihvatljivima, s odgovarajućom učinkovitošću od 100±10%.
Analize oslobađanja medijatora iz intestinalnog muskularisa
Utvrđivanja proteina i dušik oksida. Tanko crijevo kontrolnih miševa i miševa koji su podvrgnuti intestinalnoj manipulaciji, je uklonjeno pod sterilnim uvjetima, 4 ili 24 sata nakon operacije, a kolon je ostavljen in situ. Tanko crijevo je preneseno u čašu koja je bila napunjena ohlađenom Hankovom uravnoteženom slanom otopinom (Sigma, St. Louis, MO) s 200 U/ml penicilina G i 200 μg/ml streptomicina (HBSS), zatim je ispran lumen i tkivo preneseno u drugu čašu s HBSS. Muskularisi su izdvojeni kako je gore opisano za RT-PCR analizu. Tkiva su držana pod sterilnim uvjetima na 3 do 5°C kroz vrijeme uzimanja. Izolirani muskularis je stavljen na sterilnu gazu i određena je vlažna težina s alikvotima od 40-60 miligrama. Alikvoti tkiva su dva puta isprani u HBSS, preneseni u 35 mm pločice za kulture koje sadrže 3 ml DMEM bez seruma s penicilin/streptomicinom, i zatim se inkubira kroz 24 sata u 5% CO2 inkubatoru na 37°C. Farmakološka sredstva dodana u medij kulture su prije upotrebe sterilizirana filtriranjem.
Nakon perioda inkubacije mišićno tkivo se zgrudalo, i alikvoti medija kulture su smrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80°C. Razine IL-6, IL-1β, PGE2 i IL-10 proteina izlučenih u kulturni medij su mjerene putem komercijalno dostupnih ELISA setova (R&D Systems, Minneapolis, MN), prema uputama proizvođača. Dušikov oksid (NO) oslobođen u mediju kulture je određen mjerenjem stabilnih konačnih produkata NO metabolizma. Mjerene su razine nitrit/nitrata 24 sata nakon operacije uz korištenje komercijalno dostupnog test seta (Oxford Biomedicat Research, Oxford, Ml) i kvantificirane prema uputama proizvođača. U ovom testnom sustavu nitrat se reducira do nitrita uz korištenje granuliranog kadmija, i tako se zatim mjere ukupne koncentracije nitrita u uzorku preko Griessove reakcije. Sva mjerenja su normalizirana do vlažne težine tkiva.
Inhalirani CO suprimira razvoj postoperativnog ileusa
Općenita zapažanja
Sve životinje su se brzo oporavile nakon operacije. Nije bilo mortaliteta niti morbiditeta povezanog s operativnim zahvatom iti s režimom izlaganja CO. lako je kod miševa nastao ileus, postoperativna njega i svakodnevno ponašanje je bilo normalno, s time da se oralno uzimanje hrane i vode zbilo unutar nekoliko sati nakon oporavka od anestezije.
Ekspresija HO-1
Slike 7A-7E su graf sa stupcima i slike koje ilustriraju ekspresiju hemoksigenaze (HO-1) u intestinalnom muskularisu nakon operativnog zahvata tankog crijeva na glodavcima. Radi istraživanja potencijalne antiinflamantorno-zaštitne uloge za endogene HO-1 produkte, utvrđene su alternacije u HO-1 mRNA ekspresiji pomoću SYBR Green RT-PCR. Slika 7A ilustrira obrasce ekspresije HO-1 mRNA u intestinalnom muskularisu neoperiranih kontrolnih miševa i operiranih miševa, a koji su uzeti 3, 6, 12, i 24 sata nakon laparotomije. HO-1 mRNA ekspresija se znatno povećala 35-namota u odnosu na kontrolu 3 sata nakon laparotomije, s maksimalnom ekspresijom (45-namota) 6 sati poslije operacije, lako su se razine ekspresije malo smanjile nakon 6 sati, ekspresija je ostala povećana (22-namota) u konačnoj točki mjerenja 24 sata nakon operacije.
Također je ispitano je li povećanje HO-1 mRNA rezultiralo ekspresijom proteina u intestinalnom muskularisu nakon operativnog zahvata. Izvedena je HO-1 imunohistokemija na punim uzorcima na objektnom stakalcu muskularisa srednjeg jejunuma, a koji su uzeti iz neoperiranih miševa i 24 sata nakon operacije iz miševa koji su bili podvrgnuti operativnom zahvatu tankog crijeva. Kod operiranih životinja je HO-1 imunoreaktivnost zapažena unutar velikog broja dolazećih polimorfoleukocita (Slika 7B), i u stanicama koje su morfološki slične makrofagima (Slika 7C). Povremeno su također nađene stanice koje sadrže brojne citoplazmatske granule (granulociti), a pokazuju intenzivnu HO-1 imunoreaktivnost (Slika 7D). Slaba HO-1 imunoreaktivnost se pojavila i u nekarakterističnoj populaciji stanica koje su bile raspršene unutar mišićnih slojeva. HO-1 imunoreaktivnost nije uočena u uzorcima iz neoperiranih kontrolnih miševa (Slika 7E). Specifičnost imunomrlja za HO-1 je potvrđena izostavljanjem primarnih antitijela (nije prikazano).
Funkcionalna ispitivanja
Intestinalni prijenos je mjeren kod kontrolnih i tretiranih životinja 24 sata nakon operacije, a pomoću procjene gastrointestinalne distribucije oralno primjenjenog dekstrana koji je obilježen fluoresceinom. Slike 8A-8C su grafovi sa stupcima koji ilustriraju rezultate ispitivanja prijenosa, utvrđene iz distribucije neapsorbilnog dekstrana koji je obilježen fluoresceinom, 1.5 sat nakon oralne primjene. Srednji histogram fluorescencije prisutne u svakom dijelu crijeva, za prirodne kontrolne miševe i CO tretirane miševe, je nacrtan na Slici 8A. Kod kontrolnih životinja je označeni dekstran bio uglavnom raspodijeljen u terminalnom tankom crijevu, slijepom crijevu i proksimalnom kolonu, 90 minuta nakon unosa dekstrana. Inhalacijski tretman CO (250 ppm) je sam uzrokovao mali neznačajni pomak prijenosa, s distribucijom oznake predominantno u slijepom crijevu i kolonu. Slika 8B uspoređuje distribuciju signala fluorescencije kod miševa koji su podvrgnuti intestinalnoj manipulaciji, sa ili bez CO tretmana. Nakon intestinalne manipulacije, fluorescentni signal je zadržan u želucu i proksimalna 3 segmenta tankog crijeva. Kada su životinje tretirane s CO, oznaka je distribuirana distalnije duž gastrointestinalnog trakta. Rezultati računa geometrijske sredine (GC) su sažeti na Slici 8C, radi statističke usporedbe. Veće vrijednosti GC znače distalniju raspodjelu fluorescentnog signala, i odgovaraju bržem prijenosu. Vrijednosti na ovoj slici pokazuju kako CO ubrzava intestinalni prijenos kod neoperiranih miševa, ali GC vrijednosti nisu postigle statističku važnost. Dodatno, prethodno pokazane GC vrijednosti pokazuju da je prijenos uočljivo sporiji nakon intestinalne manipulacije, ali se produljenje prijenosa znatno popravilo kod miševa koji su tretirani inhalacijom CO. Učinci CO na spontanu i betanekol-stimuliranu kontraktilnost intesttnalnog kružnog mišića tankog crijeva su proučavani u in vitro pokusima kupke organa 24 sata nakon operativnog zahvata crijeva, a što je vremenska točka za koju se pokazalo kako je ileus već dosta razvijen. Slike 9A-9C ilustriraju mehaničku aktivnost takvih vrpci kružnog glatkog mišića tankog crijeva. Mišićne vrpce iz tankog crijeva izvornih miševa dale su normalne kontrakcije (Slika 9A; kontrola), i tretman s CO nije tu imao učinka (Slika 9A; kontrola+CO). Nakon IM je spontana kontraktilna aktivnost je znatno smanjena (Slika 9A; IM). Ipak, kod IM miševa koji su tretirani s CO, ritmičnost je jako popravljena (Slika 9A; IM+CO). Dodatak muskarinskog agonista betanekoia (0.3 do 300 μM) u superfuzat je povećao toničke koncentracije ovisne o koncentraciji. Područje ispod krivulje kontrakcije je integrirano i normalizirano na područje površine mišićnih traka, a da bi dobila mjera kontraktilnosti kružnog mišića. Slike 9B i 9C su linijski grafovi koji ilustriraju normaliziranu kontraktilnost. Kod kontrolnih miševa je vršna snaga kontraktilnosti (3.5±0.7 g/mm2/s) dobivena kao odgovor na 100 μM betanekola (Slika 9B). Sam CO nije imao učinka na kontrolne kontracije (3.2±0.5 g/mm2/s). Operativni zahvat je doveo do smanjenja snage kontrakcije kroz krivulju doza-učinak u usporedbi s kontrolama, a dostigle su statističku važnost pri koncentracijama betanekola većim od 10 u M (Slika 9C). Pri 100 μM betanekola se maksimalna snaga kontrakcije smanjila za 49% (1.7±0.4 g/mm2/s) kod istih miševa. Inhalacija CO (250 ppm) je potpuno spriječila inhibitorni učinak operativnog zahvata (3.6±0.7 g/mm2/s).
MPO histokemija
Operativni zahvat tankog crijeva je tipično uzrokovao masivni stanični inflamatorni odgovor u muskularisu. Da bi se kvantificirali infiltrati leukocita u tkivima kontrolnih i tretiranih životinja, sa ili bez CO tretmana, korištena je Hanker-Yatesova histokemija za mijeloperoksidaznu (MPO+) aktivnost. Slika 10 je histogram koji prikazuje podatke o MPO+ stanicama koje infiltriraju intestinalni muskularis u 4 eksperimentalne grupe korištene u ovom istraživanju. Leukociti su brojani pri povećanju od 200x. Kod kontrolnih primjeraka koji nisu podvrgnuti operaciji, MPO+ stanice su bile rijetke. Operacijska anestezija i intestinaina manipulacija su rezultirale povećanjem broja MPO+ stanica, koje ulaze u muskularis nakon 24 sata, za 250 puta. Zanimljivo je da CO tretman nije imao učinka na opseg leukocitnih infiltrata u niti jednoj skupini.
Ekspresija proinflamatornih citokina
Slike 11A-11C su grafovi sa stupcima koji ilustriraju učinke inhaliranog CO na ekspresiju IL-6. Slike pokazuju vremenski period IL-6 ekspresije gena nakon manipulacije tankog crijeva, i učinke inhaliranog CO na IL-6 ekspresiju gena i proteina. Vremenska analiza korištenjem RT-PCR je pokazala se IL-6 mRNA povećala 300-namota u odnosu na izvorne kontrolne miševe, 3 i 6 sati nakon operacije (Slika 11 A). Ekspresija je naglo pala kod 12 sati, dolazeći do povećanja od 50-namota u odnosu na kontrole u 24 sata. Inhalacija CO nije imala učinka na manipulacijom-induciranu ekspresiju gena u vremenima 3 i 6 sati (Slika 11B). Oslobađanje IL-6 proteina iz izoliranih muskularisa je mjereno nakon inkubacije u mediju stanične kulture (Slika 11C). IL-6 protein je masivno povećan 24 sata nakon IM, i suprotno PCR podacima, oslobađanje proteina se znatno smanjilo za 70% kod miševa koji su bili tretirani s CO.
Istraživan je i proinflamatorni citokin IL-1β. Vremenski period IL-1β ekspresije je prikazan na Slikama 12A-12B. Mjerenja IL-1β su bila komplicirana zbog opažanja da su razine mRNA, u ekstraktima muskularisa iz izvornih kontrolnih miševa i kontrolnih miševa tretiranih s CO, bile ispod sposobnosti detekcije analizatora sekvenci. Tako, uzorci iz manipuliranih miševa, uzeti 6 sati nakon operacije, su serijski razrijeđeni i vrijednosti praga ciklusa (CT) su normalizirane na β-aktin utvrđen iz nerazrijeđenih uzoraka. Kontrolne ACT vrijednosti su zatim izračunate preko najniže koncentracije IL-1β za koju je CT smanjen do unutar linearnog raspona. Promjene u ekspresiji gena za ostale eksperimentalne skupine su zatim izračunate u odnosu na ovu kontrolu, i tako su konzervativne u procjeni stvarnog povećanja. Iz tih računa, IL-1β mRNA ekspresija u odgovoru na anesteziju i IM se povećala 38-namota u odnosu na kontrolu, 3 sata nakon operacije. Maksimalna ekspresija se javila nešto kasnije nego što je zabilježeno za IL-6, i dostigla je 170- i 150-namota nakon 6 i 12 sati nakon operacije, te zatim opet pala na 40-namota u 24. satu (Slika 12A). Kod životinja koje su tretirane s CO, 1L-1(3 ekspresija nakon 6 sati se smanjila za 60% (Slika 12B). Oslobađanje IL-1β proteina iz ekstrakata muskularisa, koji su uzeti 24 sata nakon operacije, je mjereno nakon još 24 sata inkubacije u mediju stanične kulture (Slika 12C). Korelirajući s RT-PCR podacima, nije se moglo naći IL-1(3 protein niti u jednoj kontrolnoj skupini, pri čemu se koncentracija proteina proizvedenog u 100 mg ekstrakta tkiva povećala nakon IM. Ovaj odgovor se znatno smanjio za 60% kod miševa koji su tretirani inhalacijom CO.
Ekspresija ciklooksigenaze-2 i inducibilne sintaze dušik oksida Aktivirani statno prisutni makrofagi i dolazeći leukociti sintetiziraju i oslobađaju prostaglandine koji nastaju od inducibilne izoforme cikiooksigenaze, COX-2, i dušikov oksid (NO) koji nastaje od inducibilnog oblika sintaze dušik oksida (iNOS), a oni imaju izravan i snažan inhibitorni učinak na kontraktilni mehanizam intestinalnog glatkog mišića.
Na Slikama 13A-13C je ilustriran temporalni profil iNOS ekspresije nakon zahvata. Analiza vremenskog perioda je pokazala da se ekspresija gena povećala značajno 3 i 6 sati nakon manipulacije tankog crijeva (Slika 13A). Vršna ekspresija kod 6 sati je smanjena za 60% kod životinja koje su tretirane s CO (Slika 13B). Izlaganje izvornih miševa na CO nije imalo učinka na iNOS ekspresiju (povećanje namota: kontrola, 1.06+0.18; CO 3h, 1.04±0.19; CO 6h, 1.26+0.19). Ukupni oslobođeni nitrit u mediju kulture iz ekstrakata muskularisa, koji je uzet 24 sata nakon operacije, je mjeren kao procjena proizvodnje NO (Slika 13C). Kako je predviđeno PCR podacima, mjerenja nitrita su se znatno povećala nakon IM i to povećanje je smanjeno za 75% kod miševa tretiranih s CO. Slično smanjenje odgovora je postignuto inkubiranjem ekstrakata muskularisa u prisutnosti selektivnog iNOS inhibitora, L-Nil (50 uM), što pokazuje da je iNOS bila izvor operacijom izazvanog povećanja NO proizvodnje.
Slike 14A-14D su grafovi sa stupcima koji ilustriraju učinke inhalacije CO na ekspresiju COX-2. Slike pokazuju temporalni profil COX-2 ekspresije izazvane nakon IM. Analiza vremenskog perioda je pokazala da se ekspresija COX-2 gena povećala 8-10-namota, 3 do 6 sati nakon operacije, i ostala je povećana kroz 24 sata (Slika 14A). CO tretman nije imao učinka na ekspresiju gena u vremenskim točkama 3 i 6 sati (Slika 14B). Sama CO inhalacija kod neoperiranih kontrolnih miševa je rezultirala relativno malom indukcijom COX-2 poruke 3 sata nakon operacije (Slika 14C). Oslobađanje PGE2 iz ekstrakata muskuiarisa, koji je uzet 24 sata nakon operacije, je mjereno kao marker COX-2 aktivnosti (Slika 14D). Sukladno PCR podacima, i sama inhalacija CO i IM su uzrokovali značajna povećanja oslobađanja PGE2. Specifično vezano uz PGE2, tretman manipuliranih miševa s CO nije imao učinka na intestinalnom manipulacijom (IM) izazvano oslobađanje ovog prostanoida.
Ekspresija antiinflamatornih gena
IL-10 je pleiotropni citokin s važnim zaštitnim i antiinflamatornim učincima u gastrointestinalnom traktu. Slike 15A-15C ilustriraju učinke CO inhalacije na ekspresiju IL-10. Slike pokazuju profil ekspresije IL-10 kroz vrijeme. Ekspresija gena je prošla kroz povećanje od 12-namota u odnosu na kontrolu, a kao odgovor na intestinalnu manipulaciju, 3 i 6 sati nakon operacije. Ekspresija je zatim pala, ali je ostala povišena kroz 24 sata na oko 4-namota u odnosu na kontrolnu ekspresiju (Slika 15A). Kod operiranih životinja tretiranih s CO, pri točki 3 sata, ekspresija IL-10 gena se povećala na 43-namota u odnosu na kontrole, što je odgovor 300% veći nego za sami zahvat (Slika 15B). Kod kontrolnih miševa CO inhalacija je sama bila dovoljna da inducira značajan porast IL-10 ekspresije (Slika 15C).
Učinak inhaliranog CO na HO-1 ekspresiju je također procijenjen. Slike 16A-16B ilustriraju učinak CO inhalacije na HO-1 ekspresiju. Slika 16A uspoređuje ekspresiju gena induciranu intestinalnom manipulacijom, 3 i 6 sati nakon operacije (vidi Sliku 7D), s onom koja je postignuta kod manipuliranih miševa tretiranih s CO. Inhalacija CO je također povećala ekspresiju HO-1 gena, 3 sata nakon operacije, do razine 300% veće nego kod same manipulacije (Slika 16B). U ovome slučaju, sama inhalacija CO kod neoperiranih kontrolnih miševa je inducirala malo, alt značajno povećanje HO-1 ekspresije gena, ali samo u vremenu 6 sati.
Predstavljeni izum daje i in vivo i in vitro dokaze da inhalacija niske koncentracije CO (250 ppm) značajno smanjuje intestinalnu disfunkciju koja je karakteristična za postoperativni ileus. Podaci pokazuju kako CO može djelovati na razinu ekspresije gena i proteina, te tako selektivno modulira specifične elemente i proinflamatornih i antiinflamatornih puteva što vodi značajnom poboljšanju intestinalne funkcije.
Postoperativni ileus je trenutno neizbježna posljedica operativnih zahvata abdomena, i može varirati od kratkotrajne atonije do ozbiljnog paralitičkog ileusa koji može trajati danima. Paralitički ileus je karakteriziran intestinalnim mirovanjem, prekomjernim razmnožavanjem bakterija i neravnotežom elektrolita, što vodi znatnom morbiditetu i često mortalitetu. Izlaganje miševa inhalaciji CO je poboljšalo zahvatom induciranu supresiju spontane kontraktilnosti kružnog glatkog mišića, vratilo sposobnost mišića da se kontrahiraju kao odgovor na kolinergičke agoniste, i značajno smanjilo poremećaj intestinalnog prijenosa. Ovo poboljšanje sveukupne kontraktilne funkcije je postignuto bez veće redukcije infiltrata inflamatornih stanica, što znači da CO utječe na elemente inflamatorne reakcije, a ne na one koji su povezani s mobilizacijom leukocita. Da bi se odredio učinak CO na inflamatomi kaskadni slijed reakcija, istraživana je ekspresija gena pro- i anti-inflamatornih medijatora, pomoću RT-PCR.
Povećane razine proinflamatornih citokina IL-6 i IL-1 su stalno ekspresirane za vrijeme akutne i kronične intestinalne upale kod ljudi i životinja, uključujući postoperativni ileus. IL-6 aktivira niz staničnih vrsta radi indukcije sinteze kemoatraktanata i adhezijskih molekula, i tako ima važnu ulogu u poticanju mobilizacije leukocita i ekstravazacije u intestinatnom muskularisu. U ovome primjeru, inhalacija CO nije promijenila ranu operacijom induciranuekspresiju gena IL-6, mjereno 3 i 6 sati nakon operacije, što je u skladu i s izostankom učinka na veličinu infiltrata inflamatomih stanica. Ipak, oslobađanje IL-6 proteina iz izoliranog intestinalnog muskularisa, utvrđeno 24 sata nakon operacije, je smanjeno za 60%, sa 5000 pg/ml na 2000 pg/ml, kod miševa koji su tretirani s CO, što znači da CO ima post-transkripcijski učinak na ekspresiju IL-6. Ova niža razina oslobođenog proteina je još uvijek bila uočljivo viša u odnosu na nativnu kontrolu (150 pg/ml), čime je teže odrediti kakav učinak to može imati na IL-6 proinflamatornu signalizaciju. Nedavna istraživanja, ipak, pokazuju da IL-6 također može imati važna antiinflamatorna svojstva, što znači da je stalna ekspresija IL-6 potrebna za indukciju određenih zaštitnih puteva. Oni možda uključuju sposobnost inhibicije proizvodnje TNFα, IL-1 (3 i inflamatornog proteina-2 iz makrofaga, te sposobnost povećanja razina antagonista IL-1 receptora i TNF-topljivog receptora in vitro. Tako, smanjenje IL-6 povezanih anti-inflamantomih puteva u kasnijim fazama upalne kaskade, može doprinijeti poboljšanju intestinalne kontraktilnosti koja je opažena 24 sata nakon operacije.
Manje je istražena uloga koju ima IL-1 (3 kod postoperativnog ileusa; ipak, pokazalo se da endogeni IL-1 (3 inhibira kod štakora kontraktilne odgovore intestinalnog glatkog mišića na kolinergičke agoniste i električnu stimulaciju, što znači da svoje inhibitorne učinke iskazuje mijenjanjem neuronskih puteva. Dodatno, imuno-neutralizacija IL-13 aktivnosti je značajno smanjila ozbiljnost bolesti kod modela kolitisa na glodavcima, upućujući tako na to da ovaj citokin također ima važnu inicijatorsku ulogu u intestinalnoj upali. Kod operiranih miševa koji su tretirani s CO, IL-1 (3 ekspresija gena je znatno smanjena, sa 75%-tnom redukcijom kod operacijom inducirane ekspresije gena 6 sati nakon operacije, i prisutna je i odgovarajuća redukcija ekspresije proteina mjerena nakon 24 sata. Tako, očekuje se da će proinflamatorne aktivnosti IL-1(3, kao i njegovi potencijalni inhibitorni učinci na neuromuskutarni mehanizam, biti značajno smanjeni. Uzevši u obzir sve zajedno, ova otkrića ukazuju na to da se zaštitni učinci CO javljaju, barem jednim dijelom, preko mehanizma kojemu su cilj selektivni elementi unutar IL-6 i IL-1β posredovane inflamatorne kaskade, a koji ovise o mobilizaciji leukocita ili se javljaju nakon što je potpuno potaknuta mobilizacija leukocita.
Iako broj infiltrirajućih leukocita nije promijenjen kod miševa tretiranih s CO, podaci o citokinima pokazuju da postoji CO-ovisna funkcionalna inhibicija citokina koji po vrstama nastaju u leukocitima. Prema tome, istražena je i modulacija, iz leukocita nastalih kinetički aktivnih medijatora glatkih mišića, NO i PGE2, kao dodatnih meta za inhibiciju pomoću CO. Pokazalo se da prostanoidi nastali pomoću COX-2, i dušikov oksid nastao preko iNOS, imaju snažne inhibitorne učinke na kontraktitnost intestinalnog glatkog mišića, i da inhibicija enzima COX-2 ili selektivno smanjenje leukocita nastalih pomoću iNOS gena, značajno povećava otpor prema razvoju postoperativnog ileusa. U predstavljenom primjeru, pregled iNOS i C0X-2 ekspresije gena je otkrio da se za oboje značajno povećala nakon intestinalne manipulacije. Operacijom izazvana povećanja i iNOS ekspresije gena i proizvodnje NO, su smanjenja za oko 75% kod CO tretiranih životinja, što znači da CO može djelovati na razinu transkripicije gena i tako modulirati iNOS ekspresiju. Također se pokazalo da se in vitro aktivnost iNOS, kako endoteinih tako i neuronalnih izofortmi NOS, može izravno inhibirati sa CO, moguće preko vezanja CO na hemske vrste prisutne u NOS proteinima. Uzevši sve zajedno u obzir, smatra se da će redukcija oslobađanja NO kao rezultat smanjene ekspresije gena i/ili aktivnosti enzima, značajno doprinijeti poboljšanoj intestinalnoj funkciji, a sve to inducirano je inhalacijom CO. Suprotno iNOS, CO inhalacija nije imala učinka na operacijom induciranu COX-2 mRNA ekspresiju iti oslobađanje PGE2, kako je mjereno u kulturnom mediju inkubiranog muskularisa koji je uzet 24 sata nakon operacije. Zanimljivo, CO inhalacija je kod nativnih miševa rezultirala 2.5-namota povećanjem COX-2 mRNA ekspresije, 3 sata nakon operacije, s odgovarajućim povećanjem oslobađanja PGE2 nakon 24 sata. Indukcija COX-2 preko CO nije prije zabilježena, i funkcionalna posljedica ove povećane aktivnosti je nepoznata. CO-tretirani kontrolni miševi nisu pokazali funkcionalni poremećaj ili povećanje proinflamatornih medijatora, što bi značilo, u ovom slučaju, da indukcija COX-2 ne djeluje u svom punom proinflamatornom kapacitetu.
Jedan od dramatičnih učinaka CO inhalacije je bio na ekspresiju gena povezanu s anti-inflamatornim putevima: IL-10 i HO-1. Oba gena su bila inducirana nakon intestinalne manipulacije, a ekspresija je povećana 300% kod CO tretiranih operiranih životinja. Povećanje je opaženo 3 sata nakon operacije, ali ne i nakon 6 sati što znači da je CO izlaganje rezultiralo ranom indukcijom ovih gena, a tu teoriju podupiru rezultati koji pokazuju da je sama inhalacija CO kod nativnih životinja rezultirala značajnom indukcijom IL-10 i HO-1. Prije nije razjašnjena uloga ovih medijatora u postoperativnom ileusu. Ipak, IL-10 je pleiotropni citokin sa širokim spektrom bioloških učinaka na limfne i mijeloidne stanice. Jedna od njegovih poznatih funkcija je sposobnost inhibicije proizvodnje proinflamatornih medijatora; uključujući proizvodnju tumor-nekrotirajućeg-faktora-alfa (TNFα), IL-6, IL-1, faktora stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije, i nastanak NO pomoću aktiviranih monocita/makrofaga. Nedavno je pronađeno da IL-10 inhibira proizvodnju NO kod LPS stimuliranih makrofaga glodavaca, preko antagonizma ulaza L-arginina u stanice i katalitičke aktivnosti iNOS, i tako potencijalno doprinosi smanjenju inhibitornih učinaka NO na intestinalni glatki mišić. Dodatno, sve je jasnije da indukcija HO-1 posredovanih puteva ima važne antiinflamatorne i citoprotektivne učinke pod raznim akutnim i kroničnim inflamatornim uvjetima. Postoje dokazi koji pokazuju da je ekspresija ova dva medijatora povezana. Objavljena istraživanja su pokazala da CO izloženost povećava IL-10 ekspresiju gena i oslobađanje proteina iz LPS-stimuliranih makrofaga. Nedavno, pronađeno je da endogeni IL-10 inducira HO-1 kod makrofaga glodavaca, i da je HO-1 indukcija je potrebna za inhibitorne učinke IL-10 na lipopolisaharidima induciranu proizvodnju TNFα. Rana indukcija HO-1 može rezultirati povećanim endogenim stvaranjem CO za koji se smatra da će doprinijeti učincima egzogeno danog plina. Dodatno, aktivnost HO-1 ima citoprotektivna i antioksidativna svojstva koja su pripisana uklanjanju slobodnih radikala preko redoks ciklusa biliverdina i bilirubina. Prema tome, povećana IL-10 proizvodnja i povećana aktivnost HO-1 će djelovati tako da smanje inflamatornu kaskadu rano u njenom razvoju, a preko smanjenja ekspresije proinflamatornih medijatora, i tako povećavaju sposobnost tkiva za CO i pružaju zaštitu od stresa slobodnih radikala.
Sažeto, ovdje predstavljeni podaci pokazuju da se zaštitni učinci CO inhalacije javljaju preko djelovanja na selektivne elemente unutar pro- i anti-inflamatornih puteva. Čini se da CO djeluje na razinu i ekspresije gena i proteina, što vodi indukciji IL-10 i HO-1, smanjenju IL-1β i inhibiciji iNOS. Zajedno ovi učinci rezultiraju modulacijom operacijom induciranog upalnog odgovora u intestinalnom muskularisu, što vodi poboljšanoj postoperativnoj funkciji.
Primjer 3. CQ suprimira razvoj ileusa koji ie povezan s operativnim zahvatom tankog crijeva kod miša i svinje
Ileus je kod miševa induciran blagim zahvatom na tankom crijevu. Napravljen je rez da bi se otvorila abdominalna šupljina miša, i zatim je izveden zahvat na crijevu blagim gurkanjem i bockanjem tankog crijeva (vidi, npr. Schwarz i sur., Gastroenterology 121(6): 1354-1357 (2001)). Rez je zatim zatvoren i nakon 24 sata je provedena analiza. Miševi su izloženi inhalaciji CO (250 i 500 ppm) kroz 1 sat odmah prije intestinalne manipulacije i za vrijeme cijelog 24 satnog perioda oporavka. Intestinalna kontraktilnost je mjerena in vitro pomoću mjerenja kontrakcija vrpci kružnog mišića kao odgovor na betanekol (0.3-300 uM), te in vivo određivanjem intestinalnog prijenosa preko distribucije oralno danog, fluoresceinom obilježenog dekstrana, i računanjem geometrijske sredine kako je opisano gore u Primjeru 1. HO-1 i IL-10 mRNA ekspresija je utvrđena pomoću SYBR Green RT-PCR, iz ekstrakta vanjskog muskularisa, kako je opisano gore u Primjeru 1. Oslobađanje dušik oksida (NO), snažnog inhibitora kontraktilnosti glatkih mišića, određeno je mjerenjem ukupnih nitrita u serumu, što je također objašnjeno gore u Primjeru 1.
Maksimalna snaga kontrakcije dobivena kao odgovor na betanekol (100 μM) je znatno smanjena intestinalnom manipulacijom (1.1±0.2 g/s/mm2), a u odnosu na kontrole (2.2±0.5 g/s/mm2). IM inducirana supresija kontraktilnosti je spriječena kod IM+CO miševa (1.9±0.25 g/s/mm2). Intestinalni prijenos je također poboljšan kod CO tretiranih miševa (geometrijska sredina: kontrola = 11.0±0.5, IM = 12.7+0.2, IM+CO = 6.3±0.8). RT-PCR podaci pokazuju da je IM uzrokovala značajno povećanje vršne HO-1 ekspresije (45-namota) nakon 6 sati, te IL-6 (300-namota) i IL-10 (13-namota) ekspresija nakon 3 sata, nakon IM obratnih kontrola. Kod IM+CO miševa, HO-1 ekspresija se javila ranije, 3 sata nakon IM, u većoj razini ekspresije (150-namota) nasuprot kontrolama. IL-10 ekspresija nakon 3 sata je također bila veća kod IM+CO miševa (35-namota). Serumski nitriti su povišeni nakon IM (18.3±3.6 μM) nasuprot kontrolama (2.4±1.0 μM), i smanjeni nakon IM-CO (6.0±1.6 μM).
Prema tome, CO smanjuje operacijom izazvani intestinalni dismotilitet, in vitro i in vivo, preko mehanizama koji mogu uključivati indukciju anti-inflamatornog citokina IL-10 i smanjenje proizvodnje NO. Rana indukcija HO-1 (300% povećanje ekspresije kroz samu IM) će povećati raspoloživost CO, potičući tako njegove antiinflamatorne učinke.
Slični pokusi su provedeni na svinjskom modelu. Ileus je induciran blagom manipulacijom tankog crijeva (IM). Svinje su izložene CO (250 ppm) ili zraku (kontrole) kroz period od 3 sata prije IM. Gastrointestinalna funkcija je procijenjena in vitro promatranjem intestinalnog prijenosa čeličnih kuglica koje su smještene unutar tankog crijeva. Pronađeno je daje CO poboljšao intestinalni prijenos nakon IM.
Primjer 4. Pred-tretman s niskim koncentracijama CO (250 do 75 ppm) kroz 3 sata priie laparotomiie štiti od razvoja postoperativnog ileusa
Ovaj primjer prikazuje kako su niske koncentracije CO, dane kroz kratke vremenske periode, zaštitne protiv razvoja postoperativnog ileusa.
Ileus je induciran blagom manipulacijom tankog crijeva (IM). Štakori su izloženi opadajućim koncentracijama CO (250, 125, 75, 30 ppm) u zraku kroz period ili 1 sat ili 3 sata prije laparotomije (n=6). Rezultati su uspoređeni s onima koji su dobiveni pomoću prije ustanovljenih protokola izlaganja CO pri 250 ppm 1 sat prije i 24 sata nakon laparotomije. Gastrointestinalna funkcija je procijenjena in vivo pomoću određivanja intestinalnog prijenosa preko distribucije oralno danog fluoresceinom obilježenog dekstrana, duž gastrointestinalni trakt. Srednja raspodjela obilježenog dekstrana je utvrđena, radi statističke usporedbe, računanjem geometrijske sredine (GC).
Geometrijska sredina je znatno smanjena kod štakora koji su bili podvrgnuti operativnom zahvatu, a u usporedbi s neoperiranim kontrolama (GC: kontrola= 19.8±0.2, )M= 15.8±0.4), što upućuje na značajno smanjenje intestinalnog prijenosa, lako je izlaganje neoperiranth štakora na 250 ppm kroz 24 sata rezultiralo malim odgađanjem intestinalnog prijenosa (GC: 8.8.±0.4), 1 sat pred-tretmana i 24 satni post-tretman s 250 ppm CO su rezultirali značajnim poboljšanjem intestinalnog prijenosa kod štakora koji su bili podvrgnuti operativnom zahvatu (GC: 8.2.±0.4). Pred-tretman manipuliranih štakora s 250 ppm kroz 1 sat samo prije operacije je bio manje učinkovit u prevenciji operacijom inducirane inhibicije prijenosa (GC: 7.2.±0.3), dok je pred-tretman kroz 3 sata imao učinak ekvivalentan onome koji se postigne s 24 satnim tretmanom (GC: 8.6.±0.3). Slično poboljšanje je dobiveno pred-tretmanom s koncentracijama niskim na 125 i 75 ppm (GC: 8.6.±0.4 i 8.8.±0.1). Ovaj zaštitni učinak je smanjen kada je koncentracija CO dalje smanjena na 30 ppm (GC: 7.0.±0.2).
Ovaj primjer pokazuje kako produženo izlaganje CO nije potrebno da bi se dobils puna korist zaštite od razvoja postoperativnog ileusa. Uklapanje niskih koncentracija CO u plinove anestezije za vrijeme preoperativnog perioda može pružiti minimalno invazivnu metodu koja će pomoći u smanjenju ileusa kod podložnih pacijenata, i tako ubrzati postoperativni oporavak i smanjiti ostanak u bolnici.
Primjer 5. Protokoli za liječenje ileusa
Slijedeći primjer ilustrira protokole koji se koriste za tretiranje pacijenta prije, za vrijeme i/ili nakon operativnih zahvata, npr. transplantacije (npr. SITx) ili netransplantirajućih zahvata (npr. postupaka koji mogu rezultirati ileusom). Primjer uključuje protokole za liječenje ileusa, npr. ileusa koji je rezultat transplanirajućih i netransplantirajućih zahvata, te dodatne protokole za tretiranje donora, gastrointestinalnog trakta ili njegovog dijela, npr. tankog crijeva, i primalaca, s CO u postupku transplantacije. Bilo koji ili više slijedećih protokola, se mogu koristiti za određeni operativni zahvat.
Tretman pacijenata
CO se može dati sistemski ili lokalno pacijentu prije, za vrijeme i/ili nakon što je operativni zahvat izveden na pacijentu, ili nakon što je pacijentu dijagnosticiran ileus (npr. ileus koji je rezultat operacije ili stanja koja ne uključuju operaciju). Pacijenti mogu inhalirati CO u koncentracijama koje su u rasponu od 10 ppm do 1000 ppm, npr. oko 100 ppm do oko 800 ppm, oko 150 ppm do oko 600 ppm, ili oko 200 ppm do oko 500 ppm. Poželjne koncentracije uključuju, npr. oko 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm ili oko 1000 ppm. CO se može pacijentu dati, s prekidima ili kontinurano, počevši 0 do 20 dana prije zahvata, npr. s početkom najmanje 30 minuta, npr. 1, 2, 3, 5, 7 ili 10 sati, ili oko 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 ili 20 dana , ili više od 20 dana prije zahvata. Alternativno ili dodatno, CO se može dati pacijentu za vrijeme zahvata, npr. inhalacijom i/ili topikalnom primjenom. Alternativno ili dodatno, CO se može dati pacijentu nakon zahvata, npr. počevši odmah nakon završetka zahvata, i nastavljanjem kroz oko 1, 2, 3, 5, 7 ili 10 sati, ili 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 ili 60 dana, neograničeno, ili sve dok se ne vrati normalni motilitet crijeva nakon završetka zahvata.
Postupci transplantacije
Tretman donora
Prije uzimanja organa ili njegovog dijela, donor se može tretirati inhaliranim ugljik monokstdom {250 ppm) kroz 1 sat. Tretman se može primijeniti u dozama koje variraju od 10 ppm do 1000 ppm, i u vremenu koje može varirati od 1 do 6 sati, ili kroz cijeli period od trenutka kada je moguće tretirati mrtvo tijelo donora do trenutka kada se uklanja organ. Za ljudskog donora bi tretman trebao početi što je prije moguće nakon proglašenja prisutnosti smrti mozga. U nekim primjenama, može biti poželjno početi tretman prije smrti mozga.
Za ne-ljudske životinje, (npr. svinje) koje će se koristiti kao ksenotransplantirajući donori, živa životinja donor se može tretirati s relativno visokim dozama udahnutog ugljik monoksida, po želji, tako dugo dok tako nastali karboksihemogiobin ne ugrožava vitalnost i funkciju organa koji se transplantira. Npr. mogu se koristiti doze veće od 500 ppm (npr. 1000 ppm ili više, i do 10 000 ppm, posebno za kratko vrijeme).
Tretman organa in situ
Prije nego što se organ uzme iz donora, može se isprati ili spojiti na otopinu, npr. pufer ili medij, dok je još u donoru. Namjera je preplaviti organ otopinom koja je zasićena s ugljik monoksidom i održavana u atmosferi ugljik monoksida, tako da sadržaj ugljik monoksida ostane zasićen. Ispiranje se može odvijati kroz period od najmanje 10 minuta, npr. 1 sat, nekoliko sati ili duže. Otopina bi u idealnom slučaju trebala dopremiti najviše koncentracije ugljik monoksida, po mogućnosti u stanice organa.
Tretman organa ex vivo
Organ, kao što je tanko crijevo, se može očuvati u mediju, koji sadrži ugljik monoksid, od trenutka kada je uklonjen iz donora do trenutka kada se transplantira u primaoca. To se može izvesti održavanjem organa u mediju koji uključuje CO, ili uspostavljanjem cirkulacije tog medija kroz organ. Budući da se ovo odvija ex vivo, a ne u životinji, mogu se koristiti vrlo visoke koncentracije plina CO (npr. 10 000 ppm) da se održi medij zasićen s CO.
Tretman primaoca
Tretman primaoca s CO može početi na dan transplantacije najmanje 30 minuta prije početka operacije. Alternativno, može početi najmanje 30 minuta prije reperfuzije organa u primaocu. Može se nastaviti najmanje 30 minuta, npr. 1 sat. Doze ugljik monoksida između 10 ppm i 3000 ppm, se mogu dopremati kroz različito vrijeme, npr. minute ili sate, i može se dati na dan i dane nakon transplantacije. Npr. pacijent može udahnuti koncentraciju ugljik monoksida, npr. 3000 ppm, u 3 uzastopna držanja daha od 10 sekundi. Alternativno, niže koncentracije plina se mogu dati s prekidima ili kontinuirano kroz duži period vremena, s normalnim disanjem rade nego uz držanje daha. Koncentracije karboksihemoglobina se mogu koristiti kao vodič za prikladnu primjenu ugljik monoksida pacijentu. Obično tretmani za primaoce ne bi trebali povisiti razine karboksihemoglobina iznad onih za koje se smatra da predstavljaju rizik za pacijenta kojemu je potrebna transplantacija.
Trebalo bi razumjeti da, dok je izum bio opisan zajedno s njegovim detaljnim opisom, prethodni opis ima namjeru ilustrirati i ne ograničiti opseg izuma koji je definiran opsegom dodanih zahtjeva. Drugi aspekti, prednosti i modifikacije su unutar opsega slijedećih zahtjeva.
Claims (13)
1. Upotreba ugljik monoksida, naznačena time, što je za pripremu farmaceutske smjese za liječenje ili prevenciju ileusa kod pacijenta.
2. Upotreba prema zahtjevu 1, naznačena time, što je ileus, ileus tankoga crijeva, kolona ili želuca.
3. Upotreba prema zahtjevu 1, naznačena time, što je ileus postoperativni ili postporođajni.
4. Upotreba prema zahtjevu 1, naznačena time, što pacijent boluje od ileusa ili postoji rizik za razvoj ileusa, a koji je posljedica operacije urogenitalnog sustava; operacije probavnog sustava; operacije limfnog sustava; operacije respiratornog sustava; operacije dijafragme; operacije koja je dio tretmana liječenja raka; operacije endometrija; ili ortopedske operacije.
5. Upotreba prema zahtjevu 1 ili 2, naznačena time, što ileus nije posljedica operacije.
6. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 5, naznačena time, što se farmaceutska smjesa pacijentu daje oralno, inhalacijski ili se izravno primjenjuje u abdominalnu šupljinu pacijenta.
7. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time, što je farmaceutska smjesa u plinovitom obliku.
8. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time, što je farmaceutska smjesa u tekućem obliku,
9. Upotreba ugljik monoksida za pripremu farmaceutske smjese za liječenje ileusa kod pacijenta, naznačena time, što:
(a) koristi se spremnik koji sadrži farmaceutsku smjesu u plinovitom obliku pod pritiskom, a koja sadrži plin ugljik monoksida;
(b) farmaceutska smjesa se oslobađa iz spremnika da bi nastala atmosfera plina ugljik monoksida; i
(c) pacijent se izlaže toj atmosferi.
10. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, naznačena time, što je pacijent čovjek,
11. Spremnik koji sadrži komprimirani ugljik monoksid plin medicinske klase, naznačen time, što spremnik ima oznaku koja ukazuje na to da se plin može koristiti za liječenje ili prevenciju ileusa kod pacijenta.
12. Spremnik prema zahtjevu 11, naznačen time, što je ugljik monoksid plin u smjesi s plinom koji sadrži kisik.
13. Spremnik prema zahtjevu 12, naznačen time, što je ugljik monoksid plin prisutan u smjesi pri koncentraciji od najmanje oko 0.025%, najmanje oko 0,05%, najmanje oko 0.10%, najmanje oko 1.0%, ili najmanje oko 2.0%.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37265202P | 2002-04-15 | 2002-04-15 | |
| PCT/US2003/005428 WO2003088923A2 (en) | 2002-04-15 | 2003-02-21 | Methods of treating ileus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20040972A2 true HRP20040972A2 (en) | 2005-06-30 |
Family
ID=29250888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20040972A HRP20040972A2 (en) | 2002-04-15 | 2004-10-15 | Methods of treating ileus |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7687079B2 (hr) |
| EP (1) | EP1499333B1 (hr) |
| JP (1) | JP4588325B2 (hr) |
| CN (1) | CN100496509C (hr) |
| AU (1) | AU2003216368B2 (hr) |
| CA (1) | CA2481972A1 (hr) |
| EA (1) | EA200401365A1 (hr) |
| ES (1) | ES2546280T3 (hr) |
| HR (1) | HRP20040972A2 (hr) |
| MX (1) | MXPA04010243A (hr) |
| NO (1) | NO20044562L (hr) |
| PL (1) | PL373002A1 (hr) |
| RS (1) | RS91004A (hr) |
| UA (1) | UA85041C2 (hr) |
| WO (1) | WO2003088923A2 (hr) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
| US7678390B2 (en) * | 1999-04-01 | 2010-03-16 | Yale University | Carbon monoxide as a biomarker and therapeutic agent |
| GB0111872D0 (en) | 2001-05-15 | 2001-07-04 | Northwick Park Inst For Medica | Therapeutic agents and methods |
| AU2002318377B2 (en) * | 2001-06-21 | 2008-06-19 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Carbon monoxide improves outcomes in tissue and organ transplants and suppresses apoptosis |
| US7968605B2 (en) * | 2002-02-04 | 2011-06-28 | ALFAMA—Investigação e Desenvolvimento de Produtos Farmacêuticos, Lda. | Methods for treating inflammatory disease by administering aldehydes and derivatives thereof |
| US20080026984A1 (en) * | 2002-02-04 | 2008-01-31 | Alfama - Investigacao E Desenvolvimento De Productos Farmaceuticos Lda | Methods for treating inflammatory disease by administering aldehydes and derivatives thereof |
| CN1646140A (zh) | 2002-02-04 | 2005-07-27 | 阿尔法玛药品研发有限公司 | 可释放co的化合物在用于治疗炎症药物的制备中的应用 |
| WO2003088981A1 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods of treating necrotizing enterocolitis |
| RS91004A (en) | 2002-04-15 | 2007-02-05 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education, | Methods of treating ileus |
| JP2005522521A (ja) | 2002-04-15 | 2005-07-28 | ベス イスラエル デアコネス メディカル センター | ヘムオキシゲナーゼ−１およびヘム分解産物の使用法 |
| RS99304A (en) * | 2002-05-17 | 2007-04-10 | Yale University, | Methods of treating hepatitis |
| UA87438C2 (ru) * | 2002-06-05 | 2009-07-27 | Йельский Университет | Способы лечения или профилактики рака, способ проведения хирургической операции по удалению рака и применения монооксида углерода |
| WO2004000368A1 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Pharmaceutical use of nitric oxide, heme oxygenase-1 and products of heme degradation |
| RS20050344A (en) * | 2002-11-07 | 2007-11-15 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education, | Treatment for hemorrhagic shock |
| GB2395432B (en) * | 2002-11-20 | 2005-09-14 | Northwick Park Inst For Medica | Therapeutic delivery of carbon monoxide to extracorporeal and isolated organs |
| US7523752B2 (en) | 2005-09-21 | 2009-04-28 | Ino Therapeutics, Llc | System and method of administering a pharmaceutical gas to a patient |
| US8893717B2 (en) | 2005-09-21 | 2014-11-25 | Ino Therapeutics Llc | Systems and methods of administering a pharmaceutical gas to a patient |
| US20070207993A1 (en) * | 2005-12-20 | 2007-09-06 | Alfama - Investigacao E Desenvolvimetno De Productos Farmaceuticos Lda | Molybdenum carbonyl complexes for treating rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases |
| WO2007073226A1 (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-28 | Alfama - Investigação E Desenvolvimento De Produtos Farmacêuticos Lda | Method for treating a mammal by administration of a compound having the ability to release co |
| GB0601394D0 (en) | 2006-01-24 | 2006-03-01 | Hemocorm Ltd | Therapeutic delivery of carbon monoxide |
| SI2435121T1 (sl) | 2009-05-27 | 2017-10-30 | Ino Therapeutics Llc | Pripomoček za spajanje indeksiranega ventila in sestava posode pod tlakom s pritrdilnim obročem |
| CA3130908A1 (en) | 2009-06-30 | 2010-12-30 | Mallinckrodt Hospital Products IP Limited | Methods of treating term and near-term neonates having hypoxic respiratory failure associated with clinical or echocardiographic evidence of pulmonary hypertension |
| BR112013017933B1 (pt) | 2011-01-14 | 2021-02-23 | Children's Hospital Los Angeles | composição líquida e métodos para sua fabricação |
| WO2012145520A2 (en) | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Alfama, Inc. | Carbon monoxide releasing molecules and uses thereof |
| JP6134710B2 (ja) | 2011-07-21 | 2017-05-24 | アルファーマ インコーポレイテッドＡｌｆａｍａ，Ｉｎｃ． | 一酸化ルテニウム放出分子およびその使用 |
| WO2013022946A1 (en) | 2011-08-09 | 2013-02-14 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods of treating dna damage |
| MX368858B (es) | 2012-03-15 | 2019-10-18 | Mallinckrodt Hospital Products Ip Ltd | Metodos para administrar altas concentraciones de oxido nitrico. |
| TW201618795A (zh) * | 2014-04-15 | 2016-06-01 | 波泰里斯股份有限公司 | 用以改良器官功能及延長器官移植物壽命之系統及方法 |
| US20150328073A1 (en) * | 2014-05-19 | 2015-11-19 | Joseph Gerard Archer | Hyperbaric Social Establishment or Residence |
| US11771855B2 (en) * | 2017-01-10 | 2023-10-03 | Brian Charles Weiner | Methods of treating medical conditions with oxygen |
| JP6618976B2 (ja) * | 2017-11-14 | 2019-12-11 | イノ セラピューティクス エルエルシー | 指標付弁と襟部を有する加圧容器組立体を係合するため、かつ薬物送達を調整するための装置と流体連通したプランジャ組立体により直線的に作動させるための装置および方法 |
| JP2021525246A (ja) * | 2018-05-23 | 2021-09-24 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | 心臓特異的標的化ペプチド（ｃｔｐ）、組成物およびその使用 |
| WO2019235165A1 (ja) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | 住友精化株式会社 | 炎症性消化器官疾患用組成物 |
Family Cites Families (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4053590A (en) * | 1975-02-27 | 1977-10-11 | Alza Corporation | Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin |
| US4264739A (en) * | 1979-01-05 | 1981-04-28 | Merck & Co., Inc. | Sparger for cell culture system |
| JPS5679957A (en) | 1979-12-05 | 1981-06-30 | Sogo Seibutsu Igaku Kenkyusho:Kk | Erucinia enterocolitica polysaccharide sensitizing blood cell and method of detecting erucinia enterocolitica polysaccharide antibody using this |
| US5240912A (en) * | 1983-05-09 | 1993-08-31 | Todaro George J | Transforming growth factor (TGF) peptides |
| US5084380A (en) * | 1985-01-29 | 1992-01-28 | Applied Biotechnology | Monoclonal antibodies reactive with activated and oncogenic ras p21 proteins |
| US5449665A (en) * | 1985-09-24 | 1995-09-12 | Item Development Aktiebolag | Continuous intravenous infusion of adenosine to human patients undergoing percutaneous transluminal angioplasty |
| DE3739650C1 (de) * | 1987-11-23 | 1989-05-24 | Immuno Ag | Fermenter zum Zuechten von Zellkulturen |
| US5180366A (en) * | 1990-10-10 | 1993-01-19 | Woods W T | Apparatus and method for angioplasty and for preventing re-stenosis |
| US5792325A (en) * | 1990-11-15 | 1998-08-11 | Richardson, Jr.; William H. | Electric arc material processing system |
| US5293875A (en) * | 1992-06-16 | 1994-03-15 | Natus Medical Incorporated | In-vivo measurement of end-tidal carbon monoxide concentration apparatus and methods |
| EP0693924B2 (en) * | 1993-02-22 | 2008-04-09 | Abraxis BioScience, Inc. | Methods for (in vivo) delivery of biologics and compositions useful therefor |
| EP0804244A1 (en) | 1993-03-26 | 1997-11-05 | Biorelease Technologies, Inc. | Compositions including heme-containing proteins and methods relating thereto |
| US5763431A (en) * | 1993-08-20 | 1998-06-09 | Jackson; Meyer B. | Method for regulating neuropeptide hormone secretion |
| DE4421433C1 (de) * | 1994-06-18 | 1995-06-08 | Lohmann Therapie Syst Lts | Transdermales therapeutisches System mit Wirkstoffen, die Kohlenmonoxid-Quellen darstellen, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
| US5476764A (en) * | 1994-09-16 | 1995-12-19 | The Regents Of The University Of California | Method using CO for extending the useful shelf-life of refrigerated red blood cells |
| US6066333A (en) * | 1994-09-22 | 2000-05-23 | William Harvey Research Limited | Pharmaceutical control of inflammation |
| US5664563A (en) * | 1994-12-09 | 1997-09-09 | Cardiopulmonary Corporation | Pneumatic system |
| US5914316A (en) * | 1994-12-16 | 1999-06-22 | Washington University | Method of inhibiting intimal hyperplasia |
| US5712293A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-27 | Sepracor, Inc. | Methods for treating gastro-esophageal reflux disease and other disorders associated with the digestive tract using optically pure (-) norcisapride |
| FR2735382B1 (fr) * | 1995-06-15 | 1997-07-25 | Air Liquide | Installation de production de monoxyde de carbone incorporant une unite de separation cryogenique |
| JP3195363B2 (ja) * | 1995-06-30 | 2001-08-06 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | Ｐｄｇｆアンタゴニストとしての４−〔２−（ｎ−２−カルボキサミドインドール）アミノエチル〕ベンゼンスルホンアミドまたはスルホニル尿素 |
| AU720686B2 (en) * | 1996-04-05 | 2000-06-08 | General Hospital Corporation, The | Treatment of a hemoglobinopathy |
| US6069132A (en) * | 1996-08-14 | 2000-05-30 | Revanker; Ganapathi R. | Phosphazole compounds |
| DK0921807T3 (da) | 1996-08-27 | 2004-03-15 | Messer Griesheim Gmbh | Hydrogenholdigt lægemiddel |
| US6316403B1 (en) * | 1996-09-27 | 2001-11-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating an ischemic disorder and improving stroke outcome |
| US6315995B1 (en) * | 1996-09-27 | 2001-11-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating an ischemic disorder and improving stroke outcome |
| US8128963B2 (en) * | 1996-09-27 | 2012-03-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating ischemic disorders using carbon monoxide |
| ES2285740T3 (es) | 1996-09-27 | 2007-11-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Tratamiento de un trastorno isquemico y mejora de las consecuencias de un accidente cerebrovascular. |
| HUP0102113A3 (en) | 1998-03-16 | 2003-03-28 | Celgene Corp Warren | 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline derivatives, their preparation and their use as inhibitors of inflammatory cytokines |
| US6203991B1 (en) * | 1998-08-21 | 2001-03-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Inhibition of smooth muscle cell migration by heme oxygenase I |
| US20050250688A1 (en) * | 1999-04-01 | 2005-11-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for treating an ischemic disorder and improving stroke outcome |
| US7678390B2 (en) * | 1999-04-01 | 2010-03-16 | Yale University | Carbon monoxide as a biomarker and therapeutic agent |
| US7632803B2 (en) * | 1999-10-01 | 2009-12-15 | Dmi Life Sciences, Inc. | Metal-binding compounds and uses therefor |
| FR2812197B1 (fr) | 2000-07-27 | 2003-01-03 | Air Liquide Sante Int | Utilisation de co dans le traitement de l'inflammation des voies aeriennes superieures ou des bronches |
| FR2816212A1 (fr) | 2000-11-03 | 2002-05-10 | Air Liquide Sante Int | Utilisation de monoxyde de carbone (co) dans le traitement des inflammations du systeme cardiovasculaire |
| IL157580A0 (en) * | 2001-03-20 | 2004-03-28 | Glaxo Group Ltd | Inhalation drug combination |
| IL158182A0 (en) | 2001-03-30 | 2004-03-28 | Sangstat Medical Corp | Carbon monoxide generating compounds for treatment of vacular, inflammatory and immune disorders |
| GB0111872D0 (en) | 2001-05-15 | 2001-07-04 | Northwick Park Inst For Medica | Therapeutic agents and methods |
| DE60202677T2 (de) * | 2001-05-25 | 2005-12-29 | Medtronic, Inc., Minneapolis | Implantierbare medizinische vorrichtung mit kontrollierter freigabe von gasförmigen mitteln |
| AU2002318377B2 (en) | 2001-06-21 | 2008-06-19 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Carbon monoxide improves outcomes in tissue and organ transplants and suppresses apoptosis |
| CN1646140A (zh) * | 2002-02-04 | 2005-07-27 | 阿尔法玛药品研发有限公司 | 可释放co的化合物在用于治疗炎症药物的制备中的应用 |
| EA200401070A1 (ru) | 2002-02-13 | 2005-02-24 | Бет Изрейэл Диконисс Медикал Сентер, Инк. | Способы лечения сосудистых заболеваний |
| RS91004A (en) | 2002-04-15 | 2007-02-05 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education, | Methods of treating ileus |
| JP2005522521A (ja) * | 2002-04-15 | 2005-07-28 | ベス イスラエル デアコネス メディカル センター | ヘムオキシゲナーゼ−１およびヘム分解産物の使用法 |
| WO2003088981A1 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods of treating necrotizing enterocolitis |
| KR20040106515A (ko) | 2002-05-09 | 2004-12-17 | 예일 유니버시티 | 바이오마커 및 치료제로서 일산화탄소 |
| RS99304A (en) | 2002-05-17 | 2007-04-10 | Yale University, | Methods of treating hepatitis |
| UA87438C2 (ru) * | 2002-06-05 | 2009-07-27 | Йельский Университет | Способы лечения или профилактики рака, способ проведения хирургической операции по удалению рака и применения монооксида углерода |
| WO2004000368A1 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Pharmaceutical use of nitric oxide, heme oxygenase-1 and products of heme degradation |
| DE10230165A1 (de) | 2002-07-04 | 2004-01-15 | Ino Therapeutics Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Administration von Kohlenmonoxid |
| RS20050344A (en) * | 2002-11-07 | 2007-11-15 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education, | Treatment for hemorrhagic shock |
-
2003
- 2003-02-21 RS YUP-910/04A patent/RS91004A/sr unknown
- 2003-02-21 CN CNB038126621A patent/CN100496509C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-21 WO PCT/US2003/005428 patent/WO2003088923A2/en active IP Right Grant
- 2003-02-21 MX MXPA04010243A patent/MXPA04010243A/es active IP Right Grant
- 2003-02-21 EA EA200401365A patent/EA200401365A1/ru unknown
- 2003-02-21 UA UA20041109277A patent/UA85041C2/ru unknown
- 2003-02-21 PL PL03373002A patent/PL373002A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2003-02-21 US US10/371,666 patent/US7687079B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-21 ES ES03746917.8T patent/ES2546280T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-21 CA CA002481972A patent/CA2481972A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-21 EP EP03746917.8A patent/EP1499333B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-21 JP JP2003585676A patent/JP4588325B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-21 AU AU2003216368A patent/AU2003216368B2/en not_active Ceased
-
2004
- 2004-10-15 HR HR20040972A patent/HRP20040972A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2004-10-22 NO NO20044562A patent/NO20044562L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003088923A2 (en) | 2003-10-30 |
| CA2481972A1 (en) | 2003-10-30 |
| ES2546280T3 (es) | 2015-09-22 |
| EP1499333A4 (en) | 2008-05-28 |
| NO20044562L (no) | 2004-11-15 |
| PL373002A1 (en) | 2005-08-08 |
| AU2003216368A1 (en) | 2003-11-03 |
| UA85041C2 (ru) | 2008-12-25 |
| AU2003216368B2 (en) | 2007-08-09 |
| MXPA04010243A (es) | 2005-07-05 |
| EA200401365A1 (ru) | 2005-04-28 |
| RS91004A (en) | 2007-02-05 |
| CN1658889A (zh) | 2005-08-24 |
| EP1499333B1 (en) | 2015-06-24 |
| US20030219497A1 (en) | 2003-11-27 |
| JP4588325B2 (ja) | 2010-12-01 |
| CN100496509C (zh) | 2009-06-10 |
| JP2005531534A (ja) | 2005-10-20 |
| WO2003088923A3 (en) | 2004-05-06 |
| EP1499333A2 (en) | 2005-01-26 |
| US7687079B2 (en) | 2010-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP20040972A2 (en) | Methods of treating ileus | |
| EP1505990B1 (en) | Methods of treating hepatitis | |
| EP1558084A2 (en) | Treatment for hemorrhagic shock | |
| AU2003223562B2 (en) | Methods of treating necrotizing enterocolitis | |
| JP2005533812A (ja) | 一酸化窒素、ヘムオキシゲナーゼ−１、およびヘム分解生成物の薬学的使用 | |
| US20120195976A1 (en) | Methods of treating inflammation by administration of heme oxygenase-1 and products of heme degradation | |
| CA2475963A1 (en) | Methods of treating vascular disease | |
| AU2007231907A1 (en) | Methods of treating ileus | |
| AU2003234585B2 (en) | Methods of treating hepatitis | |
| WO2008008507A2 (en) | Methods of treatment of diabetes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20090206 Year of fee payment: 7 |
|
| OBST | Application withdrawn |