MXPA04010243A - Metodos para tratar ileo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para tratar ileo en un paciente, el cual incluye administrar una composicion farmaceutica que incluye monoxido de carbono al paciente.

Description

M ÉTODOS PARA TRATAR ILEO REFERENCIA C RUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad para la Solicitud Provisional de E .U . No. 60/372,652 presentada el 1 5 de Abril de 2002, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

DECLARACIÓN EN CUANTO A LA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA Esta invención se hizo con la ayuda del Gobierno bajo las Concesiones de los I nstitutos Nacionales de Sa lud Nos. HL55330, HL60234, GM58241 y G M53789 y AI42365. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere al tratamiento de desórdenes gastrointestinales.

ANTECEDENTES El gas de monóxido de carbono (CO) es venenoso en altas concentraciones. Sin embargo, ahora se reconoce como una molécula de señal ización importante (Verma et al. , Science 259:381 -384, 1 993). También se ha sugerido que el monóxido de carbono actúa como molécula mensajera neuronal en el cerebro (Id. ) y como un modulador neuro-endocrino en el hipotálamo (Pozzoli et al. , Endocrinology 735:2314-2317, 1994). Como óxido n ítrico ( NO), el monóxido de carbono es un relajante de músculo liso (Utz eí al. , Biochem Pharmacol . 47: 1 95-201 , 1991 ; Christodoulides eí al. , Circulation 97:2306-9, 1995) e inhibe la agregación de plaquetas (Mansouri eí al. , Throm Haemost. 48:286-8, 1982). La inhalación de bajos niveles de monóxido de carbono se ha mostrado q ue tiene efectos anti-inflamatorios en algunos modelos . El ileo es una cond ición caracterizada por la falta de motilidad del intestino, y es una de las formas más comunes de la obstrucción intestinal (ver, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. , Oxford U n iversity Press ( 1 994)). Frecuentemente, el ¡leo se origina a lo largo del tracto intestinal (por ejemplo, tanto intestino delgado como delgado), pero alg unas veces puede incluir solamente uno o varios segmentos del mismo. La manipulación intestinal durante la cirugía abdominal frecuentemente conduce al ileo. Varios procedimientos farmacéuticos para tratar el ileo se han propuesto (ver, por ejemplo, Pat. de E. U. Nos. 5,362,756 (fedotozina); 5,929,035 (neuropéptídos); 6,214,843 (pirazolopirid ina); y 5,958,407 (receptor-2 activado por proteinaza antagonizante)).

BREVE DESCRIPCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la admin istración de CO puede atenuar el ileo. De acuerdo con lo anterior, en u n aspecto, la invención caracteriza un método para tratar el ileo en un paciente, que incluye identificar un paciente que padece de o en riesgo de i leo y administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz o concentración de monóxido de carbono. El ¡leo puede ser un ileo de cualquier parte del tracto gastrointestinal, por ejemplo, el estómago, intestino delgado y/o el colon. El íleo puede dar como resultado cualquier factor que origine el ¡leo, por ejemplo, cirug ía, por ejemplo, cirugía abdominal tal como cirug ía de transplante (por ejemplo, transplante de intestino delgado (SITx)) o cirugía abdominal diferente a la cirugía de transplante (por ejemplo, cirugía abdominal que incluye laparotomía o no incluye laparotomía, por ejemplo, procedimientos laproscópicos); cirugías ortopédicas (por ejemplo, cirugía de cadera); parto; isquemia intestinal; hematoma retroperitoneal; sepsis intraabdominal; inflamación intraperitoneal, por ejemplo, apendicitis aguda, coecistitis, pancreatitis; fracturas de la médula espinal; cólico uretérico; lesiones toráxicas; neumonía básica; fracturas de costilla; infarto al miocardio; alteraciones metabólicas; o cualquier combinación de las mismas. La composición farmacéutica puede administrarse al paciente mediante cualquier método conocido en la materia para administrar gases, líquidos, y/o sólidos a pacientes, por ejemplo, por medio de inhalación, insuflación, infusión, inyección, y/o ingestión. Por ejemplo, en una modalidad de la presente invención, la composición farmacéutica se administra al paciente por inhalación. En otra modalidad , la composición farmacéutica se administra al paciente oralmente. Todavía en otra modalidad, la composición farmacéutica se administra directamente a la cavidad abdominal del paciente.

El método puede además incluir la administración al paciente de al menos uno de los siguientes tratamientos además de CO: inhibir HO-1 o ferritina en el paciente; expresar el HO-1 recombinante o ferritina en el paciente; y administrar una composición farmacéutica que comprende HO- 1 , bilirrubina, biliverdina, ferritina, desferoxamina, dextrano de hierro, o apoferritina al paciente. En otro aspecto, la invención caracteriza un método para tratar el íleo post-quirúrgico en un paciente. El método incluye identificar un paciente que padece de ileo post-quirúrgico y administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono eficaz para tratar el ileo en el paciente. El ileo puede ser ileo de cualquier parte del tracto gastrointestinal, por ejemplo, el estómago, intestino delgado, y/o intestino grueso (por ejemplo, el colon). La composición farmacéutica puede administrarse al paciente por medio de cualquier vía descrita en la presente, por ejemplo, por medio de inhalación (de composiciones gaseosas); oralmente; y/o por administración directa a la cavidad abdominal del paciente. La invención también caracteriza un método para tratar el ileo en el paciente que padece de o en riesgo de ileo no originado por la cirugía abdominal, por ejemplo, íleo originado por cualquier factor descrito en la presente diferente a la cirugía abdominal. El método incluye identificar un paciente que padece de o en riesgo de ¡leo no originado por cirugía abdominal y administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono eficaz para tratar el ileo en el paciente.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para tratar el ¡leo en un paciente, que incluye las etapas de proporcionar un recipiente que contiene un gas presurizado comprendiendo gas de monóxido de carbono, identificar un paciente que padece de o en riesgo de ¡leo, liberando el gas presurizado del recipiente para formar una atmósfera que incluye gas de monóxido de carbono, y exponer el paciente a la atmósfera, en donde la cantidad de monóxido de carbono en la atmósfera es suficiente para tratar el ileo en el paciente. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un método para realizar la cirugía en un paciente. El método incluye identificar un paciente en necesidad de cirugía, y antes, durante, y/o después de la cirug ía, originar que el paciente inhale una cantidad de gas de monóxido de carbono suficiente para tratar el ileo en el paciente. La cirugía puede ser una cirugía que origina y/o coloca al paciente en riesgo de ileo. Por ejemplo, la cirugía puede incluir la manipulación (por ejemplo, tocando (directa o indirectamente)) el tracto gastrointestinal, por ejemplo, el estómago y/o los intestinos, por ejemplo, intestino grueso (por ejemplo, el colon) o intestino delgado, y puede ser una cirugía que incluye laparotomía o no incluye laparotomía (por ejemplo, cirugías que incluyen laparoscopia). En ciertas modalidades, la cirugía puede ser cirugía de transplante o cirugía no transplante, por ejemplo, cirugía que incluye cualquier (a de los) órgano (s) o tejido (s) en el abdomen, por ejemplo, la cirugía del sistema urogenital (por ejemplo, ríñones, uretra, y/o vesícula; y órganos reproductivos (por ejemplo, útero, ovarios, y/o trompas de Falopio)); el sistema digestivo (por ejemplo, el estómago, intestino delgado, intestino grueso (por ejemplo, el colon), apéndice, vesícula biliar, hígado, bazo y/o páncreas); el sistema linfático; el sistema respiratorio (por ejemplo, los pulmones); el diafragma; cirugía para tratar el cáncer de cualquier órgano o tejido dentro del abdomen; cirugía endometrial; y cirugías ortopédicas, por ejemplo, cirugía de cadera. En otro aspecto, la invención proporciona un recipiente que comprende gas CO comprimido de grado médico. El recipiente puede sostener una etiqueta que indica que el gas puede utilizarse para tratar el ileo, por ejemplo, ileo que se da como resultado de la cirugía (por ejemplo, cirugía que incluye manipulación intestinal), en un paciente (por ejemplo, un paciente humano). El gas CO puede encontrarse en una mezcla con gas de nitrógeno, con óxido nítrico y gas de nitrógeno, o con un gas que contiene oxígeno. El gas CO puede presentarse en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente 0.025%, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.05%; 0.10%, 0.50%, 1.0%, 2.0%, 10%, 50%, o 90%. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar el ileo en un paciente, que incluye identificar un paciente que padece de o en riesgo de ileo y administrar al paciente al menos uno de los siguientes tratamientos junto con el tratamiento con CO: incluyendo HO-1 o ferritina en el paciente; expresando HO-1 recombinante o ferritina en el paciente; y administrando una composición farmacéutica que comprende HO-1 , bilirrubina, biliverdina, ferritina, o apoferritina al paciente. También se contempla el uso de CO y cualquiera de los agentes anteriormente listados en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de ¡leo. También dentro de la invención se encuentra el uso de CO en la elaboración de un medicamento para tratamiento o prevención de una condición descrita en la presente, por ejemplo, ileo. El medicamento también puede utilizarse en un método para tratar el ileo en un paciente y/o para tratar donadores, órganos, y/o recipientes en los procedimientos de transplante. El medicamento puede encontrarse en cualquier forma descrita en la presente, por ejemplo, una composición de CO gaseosa o líquida. Al menos que se defina de otra forma, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según se entiende comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece esta invención. Los métodos adecuados y materiales se describen abajo, a pesar de que los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención. Todas las publicaciones, las solicitudes de patente, las patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlarán. Los materiales, métodos, y los ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitantes. Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en los dibujos acompañantes y la descripción de abajo. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán aparentes de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es una gráfica de líneas que ilustra el efecto del transplante de intestino delgado (SITx) y el tratamiento con CO sobre contractibilidad de músculo circular de intestino delgado estimulado por betanocol. =control; =control + CO; X=SITx; = SITx + CO. La Fig. 2A es una gráfica de barras que ilustra el efecto de CO en tránsito intestinal en animales de control (animales no sometidos a SITx). Barras sólidas=control; barras en tiras= control + CO (250 ppm); stom= estómago; sb=intestino delgado. La Fig. 2B es una gráfica de barras que ilustra el efecto de CO en tránsito intestinal en animales que han superado SITx. Barras sólidas=SITx; barras en tiras=SITx + CO (250 ppm); stom= estómago; sb=intestino delgado; y col=colon. La Fig. 2C es una gráfica de barras que ilustra que CO mejoró significativamente el tránsito intestinal en ratas que han superado SITx. La gráfica resume las mediciones del centro geométrico del tránsito calculado. Control=animales de control expuestos al aire; control + CO=animales de control expuestos a CO; SITx=animales que reciben SITx y se exponen al aire; SITx + CO=animales que reciben SITx y se exponen a CO. La Fig. 3 es una gráfica de barras que ilustra el efecto de CO en . el reclutamiento de leucocitos en el músculo intestinal siguiendo SITx. Control=animales de control expuestos al aire; control + CO=animales de control expuestos a CO; SbTx=animales que reciben SITx y se exponen al aire; SbTx + CO=animales que reciben SITx y se exponen a CO. La Fig. 4A es una gráfica de líneas que ilustra la expresión de mARN I L-6 en la mucosa y músculo en varios puntos de tiempo después de SITx, según se mide por el ensayo de protección de RNasa. =músculo; =mucosa. La Fig. 4B es una gráfica de líneas que ilustra la expresión de mARN I L- 1 ß en la mucosa y el músculo en varios puntos de tiempo después de SITx, según se mide por el ensayo de protección de RNasa. =músculo; =mucosa. La Fig. 5 es un grupo de gráficas de barras que ilustran el efecto de CO en sintasa de óxido nítrico (¡NOS), expresión de IL-6, I L- 1 ß, y I L-10 en el músculo externo de los injertos intestinales cuatro horas después de la reperfusión, según se mide por el análisis RT-PCR de tiempo real. Normal=animales de control expuestos al aire; Normal + CO=animales de control expuestos a CO; SITx=animales que reciben SITx y se exponen al aire; SITx + CO=animales que reciben SITx y se exponen a CO. La Fig . 6 es un grupo de gráficas de barras que ¡lustran el efecto de CO en concentraciones de suero IL-6 y nitrato/nitrito en animales que superaron SITx según se mide uno (SITx + CO (1 hr)) y cuatro (SITx + CO (4 hr)) horas después de la reperfusión. Normal=animales de control expuestos al aire; Normal + CO=animales de control expuestos a CO; SITx (1 hr) y SITx (4 hr)=animales que superaron SITx según se mide uno y cuatro horas después de la reperfusión, respectivamente. La Fig. 7A es una gráfica de barras que ilustran el efecto de manipulación intestinal (IM) en la expresión de HO-1 en los extractos musculares según se determina utilizando el análisis RT-PCR de dos etapas de tiempo real. Las muestras se analizaron 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (I M 12h), y 24 (IM 24h) horas después de la laparatomía. La expresión HO-1 de valor máximo ocurrió 3 a 6 hr postoperativamente. Los datos representan el aumento de pliegue promedio en relación al control + SEM, n=6. *P=0.001 ; **P=0.0001 . La Fig. 7B es una fotografía de un músculo completo montado que ilustra HO-1 como inmunoreactividad en polimorfoleucocitos infiltrando el músculo siguiendo IM. La Fig. 7C es una fotografía de un músculo completo montado que ilustra 0-1 como inmunoreactividad en células similares a macrófago infiltrando el músculo siguiendo IM. La Fig. 7D es una fotografía de un músculo completo montado que ilustra HO-1 como inmunoreactividad en células que contiene gránulos infiltrando el músculo siguiendo IM. Los sitios de inmunofluorescencia distinta en mitad inferior de imagen son células debajo del plano del foco. La Fig. 7D es una fotografía de un músculo completo montado que ilustra la falta de HO-1 como inmunoreactividad en el músculo de animales de control. La Fig. 8A es una gráfica de barras que ilustra los efectos de CO inhalado (24h de exposición) sobre el tránsito intestinal en ratones no sometidos a IM. Stom=estómago; sb=intestino delgado; y col=colon. Barras sólidas=animales no expuestos a CO; barras en tiras=animales expuestos a CO. La mayoría de la señal fluorescente se localiza en el intestino ciego y colon próximo. La Fig. 8B es una gráfica de barras q ue ilustra los efectos de CO inhalado (24h de exposición) en el tránsito intestinal en ratones sometidos a I M . Stom=estómago; sb=intestino delgado; y col=colon. Barras sól ¡das=animales no expuestos a CO; barras en ti ras=animales expuestos a CO . Después de I M , el tránsito se retarda significativamente.

La inhalación de CO d io como resultado la distribución más distal del dextrano etiquetado (IM-CO). La Fig. 8C es una g ráfica de barras que ilustra el resultado de los cálculos del Centro Geométrico (GC). Los números más altos corresponden a una distribución más distal de dextrano marcado. Control=an ¡males de control; Control + CO=animales de control expuestos a CO; IM=animales sometidos a I M; IM + CO=animales sometidos a I M y expuestos a CO. *En el grupo I M, GC se deterioro notablemente en relación a los controles, P <0.0001 ; n=6. † I nhalación de CO (I M + CO) dio como resultado un aumento significante en GC en relación a I M , P=0.001 ; n=6. La Fig. 9A son trazos representativos que ilustran el efecto de CO en actividad contráctil espontánea. Control: contracciones rítmicas características de ratones sin operar. Control + CO : Inhalación de monóxido de carbono (CO) por 24 hr por ratones de control no hubo efecto sobre la contractibilidad espontánea. I M : contractilidad rítmica se pierde siguiendo la manipulación q uirúrgica del intestino delgado. I M+CO: Ritmicidad se restau ra en animales tratados con CO. La Fig. 9B es una gráfica de líneas (curva de respuesta de dosis) que ilustra el efecto de CO sobre la magnitud de contracciones tónicas en tiras de músculo liso circulares de animales no sometidos a IM. Las contracciones se indujeron por exposición a las tiras a concentraciones en aumento de betanocol (0.1 a 300 ????/L). La inhalación de CO por animales de control no tuvo efecto en actividad contráctil inducida por betanocol. =control; =Control + CO. La Fig. 9C es una gráfica de líneas (curvas de respuesta de dosis) que ilustra el efecto de CO sobre la magnitud de contracciones tónicas en tiras de músculo liso circulares de animales sometidos a IM. Las contracciones se indujeron por exposición de las tiras a concentraciones en aumento de betanocol (0.1 a 300 µ?t???/L). La capacidad de músculo circular para contraerse en respuesta al betanocol se deterioro significativamente después de IM. La inhalación de actividad contráctil restaurada por CO para controlar los niveles (IM+CO). =IM; =IM + CO. La Fig. 10 es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO sobre el número de leucocitos positivos de mieloperoxidasa (MPO) infiltrando el músculo intestinal de ratones de control y después de la manipulación intestinal (IM). Control=animales de control; Control + CO=animales de control expuestos a CO; IM=animales sometidos a IM; IM + CO=animales sometidos a IM y expuestos a CO. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P<0.001; n=4. La Fig. 11A es una gráfica de barras que ilustra los resultados de un análisis de RT-PCR de dos etapas de tiempo real de los efectos de anestesia quirúrgica e IM en el curso de tiempo de expresión de mARN IL- 6. Las muestras se analizaron a 3 (I M 3h), 6 (IM, 6h), 12 (I M, 12h), y 24 (IM, 24h) horas. La expresión se valoró a 3 y 6 horas después de la cirugía. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P<0.0001 en relación al control. La Fig. 1 1 B es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en la expresión de mARN IL-6 en 3 (I M+CO 3 hr) y 6 (IM+CO 6 hr) horas después de la cirugía. IM 3 hr e Im 6h = I M animales de control en 3 hr y 6 hr, respectivamente. Los datos se expresan como promedio + SEM. La Fig. 1 1 C es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en liberación de proteína IL-6 de extractos musculares colectados 24 hr después de la cirugía. La liberación de proteína IL-6 se atenuó significativamente por inhalación de CO. Control=animales de control; Control + CO=animales de control expuestos a CO; IM=animales sometidos a IM; IM + CO=animales sometidos a I M y expuestos a CO. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P<0.0001 en relación al control; y † P=0.001 en relación a I M; n=6. La Fig . 12A es una gráfica de barras que ilustra los resultados de un análisis de RT-PCR de dos etapas de tiempo real de los efectos de anestesia q uirúrgica e I M en el curso de tiempo de expresión de mARN IL-1 ß. La expresión de mARN después de la manipulación intestinal (IM). Las muestras se analizaron 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), y 24 (IM 24 h) horas. La expresión de valor máximo ocurrió 6 h postoperativamente. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P=0.001 y **P<0.0001 en relación al control, n=6.

La Fig. 12B es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en la expresión de mARN IL-? ß en 3 (IM+CO 3 hr) y 6 (IM+CO 6hr) horas después de cirugía. CO significativamente inhibió la expresión de mARN I L- 1 ß de valor máximo. I M 3hr e I M 6hr=lM animales de control en 3 hr y 6 hr, respectivamente. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P=0.001 en relación a IM 6hr, n=6. La Fig . 12C es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en la liberación de proteína I L- 1 ß de extractos musculares colectados 24 hr después de la cirugía. La liberación de proteína I L- 1 ß se atenuó significativamente por inhalación de CO. Control=animales de control; Control + CO=animales de control expuestos a CO; IM=animales sometidos a IM; IM+CO=animales sujetos a IM y expuestos a CO. Los datos se expresan como promedio + SEM. ND=no detectado. *P=0.001 en relación a control; † P=0.001 en relación a I M; n=6. La Fig . 1 3A es una gráfica de barras q ue ilustra los resultados de un análisis de RT-PCR de dos etapas de tiempo real de los efectos de anestesia quirúrgica e IM en el curso de tiempo de expresión de mARN ¡NOS. Las muestras se analizaron en 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h), y 24 (IM 24h) horas. La expresión máxima ocurrió 6 horas después de la cirugía. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P=0.001 ; **P<0.0001 en relación al control; n=6. La Fig. 1 3B es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en la expresión de mARN ¡NOS en 3 (IM+CO 3 hr) y 6 (IM+CO 6hr) horas después de la cirug ía. IM 3 hr e IM 6h=IM animales de control en 3 h r y 6 hr, respectivamente. Los datos se expresan como promedio + SEM . † P=0.001 en relación a I M 6 hr; n=6. La Fig . 1 3C es u na g ráfica de barras q ue ilustra el efecto de inhalación de CO en liberación de nitrito total de extractos musculares colectados 24 horas después de la cirug ía. La liberación de nitrito total se determinó como un índice de actividad de ¡NOS. La inhalación de CO inhibió significativamente el aumento quirúrgicamente inducido en liberación de nitrito de músculo manipulado. Una reducción similar en nitrito se logró por incubación de extractos musculares en la presencia del inh ibidor ¡NOS selectivo L-Nil (30 µ?; IM+L-N il). Control=animales de control; Control + CO=animales de control expuestos a CO; IM=animales sujetos a I M; I M + CO=animales sujetos a I M y expuestos a CO. * P=0.001 en relación al control; † P=0.001 en relación a I M; n=6. Los datos se expresan como promedio + SEM. La Fig. 4A es una gráfica de barras q ue ilustra los resultados del análisis de RT-PCR de dos etapas de tiempo real de los efectos de anestesia quirúrgica e I M en el curso de tiempo de expresión de mARN COX-2. Las muestras se analizaron en 3 (IM 3h), 6 (I M 6h ), 12 (I M 1 2h), y 24 ( I M 24h) horas. La expresión máxima ocurrió 3-1 2 hr después de la cirugía . Los datos se expresan como promedio + SEM. *P=0.01 ; **P=0.0001 en relación al control; n=6. La Fig. 14B es una gráfica de barras q ue ilustra el efecto de inhalación de CO en expresión mARN COX-2 en 3 (IM+CO 3hr) y 6 (I M+CO 6hr) horas después de la cirug ía. IM 3hr e I M 6h=I M control de animales en 3hr y 6hr, respectivamente. Los datos se expresan como promedio + SE . La Fig. 14C es una gráfica de barras que ilustra que la inhalación de CO por animales de control significativamente aumentó la expresión de mARN COX-2 3 hr (CO 3hr) post-tratamiento. CO 6hr=expresión en 6hr de post-tratamiento. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P=0.01 . La Fig. 14D es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en liberación de proteína PGE2 de los extractos musculares colectados 24 horas después de la cirugía. La liberación de proteína PGE2 se determinó como un índice de actividad COX-2. La inhalación de CO significativamente aumenta en la liberación de PGE2 del músculo manipulado. Control=animales de control; Control+CO=animales de control expuestos a CO; IM=animales sometidos a IM; IM+CO=animales sometidos a IM y expuestos a CO. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P=0.01 y **P=0.0001 en relación al control; n=6. La Fig. 1 5A es una gráfica de barras que ilustra los resultados de un análisis de RT-PCR de dos etapas de tiempo real de los efectos de anestesia quirúrgica e IM en el curso de tiempo de la expresión de mARN IL-10. Las muestras se analizaron en 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM, 12h), y 24 (IM 24h)horas. La expresión máxima ocurrió 3 a 6 hr después de la cirugía. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P<0.001 en relación al control; n=6. La Fig. 15B es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en la expresión de mARN IL-10 en 3 (IM+CO 3hr) y 6 (IM+CO 6hr) horas después de la cirug ía. La inhalación de CO aumentó el mensaje de IL-10 en 3 hr pero no 6 hr después de la cirugía. IM 3hr e IM 6h=IM animales de control en 3 hr y 6 hr, respectivamente. Los datos se expresan como promedio + SEM. † p=0.001 en relación a I M 3hr; n=6. La Fig . 1 5C es una gráfica de barras que ilustra que la inhalación de CO por animales de control significativamente aumentó la expresión de mARN IL-10 3 (CO 3h) y 6 hr (CO 6h) después del tratamiento. Los datos se expresan como promedio + SEM. *P<0.001 en relación al control; n=6. La Fig. 16A es una gráfica de barras que ilustra los resultados de un análisis RT-PCR de dos etapas de tiempo real de los efectos de anestesia quirúrgica e I M en el curso de tiempo de expresión de mARN HO-1 3 y 6 hr después de la cirugía (IM). La inhalación de CO significativamente aumentó la expresión de mARN HO-1 en 3 hr (IM+CO 3hr) pero no 6 hr (IM+CO 6hr) postoperativamente. I M 3hr e IM 6h=IM animales de control en 3 hr y 6 hr, respectivamente. † P<0.001 en relación a I M 3hr; n=6. La Fig. 16B es una gráfica de barras que ilustra el efecto de inhalación de CO en la expresión de mARN HO-1 3hr (CO 3h) y 6 hr (CO 6h) después del tratamiento. La inhalación de CO por animales de control aumentó la expresión de mARN HO-1 6 hr después del tratamiento. * P<0.05 en relación al control; n=6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA El término "monóxido de carbono" (o "CO") según se utiliza en la presente describe el monóxido de carbono molecular en su estado gaseoso, comprimido en forma líquida, o disuelto en solución acuosa. El término "composición de monóxido de carbono" o "composición farmacéutica que comprende monóxido de carbono" se utiliza a lo largo de la especificación para describir una composición líquida o gaseosa que contiene monóxido de carbono que puede administrarse a un paciente y/o un órgano, por ejemplo, intestino delgado. El experto en la materia reconocerá cuál forma de la composición farmacéutica, por ejemplo, gaseosa, líquida o tanto formas líquidas como gaseosas, se prefiere para una aplicación dada. Los términos "cantidad eficaz" y "eficaz para tratar", según se utiliza en la presente, se refieren a la administración de monóxido de carbono en una cantidad o concentración y por período de tiempo que incluye la administración crónica o aguda y la administración continua o periódica que es eficaz dentro del contexto de su administración para originar un efecto pretendido o resultado fisiológico. Las cantidades eficaces de CO para utilizarse en la presente invención incluyen, por ejemplo, cantidades que previenen o reducen el ileo siguiendo un procedimiento, por ejemplo, transplante de intestino delgado. Para gases, las cantidades eficaces de CO generalmente caen dentro del rango de aproximadamente 0.0000001 % a aproximadamente 0.3% en peso, por ejemplo, 0.0001 % a aproximadamente 0.25% en peso, preferentemente al menos aproximadamente 0.001 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.005%, 0.010%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.08%, 0.10%, 0.1 5%, 0.20%, 0.22%, o 0.24% por CO en peso. Paras las soluciones líquidas de CO, las cantidades eficaces generalmente caen dentro del rango de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 0.0044 g CO/100 g líquido, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.0001 , 0.0002, 0.0004, 0.0006, 0.0008, 0.0010, 0.0013, 0.0014, 0.0015, 0.0016, 0.0018, 0.0020, 0.0021 , 0.0022, 0.0024, 0.0026, 0.0028, 0.0030, 0.0032, 0.0035, 0.0037, 0.0040, o 0.0042 g CO/100 g de solución acuosa. Los rangos preferidos incluyen, por ejemplo, aproximadamente 0.0010 a aproximadamente 0.0030 g CO/100 g líquido, aproximadamente 0.0015 a aproximadamente 0.0026 g CO/100 g líquido, o aproximadamente 0.0018 a aproximadamente 0.0024 g CO/100 g líquido. Un experto en la materia apreciará qué cantidades fuera de estos rangos pueden utilizarse dependiendo de la aplicación. El término "paciente" se utiliza a lo largo de la especificación para describir un animal, humano o no humano, a quien se le proporciona el tratamiento de acuerdo a los métodos de la presente invención. Las aplicaciones veterinarias se anticipan claramente por la presente invención. El término incluye pero no se limita a mamíferos, por ejemplo, humanos, otros primates, cerdos, roedores tales como ratones y ratas, conejos, conejillos de indias, hámsteres, vacas, caballos, gatos, perros, oveja y cabras. El término "trat(amiento)", se utiliza en la presente para describir el retardo del inicio de, inhibir, prevenir, o aminorar los efectos de una condición, por ejemplo, ileo. El término "donador" o "paciente donador" según se utiliza en la presente se refiere a un paciente (humano o no humano) de quien puede obtenerse un órgano o tejido para los propósitos de transplante a un paciente recipiente. El término "recipiente" o "paciente recipiente" se refiere a un paciente (humano o no humano) en el cual puede transferirse un órgano o tejido. El término "¡leo" según se utiliza en la presente generalmente se refiere a parálisis parcial o completa o dismotilidad del tracto gastrointestinal. El Meo puede originarse a lo largo del tracto gastrointestinal, o puede incluir solamente una o varias secciones del mismo, por ejemplo, estómago, intestino delgado, o colon. El experto en la materia apreciará que el ¡leo puede originarse por un gran número de factores que incluyen, por ejemplo, cirugía (por ejemplo, cualquier cirugía que incluye laparatomía, por ejemplo, transplante de intestino delgado (SITx); o cualquier cirugía que incluye laparoscopia); isquemia intestinal; hematoma retroperitoneal; sepsis intraabdominal; inflamación ¡ntraperitoneal; apendicitis aguda; coecistitis; pancreatitis; cólico uretérico; lesiones toráxicas; neumonía básica; infarto al miocardio; alteraciones metabólicas, por ejemplo, aquellos que se dan como resultado de niveles de potasio reducido; fármacos, por ejemplo, uso prolongado de opiatos; y traumas, por ejemplo, fracturas de la médula espinal y fracturas de costilla (Ver, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malí, Eds., Oxford University Press (1994)). El término también incluye ¡leo postparto, que es un problema común para las mujeres en el período que sigue al parto, por ejemplo, que sigue al suministro vaginal ("nacimiento del niño natural") o parto auxiliado quirúrgicamente. Según se utiliza en la presente, el término "¡leo post-quirúrgico" se refiere a ¡leo experimentado por un paciente que sigue cualquier procedimiento quirúrgico, por ejemplo, cirugía abdominal. El término "intervenciones no quirúrgicos" se refiere a tratamientos médicos que no incluyen cirugía. El término "íleo que se da como resultado de condiciones q ue no incluyen cirugía" se refiere a íleo originado por factores diferentes a cirug ía, por ejemplo, factores descritos en la presente. Los ind ivid uos considerados un riesgo para desarrollar íleo pueden beneficiarse particularmente de la invención , principalmente debido al tratamiento profiláctico que comienza antes de q ue existe evidencia de ¡leo. Los ind ividuos "en riesgo" incluyen , por ejemplo, pacientes en necesidad de cirug ía abdominal, sea méd icamente necesario o electivo, y/o individuos que padecen de cualquiera de las condiciones o lesiones descritas en el párrafo precedente. El experto en la materia apreciará que un paciente puede determinarse que está en riesgo de ¡leo mediante cualq uier método conocido en la materia, por ejemplo, mediante un diag nóstico de méd ico. El término "transplante" se utiliza a lo largo de la especificación como un término general para describir el proceso de transferir un órgano o tejido (por ejemplo, un intestino delgado) en un paciente. El término "transplante" se define en la materia como la transferencia de células o tejidos vivientes de un donador a un recipiente, con la intención de mantener la integridad funcional del tejido o células transplantadas en ei recipiente (ver, por ejemplo, The Merck Manual, Berkow, Fletcher, y Brees, Eds. , Merck Research Laboratories, Rahway, N .J. , 1 992). El término incluye todas las categorías o transplantes conocidos en la materia. Los transplantes se clasifican por sitio y relación genética entre el donador y el recipiente. El término incluye, por ejemplo, autotransplante (remoción y transferencia de células o tejido de una locación sobre un paciente al mismo u otra locación sobre el mismo paciente), alotransplante (transplante entre los miembros de la misma especie), y xenotransplante (transplantes entre miembros de diferentes especies).

Preparación de Composiciones Gaseosas Una composición CO puede ser una composición de monóxido de carbono gaseosa. El gas presurizado o comprimido útil en los métodos de la invención puede obtenerse de cualquier fuente comercial, y en cualquier tipo de recipiente adecuado para almacenar gas comprimido. Por ejemplo, los gases presurizados o comprimidos pueden obtenerse de cualquier fuente que suministra gases comprimidos, tales como oxígeno, para uso médico. El término gas "grado médico", según se utiliza en la presente, se refiere a gas adecuado para la administración a pacientes según se describe en la presente. El gas presurizado incluyendo monóxido de carbono utilizado en los métodos de la presente invención puede proporcionarse de tal forma que todos los gases de la composición final deseada (por ejemplo, CO, He, NO, C02, 02, N2) se encuentran en el mismo recipiente, excepto que NO y 02 no pueden almacenarse juntos. Opcionalmente, los métodos de la presente invención pueden realizarse utilizando múltiples recipientes que contienen gases individuales. Por ejemplo, un recipiente único puede ser con la condición de que contenga monóxido de carbono, con o sin otros gases, los contenidos de los cuales pueden mezclarse opcionalmente con aire ambiente o con los contenidos de otros recipientes, por ejemplo, recipientes que contienen oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, aire comprimido, o cualquier otro gas o mezclas del mismo adecuadas. Las composiciones gaseosas administradas a un paciente de acuerdo a la presente invención típicamente contienen 0% a aproximadamente 79% en peso de nitrógeno, aproximadamente 21 % a aproximadamente 100% en peso de oxígeno y aproximadamente 0.0000001 % a aproximadamente 0.3% en peso (correspondiente a aproximadamente 1 ppb o 0.001 ppm a aproximadamente 3,000 ppm) de monóxido de carbono. Preferentemente, la cantidad de nitrógeno en la composición gaseosa es aproximadamente 79% en peso, la cantidad de oxígeno es aproximadamente 21 % en peso, y la cantidad de monóxido de carbono es aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 0.25% en peso. La cantidad de CO es preferentemente al menos aproximadamente 0.001 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.005%, 0.010%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.08%, 0.10%, 0.15%, 0.20%, 0.22%, o 0.24% en peso. Los rangos preferidos incluyen aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.24%, aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.22%, aproximadamente 0.015% a aproximadamente 0.20%, aproximadamente 0.08% a aproximadamente 0.20%, y aproximadamente 0.025% a aproximadamente 0.1 % en peso. Se señala que las composiciones de monóxido de carbono gaseosas que tienen concentraciones de monóxido de carbono mayores a 0.3% (tal como 1 % o más) pueden utilizarse por cortos períodos (por ejemplo, una o pocas respiraciones), dependiendo de la aplicación. Una composición de monóxido de carbono gaseoso puede util izarse para crear una atmósfera q ue comprende gas de monóxido de carbono. Una atmósfera q ue incluye niveles adecuados de gas de monóxido de carbono, puede crearse, por ejemplo, al proporcionar un recipiente q ue contiene un gas presurizado que comprende gas de monóxido de carbono, y liberar el gas presurizado del recipiente en u na cámara o espacio para formar una atmósfera que incluye el gas de monóxido de carbono dentro de la cámara o espacio. Alternativamente, los gases pueden l i berarse en u n aparato que cu lmina en una máscara de respiración o tubo de respiración, creando de tal modo una atmósfera q ue comprende gas de monóxido de carbono en la máscara de respiración o tubo de respiración , asegurándose q ue el paciente es la única persona expuesta a niveles significantes de monóxido de carbono. Los niveles de monóxido de carbono en una atmósfera pueden medirse o monitorearse utilizando cualq uier método conocido en la materia . Tales métodos incluyen detección electroq u ímica, cromatog rafía de gas, conteo de radioisótopo, absorción infrarroja, colorimetría, y métodos electroq u ímicos basados en membranas selectivas (ver, por ejemplo, Sunderman eí al. , Clin. Chem. 28:2026-2032, 1 982; Ingi eí al. , Neuron 1 6: 835-842, 1996). Las sub-partes por millones de niveles de monóxido de carbono pueden detectarse por ejemplo, por cromatografía de gas y conteo de radioisótopo. Además, se conoce en la materia que los niveles de monóxido de carbono en el rango sub-ppm pueden medirse en tejido biológico mediante un sensor de gas infrarrojo medio (ver, por ejemplo, Morimoto eí al. , Am J . Physiol . Herat. Circ. Physiol 280: H482-H488, 2001 ). Los sensores de monóxido de carbono y dispositivos de detección de gas se utilizan ampliamente de varias fuentes comerciales.

Preparación de Composiciones Líquidas Una composición de monóxido de carbono también puede ser una composición de monóxido de carbono líq uido. Un líquido puede elaborarse en una composición de monóxido de carbono mediante cualquier método conocido en la materia para originar que los gases lleguen a disolverse en líq uidos. Por ejemplo, el líquido puede colocarse en una tan llamada "incubadora C02" y se expone a un flujo continuo de monóxido de carbono, preferentemente balanceado con dióxido de carbono, hasta que una concentración deseada de monóxido de carbono se alcanza en el líquido. Como otro ejemplo, el gas de monóxido de carbono puede "burbujearse" directamente hacia el líquido hasta que la concentración deseada de monóxido de carbono en el líquido se alcanza. La cantidad de monóxido de carbono que puede disolverse en una solución acuosa dada aumenta con la temperatura decreciente. Asi como todavía otro ejemplo, un líquido adecuado puede pasarse a través del tubo que permite la difusión de gas, en donde el tubo recorre a través de una atmósfera que comprende monóxido de carbono (por ejemplo, utilizando un dispositivo tal como un oxigenador de membrana extracorpórea). El monóxido de carbono se propaga en el líquido para crear una composición de monóxido de carbono líquida. Es probable que tal composición líquida pretendida a introducirse en un animal viviente será a o aproximadamente 37°C al momento que se introduce en el animal.

El líquido puede ser cualquier líquido conocido por aquellos expertos en la materia por ser adecuados para la administración a pacientes, o conservación y/o lavado y/o perfusión de órganos de interés (ver, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. , Oxford University Press (1994)). En general, el líquido será una solución acuosa. Los ejemplos de soluciones adecuadas incluyen Salina Regulada de Fosfato (PBS), Celsior™, Perfadex™, solución Collins, solución de citrato, y solución de Universidad de Wisconsin (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). En una modalidad de la presente invención, el líquido es solución Ringer, por ejemplo, Solución Ringer lactada, o cualquier otro líquido que puede utilizarse infusionado en un paciente. En otra modalidad, el líquido incluye sangre, por ejemplo, sangre completa. Cualquier líquido adecuado puede saturarse a una concentración fija de monóxido de carbono por medio de difusores de gas. Alternativamente, las soluciones pre-elaboradas que han sido controladas por calidad para contener niveles fijos de monóxido de carbono, pueden utilizarse. El control agudo de dosis puede lograrse por medio de mediciones con un gas permeable, membrana impermeable líquida conectada a un analizador de monóxido de carbono. Las soluciones pueden saturarse a concentraciones eficaces deseadas y mantenerse en estos niveles.

Tratamiento de Pacientes con Composiciones de Monóxido de Carbono Un paciente puede tratarse con una composición de monóxido de carbono mediante cualquier método conocido en la materia de administración de gases y/o líquidos al paciente. Las composiciones de monóxido de carbono pueden administrarse a un paciente diagnosticado con , o determinado que se encuentra en riesgo de ileo, por ejemplo, pacientes quirúrgicos, incluyendo pacientes que superan SITx. La invención contempla la administración sistémica de composiciones de monóxido de carbono gaseoso o líquido a pacientes (por ejemplo, por inhalación y/o ingestión), y la administración local de las composiciones al tracto gastrointestinal del paciente (por ejemplo, por ingestión, insuflación, y/o introducción en la cavidad abdominal).

Suministro Sistémico de Monóxido de Carbono Las composiciones de monóxido de carbono gaseosas pueden suministrarse sistémicamente a un paciente, por ejemplo, un paciente quirúrgico o donador de transplante de intestino delgado y/o recipientes. Las composiciones de monóxido de carbono gaseosas se administran típicamente por inhalación a través de la boca o pasos nasales hacia los pulmones, en donde el monóxido de carbono puede ejercer su efecto directamente o absorberse fácilmente en la corriente sanguínea del paciente. La concentración del compuesto activo (CO) utilizada en la composición gaseosa terapéutica dependerá de la absorción, distribución, inactivación, y excreción (generalmente, a través de la respiración) escalas de monóxido de carbono así como también otros factores conocidos por aquellos expertos en la materia. Se entenderá además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específica deberán ajustarse tiempo extra de acuerdo a la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de concentración establecidos en la presente son ejemplares solamente y no se pretende que limiten el alcance o práctica de la composición reivindicada. La administración crónica, sub-aguda, y aguda del monóxido de carbono se contemplan por la presente invención, dependiendo de, por ejemplo, la severidad o persistencia de íleo en el paciente. El monóxido de carbono puede suministrarse al paciente por un tiempo (incluyendo indefinidamente) suficiente para tratar la condición y ejercer el efecto biológico o farmacológico. Los siguientes son ejemplos de algunos métodos y dispositivos que pueden utilizarse para administrar composiciones de monóxido de carbono gaseosas a los pacientes.

Ventiladores El monóxido de carbono de grado médico (concentraciones pueden variar) puede adquirirse mezclado con aire u otro gas que contiene oxígeno en un tanque estándar de gas comprimido (por ejemplo, 21 % de 02, 79% de N2). No es reactivo, y las concentraciones que se requieren para los métodos de la presente invención se conocen bien abajo del rango de combustible (10% en el aire). En un establecimiento de hospital, el gas presuntamente se suministrará al lado de la cama en donde se mezclará con oxígeno o aire de alojamiento en un mezclador a una concentración deseada en ppm (partes por millón). El paciente inhalará la mezcla de gas a través de un ventilador, que se fijará a una velocidad de flujo en base a la comodidad del paciente y necesidades. Esto se determina por gráficas pulmonares (es decir, velocidad respiratoria, volúmenes totales de la respiración, etc. ). El (los) mecanismo (s) de protección en caso de fallos para prevenir al paciente de recibir in necesariamente más de las cantidades deseadas de monóxido de carbono pueden diseñarse en el sistema de suministro. El nivel de monóxido de carbono del paciente puede monitorearse al estudiar (1 ) carboxihemoglobina (COHb), q ue puede medirse en sang re venosa , y (2) monóxido de carbono exhalado colectado desde un puerto lateral del ventilador. La exposición de monóxido de carbono puede ajustarse en base al estado de salud del paciente y sobre la base de los marcadores. Si es necesario, el monóxido de carbono puede agotarse del paciente al cambiar a 100% de inhalación de 02. El monóxido de carbono no se metaboliza; de esta manera, lo q ue se inhala últimamente se exhalará excepto por un porcentaje muy peq ueño que se convierte a C02. El monóxido de carbono también puede mezclarse con cualquier nivel de 02 para proporcionar el suministro terapéutico de monóxido de carbono sin condiciones hipóxicas consecuenciales.

Máscara Antigás y Dilatador por Inhibición Una mezcla de gas que contiene monóxido de carbono se prepara según anteriormente para permitir la inhalación pasiva por el paciente utilizando una máscara antigás o dilatador por inhibición. La concentración inhalada puede cambiarse y puede agotarse al simplemente cambiar a más de 100% de 02. El monitoreo de los niveles de monóxido de carbono podría ocurrir en o cerca de la máscara o dilatador por inhibición con un mecanismo de protección en caso de fallos que podría prevenirse tan alto de una concentración de monóxido de carbono de la que se inhala.

Inhalador Portátil El monóxido de carbono comprimido puede empaquetarse en un dispositivo inhalador portátil e inhalarse en una dosis medida, por ejemplo, para permitir el tratamiento intermitente de un recipiente que no se encuentra en un establecimiento de hospital. Las concentraciones diferentes de monóxido de carbono podrían empaquetarse en los contenedores. El dispositivo podría ser tan simple como un tanque pequeño (por ejemplo, bajo 5 kg) de CO diluido adecuadamente con una válvula no en serie y un tubo del cual el paciente toma una bocanada de CO de acuerdo a un régimen estándar o según sea necesario.

Pulmón Artificial Intravenoso Un pulmón artificial (un dispositivo de catéter para intercambio de gas en la sangre) diseñado para el suministro de 02 y remoción de C02 puede utilizarse para el suministro de monóxido de carbono. El catéter, cuando se implanta, reside en una de las venas grandes y podría ser capaz para suministrar el monóxido de carbono en concentraciones dadas ya sea para el suministro sistémico o en un sitio local. El suministro puede ser un suministro local de una concentración alta de monóxido de carbono por un corto período de tiempo en el sitio del procedimiento, por ejemplo, en proximidad al intestino delgado (esta concentración alta podría diluirse rápidamente en la corriente sanguínea), o una exposición relativamente más larga a una concentración inferior de monóxido de carbono (ver, por ejemplo, Hattler et al. , Artif. Organs 18(1 1 ):806-812 ( 1 994); y Golob et al. , ASAIO J., 47(5):432-437 (2001 )).

Cámara Normobárico En ciertos casos, podría ser deseable exponer el paciente completo a monóxido de carbono. El paciente podría encontrarse dentro de una cámara hermética al aire que podría fluirse con monóxido de carbono (a un nivel que no daña al paciente, o a un nivel que posee un riesgo aceptable sin el riesgo de espectadores que se expongan. Al consumarse la exposición, la cámara podría nivelarse con agua (por ejemplo, 21 % de 02, 79% de N2) y las muestras podrían analizarse por analizadores de monóxido de carbono para asegurar que nada de monóxido de carbono permanezca antes de permitir al paciente salir del sistema de exposición.

Suministro Sistémico de Composiciones de CO Líquidas La presente invención contempla además que las composiciones de CO líquidas pueden crearse para suministro sistémico a un paciente, por ejemplo, por infusión en un paciente. Por ejemplo, las composiciones de CO líquidas, tales como Solución Ringer saturada de CO, puede infusionarse en un paciente antes, durante, y/o después de un procedimiento quirúrgico. Alternativamente o además, la sangre total completamente saturada (o parcial) o parcialmente de CO puede infusionarse en el paciente. La presente invención también contempla que los agentes capaces de suministrar dosis de gas CO o líquido pueden utilizarse (por ejemplo, CO, gomas liberadoras, cremas, ungüentos o parches).

Tratamiento Local del Tracto Gastrointestinal con Monóxido de Carbono Alternativamente o además, las composiciones de monóxido de carbono pueden aplicarse directamente al tracto gastrointestinal, por ejemplo, al interior y/o exterior del tracto gastrointestinal completo, o a cualquier parte del mismo. Una composición gaseosa puede aplicarse directamente al tracto gastrointestinal de un paciente, por ejemplo, un paciente quirúrgico o recipiente o donador de transplante de intestino delgado, mediante cualquier método conocido en la materia para insuflar gases en un paciente. Por ejemplo, los gases, por ejemplo, dióxido de carbono, frecuentemente se insuflan en el tracto gastrointestinal y la cavidad abdominal de pacientes para facilitar la evaluación durante los procedimientos laproscópicos y endoscópicos, respectivamente (ver, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. , Oxford University Press (1 994)). El experto en la materia apreciará que los procedimientos similares podrían utilizarse para administrar las composiciones de monóxido de carbono directamente al tracto gastrointestinal de un paciente. Se contempla que la presente invención puede aplicarse para ayudar a prevenir el ¡leo que se da como resultado de laproscopía y endoscopía, por ejemplo, colonoscopía y oesofagastroduodenoscopía. Las composiciones de monóxido de carbono acuosas también pueden admi nistrarse localmente al tracto gastrointestinal de un paciente. Las formas acuosas de las composiciones pueden administrarse med iante cualq uier método conocido en la materia para administrar líquidos a pacientes. Como con las composiciones gaseosas, las composiciones acuosas pueden aplicarse directamente al interior y/o exterior del tracto gastrointestinal. Por ejemplo, la forma acuosa puede administrarse oralmente, por ejemplo, al originar que el paciente ingiera una dosis encapsulada o no encapsulada de la composición de monóxido de carbono acuosa. Como otro ejemplo, los líq uidos, por ejemplo, las soluciones salina que contienen CO disuelto, pueden inyectarse en el tracto gastrointestinal y la cavidad abdominal durante los procedimientos laproscópicos y endoscópicos, respectivamente. En el contexto de SITx, las exposiciones in situ pueden realizarse mediante cualq uier método conocido en la materia, por ejemplo, med iante nivelación in situ del órgano con una composición de monóxido de carbono líquida antes de la remoción del donador (ver, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. , Oxford University Press ( 1994)).

Conservación del Órgano del Transplante de Intestino delgado ex vivo Las composiciones de monóxido de carbono pueden utilizarse para tratar a pacientes q ue superan el transplante de cualq uier parte del tracto gastrointestinal, por ejemplo, transplante de intestino delgado (SITx). En el contexto de los procedimientos de transplante, las composiciones de monóxido de carbono pueden utilizarse para tratar donadores, recipientes y/o el órgano por sí mismo en cualquier etapa de la colección de órgano, almacenamiento, y proceso de transplante. Un órgano gastrointestinal puede colectarse de un donador, tratarse con una composición de monóxido de carbono ex vivo de acuerdo con la presente invención, y transplantarse a un paciente. Alternativamente o además, el órgano puede tratarse in situ, mientras que todavía está en el donador. Opcionalmente, una composición de monóxido de carbono puede administrarse al recipiente antes de, durante, y/o después de la cirugía; por ejemplo, después de que el órgano se reperfusiona con la sangre del recipiente. La composición de monóxido de carbono puede administrarse al donador antes de o durante el proceso de colección del órgano del donador. La exposición ex vivo del intestino delgado (o parte del mismo) al monóxido de carbono puede ocurrir al exponer el intestino delgado a una atmósfera que comprende gas de monóxido de carbono, a una composición de monóxido de carbono líquido, por ejemplo, un perfusato líquido, solución de almacenamiento, o solución de lavado que tiene monóxido de carbono disuelto en la misma, o ambas. La exposición del intestino delgado a las composiciones de monóxido de carbono gaseosas puede realizarse en cualquier cámara o área adecuada para crear una atmósfera que incluye niveles adecuados de gas de monóxido de carbono. Tales cámaras incluyen, por ejemplo, las incubadoras y las cámaras construidas para el propósito de acomodar un órgano en una solución de conservación. Una cámara adecuada puede ser una cámara en donde solamente los gases alimentados en la cámara se presentan en la atmósfera interna, de tal forma que la concentración de monóxido de carbono puede establecerse y mantenerse a una concentración y pureza dada, por ejemplo, en donde la cámara es hermética al aire. Por ejemplo, una incubadora C02 puede utilizarse para exponer un órgano a una composición de monóxido de carbono, en donde el gas de monóxido de carbono se suministra en un flujo continuo de un recipiente que contiene el gas. La exposición de un órgano a una composición de monóxido de carbono líquida puede realizarse ex vivo mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, la exposición puede realizarse ex vivo en cualquier cámara o espacio que tiene suficiente volumen para sumergir el órgano, completa o parcialmente, en la composición de monóxido de carbono. Como otro ejemplo, el órgano puede exponerse a una composición de monóxido de carbono al colocar el órgano en cualquier contenedor adecuado y originar que la composición de monóxido de carbono "se agote" del órgano, de tal forma que el órgano se expone a un flujo continuo de la composición de monóxido de carbono. Como otro ejemplo, el órgano puede perfusionarse con una composición de monóxido de carbono. El término "perfusión" es un término reconocido de la materia, y se relaciona al paso de un líquido, por ejemplo, una composición de monóxido de carbono, a través de los vasos sangu íneos del órgano. Con respecto al tracto gastrointestinal, el término incluye nivelar el lumen intestinal con una composición de monóxido de carbono. Los métodos para prefusíonar los órganos ex vivo e in situ se conocen bien en la materia. Un órgano puede perfusionarse con una composición de monóxido de carbono ex vivo, por ejemplo, mediante perfusión de máqu ina hipotérmica continua (ver, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. , Oxford University Press (1994)). Opcionalmente, en las perfusiones in situ o ex vivo, el órgano puede perfusionarse con una solución de lavado, por ejemplo, sol ución UW sin monóxido de carbono, antes de la perfusión con la composición de monóxido de carbono, para remover la sangre del donador desde el órgano. Tal proceso podría realizarse para evitar la competencia de monóxido de carbono mediante la hemoglobina del donador. Como otra opción, la solución de lavado puede ser una composición de monóxido de carbono. Como todavía otro ejemplo, el órgano puede colocarse, por ejemplo, sumergirse, en un medio o solución que no incluye monóxido de carbono, y colocarse en una cámara de tal forma que el medio o solución puede elaborarse en una composición de monóxido de carbono por medio de la exposición a una atmósfera que contiene monóxido de carbono según se describe en la presente. Como todavía otro ejemplo, y cualquier monóxido de carbono se "burbujea" así en el líquido. U n intestino delgado puede colectarse desde un donador y transplantarse mediante cualquiera de los métodos conocidos por aquellos expertos en la materia (ver, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. , Oxford University Press (1994)). El experto en la materia reconocerá que los métodos para transplantar y/o colectar los órganos para transplante pueden variar depend iendo de varias circunstancias, tal como la edad del donador/recipiente. La presente invención contempla que cualq uiera o todos los métodos anteriores para exponer un órgano a una composición de monóxido de carbono líq uida, por ejemplo, lavado, inmersión, o perfusión, pueden util izarse en un proced imiento dado, por ejemplo, util izado en un procedimiento SITx único.

Uso de Hemoxiqenasa-1 v Otros Compuestos También se contempla por la presente invención la inducción o expresión de hemooxigenasa-1 (HO-1 ) junto con la administración de monóxido de carbono. En el contexto de SITx, HO-1 puede inducirse opcionalmente en el órgano, el donador de órgano, el recipiente, o todos los tres, junto con la administración de monóxido de carbono. Por ejemplo, HO-1 puede inducirse en el donador, por ejemplo, antes de o durante la remoción del órgano, en el órgano ex vivo, y/o en el recipiente antes de, durante, o siguiente al transplante. En el contexto de otras intervenciones (es decir, transplante no relacionad) que probablemente dan como resultado ileo, podría ind ucirse HO-1 en el intestino de manera corta antes, durante, o de manera corta después de la intervención. Según se utiliza en la presente, el término "inducir (do)" significa que se origina la producción aumentada de una proteína, por ejemplo, HO- 1 , en células aisladas o las cél ulas de un tejido, órgano o animal utilizando el gen endógeno propio de las células (por ejemplo, no recombinante) que codifica la proteína.

HO-1 puede inducirse en un paciente mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, la prod ucción de HO-1 puede ind ucirse por hemina , por protoporfirina de hierro, o por protoporfirina de cobalto. Una variedad de agentes no hemo incluyendo metales pesados, citoquinas, hormonas, óxido nítrico, COCI2, endotoxina y choque térmico también son inductores fuertes de la expresión de HO-1 (Otterbein, et al. , Am. J . Physiol. Lung Cell Mol . Physiol. 279: L1029-L 1 037; 2000; Choi et al. , Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9- 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol . Toxicol. 37:517-554, 1 997; y Tenhunen et al. , J . Lab. Clin. Med . 75:41 0-421 , 1970). HO-1 también se induce altamente por una variedad de agentes y condiciones q ue crean tensión oxidativa, incluyendo peróxido de hidrógeno, eliminadores de glutationa , irradiación UV e hiperoxia (Choi eí al. , Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol . 37:51 7-554, 1 997; y Keyse et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:99- 1 03, 1989). Una "composición farmacéutica que comprende un inductor de HO-1 " significa una composición farmacéutica que contiene cualquier agente capaz de inducir HO-1 en un paciente, por ejemplo, cualq uiera de los agentes descritos anteriormente, por ejemplo, hemina, protoporfirina de hierro, y/o protoporfirina de cobalto. La expresión de HO-1 en una célula puede aumentarse por medio de una transferencia de gen . Según se utiliza en la presente, el término "expresar (ado)" significa originar la producción aumentada de una proteína, por ejemplo, HO-1 o ferritina, en células aisladas o las células de un tejido, órgano o animal utilizando un gen exógenamente administrado (por ejemplo, un gen recombinante). La HO-1 o ferritina se preferentemente de la misma especie (por ejemplo, humano, ratón, rata, etc.) como el recipiente, a fin de minimizar cualquier reacción inmune. La expresión podría conducirse mediante un promotor constitutivo (por ejemplo, promotores de citomegalovirus) o un promotor específico de tejido (por ejemplo, promotor de suero de leche para células mamaria o promotor de albúmina para las células de hígado). Un vector de terapia de gen adecuado (por ejemplo, retrovirus, virus asociado adeno (AAV), virus de sarampión (por ejemplo, vacuna), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus minuto de ratones, virus de hepatitis B, virus de gripe, Virus-1 de Herpes Simple, y lentivirus) codificando HO-1 o ferritina podría administrarse al paciente oralmente, por inhalación, o por inyección en la pared intestinal, lumen intestinal, o cavidad abdominal en cualquier momento antes, durante, y/o después del procedimiento inductor de ileo, por ejemplo, aproximadamente 24 horas o inmediatamente antes del procedimiento inductor de ileo. De igual forma, los vectores de plásmido que codifican HO-1 o apo-ferritina pueden administrarse, por ejemplo, como ADN natural, en liposomas, o en micropartículas. Además, la proteína HO-1 exógena puede administrarse directamente a un paciente mediante cualquier método conocido en la materia. HO-1 exógeno puede administrarse directamente además de, o como una alternativa, a la inducción o expresión de HO-1 en el paciente según se describe anteriormente. La proteína HO-1 puede suministrarse a un paciente, por ejemplo, en liposomas, y/o como una proteína de fusión, por ejemplo, como una proteína de fusión TAT (ver, por ejemplo, Becker-Hapak et al. , Methods 24:247-256, 2001 ).

Alternativamente o además, cualquiera de los productos de metabolismo por HO-1 , por ejemplo, bilirrubina, biliverdina, hierro y/o ferritina, puede administrarse a un paciente junto con monóxido de carbono a fin de prevenir o tratar el ileo. Además, la presente invención contempla que las moléculas de unión de hierro diferentes a ferritina, por ejemplo, desferoxamina (DFO), dextrano de hierro, y/o apoferritina, pueden administrarse al paciente. Además todavía, la presente invención contempla las enzimas (por ejemplo, reductasa de biliverdina) que catalizan la ruptura de cualquiera de estos productos puede inhibirse para crear/mejorar el efecto deseado. Cualquiera de los anteriores puede administrarse, por ejemplo, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, o por administración directa a la parte interna o parte externa del intestino. La presente invención contempla que los compuestos que librean CO en el cuerpo después de la administración del compuesto (por ejemplo, compuestos liberadores de CO, por ejemplo, compuestos liberadores de CO fotoactivables), por ejemplo, decacarbonilo dimanganeso, dímero de tricarbonildicloroutenio (I I), y cloruro de metileno (por ejemplo, en la dosis de entre 400 a 600 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 500 mg/kg), también pueden utilizarse en los métodos de la presente invención , como puede sustituirse la carboxihemoglobina y hemoglobina donadora de CO. La administración de cualquiera de los anteriores puede administrarse a un paciente en cualquier manera, por ejemplo, por administración oral, intravenosa, o intraarterial. Cualq uiera de los compuestos anteriores pueden administrarse al paciente localmente y/o slstémicamente, y en cualquier combinación. La presente invención además contempla tratar el ¡leo al administrar CO al paciente en combinación con estimulación funcional del tracto intestinal del paciente, por ejemplo, al administrar suavizantes de materias fecales, laxantes, y/o lubricantes al paciente; y/o por hidratación intravenosa y/o descompresión nasogástrica. CO puede administrarse en combinación con cualquiera de los otros métodos o compuestos conocidos para tratar el ileo. La invención se ilustra en parte por los siguientes ejemplos, que no se tomarán como limitantes de la invención en ninguna manera.

Ejemplo 1 . Efecto Protector de Monóxido de Carbono para Ileo Inducido por Transplante Animales Las ratas macho LEW (RT1 ) endógamos que pesan 200-300 gramos se adquirieron de Harían Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN), y se mantienen en una instalación de animal de flujo laminal en la Universidad de Pittsburgh. Los animales se alimentaron con una dieta estándar ad libitum.

Transplante del Intestino Delgado Para determinar si el CO es protector contra el ileo asociado con el transplante de intestino delgado, SITx ortotópico se realizó en ratas Lewis singénicas. SITx con drenaje cava) se realizó utilizando un procedimiento anteriormente descrito. El intestino delgado donador entero del ligamento a Treitz a la válvula ileocecal se aisló en un pedículo vascular consistiendo de la vena portal y de la arteria mesentérica superior en comunidad con un segmento de aorta. El injerto se perfusionó por medio del segmento aórtico con 5 mi de solución de lactato Ringer enfriada, y el lumen intestino se irrigó con 20 mi de solución salina fría que contiene 0.5% de neomicina-sulfato (Sigma, St. Louis, MO). Las anastomosas de extremo a lado entre la aorta de injerto y la aorta infrarenal de recipiente, y entre la vena portal de injerto y la vena cava de recipiente, se realizaron con 10-0 Novafil™ de sutura. El tiempo isquémico frío fue de 1 hora. El intestino de recipiente completo se removió y la continuidad entérica se restauró por anastomosas intestinal de extremo a extremo dista! y próxima. A los animales recipiente se les dio 20 mg/día de nafato cefamandol profiláctico por 3 días postoperativos. A los recipientes transplantados se les dio agua 3 horas después de cirugía, y se alimentaron 24 horas después de la cirugía.

Grupos Experimentales Cuatro grupos de animales se examinaron en este estudio, dos de los cuales recibieron un SITx. El grupo 1 consistió de ratas normales no operadas. Los animales del grupo 2 se expusieron a CO sin cirugía. En el grupo 3, SITx singeneico se realizaron y los recipientes se mantienen en aire ambiente. El grupo 4 consistió de recipientes SITx que se colocaron en la cámara de CO por 1 hora antes de la cirugía y después se volvieron a exponer así a CO inmediatamente sig uiendo la cirug ía hasta sacrificarse. En ambos Grupos 3 y 4, las ratas LEW normales sirvieron como donadores.

Exposición a CO Los animales se expusieron a CO a una concentración de 250 ppm. En resumen , 1 % de CO en aire se mezcló con aire (21 % de oxígeno) en un cilindro de mezclado de acero inoxidable y después se dirigió hacia una cámara de exposición de vidrio de 3.70 ft3 a una velocidad de flujo de 12 L/min. Un analizador CO (Interscan , Chatsworth, CA) se utilizó para medir los niveles CO continuamente en la cámara. Las concentraciones de CO se mantuvieron a 250 ppm en todas las veces. A los animales se les suministró alimentos y agua durante las exposiciones.

Estudios Funcionales El efecto del tratamiento CO en dismotilidad intestinal en los injertos transplantados se valoró tanto in vitro como in vivo. Los tejidos se colectaron 24 o 48 horas post-operativamente, que se han mostrado que son puntos de tiempo durante los cuales los valores de dismotilidad se ind ujeron por transplante. La actividad mecánica de músculo circula in vitro se midió según se describió previamente (Eskandari ef al. , Am. J. Physiol. 273(3 Pt 1 ): G727-34 ( 1997)). Las ratas se anestesiaron y se mataron por exsanguinación 24 horas post-operativamente. Un seg mento de yeyuno medio se sujetó en un plato disecador en línea Sylgaard™ q ue contiene regulador de Krebs-Ringer-bicarbonato pre-oxigenado (KRB; en mM: 137.4 Na\ 5.9 K\ 2.5 Ca2\ 1 .2 Mg2+, 134 Cl", 15.5 HC03", 1 .2 H2P04", y 1 1 .5 de glucosa) que se equilibró con 97% de 02/3% de C02- El intestino se abrió a lo largo del límite mesentérico y la mucosa se removió por destilación con fórceps fino. Las tiras de espesor completo del músculo (1 x 6 mm) se cortaron en paralelo en la capa de músculo circular. Las tiras musculares se montaron en cámaras de órgano mecánicas horizontales estándar que se superfusionaron continuamente con KRB pre-oxigenado mantenido a 37°C. Un extremo de cada tira se unió por ligadura a un poste fijo y el otro a un transductor de fuerza ¡sométrica (WPI, Sarasota, FL). Las tiras se dejaron equilibrar por 1 hora, después de la cual se tensaron en aumento a la longitud a la cual la contracción espontánea máxima ocurrió (LQ). Después de un segundo período de equilibrio de 30 minutos, las curvas de respuestas a contractibilidad se generaron al exponer los tejidos a concentraciones crecientes del combatiente muscular betanocol (0.3 a 300 µ?) por 10 minutos, seguido por un período de lavado de 10 minutos. La actividad contráctil se calculó al integrar el área bajo el elemento, normalizado al convertir el peso y la longitud de la tira a milímetros cuadrados de tejido (1 .03 mg/mm2), y se reportaron como g/s/mm2. El tránsito intestinal se midió en controles y animales manipulados 48 horas post-operativamente al evaluar la distribución intestinal de dextrano etiquetado por fluoresceína (Probetas Moleculares). Se sedó a los animales ligeramente con isoflurano inhalado y se alimentaron oralmente con dextrano etiquetado (200 µ? de 6 mg/ml en salina). Dos horas después de la administración, el animal se sacrificó y el intestino completo de estómago a colon distal se colectó. Los contenidos del estómago, intestino delgado (dividido en 10 segmentos de longitud igual), intestino ciego, y colon (3 segmentos; próximo, medio y distal) se abrieron, se colocaron en 2 mi de salina, y se arremolinaron vigorosamente para liberar el dextrano presente en cada segmento. Después de formar en pastillas el tejido intestinal y quimio, las alícuotas del sobrenadante se leyeron en duplicado en un lector de placa (CytoFluor I I; longitud de onda de excitación 530 nm y emisión 590 nm) para cuantificación de la señal fluorescente en cada segmento de intestino. Un histograma medio de la señal fluorescente se representó por diagrama así para demostrar los cambios en la distribución de dextrano etiquetado entre los grupos experimentales. El tránsito intestinal se determinó para análisis estadístico al calcular el centro geométrico (GC).

Estudios Morfológicos Estudio Histopatolóqico Los injertos del intestino grueso se fijaron en 10% de formalina regulada y se incorporaron en parafina. Las secciones se cortaron a un espesor de 4 µ?t? y se colorearon con hemtoxilina y eosína.

Histoquímica de Mieloperoxidasa Los montajes totales de músculo se prepararon del intestino grueso medio colectados 24 horas post-operativamente. Los segmentos de intestino se sumergieron en KRB en un plato de vidrio en línea Sylgaard™ y se sujetaron sin estrechar a lo largo del límite mesentérlco. La longitud y anchura de los segmentos se midieron con un calibrador. El colon se abrió así a lo largo del l ímite mesentérico y se estrechó a 1 50% de la longitud y 250% de la anchura. La mucosa y submucosa se removieron uti lizando fórceps fino, y el tejido restante se fijó en 1 00% de etanol desnaturalizado por 30 minutos. Después de lavarse varias veces con PBS, el tejido se trató con reactivo Hanker-Yates para la detección de neutrofilos polimorfonucleares (PMN's) mostrando actividad mieloperoxidasa (MPO) (Sheibani et al. , Am. J. Clin. Pathol. 75(3):367-70 (1981 )). Los tejidos se montaron en pedazos de vidrio utilizando Gel/ ount™ (Biomedia Corp. , Foster City, CA), se deslizaron por cubierta y se inspeccionaron por microscopía de luz (Nikon FXA, Fryer, Huntley, IL) a una magnitud de 200x. Los números de PMN's positivos por MPO infiltrando los músculos externos se determinaron de los conteos promedio colectados de cinco a seis campos óptimos adyacentes centrados entre los límites mesentéricos y anti-mesentéricos.

Estudios biológicos moleculares Ensayo de Protección RNasa (RPA) Para investigar el análisis secuencial de expresión mARN de citoquina en la mucosa y músculo, el ensayo de protección de RNasa se realizó con el equipo Riboq uant™ (Pharmigen) de acuerdo al protocolo del fabricante. Las probetas múltiples de ARN antisentido rad ioetiquetadas se sintetizaron utilizando un equipo de transcripción in vitro y grupo templado de múltiples probetas de citoquina de rata (rCK-1 ), que incluyó probetas para citoquinas (Interleuquina (!L)-1 a, IL-1 ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 1 0, TN F-a, TN F-ß e I FN-?) y genes cuidadores (L32 y GAPDH). Las probetas marcadas 32P (8.0 x 1 05 de cpm) y ARN de muestra (5 se hibridizaron a 56°C por 1 2-16 horas, y los ARNs de filamento único incluyendo probetas de ARN antisentido se ingirieron al utilizar equipo RPA (Pharmingen). Las probetas protegidas se cargaron sobre un 40% de gel de poliacri lamida. La autoradiografía se realizó utilizando un sistema Phosphorlmager™ (Molecular Dynamics, Krefeld , Company). La cuantificación de radioactividad de bandas mARN se realizó con N I H Image, normalizado a GAPDH, y se expresó como una proporción de citoq uina/GAPDH (n=3-4).

RT-PCR de tiempo real SYBR verde Los efectos de la inhalación de CO en expresión de gen antiinflamatorio o pro-inflamatorio inducido por transplante se valoró en extractos musculares por RT-PCR. El músculo externo se colectó de intestino normal e injertos transplantados 4 horas post-operativamente y se congelador al golpe en nitrógeno l íquido. Este punto de tiempo cae dentro del rango de expresión de mediador inflamatorio máximo q ue ocurre entre 3 y 6 horas sig uientes a la incisión abdominal. La extracción de ARN total se realizó utilizando el método de extracción de fenol-cloroformo de guanidio-tiocianato según se describe previamente (Eskandari et al. , Am. J. Clin . Pathol . 75(3):367-370 (1 997)). Las pastillas de ARN se volvieron a suspender en la solución de resuspensión segura de ARN (Ambion Inc. , Austin , TX), seguida por la remoción de ADN potencialmente contaminante por tratamiento con DNasa I (Equipo Libre de ADN, Ambion Inc. , Austin, TX). Las alícuotas ig uales (5 µg) de ARN total de cada muestra se cuantificaron por espectrofotometría (long itud de onda 250 nm) y se alicuotaron a una concentración de 40 ng/µ?. La expresión de mARN máximo se cuantificó en duplicado por RT-PCR de tiempo real , de dos etapas SYBR Verde. GAPDH se utilizó como la referencia endógena. El ARN alícuotado se sometió a la s íntesis de ADN complementaria de filamento único (cADN) utilizando hexámeros al azar (PE applied Biosystems, Foster City, CA) y SuperScriptl I™ (Life Technologies, Rockville, MD). Las secuencias de carga iniciadora se obtuvieron de la literatura o se diseñaron de acuerdo a las secuencias publicadas. Tabla 1 . Una mezcla de reacción de PCR se preparó utilizando Reactivos de Núcleo PCR SYBR Verde (PE Applied Biosystems). Cada muestra se estimó en duplicado utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. La reacción se incubó a 50°C por 2 min para activar la N'-glicosilasa de uracil y después por 1 2 min a 95°C para activar la polimerasa Amplitaq Gold™ seguida por 40 ciclos de 95°C por 15 seg y 60°C por 1 min en Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7700™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos de PCR de tiempo real se representaron por d iagramas como la señal de fluorescencia ARn contra el número de ciclo. Un umbral arbitrario se fijó en la parte lineal media del d iagrama de ciclo ARn de logaritmo. El ciclo de umbral (CT) se definió como el número de ciclo en el cual el ARn cruza este umbral. La cuantificación de expresión de mARN se normalizó a GAPDH y se calculó en relación al control utilizando el método CT comparativo (Schmíttgen et al. , J. Biochem. Biophys. ethods 46(1 -2):69-8 (2000)).

Para excluir la amplificación de PCR de ADN genómico contaminante, los controles negativos de RT (muestras que contienen ARN que no se transcribieron de manera inversa) se incluyeron en cada reacción PCR. Los análisis de curva de fusión se realizaron para cada reacción para asegurar la amplificación de producto específico. Además, las cargas iniciadoras se sometieron a la electroforesis de gel para confirmar la ausencia de bandas no específicas y para confirmar que los amplicones fueron del tamaño correcto. La eficiencia de amplificación de PCR de cADN objetivo se examinó para medir colinealmente la dilución. Las diluciones de 3 pliegues seriales de cADN se realizaron en triplicado. Las curvas estándares se generaron al representar por diagrama el valor CT contra el número de copia de entrada relativa. Las declinaciones de las curvas estándares de -3.2 + 0.3 con coeficientes de correlación de 0.99 se consideraron que fueron aceptables, teniendo eficiencias correspondientes de 100 + 10%.

Tabla 1 . Breve Descripción de la Carga Iniciadora Manchado Northern de HO- 1 El manchado northern se realizó según se describe previamente (Camhi et al. , Am . J. Respir. Cell Mol. Biol . 13:387-398 ( 1 995)). En resumen , 10 µg de ARN total extraído del tejido según se describe anteriormente se electroforizó en un 1 % de gel de agarosa y después se transfirió a membranas de nylon por acción capilar. Las membranas de nylon se prehibridizaron así en regulador de hibrid ización [1 % de albúmina de suero de bovino (BSA), 7% de SDS, 0.5 M de regulador P04, pH 7.0, y 1 mM de EDTA] a 65°C por 2 h seguido por la hibridización con probetas de oligonucleótido de cADN HO-1 de rata etiquetado 32P, la ferritina L de rata etiquetada 32P, o ferritina H de rata etiquetada 32P a 65CC por 24 h . Las membranas de nylon se lavaron así en regulador A (0.5% de BSA, 5% de SDS , 40 mM de regulador P04, pH 7.0, y 1 m M de EDTA) por 15 min dos veces a 65° C seguido por lavados en el regulador B ( 1 % de SDS, 40 mM de regulador P0 , p H 7.0, y 1 mM de EDTA) por 1 5 min tres veces a 65°C.

Probeta cADN HO-1 Un cADN de rata de longitud completa (pHOl ) se generó previamente por Dr. S. Shibahara de la Universidad de Tohoku (Sendai, Japón). El pH01 se subclonó en el vector pBluescript, y una digestión HindIll/EcoRI se realizó para aislar la inserción de cADN HO-1 0.9 kb fuera del vector pBluescript. Para controlar la variación ya sea en la cantidad de ARN en diferentes muestras o errores de carga, las manchas se hibridizaron con una probeta de oligonucleótido correspondiente al rARN 1 8S. Un oligonucleótido de 28 par base (5'- ACGGTATCTGATCGTCTTCGAACC-3'; SEQ ID NO: 17) complementario al ARN 1 8S se sintetizó utilizando un sintetizador ADN (Applied Biosystems, Foster City, CA). El cADN HO-1 se etiquetó con [32P]CTP utilizando el equipo de carga iniciadora al azar de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Todas las probetas de oliglonucleótido se etiquetaron con [32P]ATP en el extremo 3' con deoxinucleotidiltransferasa de terminal (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Las señales autoradiográficas se compararon a rARN 18S obtenido de la misma mancha.

Determinación de los niveles de citoquina de suero Las muestras de suero se tomaron secuencialmente en 1 , 4 y 24 horas después de la repferfusión y se almacenaron a -80°C hasta la evaluación. Las concentraciones de citoquina de suero, incluyendo IL-6, IL-10 y TNFa, se determinaron utilizando los equipos de inmunoensayo enlazado por enzima de rata (ELISA) según se describe por el fabricante de (R & D, Cambridge, MA).

Medición de niveles de nitrito/nitrato de suero Para monitorear los productos finales estables de metabolismo de NO, los niveles de nitritio/nitrato de suero a 1 , 4, y 24 horas se midieron utilizando un equipo de prueba comercialmente disponible (Cayman, Ann Arbor, MI) y se cuantificaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En este sistema de ensayo, el nitrato se reduce a nitrito utilizando reductasa de nitrato, y la concentración de nitrito de la muestra se mide secuencialmente utilizando la reacción Griess.

Cultivo de célula muscular El intestino delgado de control y las ratas transplantadas se removieron (bajo condiciones estériles) 24 horas post-operativamente. El colon se dejo ¡n situ. El intestino se transfirió a un vaso de precipitación estéril que contiene solución de sal balanceada Hank (Sigma, St. Louis, MO) con 200 U/ml de penicilina G y 200 µ?/p?? de streptomicina (HBSS). Los músculos se aislaron según se describe anteriormente y se mancharon sobre gasa estéril. El peso húmedo de las muestras se determinó, y las alícuotas de 150-200 miligramos de tejido se crearon. Los tejidos se lavaron dos veces en HBSS. Las alícuotas se transfirieron a láminas de cultivo de cavidades de 35 milímetros que contienen 3 mi de DMEM libre de suero que contiene penicilina/streptomicina, como lo anterior, y se incubaron por 24 hrs en una incubadora de 5% de C02 a 37°C. Después del período de incubación, 1 mi de alícuotas del sobrenadante se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Los niveles de proteína de citoquina se midieron por ELISA y se normalizaron a peso húmedo del tejido. Los equipos ELISA comercialmente disponibles se utilizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Análisis de datos Los resultados se expresan como promedio más o menos del error estándar del promedio (SEM). El análisis estad ístico se realizó utilizando la prueba de Estud iante o análisis de variaciones (ANOVA) en donde son adecuados. U n nivel de probabilidad de p<0.05 se consideró estadísticamente importante.

CO suprime el desarrollo de disfunción intestinal asociado con SITx Los efectos de SITx y tratamiento con CO en contractilidad de músculo circular de intestino grueso estimulado por betanocoi se investigaron en experimentos de baño de órgano in vitro. Los tejidos se colectaron 24 horas después de la reperfusión del injerto intestinal transplantado. Las tiras de músculo del intestino de control generó contracciones regulares (datos no mostrados). El tratamiento con CO por 24 horas no tuvo efecto sobre la actividad contráctil espontánea en ratas de control sin operar (datos no mostrados). Después de SITx, la actividad contráctil espontánea se perdió (datos no mostrados). El tratamiento CO restauró la actividad contráctil espontánea en ratas transplantadas (datos no mostrados). La adición de betanocoi (0.3 a 300 µ ) al baño de superfusato produjo las contracciones tónicas dependientes de la concentración. Las respuestas contráctiles integradas normalizadas al área de tejido obtenidas en respuesta a las dosis en aumento de betanocoi se muestran en la Fig. 1. En los animales de control, la fuerza contráctil fue la concentración dependiente más allá del rango de 10 a 300 µ? de betanocol, con una fuerza de valor máxima de 3.5 + 0.7 g/mm2/s generada en respuesta a 100 µ? de betanocol. El tratamiento con CO no tuvo efecto sobre la contractilidad en animales sin operar (fuerza contráctil de valor máximo 3.2 + 0.5 g/mm2/s. SITx condujo a una reducción en fuerza contráctil generada a lo largo de la curva de respuesta de dosis en comparación con los controles que alcanzaron importancia estadística en concentraciones de betanocol mayores a 10 µ?. En 100 µ? de betanocol, la fuerza contráctil de valor máximo se redujo por 49% a 1.7 + 0.4 g/mm2/s. El tratamiento con CO previno el efecto inhibidor de SITx a lo largo de la curva de respuesta de dosis, restaurando la fuerza contráctil de valor máximo a niveles de control (3.6 + 0.7 g/mm2/s). El tránsito intestinal se midió en controles y animales transplantados 48 horas post-operativamente al evaluar la distribución intestinal del dextrano etiquetado por fluoresceína, oralmente administrado. Las Figs. 2A-2B son histogramas de tránsito que ilustran la distribución de dextrano etiquetado por FITC no absorbente a lo largo del tracto gastrointestinal (del estómago al colon) 2 horas después de la administración oral. Un histograma medio de la fluorescencia en cada segmento de intestino, 2 horas después de la alimentación oral, de las ratas de control sin operar y de las ratas de control tratadas con CO se representó por diagrama en Fig. 2A. En ambos grupos, la mayoría de la etiqueta fluorescente se ubicó en segmentos de intestino grueso 9 y 10, y en el intestino ciego. Esto en contraste al modelo de distribución observado en las ratas transplantadas (Fig. 2B) en donde la etiqueta fluorescente se encontró principalmente en el estómago, con cierta etiqueta entrando al intestino grueso próximo. En los animales transplantados tratados con CO, la distribución de etiqueta fue más distal, acumulándose principalmente dentro de los segmentos del intestino grueso 6, 7 y 8. Los análisis estadísticos de los resultados del cálculo de Centro Geométrico, resumidos en la Fig. 2C, demuestran que la inhalación de CO significativamente mejoró el transito intestinal en ratas que superaron el transplante del intestino grueso.

Reclutamiento de Leucocitos Los casos inflamatorios celulares en el músculo de intestino grueso se caracterizaron 24 horas después de SITx. La actividad de ieloperoxidasa (MPO), según se determina por histoquímica Hanker-Yates, se utilizó para cuantificar el infiltrado de leucocito en tejidos de animales transplantados y de control, con y sin tratamiento CO. En ratas de control tratadas por CO y control sin operar, las células positivas MPO fueron raras (datos no mostrados). SITx dio como resultado un reclutamiento importante de leucocitos en el músculo intestinal (datos no mostrados). Los conteos celulares por 200X de campo se resumen en la Fig. 3, que muestra que el tratamiento CO redujo el número promedio de células positivas de MPO; sin embargo, esta reducción no logró la importancia estadística (p=0.08, n=6).

Análisis de Secuencia de citoquinas en las capas musculares y mucosales Los ensayos de protección de RNasa demostraron que SITx originó una toma importante de mARNs tanto I L-6 como I L- 1 ß , que se valoraron 3 - 6 horas dentro del injerto transplantado (Figs. 4A y 4B). De acuerdo con lo anterior, los niveles de mARN de mediador inflamatorio se analizaron 4 horas después de reperfusión.

Respuesta inflamatoria molecular La Fig. 5 es un grupo de gráficas de barras que ilustran el efecto de CO en la expresión de sintasa de óxido nítrico (¡NOS), IL-6, IL-1 ß, y 1 L-10 en los músculos externos de injertos intestinales cuatro horas después de la reperfusión. El análisis PCR de tiempo real reveló un aumento importante en la expresión de mARN de citoquina pro-inflamatoria (IL-6 (3400 pliegues) e I L-1 ß (38-pliegues) en los músculos externos de injertos intestinales. TNFa también se reguló significativamente, pero a un grado inferior (3 pliegues). La expresión de gen ICA -1 , una molécula de adhesión que juega un papel importante en el reclutamiento de células inflamatorias circulantes, se aumentó 14 pliegues. En las ratas recipiente tratadas con CO, la expresión IL-6 e I L-1 ß relativa promedio se redujo (por 40% y 50%, respectivamente), mientras que la expresión TNFa e ICAM-1 no cambió. Debido a la gran desviación estándar entre los grupos transplantados, la reducción en la expresión de mARN IL-6 en las ratas tratadas por CO no lograron importancia estadística (p=0.084, n=6) mientras que la expresión de I L- 1 ß se redujo significativamente (p=0.046, n=6). La expresión de gen de las formas inducibles de ciclooxigenasa (COX-2) y la sintasa de óxido nítrico (¡NOS) también se regularon significativamente en el músculo de los injertos transplantados (5 pliegues y 48 pliegues, respectivamente). La expresión de mARN relativo promedio de ambas enzimas se redujo por aproximadamente 50% en ratas tratadas por CO. Una vez nuevamente, la reducción en expresión ¡NOS no fue muy importante (p=0.060, n=6) mientras que la reducción en la expresión COX-2 fue muy importante (p=0.26, n=6). La inhalación de CO solo no tuvo efecto en la expresión de cualquiera de los mediadores estudiados. La Fig. 6 es un grupo de gráficas de barras que ilustran el efecto de CO las concentraciones de suero IL-6 y nitrato/nitrito en animales que reciben injertos intestinales en una y cuatro horas después de la reperfusión. Para generar estos datos, las muestras de suero se tomaron en varios puntos de tiempo seguidos al transplante y se almacenaron a -80°C hasta la evaluación. Las concentraciones de suero IL-6 se determinaron utilizando un equipo de inmunoensayo enlazado por enzima de rata (ELISA) (R&D, Cambridge, MA). Los niveles de nitrito/nitrato de suero, los productos finales estables de metabolismo NO, se midieron utilizando un equipo de prueba comercialmente disponible (Cayman, Ann Arbor, MI). En este sistema de ensayo, el nitrato se reduce a nitrito utilizando reductasa de nitrato, y la concentración de nitrito de la muestra se midió subsecuentemente utilizando la reacción Griess. Los niveles de nitrito/nitrato de IL-6 de suero en animales sometidos a SlTx y tratados con aire aumentaron a través del tiempo. Los animales sujetos a SITx y tratados con CO (SITx + CO) mostraron niveles de suero significativamente reducidos tanto de IL-6 como nitrito/nitrato. Los datos que demuestran que CO se protege contra la disfunción intestinal inducida por transplante se tabulan en la Tabla 1 , de abajo. Tempranamente (<48 horas) después de SITx, los injertos intestinal padecieron de un retardo importante en el tránsito intestinal, la reducción de contractilidad de músculo, y los infiltrados inflamatorios masivos. Estos cambios se redujeron en recipientes tratados con CO . Las concentraciones de I L-6 de suero (4 horas después de la reperfusión) fueron significativamente inferiores en SITx con CO en comparación a SITx sin CO. CO previno la inflamación de injerto intestinal y lesión l/R asociada con SITx por la baja regulación de citoquinas pro-inflamatorias IL-6 e IL-1 .

Tabla 2. CO suprime la disfunción intestinal asociada:con SITx.

Ejemplo 2. CO suprime el desarrollo de ¡leo asociado con manipulación quirúrgica del intestino grueso Animales Los ratones macho tipo silvestre C57B16 (20-25 g) se obtuvieron de Harían (Indianápolis, IN). Los ratones se alojaron en una instalación libre de patógeno, se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad, y se les alimentó con comida para roedores comercialmente disponible y agua de grifo ad libitum.

Grupos Experimentales y Procedimientos Operativos Los ratones agrupados por edad se dividieron en cuatro grupos experimentales: controles nativos (Control); controles tratados con CO (Control+CO); ratones sometidos a manipulación quirúrgica del intestino grueso (IM); y ratones sometidos a manipulación quirúrgica y tratamiento con CO (IM+Co).

Manipulación Quirúrgica. Los ratones se anestesiaron con isoflurano inhalado y el abdomen se abrió por laparotomía de línea medida. El intestino grueso se abrió y suavemente se comprimió a lo largo de su longitud utilizando aplicadores de algodón estériles húmedos. Este procedimiento se diseño para estimular "la ejecución" del intestino comúnmente realizado durante la cirugía abdominal en el establecimiento clínico. El intestino se volvió a colocar en la cavidad abdominal y la incisión se cerró por dos capas de suturas continuas. La duración del procedimiento fue de aproximadamente 15 minutos y los animales se movieron libremente alrededor de su caja dentro de 20 minutos de extracción de anestesia. Tratamiento de Inhalación de CO. Los ratones alojados en las cajas se colocaron en cámaras plexividrio que se ventilaron continuamente con aire o con aire que contiene CO (250 ppm). Un puerto de muestreo se proporcionó para monitorear continuamente las concentraciones de monóxido de carbono dentro de la cámara. Los animales tuvieron libre acceso al alimento y agua todas las veces. Los ratones se expusieron a CO o aire 1 hora antes de la laparotomía, se removieron por manipulación quirúrgica, y después regresaron a la cámara por 24 horas. Los ratones que no superan la cirugía se removieron de la cámara por una longitud similar de tiempo y después regresaron a la cámara por 24 horas.

Estudios Morfológicos Histoquímica MPO. Los montajes totales del músculo se prepararon del yeyuno medio colectados 24 hr post-operativamente. Los segmentos de intestino se sumergieron en KRB en un plato de vidrio en línea Sylgard (Midland, MI) y se sujetaron sin estrechamiento a lo largo del límite mesentérico. La longitud y la anchura de los segmentos se midieron con un calibrador. El segmento yeyunal se abrió así a lo largo del límite mesentérico y se estrechó a 150% de la longitud y 250% de la anchura. La mucosa se removió utilizando fórceps fino, y el tejido restante se fijo en 100% de etanol desnaturalizado por 30 min. Después de lavarse varias veces con PBS, el tejido se trató con reactivo Hanker- Yates (Polysciences, Warrington, PA) para la detección de neutrofilos polimorfonucleares (PMN's) mostrando actividad mieloperoxidasa (MPO). Los tejidos se montaron sobre pedazos de vidrio utilizando Gel/Mount™ (Biomedia Corp., Foster City, CA), se deslizaron por cubierta y se inspeccionaron por microscopía de luz (Nikon FXA, Fryer, Huntley, IL) a una magnitud de 200x. Los PMN's se contaron en cinco a seis campos óptimos adyacentes centrados entre los l ímites mesentéricos y anti-mesentéricos.

Inmunohistoquímica de HO-1. Los montajes totales del músculo preparados según anteriormente se fijaron en fijador Zamboni por 1 hora, se aclararon con DMSO. Después de lavarse varias veces con PBS, los tejidos se trataron con PBS que contiene 1 0% de suero de mono normal y 0. 1 % de Triton-X. Los montajes totales se incubaron así durante la noche con anticuerpo HO-1 anti-rata y burro (1 :500, Stressgen, Vancouver, Canadá), se lavaron, y se incubaron por 2 hr con conjugado lgG-Cy3 anti-conejo burro (Jackson ImmunoResearch Laboratories, I nc. , West Grove, PA). Los tejidos se montaron con Gel/MountTM como anteriormente y se inspeccionaron por microscopía de fluorescencia (Nikon Microphot-FXA, Huntley, I L).

Estudios Funcionales Las ratas se anestesiaron y se mataron por exsanguinación al final del tratamiento de cámara de 24 horas con CO o aire ambiente. La actividad mecánica de músculo circular in vitro se midió según se describe previamente en Eskandari ef al. (Am. J . Physiol. 273:G727-G734 (1997)). En resumen , un segmento de intestino grueso med io se sujetó en un plato disecador en línea Sylgaard™ (Midland , M) que contiene regulador de Krebs-Ringer-bicarbonato pre-oxigenado (KRB; en m : 137.4 Na+, 5.9 K+, 2.5 Ca2+, 1 .2 Mg2+, 134 Cl\ 15.5 HC03", 1.2 H2P04-, y 1 1 .5 de glucosa) gasificado con 97% de 02/3% de C02 para establecer un pH de 7.4. El intestino se abrió a lo largo del límite mesentérico y la mucosa se removió por destilación con fórceps fino. Las tiras de espesor completo del músculo (1 x 6 mm) se cortaron en paralelo en la capa de músculo circular, se montaron en cámaras de órgano mecánicas horizontales estándar que se superfusionaron continuamente con KRB pre-oxigenado mantenido a 37°C. Un extremo de cada tira se unió por ligadura a un poste fijo y el otro a un transductor de fuerza isométrica (WPl, Sarasota, FL). Las tiras se dejaron equilibrar por 1 hora, después de la cual se tensaron en aumento a L0 (longitud a la cual la contracción espontánea máxima ocurrió). Después de un período de registro de línea base de 30 minutos, las curvas de respuestas a contractibilidad se generaron al exponer los tejidos a concentraciones crecientes del combatiente muscular betanocol (0.3 a 300 µ?) por 10 minutos, seguido por un período de lavado de 10 minutos. La actividad contráctil se calculó al integrar el área bajo el elemento. La respuesta se normalizó a la cantidad de tejido al convertir el peso (1 .03 mg/mm2)y la longitud de la tira a milímetros cuadrados de tejido, y se reportaron como g/s/mm2. El tránsito intestinal se midió en controles y animales manipulados 24 horas post-operativamente al evaluar la distribución intestinal de dextrano etiquetado por fluoresceína ( W 70,000). Se sedaron a los animales ligeramente con isoflurano inhalado y se alimentaron oralmente con dextrano etiquetado (100 µ? de 25 mg/ml de solución concentrada). Noventa minutos después de la administración, el animal se sacrificó y el intestino completo de estómago a colon distal se colectó. Los contenidos del estómago, intestino delgado (dividido en 10 segmentos de longitud igual), intestino ciego, y colon (3 segmentos; de igual longitud) cada uno se atenuó en 1 mi de salina, y se arremolinaron vigorosamente para liberar el dextrano presente en cada segmento. Después de formar en pastillas el tejido intestinal y quimio, las alícuotas del sobrenadante se leyeron en duplicado en un lector de placa (CytoFluor II; longitud de onda de excitación 530 nm y emisión 590 nm) para cuantificación de la señal fluorescente en cada segmento de intestino. La distribución de la señal a lo largo del tracto gastrointestinal se determinó al calcular el centro geométrico (GC=?(porcentaje de señal fluorescente total en cada segmento x el número de segmento) para la comparación estadística cuantitativa entre los grupos experimentales.

RT-PCR de tiempo real SYBR verde La expresión de gen anti-inflamatorio y Pro se determinó por RT-PCR de tiempo real. El músculo externo del intestino delgado se colectó en 4 puntos de tiempo (3, 6, 12, y 24 hr) post-operativamente y se congelaron por golpe en nitrógeno líquido. La extracción de ARN total se realizó utilizando el método de extracción de fenol-cloroformo de guanidio-tiocianato según se describe en Eskandari et al., (Id.). Las pastillas de ARN se volvieron a suspender en la solución de resuspensión segura de ARN (Ambion Inc., Austin, TX), seguida por la remoción de ADN potencialmente contaminante por tratamiento con DNasa I (Equipo Libre de ADN, Ambion Inc., Austin, TX). Las alícuotas iguales (5 µg) de ARN total de cada muestra se cuantificaron por espectrofotometría (longitud de onda 250 nm). La expresión de mARN máximo se cuantificó en duplicado por RT-PCR de tiempo real, de dos etapas SYBR Verde , ß-actina se utilizó como la referencia endógena. El ARN alícuotado (40 ng ) se sometió a la síntesis de ADN complementaria de filamento único (cADN) utilizando hexámeros al azar (PE applied Biosystems, Foster City, CA) y SuperScriptl I™ (Life Tech nologies, Rockville, MD). Las cargas iniciadoras tomaron de la literatura o se d iseñaron de acuerdo a las secuencias publicadas (Tabla 3). La mezcla de reacción de PCR se preparó utilizando Reactivos de Núcleo PCR SYBR Verde (PE Applied Biosystems). Cada muestra se estimó en duplicado utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. Los datos de PCR de tiempo real se representaron como la señal de fluorescencia ARn contra el número de ciclo. Un umbral arbitrario se fijó en la parte lineal media del diagrama de ciclo ARn de logaritmo. El ciclo de umbral (CT) se definió como el número de ciclo en el cual el ARn cruza este umbral. La cuantificación de expresión de mARN se normalizó a ß-actina y se calculó en relación al control utilizando el método CT comparativo.

Tabla 3. Breve Descripción de la Carga Iniciadora 22 CAGAGGCAAGGAGGAAACACA IL-10 GenBank CACAAAGCAGCCTTGCAGAA 68 23 M37897 24 AGAGCAGGCAGCATAGCAGTG HO-1 GenBank CTCACTGGCAGGAAATCATCC 67 25 X 3356 26 ACCTCGTGGAGACGCTTTACA ¡NOS GenBank GTGACGGCAAACATGACTTCAG 74 27 NM010927 28 GCCATCGGGCATCTGGTA COX2 GenBank CTGGGACCCAACCCTCTGA 71 29 NM01 1 198 30 ACGGTGTGTACCACACGGC Para excluir la amplificación de PCR de ADN genómico contaminante, los controles negativos de RT (muestras que contienen ARN que no se transcribieron de manera inversa) se incluyeron en cada reacción PCR. Los análisis de curva de fusión se realizaron para cada reacción para asegurar la amplificación de producto específico. Además, la electroforesis de gel se realizó para confirmar la ausencia de bandas no específicas y para confirmar que los amplicones fueron del tamaño correcto. La eficiencia de amplificación de PCR de cADN objetivo se midió al determinar la colinearidad de las diluciones seriales. Las diluciones de 3 pliegues seriales de cADN se realizaron en triplicado para todas las cargas iniciadoras. Las curvas estándares se generaron al representar los valores CT contra el número de copia de entrada relativa para validar las cargas iniciadoras. Las declinaciones de las curvas estándares de -3.2 + 0.3 con coeficientes de correlación de 0.99 se consideraron que fueron aceptables, teniendo eficiencias correspondientes de 100 + 10%.

Análisis de Liberación de Mediador de Músculo Intestinal Determinaciones de Óxido Nítrico y Proteína. El intestino delgado de control y los ratones sometidos a manipulación intestinal se removió bajo condiciones estériles, 4 o 24 horas post-operativamente, dejando el colon in situ. El intestino delgado se transfirió a un vaso de precipitación q ue contiene solución de sal balanceada Hanks (Sigma, St. Louis, MO) con 200 U/ml de penicilina G y 200 µg/ml de streptomicina (HBSS), el lumen nivelado, y el tejido transferido a un segundo vaso de precipitación de H BSS. El músculo se colectó según se describe anteriormente para RT-PCR de tiempo real. Los tejidos se mantuvieron bajo condiciones estériles a 3 a 5°C a lo largo del procedimiento de colección. El músculo aislado se manchó sobre gasa estéril, y el peso húmedo se determinó para obtener las alícuotas de 40 a 60 mg. Las alícuotas de tejido se lavaron dos veces en H BSS, se transfirieron en láminas de cultivo de cavidades de 35 mm que contienen 3 mi de DMEM libre de suero que contiene penicilina/streptomicina, y se incubaron por 24 hrs en una incubadora de 5% húmedo de C02 a 37°C. Los agentes farmacológicos agregados al medio de cultivo se esterilizaron por filtro antes de utilizarse. Después del período de incubación , el tejido muscular se formó en pastillas, y las alícuotas de medio de cultivo se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Los niveles de proteínas I L-6, I L-1 ß, PGE2, y I L-10 secretadas en el medio de cultivo se determinaron utilizando equipos ELISA comercialmente disponibles (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdó a las instrucciones del fabricante. El óxido nítrico (NO) liberado en el medio de cultivo se estimó al medir los productos finales estables de metabolismo NO. Los niveles de nitrato/nitrito se midieron 24 horas post-operativamente utilizando equipo de prueba comercialmente disponible (Oxford Biomedical Research, Oxford, MI) y se cuantificaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En este sistema de ensayo, el nitrato se reduce a nitrito utilizando cadmio granulado, y la concentración de nitrito total se mide subsecuentemente utilizando la reacción Griess. Todas las mediciones se normalizaron a peso húmedo de tejido. CO inhalado suprime el desarrollo de Ileo Postoperativo Observaciones Generales Todos los animales se recuperaron rápidamente de la cirugía. Nada de mortalidad y morbidez se asoció con el procedimiento quirúrgico o con el régimen de exposición CO. A pesar de que los ratones desarrollaron íleo, la preparación post-operativa y el comportamiento diario fue normal, con la reanudación de alimentación oral y la toma de agua que se origina dentro de pocas horas después de la recuperación de la anestesia. Expresión de HO-1 Las Figs. 7A-7E son una gráfica de barras y dibujos que ¡lustran la expresión de hemo oxigenasa (HO-1 ) dentro del músculo intestinal siguiendo la manipulación quirúrgica del intestino delgado murino. Para investigar un papel protector anti-inflamatorio potencial para los productos HO-1 endógeno, las alteraciones en la expresión de mARN HO-1 se determinaron por RT-PCR de tiempo real SYBR verde. La Fig. 7A ilustra los modelos de expresión de mARN HO-1 en el músculo intestinal de ratones de control sin operar, y los ratones manipulados que se colectaron 3, 6, 12 y 24 h después de la laparatomía. La expresión de mARN HO-1 se aumentó significativamente 35 pliegues en relación a los controles por 3 hr de post-laparatomía, con expresión de valor máximo originándose 6 hr post-operativamente en 45 pliegues. A pesar de que los niveles de expresión se declinaron de cierta forma después de 6 hr, la expresión permaneció elevada (22 pliegues) a través del punto de tiempo final medido en 24 hr post-operativamente. También se investigó si el aumento en mARN HO-1 dio como resultado la expresión de proteína dentro del músculo intestinal después de la manipulación quirúrgica. La inmunohistoquímica de HO-1 se realizó en montajes totales del músculo de yeyuno medio colectados de ratones sin operar y 24 hr post-operativamente de ratones sometidos a la manipulación quirúrgica del intestino delgado. En animales manipulados, la inmunoreactividad HO-1 se observó dentro de grandes números de polimorfoleucocitos infiltrantes (Fig. 7B) y en células que son morfológicamente similares a macrófagos (Fig. 7C). Ocasionalmente, las células que contienen granulos citoplásmicos numerosos (granuiocitos) también se encontró que muestran inmunoreactividad de HO-1 intensa (Fig. 7D). La inmunoreactividad HO-1 débil también se observó en una población sin caracterizar de células dispersas dentro de las capas de músculo. La inmunoreactividad HO-1 no se detectó en montajes totales de ratones de control sin operar (Fig. 7E). La especificidad de inmunocoloración para HO-1 se confirmó por omisión de los anticuerpos primarios (no mostrados). Estudios Funcionales El tránsito intestinal se midió en animales manipulados y controles 24 horas post-operativamente al evaluar la distribución gastrointestinal de dextrano etiquetado por fluoresceína oralmente alimentado. Las Figs. 8A-8C son gráficas de barras que ilustran los resultados de estudios de tránsito determinados de la distribución de dextrano etiquetado por fluoresceína no absorbente 1 .5 horas después de la administración oral. Un histograma medio de la fluorescencia presente en cada segmento del intestino de ratones de control naturales y ratones tratados por CO se representa por diagrama en la Fig. 8A. En los animales desnudos, el dextrano etiquetado se distribuyó principalmente dentro de la terminal del intestino delgado, intestino ciego, y colon próximo 90 minutos después de ingerir dextrano. El tratamiento de inhalación con CO (250 ppm) solo originó un cambio insignificante ligero en tránsito, con la etiqueta distribuida predominantemente dentro del intestino ciego y colon. La Fig. 8B compara la distribución de la señal fluorescente en ratones que superaron la manipulación intestinal, con o sin tratamiento CO. Después de la manipulación intestinal, la señal fluorescente se confinó en el estómago y próximo a los 3 segmentos del intestino delgado. Cuando los animales se trataron con CO, la etiqueta se distribuyó más distalmente a lo largo del tracto gastrointestinal. Los resultados de los cálculos del Centro Geométrico (GC) se resumen en la Fig. 8C para comparación estadística. Los valores más altos de GC indican una distribución más distal de señal fluorescente, y corresponden a un tránsito más rápido. Los valores en esta figura demuestran q ue el tránsito intestinal acelerado por CO en ratones sin operar, pero los valores GC no lograron la importancia estadística. Adicionalmente, según se muestra previamente los valores GC muestran q ue el tránsito es notablemente más lento después de la manipulación intestinal , pero que esta prolongación en tránsito se mejoró significativamente en ratones tratados con inhalación de CO. Los efectos de CO sobre la contractilidad del músculo circular del intestino delgado estimulado por betanocol y espontáneo se investigaron in vitro en experimentos de baño de órgano 24 horas después de la manipulación q uirúrgica del intestino, un punto de tiempo cuando el ileo se ha mostrado que establece bien. Las Figs. 9A-9C ilustran la actividad mecánica de tales tiras de músculo liso circular del intestino delgado. La Fig . 9 es un grupo de elementos representativos que muestran la contractilidad espontánea de músculo circular intestinal. Las tiras de músculo del intestino delgado de ratones desnudos generaron contracciones regulares (Fig. 9A; Control), y el tratamiento con CO no tuvo efecto (Fig. 9A; control + CO). Después de I M, la actividad contráctil espontánea se suprimió significativamente (Fig. 9A; I M). Sin embargo, en ratones IM tratados con CO, la ritmicidad se mejoró significativamente (Fig. 9A; IM + CO). La adición del combatiente muscarínico betanocol (0.3 a 300 µ?) al superfusato produjo las contracciones tónicas dependientes de la concentración . El área bajo la curva de contracción se integró y se normalizó al área de superficie de tira muscular para obtener una medida de contractilidad de músculo circular. Las Figs. 9B y 9C son gráficas de líneas que ilustran la contractilidad normalizada. En ratones de control, la fuerza contráctil máxima (3.5 + 0.7 g/s/mm2) se generó en respuesta a 100 µ? de betanocol (Fig. 9B). CO solo no tuvo efecto sobre las contracciones de control (3.2 + 0.5 g/s/mm2). La manipulación quirúrgica condujo a una reducción en fuerza contráctil a lo largo de la curva de respuesta de dosis en comparación con los controles, logrando importancia estad ística en las concentraciones de betanocol mayores a 10 µ? (Fig . 9C). La fuerza contráctil máxima generada con 1 00 µ? de betanocol se redujo por 49% ( 1 .7 + 0.4 g/s/mm2) en estos ratones. La inhalación de CO (250 ppm) completamente previno el efecto inhibidor de manipulación q uirúrgica (3.6 + 3.07 g/s/mm2). Histoquímica MPO La manipulación q uirúrgica del intestino delgado típicamente origina una respuesta inflamatoria celular masiva dentro del músculo. La histoq u ímica Yanker-Yates para la actividad mieloperoxidasa (MPO+) se utilizó para cuantificar el infiltrado de leucocito en tejidos de control y animales manipulados, con y sin tratamiento CO. La Fig. 1 0 es un histograma que resume los daos en las células MPO+ que infiltran el músculo intestinal para los cuatro grupos experimentales utilizados en este estudio. Los leucocitos se contaron a una magnitud de 200X. En especímenes de control que no superaron la cirugía, las células MPO+ fueron raras. La anestesia quirúrgica y manipulación intestinal dio como resultado un aumento de 250 pliegues en el número de células MPO+ que infiltran el músculo en 24 hr. De manera interesante, el tratamiento de inhalación de CO no tuvo efecto sobre la magnitud del infiltrado de leucocito en cualquier grupo. Expresión de Citoquina Pro-Inflamatoria Las Figs. 1 1 A-1 1 C son gráficas de barras que ilustran los efectos de CO inhalado sobre la expresión de IL-6. Las figuras muestran el curso de tiempo de la expresión de gen IL-6 después de la manipulación de intestino delgado, y los efectos de CO inhalado en gen I L-6 y expresión de proteína. El análisis de curso de tiempo utilizando RT-PCR de tiempo real mostró que el mARN IL-6 se aumentó 300 pliegues en relación a los ratones de controles desnudos, 3 y 6 postoperativamente (Figura 1 1 A). La expresión se declinó rápidamente por 2 hr, cayendo en un aumento de 50 pliegues en relación a los controles en 24 hr. La inhalación de CO no tuvo efecto en la expresión de gen inducida por manipulación en los puntos de tiempo de 3 y 6 hr (Fig. 1 1 B). La liberación de proteína IL-6 del músculo aislado se midió después de la incubación en el medio de cultivo celular (Fig. 1 1 C). La proteína IL-6 se elevó masivamente 24 hr después de la manipulación intestinal, y en contraste a la liberación de proteína de datos PCR se redujo significativamente por 70% en ratones tratados con CO. La citoquina proinflamatoria IL-1 ß también se investigó. El curso de tiempo de expresión de gen I L- 1 ß se muestra en las Figs. 12A-12B. Las mediciones de f L- 1 p se complicaron por la observación de que los niveles mARN en los extractos musculares de ratones de control desnudos y en ratones de control tratados con CO estuvieron por debajo de las capacidades del analizador de secuencia. De esta manera, las muestras de ratones manipulados colectados 6 hrs postoperativamente se diluyeron serialmente y los valores de umbral de ciclo (CT) se normalizaron a ß-actina determinada de las muestras sin diluir. Los valores ACT de control se calcularon así utilizando la concentración más baja de I L-1 ß para lo cual el CT se redujo dentro del rango lineal. Los cambios en la expresión de gen para los grupos experimentales restantes se calcularon así en relación a este control, y por lo tanto son conservadores en su estimación del aumento de pliegue actual. De estos cálculos, la expresión de mARN l L- 1 ß en respuesta a la anestesia quirúrgica y la manipulación intestinal se encontró que aumentó 38 pliegues en relación al control, 3 hrs después de la cirugía. La expresión máxima ocurrió de cierta forma al último que la temprana reportada para IL-6, alcanzando 170 y 150 pliegues en 6 y 12 hr postoperativamente, y cayendo nuevamente a 40 pliegues por 24 hr (Fig. 12A). En animales tratados con CO, la expresión de I L- 1 ß en el punto de tiempo de 6 hr se redujo por 60% (Fig. 12B). La liberación de proteína IL- ß de los extractos musculares colectados 24 hr después de la cirug ía se midió después de un adicional de 24 horas de incubación en medio de cultivo celular (Fig. 12C). Correlacionándose con los datos RT-PCR, nada de proteína IL-? ß podría detectares en cualquier grupo de control, mientras que la concentración de proteína producida por 100 mg de tejido extraído se elevó después de la manipulación intestinal. Esta respuesta se redujo significativamente por 60% en ratones tratados con inhalación de CO.

Expresión de Ciclooxigenasa 2 y Sintasa de Óxido Nítrico Inducible Los macrófagos residentes activados y los leucocitos infiltrantes sintetizan y liberan las prostaglandlnas derivadas de isoforma inducible de ciclooxigenasa, COX-2, y óxido nítrico (NO) derivado de la forma inducible de sintasa de óxido nítrico (¡NOS), que tienen efectos inhibidores potentes y directos sobre el aparato contráctil de músculo liso intestinal. La configuración temporal para la expresión ¡NOS siguiendo la manipulación se ilustra en las Figs. 13A-13C. El análisis de curso de tiempo mostró que la expresión de gen se aumentó significativamente 3 y 6 hr después de la manipulación del intestino delgado (Fig. 13B). La expresión máxima en 6 hr se redujo por 60% en animales tratados con CO (Fig. 14B). La exposición de ratones desnudos a CO no tuvo efecto sobre la expresión de ¡NOS (aumento de pliegue.Control, 1 .06 + 0.18; CO 3 hr, 1 .04 + 0.19; CO 6 hr, 1 .26 + 0.19). El nitrito total liberado en el medio de cultivo de extractos musculares colectados 24 hr post-operativamente, se midió como un estimado de producción NO (Fig. 13C). Según se pronostica por los datos PCR, las mediciones de nitrito se aumentaron significativamente después de la manipulación intestinal y este aumento se redujo por 75% al tratar los ratones con CO. Una atenuación similar de la respuesta se logró al incubar los extractos musculares en la presencia del inhibidor ¡NOS selectivo, L-Nil (50 /¿M), indicando que ¡NOS fue la fuente del aumento quirúrgicamente inducido en la producción de NO. Las Figs. 14A-14D son gráficas de barras que ilustran los efectos de inhalación de CO sobre la expresión de COX-2. Las figuras muestran que la configuración temporal de IM indujo la expresión COX-2.

El análisis de curso de tiempo mostró que la expresión de gen COX-2 se aumentó 8-10 pliegues, 3 a 6 hr después de la cirugía, y permaneció elevado a través de 24 hr (Fig. 14A). El tratamiento de CO no tuvo efecto en expresión de gen en los puntos de tiempo 3 o 6 hr (Fig. 14B). La inhalación de CO por sí misma por ratones de control sin operar dio como resultado una inducción relativamente pequeña de 2.5 pliegues de mensaje COX-2 3 hr post-operativamente (Fig . 14C). La liberación de PGE2 de los extractos musculares colectados 24 hr después de la cirugía se midió como un marcador de actividad COX-2 (Fig. 14D). Consistente con los datos PCR, tanto la inhalación de CO solo como la manipulación intestinal originaron los aumentos significantes en liberación de PGE2. Específicamente el PGE2 concerniente, el tratamiento de ratones manipulados con CO no tuvo efecto en liberación inducida por IM de este prostanoide.

Expresión de Gen Anti-lnflamatorio IL-1 0 es una citoquina pleyotrópica que tiene efectos antiinflamatorios y protectores importantes en el tracto gastrointestinal. Las Figs. 15A-15C ilustran los efectos de inhalación de CO de una expresión IL-10. Las figuras muestran la configuración de la expresión I L-10 a través del tiempo. La expresión de gen se sometió a un aumento de 12 pliegues en relación al control en respuesta a la manipulación intestinal, 3 y 6 hrs después de la cirugía. La expresión se goteó de allí en adelante, pero permaneció elevado a través de 2 hr en aproximadamente 4 pliegues en relación a la expresión de control (Fig. 15A). En animales tratados con CO en el punto de tiempo de 3 hr, la expresión de gen IL-10 se aumentó a 43 pliegues en relación a controles, una respuesta 300% mayor a aquella de la manipulación sola (Fig. 15B). En ratones de control, la inhalación de CO sola fue suficiente para inducir un aumento significante en la expresión de IL-10 (Fig . 15C). El efecto de CO inhalado en la expresión de gen HO-1 también se evaluó. Las Figs. 16A-16B ilustran el efecto de inhalación en la expresión de HO-1 . La Fig. 16A compara la expresión de gen inducido por IM 3 y 6 hr después de la cirugía (ver Fig. 7D), con aquella lograda en ratones manipulados tratados con CO. La inhalación de CO también aumentó la expresión de gen HO-1 3 h post-operativamente a un nivel de 300% mayor a aquel de la manipulación sola (Fig. 16B). En este caso, la inhalación de CO solo por ratones de control sin operar indujo a un aumento pequeño, aún significante en la expresión de gen HO-1 , pero solamente en el punto de tiempo 6hr. El presente ejemplo proporciona tanto evidencia in vivo como ex vivo que la inhalación de una baja concentración de CO (250 ppm) significativamente atenúa la dismotilidad intestinal que caracteriza el ileo postoperativo. Los datos muestran que CO puede actuar en el nivel del gen y la expresión de proteína para modular selectivamente los elementos específicos tanto de trayectorias anti-inflamatorias como pro-inflamatorias conduciendo a una mejora significante en la función intestinal. El ileo post-operativo es actualmente una consecuencia virtualmente inevitable de procedimientos quirúrgicos abdominales, y puede variar de atonía a corto plazo para agravar el ileo paralítico que puede durar por días. El ¡leo paralítico se caracteriza por la estasis intestinal, sobre crecimiento bacterino, y desequilibrios de electrolito fluido, dando como resultado la morbidez importante y frecuentemente mortalidad. La exposición de ratones a CO por inhalación mejoró la supresión inducida por manipulación en contractilidad de músculo liso circular espontáneo, restauró la capacidad del músculo para contraerse en respuesta a los combatientes colinérgicos, y significativamente aumentó el deterioro en el tránsito intestinal. Esta mejora en la función contráctil global se logró sin una reducción importante en el infiltrado de célula inflamatoria, sugiriendo que CO actuó sobre elementos de la cascada inflamatoria diferente a aquellos asociados con el reclutamiento de leucocitos. A fin de valorar el efecto de CO sobre la cascada inflamatoria, la expresión de gen mediador pro- y anti-inflamatorio se valoró por RT-PCR de tiempo real. Los niveles aumentados de las citoquinas pro-inflamatorias IL- 6 e IL-1 se expresan consistentemente durante la inflamación intestinal crónica y aguda en humanos y animales, incluyendo el ileo post-operativo. IL-6 activa una variedad de tipos de célula para inducir la síntesis de quimioatractores y moléculas de adhesión, y de esta manera juega un papel central en iniciar el reclutamiento de leucocitos y la extravasación en el músculo intestinal. En este ejemplo, la inhalación de CO no alteró el aumento quirúrgicamente inducido temprano en la expresión de gen IL-6 medida 3 y 6 hr post-operativamente, un descubrimiento consistente con su carencia de efectuar en la magnitud del infiltrado de célula inflamatoria. Sin embargo, la liberación de proteína IL-6 del músculo intestinal aislado determinada 24 hr post-operátivamente se redujo por 60% de 5000 pg/ml a 2000 pg/ml en ratones tratados con CO, sugiriendo que CO tiene un efecto post-transcripcional en la expresión I L-6. Este nivel sostenido de liberación de proteína todavía se elevó notablemente en relación a los controles desnudos (150 µg/ml), haciendo difícil estimar q ué efecto puede tener esto sobre la señalización proinflamatoria IL-6. Sin embargo, los estud ios recientes, han mostrado que I L-6 puede también tener propiedades anti-inflamatorias importantes, sugiriendo que la expresión continua de IL-6 es necesaria para la inducción de ciertas trayectorias protectoras. Estas potencialmente incluyen la habilidad de inhibir la producción de TN F-a, I L- 1 ß y proteína 2 inflamatoria de macrófago, y para aumentar niveles de antagonista de receptor IL-1 y receptor soluble de TN F in vitro. De esta manera , la humectación de trayectorias pro-inflamatorias mediadas por I L-6, así como también el inicio de trayectorias anti-inflamatorias mediadas por I L-6 en las últimas etapas en la cascada inflamatoria, puede contribuir a la contractilidad intestinal mejorada observada 24 hr postoperativamente. El papel jugado por IL-1 ß en íleo postoperativo se ha caracterizado menos bien; sin embargo, el I L-1 ß endógeno se ha mostrado que inhibe las respuestas contráctiles del músculo liso intestinal de rata a combatientes colinérgicos y a estimulación eléctrica, sugiriendo que ejerce sus efectos inhibidores al alterar las trayectorias neuronales. Además, la neutralización inmune de la actividad IL-1 mayormente disminuyó la severidad de enfermedad en un modelo murino de colitis, indicando que esta citoquina también juega un papel de inicio importante en la inflamación intestinal. En los ratones manipulados tratados con CO, la expresión de gen I L- ß se redujo notablemente, con un 75% de reducción en expresión de gen quirúrgicamente inducido en 6 hr después de la cirugía, y una reducción correspondiente en la expresión de proteína medida en 24 hr. De esta manera, podría esperarse que las actividades pro-inflamatorias de l L- 1 ß, así como también sus efectos inhibidores potenciales sobre el aparato neuromuscular, podría atenuarse notablemente. Tomados juntos, estos descubrimientos sugieren que los efectos protectores de la inhalación de CO ocurren, al menos en parte, por un mecanismo que tiene como objetivo los elementos selectivos dentro de la cascada pro-inflamatoria mediada por IL-6 e IL-? ß que son independientes de reclutamiento de leucocitos o que ocurren después de que el reclutamiento de leucocitos se ha iniciado completamente. A pesar de que el número de leucocitos de infiltración no se alteró en ratones tratados por CO, los datos de citoquina indicaron que hubo una inhibición funcional dependiente de CO de citoquinas que se generan clásicamente por leucocitos. Por lo tanto, la modulación de los mediadores de músculo liso cinéticamente activos derivados de leucocito NO y PGE2 como objetivos adicionales para la inhibición por CO se investigó. También se mostró que los prostanoides producidos por COX-2 y óxido nítrico producidos por ¡NOS tienen efectos inhibidores potentes sobre la contractilidad de músculo liso intestinal, y que la inhibición de la enzima COX-2 o la ruptura selectiva del gen iNOS derivado del leucocito notablemente aumenta la resistencia al desarrollo de íleo post-operativo. En el presente ejemplo, la evaluación de iNOS y expresión de gen COX-2 reveló que ambos se elevaron significativamente siguiendo la manipulación intestinal. Los aumentos quirúrgicamente inducidos tanto en la expresión de gen iNOS como la producción NO se redujeron por aproximadamente 75% en animales tratados por CO, sugiriendo que CO podría actuar en el nivel de transcripción de gen para modular la expresión de iNOS. También se mostró in vitro que la actividad ¡NOS, así como también las isoformas neuronales y endoteliales de NOS, pueden inhibirse directamente por CO, posiblemente a través de la unión de CO a porciones emo presentes en las proteínas NOS. Tomadas juntas, una reducción en la liberación NO como resultado de la expresión de gen reducido y/o la actividad de enzima podría esperarse que contribuyan significativamente a la función intestinal mejorada inducida por la inhalación de CO. En contraste a ¡NOS, la inhalación CO no tuvo efecto sobre la expresión de mARN COX-2 quirúrgicamente inducido o liberación de PGE2, según se mide en el medio de cultivo del músculo incubado colectado 24 hr después de la cirugía. De manera interesante, la inhalación CO por ratones desnudos dio como resultado un aumento de 2.5 pliegues en la expresión de mARN COX-2 3 hr después de la cirugía con un aumento correspondiente en la liberación de PGE2 después de 24 hr. La inducción de COX-2 por CO no se ha reportado previamente, y la consecuencia funcional de esta actividad aumentada se desconoce. Los ratones de control tratados por CO no mostraron deterioro funcional o elevación de mediadores pro-inflamatorios sugirieron que, en este caso, la inducción de COX-2 no actúa en una capacidad pro-inflamatoria. Uno de los efectos dramáticos de inhalación de CO fue sobre la expresión de genes unidos a trayectorias anti-inflamatorias: IL-10 y HO- 1 . Mientras que ambos genes se indujeron después de la manipulación intestinal, la expresión se aumentó por 300% en animales manipulados tratados con CO. Este aumento se observó en el punto de tiempo postoperativo de 3 h pero no el punto de tiempo de 6 hr sugirieron que la exposición de CO dio como resultado la inducción temprana de estos genes, un concepto soportado por los resultados que muestran que la inhalación de CO solo por los animales desnudos dio como resultado una inducción importante de IL-10 y HO-1 . El papel jugado por estos mediadores en el íleo postoperativo no se ha caracterizado previamente. Sin embargo, I L-10 es una citoquina pleyotrópica con un amplio espectro de efectos biológicos sobre células mieloide y linfoide. Una de sus funciones conocidas es su habilidad para inhibir la producción de mediadores pro-inflamatorios; incluyendo la producción de factor alfa de necrosis tumoral (TNFa)IL-6, IL-1 , factor estimulante de colonia de macrófago de granulocito, y la generación de óxido nítrico por monocitos/macrófago activados. Recientemente, IL-10 se encontró que inhibía la producción de NO por macrófagos murino estimulados por LPS, tanto al antagonizar la toma celular de L-arginina así como también la actividad catalítica de ¡NOS por sí mismo, contribuyendo de tal modo potencialmente a la atenuación de los efectos inhibidores de NO sobre el músculo liso intestinal. Además, ha llegado a ser aparente en aumento que la inducción de la trayectoria mediada por HO-1 tiene efectos citoprotectores y anti-inflamatorios importantes bajo una variedad de condiciones inflamatorias crónicas y agudas. Ahora esto se evidencia sugiriendo que la expresión de estos dos mediadores se ínter relaciona. Los descubrimientos publicados han mostrado que la exposición de CO aumenta la expresión de gen IL-10 y liberación de proteína de los macrófagos estimulados por LPS. Más recientemente, IL-1 0 endógeno se encontró que indujo el HO-1 en macrófagos murino, y la inducción HO-1 se requirió para los efectos inhibidores de IL-10 sobre la producción de TNF-a inducido por lipopolisacárido. La inducción temprana de HO-1 podría dar como resultado la salida de OC endógeno aumentado que podría esperarse que contribuya a los efectos del gas exógenamente aplicado. Además, la actividad de HO-1 tiene propiedades anti-oxidantes y citoprotectoras que se han atribuido al eliminador de radical libre a través del ciclado reducción oxidación de biliverdina y bilirrubina. Por lo tanto, la producción de IL-1 0 aumentada y la actividad mejorada de HO-1 podría actuar de acuerdo a humedecer la cascada inflamatoria temprana en su desarrollo por expresión de mediador pro-inflamatorio de baja regulación, mejorando la disponibilidad de tejido de CO y proporcionando protección de tensión libre de radical. En resumen, los datos presentados aquí sugieren que los efectos protectores de la inhalación de CO ocurren al tener como objetivo los elementos selectivos dentro de las trayectorias pro- y antiinflamatorias. CO parece que actúa en el nivel tanto de expresión de proteína como de gen conduciendo a la inducción de IL-1 0 y HO-1 , baja regulación de IL-? ß, y la inhibición de ¡NOS. Juntos estos efectos dan como resultado la modulación de las respuestas inflamatorias quirúrgicamente inducidas dentro del músculo intestinal, conduciendo a la función postoperativa mejorada.

Ejemplo 3. CO suprime el desarrollo del íleo asociado con manipulación quirúrgica del intestino delgado en el ratón v el cerdo El ¡leo se indujo en ratones por manipulación suave del intestino delgado. Una incisión se hizo para exponer la cavidad abdominal del ratón, y la manipulación de intestino se realizó por limpieza suave y pinchado del intestino delgado (ver, por ejemplo, Schwartz, er al. , Gastroenterology 121 (6): 1354-1357 (2001 )). La incisión se cerró subsecuentemente, y los análisis se realizaron 24 horas después. Los ratones se expusieron a CO por inhalación (250 y 500 ppm) por 1 hora inmediatamente antes de la manipulación intestinal y durante el período de recuperación de 24 horas completas. La contractilidad intestinal se valoró in vitro al medir las contracciones de tira de músculo circular en respuesta a betanocoi (0.3-300 µ ) e in vivo al determinar el tránsito intestinal de la distribución de dextrano etiquetado por fluoresceína, oralmente alimentado, y calculando el centro geométrico según se describe en el Ejemplo 1 anterior. La expresión de mARN IL-10 y HO-1 se determinaron por RT-PCR de tiempo real SYBR verde de extractos de músculos externos, según se describe en el Ejemplo 1 anterior. La liberación de óxido nítrico (NO), un inhibidor potente de contractilidad de músculo liso, se estimó al medir el nitrito de suero total, también descrito en el Ejemplo 1 anterior. La fuerza contráctil máxima generada en respuesta a betanocoi (100 µ?) se redujo significativamente por IM (1 .1 + 0.2 g/s/mm2) en comparación a los controles (2.2 + 0.5 g/s/mm2). La supresión inducida por IM de contractilidad se previno en ratones IM+CO (1.9 + 0.5 g/s/mm2). El tránsito intestinal también se mejoró en ratones tratados por CO (centro geométrico: control=11.0 + 0.5, IM=2.7 + 0.2, IM + CO = 6.3 + 0.8). Los datos de RT-PCR mostraron que IM indujo aumentos importantes en la expresión HO-1 máxima (45 pliegues) en 6 hrs, y expresión de IL-6 (300 pliegues) e IL-10 (13 pliegues) 3 hrs, después de IM contra los controles. En los ratones IM-CO, la expresión de HO-1 se valoró de manera temprana, 3 hrs de post-IM, a un nivel de expresión superior (150 pliegues) contra los controles. La expresión de IL-10 en 3 hr también fue superior en ratones IM-CO (35 pliegues). El nitrito de suero se aumentó después de IM (18.3 + 3.6 µ?) contra control (2.4 + 1.0 µ?), y se redujo después de IM-CO (6.0 + 1.6 µ?). Por lo tanto, CO atenúa la dismotilidad intestinal quirúrgicamente inducida, in vitro e in vivo, por medio de mecanismos que pueden incluir la inducción de la citoquina anti-inflamatoria IL-10 y la producción NO reducida. La inducción temprana de HO-1 (300% de aumento en la expresión sobre IM solo) podría aumentar la disponibilidad de CO, mejorando sus efectos anti-inflamatorios. Los experimentos similares se realizaron en un modelo de cerdo. El ¡leo se sometió por manipulación medida del intestino delgado (IM). Los cerdos se expusieron a CO (250 ppm) o aire (controles) por un período de 3 hr antes de IM. La función gastrointestinal se valoró in vivo al observar el tránsito intestinal de revestimientos de bola de acero colocados dentro del intestino delgado. CO se encontró que mejora el tránsito intestinal siguiendo la manipulación intestinal.

Ejemplo 4. Pre-Tratamiento con Concentraciones Bajas de CO (250 a 75 ppm) por Tres Horas Antes de que La Laparotomía se Proteja Contra El Desarrollo de Ileo Postoperativo. Este ejemplo demuestra que las concentraciones bajas de CO suministrado por cortos períodos de tiempo son protectoras contra el desarrollo de íleo postoperativo. El íleo se indujo por manipulación media del intestino delgado (IM). Las ratas se expusieron a concentraciones decrecientes de CO (250, 125, 75, 30 ppm) en aire por un período ya sea de 1 hr o 3 hr antes de la laparotomía (n=6). Los resultados se compararon a aquellos obtenidos utilizando los protocolos previamente establecidos de exposición a CO a 250 ppm 1 hr antes de y por 24 hr después de la laparotomía. La función gastrointestinal se valoró in vivo al determinar el tránsito intestinal de la distribución a lo largo del tracto Gl de dextrano etiquetado por fluoresceína oralmente alimentado. La distribución media del dextrano etiquetado se determinó para la comparación estadística al calcular el centro geométrico (GC). El centro geométrico se redujo significativamente en ratas que superaron la manipulación quirúrgica en comparación a los controles sin operar (GC:control=9.8 + 0.2, IM=5.8 + 0.4) indicando una disminución significante de tránsito intestinal. A pesar de que la exposición de ratas sin operar a 250 ppm por 24 hr dio como resultado un retardo ligero en el tránsito intestinal (GC: 8.8 + 0.4), un pretratamiento de 1 h4 seguido por 24 hr de post tratamiento con 250 ppm de CO dio como resultado una mejora importante en el tránsito intestinal en ratas que superaron la manipulación quirúrgica (GC: 8.2 + 0.4). El pretratamiento de ratas manipuladas con 250 ppm por 1 hr solamente antes de la cirug ía fue menos eficaz en la prevención de la inhibición quirúrgicamente inducida de tránsito (GC:7.2+0.3), mientras que el pretratamiento por 3hr produjo un efecto equivalente a aquel logrado con 24 hr de tratamiento (GC.8.6 + 0.3). Una mejora similar se obtuvo al pre-tratar con concentraciones tan bajas como 125 y 75 ppm (GC:8.6 + 0.4 y 8.8 + 0.1 , respectivamente). Este efecto protector se declinó cuando la concentración de CO se redujo más a 30 ppm (GC:7.0 + 0.2). Este ejemplo demuestra que la exposición prolongada a CO no se requiere para derivar el beneficio total de la protección del desarrollo de íleo postoperativo. La incorporación de bajas concentraciones de CO en gases anestésicos durante el período pre-operativo puede proporcionar una técnica mínimamente invasiva que podría ayudar en la reducción de ¡leo en pacientes susceptibles, acelerando de esta manera la recuperación post-operativa y la reducción de la permanencia en el hospital.

Ejemplo 5. Protocolos para el Tratamiento de Ileo El siguiente ejemplo ilustra los protocolos para utilizarse en los tratamientos de pacientes antes, durante y/o después de los procedimientos quirúrgicos, por ejemplo, un transplante (por ejemplo, SITx) o procedimientos de no transplante (por ejemplo, un procedimiento de los cuales el ileo puede darse como resultado). El ejemplo incluye protocolos para tratar el ¡leo, por ejemplo, él ¡leo que se da como resultado de procedimientos de transplante y no transplante, y protocolos adicionales para tratar donadores, el tracto gastrointestinal o una parte del mismo, por ejemplo, un intestino delgado, y recipientes con CO en un procedimiento de transplante. Cualquiera o más de los siguientes procedimientos pueden utilizarse en un procedimiento quirúrgico dado.

Tratamiento de Pacientes CO puede administrarse sistémicamente o localmente a un paciente antes de que, durante y/o después de que un procedimiento quirúrgico se realice en el paciente o después de que al paciente se le diagnostica el ileo (por ejemplo, ileo que se da como resultado de la cirugía o que se da como resultado de las condiciones no Incluyendo cirugía). Los pacientes pueden inhalar CO en concentraciones que varían de 10 ppm a 1000 ppm, por ejemplo, aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 800 ppm, aproximadamente 150 ppm a aproximadamente 600 ppm, o aproximadamente 200 ppm a aproximadamente 500 ppm. Las concentraciones preferidas incluyen, por ejemplo, aproximadamente 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, o aproximadamente 1000 ppm. El CO puede administrarse al paciente, intermitentemente o continuamente, comenzando 0 a 20 días antes de que el procedimiento se realice, por ejemplo, comenzando en al menos aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, aproximadamente 1 , 2, 3, 5, 7 o 10 horas, o aproximadamente 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 o 20 días, o más de 20 días, antes del procedimiento. Alternativamente o además, CO puede administrarse al paciente durante el procedimiento, por ejemplo, por inhalación y/o administración local. Alternativamente o además, CO puede administrarse al paciente después del procedimiento, por ejemplo, comenzando inmediatamente después de consumirse el procedimiento, y continuando por aproximadamente 1 , 2, 3, 5, 7 o 1 0 horas, o aproximadamente 1 , 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 o 60 d ías, indefinidamente, o hasta que la motilidad de intestino normal se restaura, después de consumirse el procedimiento.

Procedimientos de Transplante Tratamiento de Donador Antes de colectar un órgano o parte del mismo, el donador puede tratarse con monóxido de carbono inhalado (250 ppm) por una hora. El tratamiento puede administrarse a dosis que varían de 1 0 ppm a 1000 ppm por veces variando de una hora a seis horas, o por el período total del momento cuando llega a ser posible tratar un donador de muerte cerebral (cadáver) al momento que se remueve el órgano. Para un donador humano, el tratamiento deberá comenzar lo más pronto posible siguiendo la declaración de que la muerte cerebral está presente. En algunas aplicaciones, puede ser deseable comenzar el tratamiento antes de la muerte cerebral. Para los animales no humanos (por ejemplo, cerdos) a utilizar como donadores xenotransplante, el animal donador vivo puede tratarse con niveles relativamente altos de monóxido de carbono inhalado, según se desee, mientras que la carboxihemoglobulina así producida no comprende la viabilidad y función del Órgano a transplantarse. Por ejemplo, uno podría utilizar niveles mayores a 500 ppm (por ejemplo, 1000 ppm o más, y hasta 10,000 ppm, particularmente por tiempos breves). Tratamiento del órgano in situ Antes de que un órgano se colecte de un donador, puede nivelarse o perfusionarse con una solución, por ejemplo, un regulador o medio, mientras que todavía se encuentra en el donador. El intento es nivelar el órgano con una solución saturada con monoxido de carbono y mantenerse en una atmósfera de monoxido de carbono de tal forma que el contenido de monoxido de carbono permanece en saturación. La nivelación puede tener lugar por un período de tiempo de al menos 10 minutos, por ejemplo, 1 hora, varias horas, o más. La solución deberá suministrar idealmente la concentración más alta de monoxido de carbono posible a las células del órgano. Tratamiento del órgano ex vivo Un órgano, tal como un intestino delgado, puede conservarse en un medio que incluye el monoxido de carbono desde el momento que se remueve del donador al momento que se transplanta al recipiente. Esto puede realizarse al mantener el órgano en el medio comprendiendo CO, o al prefusionarlo con tal medio. Ya que esto ocurre ex vivo en lugar de un animal, pueden utilizarse concentraciones muy altas de gas CO (por ejemplo, 10,000 ppm) para mantener el medio saturado con CO.

Tratamiento de un Recipiente El tratamiento del recipiente con CO puede comenzar en el día del transplante al menos 30 minutos antes de que comience la cirug ía. Alternativamente, podría comenzar al menos 30 minutos antes de la reperfusión del órgano en el recipiente. Puede continuarse por al menos 30 minutos, por ejemplo, 1 hora. Las dosis de monóxido de carbono entre 100 ppm y 3000 ppm pueden suministrarse para tiempos variantes, por ejemplo, minutos u horas, y pueden administrarse en el día de y en los días siguientes al transplante. Por ejemplo, el paciente puede inhalar una concentración de monóxido de carbono, por ejemplo, 3000 ppm, por tres umbrales de respiración de 1 0 segundos consecutivos. Alternativamente, una concentración inferior del gas puede suministrarse intermitentemente o constantemente, por un período más largo de tiempo, con respiración regular en lugar de mantener la respiración. Las concentraciones de carboxihemoglobulina pueden utilizarse como una guía para la administración adecuada de monóxido de carbono a un paciente. Usualmente, los tratamientos para los recipientes no deberán elevar los niveles de carboxihemoglobina arriba de aquellos considerados por proponer un riesgo aceptable para un paciente en necesidad de un transplante.

Se entenderá que, mientras que la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción precedente se pretende que ilustre y no limite el alcance de la invención, la cual se define por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (2)

1. REIVI NDICACION ES 1 . Un método para tratar ¡leo en un paciente, el método comprendiendo: identificar un paciente que padece de ileo; y administrar al paciente una composición farmacéutica q ue comprende una cantidad de monóxido de carbono eficaz para tratar el ileo en el paciente. 2. El método seg ún la reivindicación 1 , caracterizado porq ue el ileo es el ileo del intestino delgado. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el ileo es el ileo del colon. 4. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el ileo es el ileo del estómago. 5. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porq ue el ileo es el ileo post-q uirúrgico. 6. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porq ue el ileo es el ileo post-parto. 7. El método según la reivind icación 1 , caracterizado porq ue la composición farmacéutica se administra al paciente por medio de la inhalación. 8. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la composición farmacéutica se encuentra en forma líq uida y se administra al paciente oralmente. 9. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la composición farmacéutica se administra directamente a la cavidad abdominal del paciente. 10. Un método para tratar el ileo en un paciente, el método comprendiendo: identificar un paciente que padece de o en riesgo de ileo originado por una cirugía abdominal seleccionada del grupo que consiste de: cirugía del sistema urogenital; el sistema digestivo; el sistema linfático; el sistema respiratorio; cirugía del diafragma; cirugía para tratar cáncer; cirugía endométrica; y cirugía ortopédica; y administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono eficaz para tratar el ileo en el paciente. 1 1 . El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el ileo es el ileo del intestino delgado. 12. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el ileo es el ileo del colon. 13. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra al paciente por medio de la inhalación. 14. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica se encuentra en forma líquida y se administra al paciente oralmente. 15. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra directamente a la cavidad abdominal del paciente. 16. Un método para tratar el ileo en un paciente, el método comprendiendo: identificar un paciente que padece de o en riesgo de ileo no originado por cirugía; y administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono eficaz para tratar el ileo en el paciente. 17. Un método para tratar el ileo en un paciente, comprendiendo: (a) proporcionar un recipiente que contiene gas presurizado que comprende gas de monóxido de carbono; (b) identificar un paciente que padece de ileo; (c) liberar el gas presurizado del recipiente, para formar una atmósfera que comprende gas de monóxido de carbono; y (d) exponer el paciente a la atmósfera, en donde la cantidad de monóxido de carbono en la atmósfera es suficiente para tratar el ileo en el paciente. 18. Un recipiente que comprende gas de monóxido de carbono comprimido de grado médico, el recipiente que sostiene una etiqueta que indica que el gas puede utilizarse para tratar el ileo en un paciente. 19. El recipiente según la reivindicación 18, caracterizado porque el gas de monóxido de carbono se encuentra en mezcla con un gas que contiene oxígeno. 20. El recipiente según la reivindicación 19, caracterizado porque el gas de monóxido de carbono se presenta en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente 0.025%. 21 . El recipiente según la reivindicación 19, caracterizado porque el gas de monóxido de carbono se presenta en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente 0.05%. 22. El recipiente según la reivindicación 19, caracterizado porque el gas de monóxido de carbono se presenta en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente 0.10%. 23. El recipiente según la reivindicación 19, caracterizado porque el gas de monóxido de carbono se presenta en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente 1.0%. 24. El recipiente según la reivindicación 19, caracterizado porque el gas de monóxido de carbono se presenta en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente
2. 2.0%.