MXPA04007896A - Metodos para tratar enfermedades vasculares. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para tratar pacientes que padecen de, o que estan en riesgo de hiperplasia intima y/o arteriosclerosis. El tratamiento incluye administrar al paciente una composicion farmaceutica que incluye monoxido de carbono.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES VASCULARES Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/356,718 presentada el 13 de febrero del 2002, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Manifestación para la Investigación Patrocinada por la Federación La presente invención se realizó con el soporte gubernamental de acuerdo con las garantías Nos. HL55330, HL60234, HL67040, HL58688, HL53458, HL60234, HL5785405 y AI42365 del Instituto Nacional de Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención. Campo del Invento La presente invención se refiere de manera general al tratamiento de enfermedades vasculares. Antecedentes del Invento La oxigenasa Heme-1 (HO-1) cataliza el primer paso en la degradación de heme. La HO-1 disocia el puente de carbono -meso de las moléculas heme tipo-b mediante oxidación para producir cantidades equimolares de biliverdina IXa, monóxido de carbono (CO), y hierro libre. De manera subsecuente, la biliverdina se convierte a bilirrubina mediante reductasa de biliverdina, y el hierro libre es secuestrado en ferritina (cuya producción es inducida mediante hierro libre). Se reconoce el CO como una molécula de señalización importante (Verma y asociados, Science 259: páginas 381 a 384, 1993). Se ha sugerido que el monóxido de carbono actúa como una molécula mensajera neuronal en el cerebro (Id.) y como un modulador neuro-endrocrino en el hipotálamo (Pozzoli y asociados, Endocrinology 735: páginas 2314 a 2317, 1994) Al igual que el óxido nítrico, el CO es un relajante de músculo liso (Utz y asociados, Biochem Pharmacol, 47: páginas 195 a 201, 1991; Christodoulidos y asociados, Circulation 97: páginas 2306 a 2309, 1995) e inhibe la agregación a las plaquetas (Mansouri y asociados, Thromb Haemost. 48: páginas 286 a 288, 1982). La inhalación de bajos niveles de CO ha demostrado tener efectos anti-inflamatorios en algunos modelos. La hiperplasia de la íntima de un vaso sanguíneo (hiperplasia íntima), un engrosamiento de la capa interna del vaso sanguíneo, es un proceso patológico que surge de la lesión vascular que procede de procedimientos tales como angioplastía, cirugía de derivación o transplante de órganos. La hiperplasia íntima continúa limitando el éxito de estas intervenciones terapéuticas. ¦ * Sumario del Invento La presente invención se basa en parte, en los descubrimientos de que el CO evita las lesiones arterioescleróticas y la hiperplasia íntima que siguen a un transplante de aorta y a lesiones por un balón en la arteria carótida en animales. Por consiguiente, en un aspecto de. la presente invención se proporciona un método para tratar la hiperplasia íntima en un paciente. El método incluye identificar a un paciente que padece de o que está en riesgo de hiperplasia íntima (por ejemplo, la hiperplasia íntima que resulta de un procedimiento de angioplastía o un procedimiento de transplante, o que resulta de un procedimiento o condición diferente a un procedimiento de transplante) y administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono efectiva para tratar la hiperplasia íntima en el paciente. La presente invención también proporciona un método para llevar a cabo la angioplastía en un paciente. El método incluye llevar a cabo la angioplastía en el paciente y antes, durante y/o después de llevar a cabo la angioplastía, administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de CO efectiva para tratar la hiperplasia íntima en el mismo. La angioplastía puede ser cualquier procedimiento de angioplastía, por ejemplo, angioplastía de balón; angioplastía láser; artrectomía, por ejemplo artrectomía direccional, artrectomía de rotación o artrectomía de extracción; y/o cualquier procedimiento de angioplastía que utilice un stent, o cualquier combinación de dichos procedimientos. La presente invención también proporciona un método para tratar (por ejemplo, evitar o disminuir) la restenosis en un paciente. El método incluye proporcionar un envase que contenga un gas presurizado que comprenda gas de monóxido de carbono, identificar a un paciente que padece de o que está en riesgo de restenosis, liberar el gas presurizado del envase para formar una atmósfera que comprenda gas de monóxido de carbono y exponer al paciente a la atmósfera, en donde la cantidad de monóxido de carbono en la atmósfera es suficiente para tratar la restenosis en el paciente. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar la restenosis en un paciente. El método incluye identificar a un paciente que padece de o que está en riesgo de restenosis y administrar al mismo una composición farmacéutica que comprenda una cantidad de monóxido de carbono efectiva para tratar la restenosis en el paciente. La restenosis puede resultar de cualquier procedimiento de angioplastía, es decir, angioplastía de balón, angioplastía láser, artrectomía, por ejemplo, artrectomía direccional, artrectomía de rotación o artrectomía de extracción y/o cualquier procedimiento de angioplastía que utilice un stenfco cualquier combinación de dichos procedimientos. La presente invención también proporciona un método para llevar a cabo una cirugía vascular, es decir, :un procedimiento de transplante en un paciente. El método incluye: (a) realizar la cirugía vascular (por ejemplo, un procedimiento de transplante) en un paciente y (b) antes, durante y/o después de (a), administrar al paciente una composición farmacéutica que comprenda una cantidad de CO efectiva para tratar arteriesclerosis (por ejemplo, hiperplasia íntima) en el paciente. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la proliferación de las células de músculo liso. El método incluye proporcionar una célula(s) de músculo liso y administrar a la célula(s) de músculo liso una cantidad de CO efectiva para inhibir la proliferación de la célula(s) de músculo liso. Esto se puede llevar a cabo ¡n vivo o in vi tro. También se proporciona un método para llevar a cabo la angioplastía en un paciente, en donde el método incluye proporcionar un aparato de angioplastía (por ejemplo, el aparato que se describe en la presente invención) que tenga la capacidad de administrar monóxido de carbono a un paciente, colocar el aparato en un vaso sanguíneo que necesita de angioplastía, llevar a cabo la angioplastía utilizando el aparato y antes, durante y/o después de realizar la angioplastía, administrar CO al vaso sanguíneo utilizando el aparato, en una cantidad suficiente para la hiperplasia íntima, para llevar a cabo de éste modo la angioplastía en el paciente. El aparato puede ser cualquier aparato que tenga la capacidad de utilizar un procedimiento de angioplastía, por ejemplo, el aparato que se describe en la presente invención. Como alternativa o en adición, el aparato puede estar recubierto con un agente que libera CO, es decir un hidrogel, aceite o ungüento que libere CO o un compuesto que libere CO. En otro aspecto, la presente invención proporciona un envase que comprende gas de CO comprimido de grado médico. El envase puede contener una etiqueta que indique que se puede utilizar el gas para reducir la restenosis, arteriosclerosis y/o hiperplasia íntima en un paciente (por ejemplo, un paciente humano), y/o que se puede utilizar en un procedimiento de angioplastía. El gas de CO puede estar en una mezcla con gas de nitrógeno, con óxido nítrico y gas de nitrógeno o con un gas que contiene oxígeno. El gas de CO puede estar presente en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente el 0.025%, por ejemplo al menos aproximadamente 0.05%, 0.10%, 0.50%, 1.0%, 2.0%, 10%, 50%, ó 90%. La presente invención también proporciona un equipo que incluye un aparato para angioplastía (por ejemplo, un aparato de angioplastía de balón, un aparato de angioplastía láser; un aparato de artrectomía; y/o un stent) y un envase que contiene CO (por ejemplo, una composición CO líquida y/o gaseosa). El aparato de angioplastía tiene la capacidad de administrar monóxido de carbono a un paciente. El equipo puede incluir además instrucciones para utilizar la composición de monóxido de carbono en un método para llevar a cabo la angioplastía en un paciente. En otro aspecto, la presente invención proporciona aparatos de angioplastía (por ejemplo, aparatos de angioplastía de balón, aparatos de angioplastía de láser; aparatos de artrectomía; y stents, por ejemplo, el aparato que se describe en la presente invención) que tengan la capacidad de administrar CO a un paciente y/o un vaso sanguíneo, inmediatamente antes, durante y/o después de un procedimiento de angioplastía. En una modalidad, el aparato de angioplastía comprende una composición de CO. En otra modalidad, el aparato es un aparato de angioplastía de balón que incluye un elemento inflable (por ejemplo, un balón) que tiene una pluralidad de aperturas y un depósito que contiene CO (una composición CO líquida o gaseosa) conectado al elemento inflable, de modo que el CO pueda ser administrado desde el depósito a través del elemento inflable y al vaso sanguíneo. También está dentro de la presente invención, el uso de CO en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una de las condiciones aquí descritas, por ejemplo, hiperplasia íntima, restenosis, y/o arteriesclerosis. El medicamento también se puede utilizar en un método para llevar a cabo un procedimiento de angioplastía y/o un procedimiento de transplante. El medicamento puede estar en cualquier forma de las que se describen en la presente invención, por ejemplo una composición CO líquida o gaseosa . A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado al que es utilizado comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Más adelante se describen métodos y materiales adecuados, aunque también se pueden elaborar en la práctica o elaboración de pruebas de la presente invención métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad como referencia a la presente invención. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, será controlada. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención. Se podrán apreciar otras características y ventajas de la presente invención, a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones que se encuentran más adelante.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1A, es una fotomicrográfica (magnificación 50X) de un injerto de aorta transplantado en forma singeneíca que ilustra el efecto de un transplante singeneíco en el injerto; La figura 1B, es una fotomicrográfica (magnificación 50X) de un injerto de aorta transplantado en forma alogeneíca que ilustra el efecto de un transplante alogeneíco en el injerto. La figura 1C, es una fotomicrográfica (magnificación 50X) de un injerto de aorta transplantado en forma alogeneíca que ilustra el efecto de un transplante alogeneíco en el injerto cuando el receptor se expone a CO. La figura 1 D, es una fotomicrográfica (magnificación 200X) de un injerto de aorta transplantado en forma singeneíca que ilustra el efecto de un transplante singeneíco en el injerto. La figura 1E, es una fotomicrográfica (magnificación • * o - 200X) de un injerto de aorta transplantado en forma alogeneíca que ilustra el efecto de un transplante alogeneíco en el injerto. La figura 1F, es una fotomicrográfica (magnificación 200X) de un injerto de aorta transplantado en forma alogeneíca que ilustra el efecto de un transplante alogeneíco en el injerto, cuando el receptor se expone a CO.

La figura 1G, es una gráfica de barras que ilustra las áreas relativas promedio (en unidades arbitrarias) de la parte interna de injertos de aorta transplantados en forma singeneíca en receptores expuestos al aire (Sing), en forma alogeneíca en receptores expuestos al aire (Alio), y en forma alogeneíca en receptores expuestos a CO (Alo. + CO).; La figura 1H, es una gráfica de barras que ilustra las áreas relativas promedio (en unidades arbitrarias) de la media de injertos de la aorta transplantados en forma singeneíca en receptores expuestos al aire (Syng), y en forma alogeneíca en receptores expuestos al aire (Alo.) y en forma alogeneíca en receptores expuestos a CO (Alo. + CO). La figura 11 es una gráfica de barras que ¡lustra la proporción del área íntima/media de injertos de aorta transplantados en forma singeneíca en receptores expuestos al aire (Sing.), en forma alogeneíca en receptores expuestos al aire (Alo.) y en forma alogeneíca en receptores expuestos a CO (ALO. + CO). La figura 2a, es una gráfica de barras que ilustra la acumulación de leucocitos activados (medidos mediante el conteo de núcleos totales) en la adventicia de injertos de aorta transplantados en forma singeneíca en receptores expuestos al aire (Singeneíca) en receptores expuestos al aire (Alogeneíca) y en forma alogeneíca en receptores expuestos a diversas concentraciones de CO (CO 250 ppm; CO 500 ppm; y CO 750-1000 ppm). La figura 2B, es un grupo de gráficas de barras que ilustran la acumulación de células positivas CD45, ED1, MHCII, y CD54 en la adventicia de injertos de aorta transplantados en forma singeneíca en receptores expuestos al aire (Sing.)> en forma alogeneíca en receptores expuestos al aire (Alog.). y en forma alogeneíca en receptores expuestos a CO (Alo. + CO). La figura 2C, es un grupo de gráficas de barras que ilustra la acumulación de células positivas CD3, CD4, y CD8 en la adventicia de los injertos de aorta transplantados en forma singeneíca en receptores expuestos al aire (Sing.), en forma alogeneíca en receptores expuestos al aire (Alog.) y en forma alogeneíca en receptores expuestos a CO (Alo. + CO). La figura 3A, es una fotomicrográfica (magnificación 10X) de una muestra de arteria carótida que ilustra el efecto de angioplastía de balón en la arteria. La figura 3B, es una fotomicrográfica (magnificación 10X) de una muestra de arteria carótida que ilustra el efecto de la angioplastía de balón en la arteria, cuando el sujeto se expone previamente a CO. La figura 3C, es una fotomicrográfica de una muestra de arteria carótida que ilustra el efecto de la angioplastía de balón en la arteria. La figura 3D, es una fotomicrográfica de una muestra de carótida que ilustra el efecto de la angioplastía de balón en la arteria, cuando el sujeto se expone previamente a CO. La figura 3E, es una gráfica de barras que ilustra las áreas relativas promedio (en unidades arbitrarias) de la parte interna de arterias carótidas sometidas a angioplastía de balón, cuando el sujeto animal se expone previamente ya sea a aire (Control) o a 250 ppm de CO (CO). La figura 3F, es una gráfica de barras que ilustra las áreas relativas promedio (en unidades arbitrarias) de la media de las arterias carótidas sometidas a angioplastía de balón, cuando el sujeto animal se expone previamente ya sea a aire (Control) o a 250 ppm de CO (CO). La figura 3G, es una gráfica de barras que ilustra la proporción del área íntima/media de arterias carótidas sometidas a angioplastía de balón, cuando el sujeto animal se expone previamente ya sea a aire (Control) o 250 ppm de CO (CO). La figura 4A, es una gráfica de líneas que ¡lustra la proliferación de SMC de ratas que fueron no transducidas (o; Medio), transducidas con adenovirus recombinante Lac.Z (?; LacZ Rec. Ad.) o transducidas con adenovirus recombinante HO-1 (·; HO-1 rec. Ad.). .' La figura 4B, es una gráfica de líneas que ilustra la proliferación de SMC en la presencia (·; 1000 ppm) o ausencia (?) de CO.

La figura 4C, es una gráfica de barras que ilustra fia proliferación de SMC aislada de ratones tipo natural (WT) o con deficiencia de HO-1 (ho-1"1) en la presencia (CO) y ausencia (Aire) de CO. La figura 4D, es un manchado Western que ilustra el efecto de la exposición de CO (durante 0, 4, 5, 16, y 24 horas) a la expresión de la proteína p21 y de actina-ß en SMC de ratón. La figura 4E, es una gráfica de barras que ilustra el efecto de CO en ia proliferación de SMC de ratón aislado de ratones (wt), p21Cip1 (p21~1') y p53 {p53'1'). (Las barras grises indican células expuestas a aire ambiental y las barras negras células expuestas a CO (250 ppm). La figura 4F, es una gráfica de barras que ¡lustra la proporción del área íntima/media de arterias carótidas lesionadas con balón de ratones tipo natural (C57/B16/S129; wt) y p21'1' expuestos a aire (Aire) o monóxido de carbono (CO). La figura 5A, es una gráfica de barras que ilustra el efecto de la exposición al aire (Aire) y CO (250 ppm durante 8 ó 16 horas) en el contenido cGMP célular promedio de SMCs de ratón. La figura 5B es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H)timidina a través de SMCs de ratón expuestos a aire (Aire), CO (250 ppm) y CO además de inhibidor de ciclasa de guanilato 11-1(1,2,4) Oxadiazolo(4,3-a) Quinoxalin-1 (CO/ODQ). La figura 5C, es una ilustración compuesta de un manchado Western que ilustra el efecto de sal de sodio de monofosfato 3'-5'-cíclico 8-Bromoguanosina (8-Br-cGMP) en la expresión p21Cip1. La figura 5D, es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H]timidina a través de SMC aislado de ratones tipo natural (wt) y p21cip (p21'1~) en la presencia de (8Br-cGMP; 8Br-cGMP (p21'1')) y en la ausencia de (Aire) del análogo 8Br-cGMP cGMP. La figura 5E, es una ilustración compuesta de un manchado Western que ilustra el efecto de CO (250 ppm) en la expresión de p38 MAPK fosforilado (p-p38), ATF-2 (p-ATF-2), JNK (p-JNK) y ERK (p-ERK) comparado con p38 MAPK, ATF-2, JNK y ERK en SMC. La figura 5F, es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H]timidina a través de SMC de ratón expuesto a aire (Aire) 250 ppm de CO (CO) y CO más inhibidor p38 MAPK sb203580 (CO/SB). La figura 5G, es una ilustración compuesta de un manchado Western que ilustra el efecto de aire (Aire), CO . " (250 ppm; CO)), SB203580 y DMSO en la expresión de p21Cip1 en SMC de ratón. La figura 6A, es una ilustración compuesta de un manchado Western que ¡lustra el efecto de 8-Br-cGMP en la expresión de p38 MAPK en SMC de ratón. La figura 6B, es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H]timidina a través de SMC de ratón expuesto a aire (Aire), CO más 8-Br-cGMP (8-Br-cGMP) y CO más 8-Br-cGMP más SB203580 (8-Br-cGMP + SB203580). La figura 7A, es una ilustración de citometría de flujo que ilustra el efecto de la exposición al aire (Aire) y CO (250 ppm) en el ciclo celular de la SMC de aorta de rata. La figura 7B es una gráfica de líneas que ilustra el efecto del aire (?) y CO (¦) en la proliferación de SMC. La figura 8, es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H]timidina mediante SMC de ratón tipo natural (wt), p2T1", p53"1" expuesto ya sea a aire (barras grises) o a CO (250 ppm, barras negras) durante 24 horas. La figura 9A, es una fotomicrográfica (magnificación 20X) de una sección de arteria carótida procedente de un ratón tipo natural 14 días después de la lesión con el cable; El sujeto animal fue expuesto a aire ambiental durante 1 hora antes de la lesión con el cable. La figura 9B, es una fotomicrográfica (magnificación 20X) de una sección de arteria carótida procedente de un ratón tipo natural 14 días después de la lesión con el cable. El sujeto animal se expuso a CO (250 ppm) durante 1 hora antes de la lesión con cable.

La figura 9C, es una fotomicrográfica (magnificación 20X) de una sección de arteria carótida procedente de un ratón p21"1" 14 días después de la lesión con cable. El sujeto animal fue expuesto a aire ambiental durante 1 hora antes de la lesión con cable. La figura 9D, es una fotomicrográfica (magnificación 20X) de una sección de arteria carótida procedente de un ratón p21"1" 14 días después de ser sometido a una lesión con cable. El sujeto animal se expuso a CO (250 ppm) durante 1 hora antes de la lesión con cable. La figura 9E, es una gráfica de barras que ilustra las áreas relativas promedio (en unidades arbitrarias) de la íntima de las arterias de carótida lesionadas con cable procedentes de ratones tipo natural (wt) y p21"1" expuestos ya sea a aire (Control) o a 250 ppm de CO (CO). La figura 9F, es una gráfica de barras que ilustra las áreas relativas promedio (en unidades arbitrarias) de la media de arterias carótidas lesionadas con cable procedentes de ratones tipo natural (wt) y p21 "1"expuestos ya sea a aire (Control) a 250 ppm de CO (CO). La figura 9G, es una gráfica de barras que ilustra la proporción del área íntima/media de las arterias de carótida lesionadas con cable procedentes de ratones tipo natural (wt) y p21"1" expuestos ya sea a aire (Control) o a 250 ppm de CO (CO).

La figura 10, es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H]timidina mediante SMC derivado de ratón p21"1" tratado con aire (Aire), CO (250 ppm; CO) y CO más SB203580 (CO/SB). La figura 11A, es una gráfica de barras que ilustra la captación de [3H]timidina mediante SMC derivado de ratón tipo natural (wt), con deficiencia de enos'1', and y ¡nos'1' expuesto a aire (Aire) o a CO (250 ppm; CO). La figura 11B es una gráfica de barras que ilustra las áreas íntima y media promedio y las proporciones del área íntima/media de arterias carótidas procedentes de ratas Sprague-Dawley expuestas a aire ambiental (barras blancas) o NO (barras negras; 1 hora; 250 ppm) antes de la lesión con balón de la arteria carótida. La figura 12A, es una ilustración compuesta de una manchado Western que ilustra la expresión PAI-1 en SMC tratado con o sin suero (Suero y no Suero, respectivamente) y con y sin CO (Aire y CO, respectivamente) durante 24 ó 48 horas. Hígado=lisados de célula completa procedentes de homogéneos de hígado de rata tratados sin endotoxina (LPS). TNF-a = control en donde TNF-a se agregó al cultivo celular para estimular la expresión de PAI-1. La figura 12B, es una ilustración de una manchado Western que ¡lustra la expresión PAI-1 en aortas no transplantadas (control), transplantadas (Alo. + Aire), y transplantadas tratadas con CO (Alo. + CO) 56 días después del transplante. La figura 12C, es una ilustración de un gel de poiiacriiamida teñido con azul Coommassie utilizado para el manchado Western de la figura 12B, el cual ¡lustra. Ja expresión de PAI en aortas no transplantadas (control), transplantadas (Alo. + Aire) y transplantadas tratadas con CO (Alo. + CO) 56 días después del transplante. Las figuras 13A y 13B, ilustran un ejemplo de un aparato de angioplastía de balón con la capacidad de administrar CO a un paciente, durante un procedimiento de angioplastía en diversas etapas de la operación. Las figuras 13C y 13D ilustran modalidades alternativas del aparato de angioplastía de balón. Las figuras 14A y 14B ilustran un ejemplo de un stent con la capacidad de administrar CO a un paciente durante un procedimiento de angioplastía en varias etapas de la operación. La figura 15 ilustra un ejemplo de un aparato de angioplastía de balón con múltiples balones diseñados para administrar CO a un paciente durante un procedimiento de angioplastía. La figura 16, ilustra un ejemplo de un aparato para administrar CO a un paciente durante un procedimiento de angioplastía.

Descripción Detallada del Invento El término "monóxido de carbono" (o "CO"), tal como se utiliza en la presente invención, describe monóxido de carbono molecular en su estado gaseoso, comprimido en forma líquida o disuelto en una solución acuosa. El término "composición de monóxido de carbono" o "composición farmacéutica que comprende monóxido de carbono", se utiliza a lo largo de la presente especificación para describir una composición líquida o gaseosa que contiene monóxido de carbono que puede ser administrada a un paciente y/o un vaso sanguíneo, por ejemplo, un paciente (o vaso sanguíneo) sometido a angioplastía, cirugía de derivación, transplante o cualquier otro procedimiento que pueda dar como resultado hiperplasia íntima y/o arteriesclerosis. Un experto en la técnica reconocerá que forma de composición farmacéutica, por ejemplo, gaseosa, líquida o tanto líquida como gaseosa, se prefiere para una aplicación determinada. El término "hiperplasia íntima" es un término reconocido en la técnica y se utiliza en la presente invención para referirse a la proliferación de células, por ejemplo, células de músculo liso dentro de la íntima de un vaso sanguíneo. El experto en la técnica apreciará que la hiperplasia íntima puede ser originada por cualquier número de factores, por ejemplo, daño mecánico, químico y/o inmunológico a la íntima. La hiperplasia íntima se puede observar con frecuencia en pacientes, por ejemplo, después de angioplastía de balón o cirugía vascular, por ejemplo, cirugía vascular que comprende injertos de vena (por ejemplo, cirugía de transplante). Los términos "arterieesclerosis", "lesión arterioesclerótica", "placa arterioescleró.tica" y "condición artereoesclerótica" también son términos conocidos en la técnica y se utilizan en la presente invención para describir un engrosamiento y endurecimiento de la pared arterial. El término "vasculatura", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al sistema vascular, (o cualquier parte del mismo) de un cuerpo, humano o no humano e incluye vasos sanguíneos, por ejemplo, arterias, arteriales, venas, venúlas y capilaridades. El término "restenosis" se refiere a un nuevo estrechamiento de una arteria después de la angioplastía. El término "angioplastía" es un término reconocido en la técnica y se refiere a cualquier procedimiento, solo o en combinación, que comprenda remodelar un vaso sanguíneo, por ejemplo, dilatar una región estenótica en la vasculatura de un paciente para restaurar el flujo adecuado de sangre más allá de la estenosis. Tales procedimientos incluyen angioplastía transluminal percutánea (PTA), la cual emplea un catéter que tiene un extremo distal expandible, por ejemplo un balón inflable (conocido como "angiplastía de balón"); angioplastía láser; atreroctomía de extracción; atreroctomía de dirección; atreroctomía de rotación; procedimiento de stent; y cualquier otro procedimiento para remodelar un vaso sanguíneo, por ejemplo, una arteria. Los términos "cantidad efectiva" y "efectiva para tratar", tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a una cantidad o a una concentración de monóxido de carbono utilizada durante un período de tiempo (incluyendo administración aguda o crónica y administración periódica o continua) que es efectiva dentro del contexto de su administración para originar el efecto o resultado fisiológico. Las cantidades efectivas de monóxido de carbono para utilizarse en la presente invención incluyen, por ejemplo, cantidades que evitan o reducen la hiperplasia íntima después de un procedimiento, por ejemplo angioplastía. Las cantidades efectivas de monóxido de carbono, también incluyen cantidades que evitan o reducen la arterieesclerosis en un paciente, por ejemplo, un paciente con transplante. El término "tratar(tratamiento)" se utiliza en la presente invención para describir el retraso del desencadenamiento de, inhibición o alivio de efectos perjudiciales de una condición, por ejemplo, hiperplasia íntima y/o aterioesclerosis. Para gases, las cantidades efectivas de CO generalmente están dentro del rango de desde aproximadamente 0.0000001% hasta aproximadamente 0.3% por peso, por ejemplo desde 0.0001% hasta aproximadamente 0.25% por peso, preferentemente al menos aproximadamente 0.001%, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.005%, 0.010%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.08%, 0.10%, 0.15%, 0.20%, 0.22% ó 0.24% por peso de CO. Los rangos de CO preferidos incluyen 0.002% hasta aproximadamente 0.24%, desde aproximadamente 0.005% hasta aproximadamente 0.22%, desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.20% y desde aproximadamente 0.02% hasta aproximadamente 0.1% por peso. Para soluciones de CO líquidas, las cantidades efectivas generalmente están dentro del rango de desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 0.0044 g CO/100 g líquido, por ejemplo al menos aproximadamente 0.0001, 0.0002, 0.0004, 0.0006, 0.0008, 0.0010, 0.0013, 0.0014, 0.0015, 0.0016, 0.0018, 0.0020, 0.0021, 0.0022, 0.0024, 0.0026, 0.0028, 0.0030, 0.0032, 0.0035, 0.0037, 0.0040, ó 0.0042 g CO/100 g de solución acuosa. Los rangos preferidos incluyen, por ejemplo, desde aproximadamente 0.0010 hasta aproximadamente 0.0030 g CO/100 g de líquido, desde aproximadamente 0.0015 hasta aproximadamente 0.0026 g CO/100 g de líquido, o desde aproximadamente 0.0018 hasta aproximadamente 0.0024 g CO/100 g de líquido. Un experto en la técnica podrá apreciar que se puedan utilizar las cantidades fuera de estos rangos dependiendo de la aplicación.

El término "paciente" se utiliza a lo largo de la presente especificación para describir un animal, humano o no humano a quien se le proporciona el tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención. En la presente invención se contemplan aplicaciones veterinarias y no veterinarias. El término incluye pero no se limita a, mamíferos, por ejemplo, humanos, otros primates, cerdos, roedores tales como ratones y ratas, conejos, cerdos de guinea, hamsters, vacas, caballos, gatos, perros, ovejas y cabras. El término "transplante", se utiliza a lo largo de la presente especificación como un término general para describir el proceso para transferir un órgano o tejido en un paciente. El término "transplante" se define en la técnica como la transferencia de tejidos o células vivas de un donante a un receptor, con la intención de mantener la integridad funcional del tejido o células transplantadas en el receptor (ver, por ejemplo, The Merck Manual, Berkow, Fletcher, and Beers, Eds. Merck Research Laboratories, Rahway, N.J., 1992). El término incluye todas las categorías de transplantes conocidas en la técnica. Los transplantes se categorizan mediante el sitio y relación genética entre el donante y el receptor. El término incluye, por ejemplo, autotransplante (eliminación y transferencia de células o tejido de un lugar en un paciente al mismo o a otro lugar en el mismo paciente), alotransplante (transplante entre los elementos de la misma especie) y xenotransplante (transplantes entre elementos de diferentes especies). El término "donante" o "paciente donante", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un animal (humano o no humano) del cual se puede obtener un órgano o tejido para los propósitos de transplante a un paciente receptor. El término "receptor" o "paciente receptor" se refiere a un animal (humano o no humano) en el cual se puede transferir un órgano o tejido. Los términos "rechazo de órgano" "rechazo de transplante" y "rechazo" son términos reconocidos en la técnica y se utilizan a lo largo de la presente invención como términos generales para describir el proceso de rechazo de un órgano, tejidos o células en un receptor. Están incluidos dentro de las definiciones, por ejemplo tres patrones principales de rechazo que normalmente son identificados en la práctica clínica: rechazo hiperagudo, rechazo agudo y rechazo crónico (ver por ejemplo, la publicación de Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. Oxford University Press (1994)). El término "órgano(s)", se utiliza a lo largo de i la especificación como un término general para describir cualquier parte o elemento anatómico que tenga una función específica en el animal. Incluidas en forma adicional dentro del significado de éste término, se encuentran partes substanciales de órganos, por ejemplo, tejidos de cohesión obtenidos de un órgano. Tales órganos incluyen pero no se limitan a riñon, hígado, corazón, intestino, por ejemplo, intestino grueso o delgado, páncreas y pulmones. También incluida dentro de esta definición se encuentra la vasculatura, por ejemplo venas y arterias, y huesos. Los individuos considerados en riesgo de desarrollar hiperplasia íntima o asterioesclerosis, se pueden beneficiar particularmente de la presente invención, debido principalmente a que el tratamiento CO profiláctico se pueda administrar antes de un procedimiento que se lleva a cabo en un paciente, o antes de que exista cualquier evidencia de hiperplasia íntima o una placa arterioesclerótica. Los individuos "en riesgo", incluyen, por ejemplo, pacientes que tienen o tendrán cualquier tipo de daño mecánico, químico y/o inmunológico a la íntima, por ejemplo, pacientes que ya hayan pasado o que habrán de pasar por cirugía de transplante y/o angioplastía. Los expertos en la técnica apreciarán que un paciente puede determinarse como en riesgo de hiperplasia íntima o arterioesclerosis, a través de cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante diagnóstico de un especialista. Preparación de Composiciones Gaseosas Una composición de CO puede ser una composición gaseosa. El gas comprimido o presurizado útil, en los métodos de la presente invención, puede obtenerse de cualquier fuente comercial, y en cualquier tipo de recipiente adecuado para almacenar gas comprimido. Por ejemplo, los gases comprimidos o presurizados pueden ser obtenidos de cualquier fuente que suministre gases comprimidos, tales como oxígeno, para uso médico. El término gas "de grado médico", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un gas adecuado para la administración a pacientes como los descritos en la presente invención. El gas presurizado que incluye CO utilizando los métodos de la presente invención, puede ser proporcionado de modo que todos los gases de la composición final deseada (por ejemplo, CO, He, NO, C02, 02, N2) estén en el mismo envase, excepto que NO y 02 no se pueden almacenar juntos. Opcionalmente, los métodos de la presente invención se pueden llevar a cabo utilizando múltiples envases que contengan gases individuales. Por ejemplo, se puede proporcionar un solo envase que contenga monóxido de carbono, con o sin otros gases, cuyos contenidos pueden ser mezclados en forma opcional con los contenidos de otros envases, por ejemplo, envases que contienen oxígeno, nitrógeno, óxido de carbono, aire comprimido, o cualquier otro gas adecuado o mezclas de los mismos. Las composiciones gaseosas administradas a un paciente, de acuerdo con la presente invención, contienen normalmente de 0% hasta aproximadamente 79% por peso de nitrógeno, desde aproximadamente 21% hasta aproximadamente 100% por peso de oxígeno y desde aproximadamente 0.0000001% hasta aproximadamente 0.3% por peso (que corresponde a aproximadamente 1 ppb o 0.001 ppm hasta aproximadamente 3,000 ppm) de CO. Preferentemente, la cantidad de nitrógeno en la composición gaseosa es de aproximadamente 79% por peso, la cantidad de oxígeno es de aproximadamente 21% por peso y la cantidad de CO es de aproximadamente 0.0001% hasta aproximadamente 0.25% por peso. La cantidad de CO es preferentemente al menos aproximadamente 0.001%, por ejemplo, al menos aproximadamente 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.08%, 0.10%, 0.15%, 0.20%, 0.22%, ó 0.24% por peso. Los rangos preferidos de CO incluyen de o.005% hasta aproximadamente 0.24%, desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.22%, desde aproximadamente 0.015% hasta aproximadamente 0.20% y de aproximadamente 0.025% hasta aproximadamente 0.1% por peso. Se debe observar que las composiciones de CO gaseosas que tienen concentraciones de CO mayores a 0.3% (tal como 1% o mayor) pueden utilizarse durante períodos cortos (por ejemplo, una o unas cuantas respiraciones), dependiendo de la aplicación. Se puede utilizar una composición de CO gaseosa para crear una atmósfera que comprenda gas CO. Se puede crear una atmósfera que incluya niveles adecuados de gas CO, por ejemplo, proporcionando un envase que contenga un gas presurizado que comprenda gas CO, y liberando el gas presurizado del envase en una cámara o espacio para formar una atmósfera que incluya el gas CO dentro de la cámara o espacio para formar una atmósfera que incluya el gas CO dentro de la cámara o espacio. Como alternativa, los gases pueden ser liberados en un aparato que culmine en una máscara de respiración o tubo de respiración, creando de este modo una atmósfera que comprenda gas CO en la máscara de respiración o tubo de respiración, asegurando que el paciente sea la única persona en la habitación expuesta a niveles significativos de CO. Los niveles de CO en una atmósfera, pueden ser medidos o monitoreados utilizando cualquier método conocido en la técnica. Tales métodos incluyen detección electroquímica, cromatografía de gas, conteo de radioisótopos, absorción de infrarrojos, colorlmetría y métodos electroquímicos con base en membranas selectivas, (ver por ejemplo, Sunderman y asociados, Clin, Chem, 28: páginas 2026 a 2032, 1982; Ingi y asociados, Neuron 16: páginas 835 a 842, 1996). Se pueden detectar niveles de CO de subpartes por millón mediante por ejemplo, cromatografía de gas y conteo de radioisótopos. Además, en la técnica se conoce que los niveles de CO en un rango de sub-ppm pueden ser medidos en tejido biológico a través de un sensor de gas midinfrarrojo (ver por ejemplo, Morimoto y asociados, Am. J. Physiol. Herat. Circ. Physiol 280: páginas H482-H488, 2001). Los sensores de CO y aparatos de detección de gas están ampliamente disponibles en muchas fuentes comerciales. Preparación de Composiciones Líquidas Una composición farmacéutica que comprende CO, también puede ser una composición líquida. Un líquido puede elaborarse en una composición farmacéutica que comprenda CO, a través de cualquier método conocido en ia técnica para originar que los gases se disuelvan en líquidos. Por ejemplo, el líquido puede ser colocado en un denominado "incubador de C02" y expuesto a un flujo continuo de CO, balanceado preferentemente con dióxido de carbono, hasta que se alcance una concentración de CO deseada en ei líquido. Como otro ejemplo, el gas CO puede ser sometido a "burbujeo" directamente en el líquido, hasta que se alcance la concentración de CO deseada en el líquido. La cantidad de CO que puede ser disuelta en una solución acuosa incrementa con la disminución de la temperatura. Como otro ejemplo, se puede pasar un líquido adecuado a través del entubado que permite la difusión de gas, en donde el entubado corre a través de una atmósfera que comprende CO (por ejemplo, utilizando un aparato tal como un oxigenador de membrana extra corporal). El CO se difumina en el líquido para crear una composición de CO líquida. Es probable que se pretenda que dicha composición líquida sea introducida en una animal vivo el cual tendrá o tiene una temperatura de aproximadamente 37°C al momento en que se introduce en el animal. El líquido puede ser cualquier líquido conocido para los expertos en la técnica como adecuado para administrarse a pacientes, (ver por ejemplo, la publicación de Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds. Oxford University Press (1994)). En general, el líquido estará en una solución acuosa. Los ejemplos de estas soluciones incluye Phosphate Buffered Saline (PBS), Celsior™' Perfadex™, solución Collins, solución de citrato y solución de la University of Wisconsin (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). En una modalidad de la presente invención, el líquido es una solución de Ringer, por ejemplo, solución de Ringer lactada o ÍÍ cualquier líquido que pueda utilizarse infusionado en un paciente. En otra modalidad, el líquido incluye sangre, por ejemplo, sangre de la circulación. Se puede saturar cualquier líquido adecuado hasta obtener una concentración de CO a través de difusores de gas. Como alternativa, se pueden utilizar soluciones elaboradas previamente que tengan calidad controlada para contener niveles ajustados de CO. Se puede lograr un control preciso de la dosis a través de medidas con una membrana permeable a los gases, impermeable a los líquidos conectada a un analizador de CO. Las soluciones pueden ser saturadas hasta obtener concentraciones efectivas deseadas y mantenerse en estos niveles. Tratamiento de Pacientes v Vasculatura con Composiciones de CO. La presente invención contempla la administración de composiciones de CO a pacientes y/o partes de su vasculatura, antes, durante y/o después de que el paciente haya pasado por angioplastía, cirugía de transplante, cirugía vascular o cualquier otro procedimiento que origine/incremente el riesgo de hiperplasia íntima, restenosis y/o arterioesclerosis en el paciente. Un paciente puede ser tratado en forma sistémica con composiciones de CO gaseosas y/o líquidas a través de cualquier método conocido en la técnica para administrar gases y/o líquidos a pacientes, por ejemplo, mediante inhalación del gas y la administración intravenosa o intraarterial del líquido. En el tratamiento sistémico, se puede tratar con CO substancialmente toda la vasculatura del paciente. Una parte de la vasculatura del paciente, por ejemplo, una vena o arteria específica puede ser tratada administrando una composición de CO gaseosa o líquida directamente a la arteria o vena. Aunque la presente invención no se limita a cualquier modo en particular para administrar composiciones de CO a pacientes y/o partes de su vasculatura, a continuación se describen con mayor detalle diversos tratamientos. Administración Sistémica de CO Gaseoso. Las composiciones de CO gaseoso pueden ser administradas en forma sistémica a un paciente, por ejemplo, un paciente que padece de o que está en riesgo de hiperplasia íntima (por ejemplo restenosis y/o arterioesclerósis). Las composiciones de CO gaseoso normalmente se administran mediante inhalación a través de la boca o pasajes nasales hacia los pulmones, en donde el CO se absorbe fácilmente en la corriente sanguínea del paciente. La concentración de compuesto activo (CO) utilizado en la composición gaseosa y terapéutica, dependerá de los rangos de absorción, distribución, inactivación y excreción (generalmente a través de la respiración), del CO, así como de otros factores conocidos para los expertos en la técnica. Quedará entendido en forma adicional que para cualquier sujeto en particular, se deben ajustar con el tiempo los regímenes de dosificación de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional del especialista que administra y supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de concentración establecidos en la presente Invención son únicamente de ejemplo y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada. En la presente invención se contempla la administración aguda, subaguda y crónica de CO. El CO puede administrarse al paciente durante un tiempo, (incluyendo en forma indefinida) suficiente para tratar la condición y ejercer el efecto farmacológico o biológico pretendido. Los siguientes, son ejemplos de algunos métodos y aparatos que pueden ser utilizados para administrar composiciones de CO gaseoso a pacientes.

Ventiladores Se puede comprar CO de grado médico (las concentraciones pueden variar) mezclado con aire o con otro gas que contenga oxígeno en un tanque de gas comprimido estándar (por ejemplo 21% 02, 79% N2). No es reactivo, y las concentraciones que se requieren para los métodos de la presente invención, están debajo del rango de combustible (10% en aire). En una instalación de hospital, el gas se administrará en forma presumible en la parte lateral de la cama en donde se mezclará con oxígeno o aire ambiental en un mezclador hasta obtener una concentración deseada en ppm (partes por millón). El paciente inhalará la mezcla de gas a través de un ventilador, el cual se ajustará a un rango de flujo con base en el confort y necesidad del paciente. Esto se determina mediante gráficas pulmonares (por ejemplo rango respiratorio, volumen tidal, etc). En el sistema de administración de pueden diseñar los mecanismos a prueba de fallas para evitar que el paciente reciba en forma innecesaria más de las cantidades deseadas de monóxido de carbono. Se puede monitorear el nivel de CO del paciente estudiando (1) la carboxihemoglobina (COHb), la cual se puede medir en la sangre venosa y (2) el CO exhalado recolectado de una puerta lateral del ventilador. La exposición a CO se puede ajustar con base en el estado de salud del paciente y sobre la base de los marcadores. Si es necesario, el CO se puede lavar del paciente cambiando a una inhalación de 02 al 100%. El CO no se metaboliza, por lo tanto, siempre que sea inhalado será exhalado finalmente excepto un porcentaje muy pequeño que se convierte a C02. CO también puede ser mezclado con cualquier nivel de 02 para proporcionar la administración terapéutica de CO sin condiciones hipóxicas consecuentes. Máscara y Tensor Facial Se prepara una mezcla de gas que contiene CO tal como se describió anteriormente, para permitir la inhalación pasiva a través del paciente que utiliza una máscara o tensor facial. La concentración inhalada puede cambiarse y enjuagarse, cambiando simplemente a 02 al 100%. El monitoreo de niveles de CO puede ocurrir en o cerca de la máscara o tensor, con un mecanismo a prueba de fallas que podría evitar que se inhale una concentración de CO demasiado alta. Inhalador Portátil Se puede empacar el CO comprimido en un aparato de inhalación portátil e inhalarse en una dosis medida, por ejemplo, para permitir el tratamiento intermitente de un receptor quien no está en una sala de hospital. Se pueden empacar diferentes concentraciones de CO en los contenedores. El aparato puede ser tan simple como un pequeño tanque (por ejemplo, menos 5 kilos) de CO diluido en forma adecuada con una válvula de encendido y apagado y un tubo del cual el paciente toma una inhalación de CO de acuerdo con un régimen estándar o según lo necesite. Pulmón Artificial Intravenoso Para la administración de CO se puede utilizar un pulmón artificial (un aparato de catéter para el intercambio de gas en la sangre) diseñado para la administración de 02 y la eliminación de C02. El catéter, cuando se implanta, reside en una de las venas grandes y podría tener la capacidad de administrar CO en concentraciones deseadas ya sea para la administración sistémica o en el sitio local. La administración puede ser una administración local de una concentración de CO alta durante un período de tiempo corto en el sitio de un procedimiento angioplástico (esta alta concentración podría ser diluida rápidamente en la corriente sanguínea) o una exposición relativamente más prolongada a una concentración Inferior de CO. Los ejemplos de pulmones artificiales se describen, por ejemplo en la Publicación de Hattler y asociados, Artif. Organs 18(11 ):806-812 (1994); y Golob y asociados, ASAIO J., 47(5):432-437 (2001). Tal como se utiliza en la presente Invención, el término "aparato de administración de monóxido de carbono intra-vaso", se refiere a un aparato de catéter, por ejemplo, un pulmón artificial (o versión modificada del mismo) que tiene la capacidad de residir en un vaso sanguíneo durante períodos de tiempo prolongados (incluyendo en forma Indefinida) y administrarse CO al paciente en forma sistémica y/o local. Cámara Normobárica En ciertos casos, podría ser deseable exponer a todo el paciente a CO. El paciente podría estar dentro de una cámara hermética que podría tener flujo de CO en un nivel que no ponga en peligro al paciente, o en un nivel de riesgo aceptable, para no poner en grave riesgo a las demás personas. Al término de la exposición, la cámara podría ser enjuagada con aire (por ejemplo, 21% 02, 79% N2), y las muestras podrían ser analizadas mediante analizadores de CO para asegurar que no permanezca CO antes de permitir que el paciente salga del sistema de exposición.

Administración Sistémica de Composición de CO Líquidas La presente invención contempla además que se pueden crear composiciones de CO líquidas para la administración sistémica a un paciente, por ejemplo, mediante infusión intravenosa o intra-arterial en un paciente. Por ejemplo, se puede infusionar en un paciente composiciones de CO líquidas, tales como Solución de Ringer saturada con CO antes, durante y/o después de un procedimiento angioplástico o de transplante. Como alternativa o en adición, se puede infusionar en el paciente toda la sangre (o una parte) saturada completa o parcialmente con CO. La presente invención también contempla que se pueden utilizar agentes con la capacidad de administrar dosis de gas CO o líquidos (por ejemplo, gomas, cremas, ungüentos o parches de liberación de CO). Administración de CO a Partes de la Vasculatura Tratamiento In situ Como alternativa o en adición al tratamiento sistémico, se pueden aplicar composiciones de monóxido de carbono directamente a cualquier parte de la vasculatura de un paciente que tenga o esté en riesgo de hiperplasia íntima y/o arterioesclerosis. Se puede aplicar una composición gaseosa directamente a una parte de la vasculatura del paciente, por ejemplo, a una arteria afectada, a través de cualquier método conocido en la técnica para administrar gases en la vasculatura del paciente. Por ejemplo, se puede administrar CO a una arteria antes, durante, y/o después de un procedimiento angioplástico (por ejemplo, angioplastía de balón) o quirúrgico (por ejemplo, transplante) a través de un aparato similar al pulmón artificial intravenoso descrito anteriormente. Como otro ejemplo, se puede modificar cualquier aparato utilizado para llevar a cabo un procedimiento angioplástico para administrar CO a la vasculatura de un paciente a través del instrumento, mientras se realiza la angioplastía. Tales aparatos se describirán con mayor detalle más adelante. También se pueden aplicar composiciones de CO líquidas directamente a una parte de la vasculatura de un paciente. Las composiciones de CO líquidas pueden ser administradas a través de cualquier método conocido en la técnica y administrar líquidos a la vasculatura de un paciente. Por ejemplo, se puede administrar una composición de CO líquida a una vena específica (por ejemplo, mediante inyección intravenosa) o arteria (por ejemplo, mediante inyección ¡ntra-arterial) antes, durante, y/o después de un procedimiento. Como otro ejemplo, tal como se describe anteriormente, se puede modificar cualquier instrumento utilizado en procedimientos angíoplásticos para administrar a una vena o arteria una composición de CO líquida mientras se está llevando a cabo un procedimiento angioplástico.

Tratamiento Ex vivo La presente invención contempla además el uso de composiciones de CO para evitar o reducir la hiperplasia íntima y/o arterieesclerosis en una vasculatura transplantada, por ejemplo, vasos sanguíneos individuales (por ejemplo, vena o transplantes de aorta) o vasos sanguíneos que permanezcan asociados con un órgano transplantable (por ejemplo, riñon, hígado, corazón o pulmón). En forma alternativa o en adición a las exposiciones in situ descritas anteriormente, la exposición de la vasculatura a composiciones de CO puede ocurrir ex vivo. Por ejemplo, antes de transplantar en un paciente receptor vasos sanguíneos individuales o un órgano con su vasculatura asociada, la vasculatura puede ser expuesta a una atmósfera que comprenda gas de monóxido de carbono, a una composición de monóxido de carbono líquida, por ejemplo, una perfusión líquida, una solución de almacenamiento o solución de enjuague que tenga monóxido de carbono disuelto en la misma, o ambas. La exposición de la vasculatura a composiciones de CO gaseosas ex vivo, se pueden llevar a cabo en cualquier cámara o área adecuada para crear una atmósfera que incluya niveles adecuados de gas CO. Tales cámaras incluyen, por ejemplo, incubadores y cámaras construidas con el propósito de acomodar un órgano en una solución de conservación. Como otro ejemplo, una cámara adecuada puede ser una cámara en donde únicamente los gases alimentados en la cámara estén presentes en la atmósfera interna, de modo que la concentración de monóxido de carbono pueda ser establecida y mantenida en una concentración y pureza determinadas, por ejemplo, cuando la cámara sea hermética. Por ejemplo, se puede utilizar un incubador de C02 para exponer la vasculatura a una composición de monóxido de carbono, en donde el gas de monóxido de carbono se suministre en un flujo continuo procedente de un envase que contiene el gas. La exposición de la vasculatura a composiciones de CO líquidas ex vivo, se puede llevar a cabo en cualquier cámara o espacio que tenga un volumen suficiente para sumergir la vasculatura, completa o parcialmente en una composición de CO líquida. La vasculatura también puede exponerse a tales composiciones, colocando la misma en cualquier contenedor adecuado, y originando que una composición de CO líquida "enjuague a" o se "enjuague" a través de la vasculatura, de modo que la vasculatura se exponga a un flujo continuo de la composición de CO. Como otro ejemplo, la vasculatura puede ser sumergida en un medio o solución que no incluya CO, y colocada en una cámara de modo que el medio o solución puedan elaborarse en una composición de CO a través de la exposición a una atmósfera que contiene CO, tal como se describe en la presente invención. Aún como otro ejemplo, la vasculatura puede ser sumergida en un líquido que no incluya CO, y el CO puede ser "sometido a burbujeo" en el líquido. Aparatos La presente invención contempla la administración dé CO a la vasculatura de un paciente, utilizando un aparato que tenga la capacidad de ser utilizado tanto para llevar a cabo un procedimiento de angioplastía como para administrar CO a la vasculatura de un paciente. El CO puede administrarse a través de y/o mediante el instrumento, o a través de un recubrimiento de administración de CO en el mismo, mientras que se lleva a cabo la angioplastía (por ejemplo, inmediatamente antes, durante, y/o inmediatamente después de que se lleva a cabo la angioplastía). Tales aparatos incluyen aparatos que se utilizan para angioplastía de balón ("aparatos de angioplastía de balón"), angioplastía láser ("aparatos de angioplastía láser"), y aparatos utilizados para atreroctomía ("aparatos de atreroctomía"), por ejemplo, atreroctomía de extracción; atreroctomía de dirección; atreroctomía de rotación; y stents. Tal como se utiliza en la presente invención, un "aparato de angioplastía" es cualquier - ü ' aparato que pueda utilizarse para llevar a cabo la angioplastía en un paciente. Haciendo referencia a las figuras 14A a 13D, se muestran ejemplos de un aparato de catéter con un elemento inflable (por ejemplo, un balón) diseñado para administrar CO (por ejemplo, composición de CO líquida o gaseosa) a un paciente durante la angioplastía. En la figura 13A, el catéter 1303 se muestra en una posición dentro de una región estenótica 1302 del vaso sanguíneo 1301. El elemento inflable 1304 se muestra en el estado desinflado. El elemento inflable incluye al menos una apertura 1305, a través de la cual se puede administrar CO al vaso sanguíneo durante el procedimiento. El CO puede ser administrado al elemento inflable (por ejemplo, para inflar el elemento inflable) desde un depósito (no mostrado) que contiene CO, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende monóxido de carbono. El aparato puede ser guiado opcionalmente al sitio proyectado a través de un cable guía 1306. En la figura 13B, el catéter 1303 se muestra con el elemento inflable 1304 en un estado inflado. El CO puede ser administrado a través de la apertura(s) 1305 al vaso 1301. En una modalidad, se infla el elemento inflable con CO o una mezcla de gases que incluyen CO, de modo que una cantidad de CO suficiente para tratar la hiperplasia íntima, fluya fuera de la apertura(s) 1305 y se administre al vaso sanguíneo 1301 durante y/o después de inflar el elemento inflable 1304.

La figura 13C, ilustra otra modalidad del aparato de catéter, en donde el catéter 1303 incluye al menos un lumen 1307 para administrar CO al vaso sanguíneo 1301 durante el procedimiento de angioplastía. En la figura 13D, se muestra aún otra modalidad en donde un lumen central 1307 administra CO a una pluralidad de sitios en el vaso sanguíneo 1301. Se puede conectar un depósito que contiene CO (no mostrado) al lumen 1307, de modo que se administre una dosis de CO desde el depósito a través del lumen 1307 hasta el vaso sanguíneo. Como alternativa o en adición, el elemento inflable 1304 puede ser cubierto con un recubrimiento liberación de CO, por ejemplo, un hidrogel que contiene una composición de CO, de modo que el CO se administra a la región estenótica 1302, por ejemplo, al contacto con el elemento inflable 1304. Haciendo referencia a las figuras 14A y 14B, se muestra un ejemplo de un stent diseñado para administrar CO a un paciente. El término "stent" es un término reconocido en la técnica y se refiere a un tubo de malla, normalmente elaborado de alambre, que se utiliza para mantener un vaso sanguíneo en una posición abierta, por ejemplo, un vaso sanguíneo que haya sido remodelado recientemente durante la angioplastía. En la figura 14A, se muestra un stent 1402 en un estado colapsado. El stent cubre un catéter de balón 1404, mostrado en la figura 14A en un estado desinflado. En la figura 14B, el stent 1402 y el catéter de balón 1404 se muestran en un estado expandido/inflado. Al momento de inflar el catéter de balón 1404, se expande el stent 1402, que asegura en su lugar y forma un andamio tal como se muestra en la figura 14B, manteniendo de este modo el vaso sanguíneo en una posición abierta. En una modalidad de la presente invención, el stent 1402 se recubre con un recubrimiento de liberación de CO, por ejemplo, un hidrogel que libera CO, de modo que se administre una cantidad de CO suficiente para tratar la hiperplasia íntima, al vaso sanguíneo durante una cantidad de tiempo adecuada, por ejemplo, la cantidad de tiempo en la que el stent permanezca en su lugar. Haciendo referencia a la figura 5, se muestra un catéter 1502 con dos elementos inflables 1504. Los elementos ¡nflables 1504 pueden ser utilizados para aislar una región estenótica 1506, de modo que se pueda administrar el CO a la región estenótica 1506 entre los elementos inflables 1504. Se inserta el catéter 1502 en el vaso sanguíneo 1508 antes de inflar los elementos inflables 1504. Los elementos inflables 1504 se inflan posteriormente utilizando un tubo de inflado/desinflado 1510 alojado dentro del catéter 1502. Los elementos inflables 1504 cuando se encuentran en su estado inflado, obstruyen el flujo de sangre a la región del vaso sanguíneo que está en tratamiento. Los ductos de entrada 1512 que se encuentran en el extremo de entrada del catéter, permiten que la sangre fluya dentro y a través del catéter 1502 a los ductos de salida 1504 localizados en el extremo distante del catéter. Esto permite que la sangre continúe fluyendo al resto de la arteria 1508 en tanto que se trata el sitio local de la arteria 1506. El CO puede introducirse a la región aislada a través de un tubo de suministro ele administración 1516. Los elementos inflables 1504 inflados, proporcionan un área de tratamiento aislada dentro de la cual se pueden administrar al vaso niveles adecuados de CO. Además, se pueden asegurar sondas de fibra (no mostradas) al estuche del catéter 1502, y el lugar puede ser expuesto a radiación electromagnética a través de las sondas de fibra. El CO puede ser administrado al sitio antes, durante, y/o después del tratamiento del sitio con radiación electromagnética. Haciendo referencia a la figura 16, se muestra un ejemplo de un instrumento con la capacidad de administrar CO a un paciente en tanto se lleva a cabo la atreroctomía. La atreroctomía comprende cortar y eliminar la placa 1602 de las paredes del vaso sanguíneo 1604. El catéter 1606 se coloca dentro de la arteria 1604. Se utiliza una guía flexible 1608 para mover el instrumento a través de la región de tratamiento 1610. Posteriormente se extienden las cuchillas de corte de rotación 1612 más allá del catéter 1606. Las cuchillas de corte de rotación 1612 siguen la guía flexible 1608 y cortan a través de la placa 1602. Las cuchillas de corte 1602 extraen las partículas de placa removidas en y hacia el extremo próximo del catéter 1606. El CO puede ser introducido a la región tratada a través de un tubo de administración 1614 dentro del catéter 1606. Se puede asegurar un tubo de administración 1604 a la guía 1608. El CO puede ser administrado por medio del catéter 1606 a través de al menos un poro 1616 que se encuentra en el extremo distante del tubo de administración 1604. Como alternativa o en adición al suministro de CO a través de ún tubo de administración 1614, se pueden alojar los ductos 1620 y 1622 dentro de las paredes de las cuchillas de corte 1612. Se puede suministrar monóxido de carbono a través de un ducto de salida 1620. Al término del tratamiento en el ducto de entrada 1622, se puede eliminar el CO. El CO puede ser administrado antes, durante, y/o después de la eliminación de las placas. Además de lo anterior, un experto en la técnica apreciará que se puede modificar cualquier aparato conocido en la técnica para llevar a cabo procedimientos de angioplastía para administrar CO a la vasculatura de un paciente durante uso. Los ejemplos de dichos aparatos se pueden encontrar, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,409,716; 5,985,307; 6,508,787; 5,709,875; y 6,450,989. Además, un experto en la técnica reconocerá que cualesquiera de dichos aparatos pueden ser recubiertos con un agente de administración de CO, por ejemplo, un aceite, ungüento o hidrogel, con la capacidad de liberar dosis efectivas de CO, de modo que el CO se administre al vaso sanguíneo al momento del contacto con.fel instrumento/recubrimiento. Uso de Compuesto de Hemoxigenasa-1 y Otros Compuestos En la presente invención también se contempla la inducción o expresión de hemeoxigenasa-1 (HO-1) junto con la administración de monóxido de carbono. La HO-1 puede proporcionarse a un paciente induciendo o expresando HO-1 en el paciente, o administrando HO-1 exógeno directamente al paciente. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inducido" significa que origina una producción incrementada de una proteína, por ejemplo, HO-1, en células aisladas o células de un tejido, órgano o animal utilizando el gen endógeno de las propias células (por ejemplo, no recombinantes) que codifica la proteína. La HO-1 puede inducirse a un paciente a través de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la producción de HO-1 puede ser inducida mediante hemina, mediante protoporfirina de hierro o mediante protoporfirina de cobalto. Una variedad de agentes non-heme incluyendo metales pesados, citocinas, hormonas, óxido nítrico, COCI2, endotoxina e impacto térmico también son fuertes inductores de la expresión de HO-1 (Otterbein y asociados, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1029-L1037, 2000; Choi y asociados, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; y Tenhunen y asociados, J. Lab. Clin. Med. 75:410-421, 1970). La HO-1 también se induce fuertemente a través de una variedad de agentes y condiciones que crean tensión oxidativa, incluyendo peroxidasa de hidrógeno, agentes que disminuyen la glutationa, radiación UV e hiperoxia . (Choi y asociados, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; y Keyse y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:99-103, 1989). Una "composición farmacéutica que comprende un inductor de HO-1" significa una composición farmacéutica que contiene cualquier agente con la capacidad de inducir HO-1 en un paciente, por ejemplo, cualesquiera de los ejemplos descritos anteriormente, por ejemplo, hemina, protoporfirina de hierro y/o protoporfirina de cobalto. La expresión HO-1 en una célula puede incrementarse a través de transferencia genética. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "que expresa(expresado)" significa que origina la producción incrementada de una proteína, por ejemplo, HO-1 ó ferritina, en células aisladas o las células de un tejido, órgano o animal utilizando un gen administrado en forma exógena (por ejemplo, un gen recombinante). La HO-1 o ferritina es preferentemente de la misma especie (por ejemplo, humano, ratón, rata, etc.) que el receptor, con el objeto de minimizar cualquier reacción inmune. La expresión podría conducirse a través de un promotor constitutivo (por ejemplo, promotores de citomegaiovirus) o un promotor específico de tejido (por ejemplo, promotor de suero de leche para células mamarias o promotor de albúmina para células de hígado). Se puede administrar al paciente en forma oral, mediante inhalación, o mediante inyección en un lugar adecuado para el tratamiento de hiperplasia íntima, un vector de terapia genética adecuada (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus asociados con adeno (AAV), pox (por ejemplo, vacuna), virus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus minuto de ratón, virus de hepatitis B, virus de influenza, Virus de Herpes Simplex-1, y virus de lenti) para codificar HO-1 ó ferritina. En forma similar, se pueden administrar vectores de plásmido que codifican HO-1 o una apo-ferritina, por ejemplo, un ADN descubierto, en liposomas o en micropartículas. Además, la proteína HO-1 exógena puede ser administrada directamente al paciente a través de cualquier método conocido en la técnica. Tal como se describió anteriormente, la HO-1 exógena puede ser administrada directamente además de, o como una alternativa a la inducción o expresión de HO-1 en el paciente. La proteína HO-1 puede ser administrada a un paciente, por ejemplo, en liposomas, y/o como una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión-TAT (por ejemplo, ver la Publicación de Becker-Hapak y asociados, Methods 24:247-256, 2001). Como alternativa o adición, cualesquiera de los productos de metabolismo mediante HO-1, por ejemplo, bilirrubina, biliverdina, hierro, y/o ferritina pueden administrarse a un paciente junto con, o en lugar de monóxido de carbono, con el objeto de evitar o tratar hiperplasia íntima. Además, la presente invención contempla que se pueden administrar al paciente moléculas que enlazan a hierro diferentes a ferritina, por ejemplo, desferoxamina (DFO), dextrano de hierro, y/o apoferritina. Además, la presente invención contempla también que se pueden inhibir enzimas (por ejemplo, reductasa de biliverdina) que catalicen el rompimiento de cualesquiera de estos productos para crear/aumentar el efecto deseado. La presente invención contempla que los compuestos que liberan CO en el cuerpo después de la administración del compuesto (por ejemplo, compuestos de liberación de CO), por ejemplo, decacarbonilo de dimanganeso, dímero de tricarbonildiclororutenio (II), y cloruro de metileno (por ejemplo, en una dosis de entre 400 a 600 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 500 mg/kg), también pueden utilizarse en los métodos de la presente invención, como carboxihemoglobina can y substitutos de donación de CO, and.

La administración de cualesquiera de los anteriores, puede suministrarse a un paciente, por ejemplo, mediante administración oral, intravenosa o intra-arterial. Cualesquiera de los compuestos anteriores pueden ser administrados al paciente en forma local y/o sistémica, y en cualquier combinación. La presente invención se ilustra en parte a través de los ejemplos que se encuentran a continuación, los cuales no se tomarán como limitaciones de la presente invención. Ejemplo 1. CO que Suprime Arteriesclerosis, Desarrollo de Hiperplasia íntima v Proliferación de SMC Animales. Se utilizaron ratas macho Brown Norway (250-350 g) (RT1n) como donadores de injerto de aorta y ratas macho Lewis (250-350g) (RT11) como receptores. Se utilizaron ratas Dawiey (400-450g) en el modelo de lesión por balón. Se contaron ratones C57BL/6, C57/S129, p21~'~ y p53" macho adultos en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), se generaron ratones mkk3<'/~) nuil tal como se describe en la Publicación de Lu y asociados (EMBO. 18:1845-1857 (1999)). Los ratones ¡nos''' y enos'1' fueron obtenidos de la Universidad de Pittsburgh. Modelo de transplante de aorta. Se llevó a cabo el transplante de aorta tal como se describe en la Publicación de Shimizu y asociados (Nat Med. 7:738-741 (2001)). En síntesis, se recolectaron de 3 a 4 centímetros de aorta descendiente del donante y se implantaron entre las arterias renales y la bifurcación aórtica del receptor. Se ligaron ambos extremos de la aorta abdominal nativa. Modelo de lesión con balón. Se llevó a cabo a angioplastía de balón tal como se describe en la Publicación de Murakami y asociados (Atherosclerosis 157:361-368 (2001)). En síntesis, se insertó un catéter de embolectomía arterial 2 Fr. (Bacter, Chicago, IL) en la arteria carótida común, y se creó una lesión inflando el balón a 5 atmósferas de presión durante 5 minutos. Las arterias fueron enjuagadas y se ligó la arteria carótida, asegurando el retorno de flujo sanguíneo a través de las arterias carótidas comunes e internas. Se realizó la lesión de la pared del vaso sanguíneo y el análisis patológico subsecuente en una forma oculta para el grupo de tratamiento. Exposición de CO. Se administró CO a animales, tal como se describió en la Publicación de Otterbein y asociados (Nat. Med. 6:422-428 (2000)). Los donantes y receptores de injerto fueron expuestos a CO (250 ppm) durante 2 días antes del transplante y durante 56 días inmediatamente después del transplante. En el modelo de lesión con balón, las ratas ya sea que no recibieron tratamiento previo o fueron expuestas a CO (250 ppm) durante 1 hora antes de la lesión. Después de la cirugía, las ratas fueron alojadas en aire ambiental durante dos semanas.

Células. Se aislaron y cultivaron células de ratón primarias y de músculo liso de ratón (SMC,) tal como se describe en la Publicación de Laubach y asociados (Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 92:10688-9 (1995)). Se obtuvo SMC de ratón aislado de ratones HO-1"'" tal como se describe en la Publicación de Duckers y asociados (Nat. Med. 7:693-698 (2001 )). Tratamiento de células y reactivos. Se disolvieron en DMSO el inhibidor de ciclasa de guanilato 11-1(1 ,2,4)oxadiazol(4,3-a)quinoxalin-1 (ODQ; Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA; 10-100 µ?) e imidazol de piridinilo SB203580 de inhibidor p38 MAPK (Calbiochem; 5-20 µ?). Se disolvieron en agua la sal de sodio 8-bromo-cGMP análoga cGMP (8-Br-cGMP; Sigma-Aldrich, San Luis, MO; 10-100 µ?) y el inhibidor PKG (10-100 µ?; Alexis Biochemicals).

Conteos celulares e incorporación de [3H] timidina. Se aislaron el SMC de rata y ratón y se cultivaron tal como se describe en la Publicación de Peyton y asociados (Blood 99:4443-4448 (2002)). Se llevaron a cabo ensayos de. proliferación tal como se describe en la Publicación de Petkova y asociados (J. Biol. Chem. 276:7932-7936 (2001)). Para los estudios de incorporación de [3H] timidina, las células fueron inhibidas de suero durante la noche y posteriormente estimuladas con 10% de suero que contiene 5 pCi/ml de [3H] timidina (New England Nuclear, Boston MA). Se midió la incorporación de [3H] timidina mediante espectroscopia por centelleo y se presentaron como conteos promedio/min/depósito. Análisis histomorfométrico. Se recolectaron injertos de aorta y arterias carótidas a los 56 y 14 días respectivamente. Los vasos fijados, incrustados y seccionados en serie (5 µ) ¡n toto. Cada tercera platina se tiñó con Hematoxilina y Eosina (H&E) para análisis histomorfométricos. En ambos modelos, se capturaron de una a dos imágenes por platina en una resolución de 1,520 x 1,080 pixeles, a una magnificación de 25X con un microscopio Zeiss (Axioskop, lowa City, lowa), RT color SPOT (Diagnostic Instruments, Inc. Saint Joseph, MI) y Windows NT (Compaq Computer) utilizando el software de Adobe Photoshop versión 5.5. Se calcularon las áreas de 8 a 10 imágenes capturadas, utilizando un software de generación de imagen digital como un número de pixeles que corresponden a dichas áreas. Se analizaron en forma estadística 24 a 48 secciones de cada grupo con el software SPSS versión 10. Inmunotinción y análisis histomorfométrico de población celular. Los injertos fueron recolectados 56 días después del transplante. Se detectaron poblaciones de leucocitos de rata utilizando antígeno común de leucocito anti-rata (LCA, CD45; OX-1) (Serotec, Harían Bioproducts, Indianapolis, IN); CD3 (G4.18), CD4 (OX-35), CD8 (OX-8), macrófago (CD68, ED- ), ICAM-1 (CD54; 1A29), e histocompatibilidad mayor clase II (OX-6), obtenidos todos en Becton Disckinson Biosciencés, (San Diego, CA). Se obtuvo mAb anti-PAI-1 en America Diagnostica (Greenwich, CT). Se capturaron de 8 a 10 imágenes de cada aorta transplantada y se analizaron tal como se describió anteriormente. Extractos celulares y análisis de Manchado Western. Los extractos de proteína celular fueron electroforizados (genes de poliacrilamida del 10 al 12.5%) y se transfirieron en nitrocelulosa (BioRad, Hercules, CA). Las formas totales y fosforiladas de ERK, JNK, y p38 MAPK, así como ATF-2, se detectaron utilizando anticuerpos policlonales de conejo (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA). Se detectó anti-a-actina (Sigma; San Luis, MO). Se detectó p21c,p1 utilizando un anticuerpo policlonal de conejo (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Se detectaron anticuerpos primarios tal como se describe en métodos suplementarios. Análisis estadístico. Se determinó el significado de la diferencia utilizando análisis de varianza (ANOVA). Exposición de óxido nítrico (NO). Se expusieron ratas a 240 ppm a 500 ppm de NO durante 1 hora. Se mezcló el gas NO (1% de N2) con aire en el mismo aparato de exposición que se utilizó en los experimentos de CO. Se monitorearon las concentraciones en la cámara con un analizador NO (Interscan). Después de la exposición, se llevó a cabo la angioplastía de balón, tal como se describió anteriormente. Se expusieron al aire los animales de control. Se ocultaron las acciones de cirugía de la lesión con balón para las ratas que estaban siendo manipuladas. Los análisis de arterias carótidas se llevaron a cabo dos semanas después del procedimiento que se describió anteriormente. Lesión arterial de ratón. La disección fue similar a la descrita en la Publicación de Lindner y asociados (Circ Res. 73:792-796 (1993))., y se llevó a cabo utilizando un cable guía de 0.04572 centímetros (0.018 pulgadas) (Cook, Bloomington, IN), insertado a través de una artreroctomía de carótida externa en la carótida común, girada 360 grados tres veces y eliminada un total de tres veces consecutivas. Inmunoensayos cGMP. Se cuantificaron niveles celulares de cGMP utilizando un EIA (Biomol. Plymouth Meeting, PA). Se incubaron SMC en la presencia o en ausencia de CO (250 ppm) y los Usados celulares fueron analizados con respecto al contenido de cGMP, tal como lo sugiere el vendedor. Conteos Celulares. Las células fueron sembradas a 5 x 103 células/depósito y cultivadas durante la noche en DMEM de glucosa superior que contiene 10% de FCS, penicilina y gentamicina (Life Technologies). Las células fueron inhibidas del suero durante 48 horas adicionales (0% de suero) y cuando se indicó se expusieron a CO (250 ppm para SMC de rata y ratón) antes de la Inducción de la proliferación celular (10% de FCS; Life Technology). Las células fueron contadas diariamente utilizando un hemocitómetro Neubauer. Se evaluó la viabilidad con azul tripano. Adenovirus recombinante. Se obtuvo adenovirus de ß-galactosidasa recombinante en la University of Texas Southwest Medical Center, Dallas, TX. El adenovirus HO-1 recombinante que expresa el cADN HO-1 de rata ha sido descrito en la Publicación de Brouard y asociados (J. Exp. Med. 192:1015-1026 (2000)). Se infectaron SMC de rata con una multiplicidad de infecciones (MOI) de 400 placas que forman unidades por células (PFU/cell), tal como se describe en la Publicación de Brouard y asociados (Id.). Citometría de flujo. Se recolectó SMC de aorta de rata mediante digestión de tripsina (0.025% Tripsina/0.01% EDTA) (Life Technology), se lavaron en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7.2) con 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich Co.), y se incubó con yoduro de propidio (1 pg/ml, 1h, RT). Se evaluó la marcación. -de fluorescencia utilizando un FACsort equipado con Cell Quest Software (Becton Dickinson, Palo Alto, CA). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Análisis histomorfométricos. En el modelo de transplante, se recolectaron injertos 56 días después del transplante. Las aortas fueron fijadas en 10% de formalina, incrustadas en parafina y seccionadas en serie (5 µ) in toto. Se colocaron 10 muestras de cada tres secciones por platina en un total de aproximadamente 24 a 30 platinas. Cada tercera platina se tiñó con hematoxilina y Eosina (H&E) para el análisis histomorfométrico. En el modelo de lesión por balón, los animales fueron eutanizados 14 días después de la lesión y las arterias fueron recolectadas para el análisis morfométrico. Las arterias carótidas de rata fueron perfusionadas y fijadas in situ con PBS y paraformaldehído (2%). Los vasos se fijaron durante 2 horas en paraformaldehído al 2% a una temperatura de 4°C y fueron crioprotegidos en sacarosa al 30% durante la noche a una temperatura de 4°C. Los vasos se congelaron rápidamente en 2-metilbutano y se cortaron en criosecciones de 7 pm. Detección de anticuerpo primario para inmunotinción. Se detectaron anticuerpos primarios utilizando anticuerpos secundarios IgG anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano (Pierce, Rockford, IL, EUA). La peroxidasa fue visualizada utilizando el ensayo Enhanced ChemiLuminescence (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL., EUA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se almacenó en la forma de fotorradiografías (BiomaxTM S, Eastman Kodak, Rochester, NY). Cuando se indicó, las membranas fueron descubiertas (62.5 mM Tris.HCI pH 6.8, 2% SDS y 100 mM ß-mercaptoetanol, 30 minutos, 50°C). El p38 fosforilado fue normalizado para la cantidad total de p38, detectado en la misma membrana. Reactivos misceláneos. Se detectaron iNOS y eNOS de ratón, utilizando anticuerpos policlonales anti-ratón de conejo contra ¡NOS y eNOS (Becton Dickinson, Biosciences, San Diego, CA). CO que suprime el desarrollo de arterieesclerosis asociada con transplante. Las figuras de la 1A a la 11 ilustran que el tratamiento con CO suprime la hiperplasia íntima asociada normalmente con rechazo crónico a injerto. Las figuras de la 1A a la 1F son fotomicrográficas de muestras de diversos injertos de aorta 56 días después del transplante. Para generar estos datos, se transplantaron aortas Brown Norway en ratas Brown Norway (figuras 1A y 1D), ratas Lewis expuestas a aire (figuras 1B y 1E), y ratas Lewis expuestas a CO (250 ppm; figuras 1C y 1F). Las muestras fueron recolectadas 56 días después del transplante y teñidas mediante un tricrorno teñido-masson elástico modificado (elástico; figuras 1A-1C) o mediante hematoxilina y eosina (H&E; figuras 1D-1E). Las tinciones elásticas se magnificaron a 50x (figuras 1A a 1C) y las tinciones H&E se magnificaron a 200x (figuras 1D-1E). Las muestras son representativas de 3 a 6 animales analizados por grupo. Las figuras de la 1G a la 11 son gráficas de barras que ilustran áreas relativas promedio (desviación estándar +.) que corresponden a las regiones íntimas y medias, calculadas de muestras recolectadas de aortas Brown Norway transplantadas en ratas Brown Norway (Syng.; n = 6), ratas Lewis expuestas a aire (Alo.; n = 6) ó CO (250 ppm) (Alo. + CO; n = 3). *P<0.001 versus AIo. + CO. Los segmentos de aorta Brown Norway transplantados en ratas Lewis desarrollaron lesiones aterioescleróticas consistentes con rechazo crónico de injerto (figuras 1B y 1E). Las lesiones aparecieron de los 20 a los 30 días posteriores al transplante, pero fueron significativamente más pronunciadas alrededor de los días 50 a 60; todos los análisis se llevaron a cabo a los 56 días después del transplante. Las lesiones fueron caracterizadas mediante hiperplasia íntima, pérdida de SMC medial y acumulación de leucocitos en la adventicia (figuras 1B y 1E). Estas características se observaron en vasos del receptor, las lesiones no se observaron en injertos singenéicos (figuras 1A y 1D). La hiperplasia íntima se inhibió significativamente (p<0.001) (61.4 +. 2.9% reducción versus control) en aortas transplantadas en receptores expuestos a CO (250 ppm) inmediatamente después del transplante (y durante 56 días posteriores), comparados con aquéllos transplantados en receptores expuestos a aire (figuras 1C, 1F, 1G, 1H, y 11). . Las Figuras 2A a 2C son gráficas de barras que ilustran que el CO suprime la infiltración del injerto mediante leucocitos activados. Para generar los datos en las figuras 2A a 2C, se llevaron a cabo análisis inmunocitoquímicos en injertos 56 días posteriores al transplante. Las aortas de rata Brown Norway fueron transplantadas en ratas Brown Norway (singenéicas), ratas Lewis no tratadas (alogenéicas) o ratas Lewis expuestas a CO (250-1000 ppm). Las muestras fueron recolectadas 56 días posteriores al transplante. La figura 2A ¡lustra el número promedio (desviación estándar +. (n = 3-6)) de núcleos en la adventicia de aortas Brown Norway transplantadas en receptores Brown Norway (Singenéicos), receptores Lewis no tratados (alogenéicos), y receptores Lewis expuestos a diversas concentraciones de CO (CO 250 ppm, CO 500 ppm, y CO 750-1000 ppm) (* = P<0.001 versus Alo.). La figura 2B ilustra el número promedio (desviación estándar + (n = 6)) de células CD45 (*P<0.002 versus Alo.), CD68 (M0/ED1; * P<0.001 versus Alo.), MHC II, y CD45 (ICAM-1) (* P<0.001 versus Alo.) en la adventicia de aortas de rata Brown Norway transplantadas en receptores de rata Brown Norway (Sing.), receptores de rata Lewis no tratados (Alo.), y receptores de rata Lewis expuestas a CO (Alo. + CO). La Figura 2C ilustra el número promedio (desviación estándar +. (n = 6)) de células positivas CD3, CD4, y CD8 (* P < 0.02, 0.001, 0.096, respectivamente versus Alo.) en la adventicia de aortas Brown Norway transplantadas en receptores Brown Norway (Syng.), receptores Lewis no tratados (Alo.), y receptores Lewis expuestos a CO (CO 250 ppm). La acumulación de leucocitos en la adventicia de aortas transplantadas se midió en receptores expuestos a CO (ver figuras 2A a 2C). No se observó acumulación de leucocitos en injertos singenéicos. La habilidad del CO para suprimir la infiltración de injerto mediante leucocitos activados (CD45 + ) fue dependiente de la dosis con niveles en incremento de CO (250-1000 ppm) que dan como resultado una infiltración de leucocitos disminuida; se observó un efecto máximo de 700 a 1000 ppm de CO (52 +_ 20% de inhibición versus controles tratados con aire figura 2A). El CO suprimió en forma significativa la acumulación de monocito/macrófagos CD45+/CD68+ (M0) (65 + 24% de inhibición versus controles tratados con aire) así como células CD45+/CD3+ T (57 + 22% de inhibición versus controles tratados con aire), incluyendo células tanto CD4+ ("auxiliar") como CD8+ ("citotóxicas") (figura 2C). El CO también inhibió la expresión de genes pro-inflamatorios asociados con activación de M0 incluyendo antígenos de histocompatibilidad mayor clase II (MHC II) y la molécula de adhesión intracelular 1 (CD54/ICAM-1 ) (figura 2B). El CO suprime el desarrollo de hiperplasia íntima después de lesión mediante balón. Las figuras 3A-3G ilustran que el CO suprime el desarrollo de lesiones vasculares asociadas con lesión con balón. Las figuras 3A a 3D son fotomicrográficas (magnificación 10x) de arterias carótidas teñidas en forma inmunocitoquímica analizadas 14 días después de angioplastía de balón. Para generar los datos de las figuras 3A a 3D, se expusieron las ratas a aire ambiental (figuras 3A y 3C) o a CO (1 hora; 250 ppm; figuras 3B y 3D) antes de la lesión con balón. Todos los animales fueron expuestos a aire ambiental después de la lesión con balón. Dos semanas después de la lesión con balón, se tiñeron muestras con hemotoxilina y eosina (H&E). Se muestran, muestras de ratas tratadas previamente con aire ambiental (figuras 3A y 3C) y CO (figuras 3B y 3D). Las figuras 3E, 3F, y 3G son gráficas de barras que ilustran las áreas relativas promedio (+. desviación estándar (n = 8; * P<0.001 versus control)) de las regiones íntima y media de muestras analizadas en las figuras 3A-3D. Las arterias carótidas de rata desarrollaron hiperpiasia íntima 15 días después de la lesión con balón (figuras 3A y 3C; y figuras 3E y 3G). La hiperpiasia íntima en ratas expuestas a CO (250 ppm) durante una hora antes de la lesión con balón (después de lo cual se interrumpió la exposición de CO) fue suprimida mediante 74 +. 8% comparado con animales de control expuestos a aire (n = 8-10; p<0.001) (figuras 3B y 3D, y figuras 3E-3G).

El O suprime la proliferación de SMC Las figuras 4A-4F ilustran que el CO bloquea la proliferación de SMC y que p21Cip1 está involucrado en el efecto antiproliferativo de CO in vitro. La figura 4A, es una gráfica de líneas que ilustra la proliferación de SMC de rata que no fue transducido (o; Medio), o transducido con Lac.Z (?; LacZ Rec. Ad.) ó HO-1 (·; HO-1 rec. Ad.) adenovirus recombinante. Los resultados muestran que es una desviación promedio +_ estándar de n = 3 depósitos por grupo (* P<0.001 versus LacZ y no transducidos). La figura 4B es una gráfica de líneas que ilustra la proliferación de crecimiento SMC de rata en la presencia o en ausencia de CO (·; 1000 ppm). Los resultados muestran una desviación promedio +_ estándar (n = 3 depósitos por grupo; P<0.001 versus aire.D). La figura 4C ilustra una gráfica de barras que ilustra la proliferación de SMC aislado de ratones tipo natural (WT) o con deficiencia de HO-1 (ho-1~'~) en la presencia y ausencia de CO (250 ppm) (n = 6 depósitos/grupo; # P <0.006 versus aire, * P<0.001). La figura 4D es un manchado Western que ¡lustra la expresión de proteína p21 y ß-actina en SMC de ratón después de la exposición a CO (250 ppm). La figura 4E es una gráfica de barras que ¡lustra la proliferación de SMC de ratón aislado de ratones tipo natural (wt), y con deficiencia de p21Clf> p21'f') ó p53 (p53";"). Las barras grises indican las células expuestas al aire ambiental y las barras negras indican células expuestas a CO (250 ppm). Los resultados mostrados son la desviación promedio + estándar (n = 3 * P<0.001 versus aire) en uno de seis experimentos independientes. La figura 4F es una gráfica de barras que ilustra que la expresión endógena de p21Cip juega un papel importante en el control del grado de hiperplasia íntima después de la lesión arterial en ratones. Se expusieron ratones tipo natural (C57/B16/S129) ó p21-/- a aire ambiental o CO (1 hora; 250 ppm) antes de la lesión de la arteria carótida y se expusieron posteriormente a aire ambiental. Las muestras fueron recolectadas y analizadas dos semanas después de la lesión. La desviación promedio +. estándar (n = 4) de la proporción entre el área relativa del área relativa se expresa en unidades arbitrarias (* P<0.001 versus aire). Las figuras 7A-7B ¡lustran en forma adicional que el CO bloquea la proliferación de SMC. La figura 7A es un análisis de ciclo celular de un SMC de aorta de rata en incubación estándar (Aire) versus CO (250 ppm) después de 24 horas de tratamiento. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes La figura 7B es una gráfica de líneas que ilustra la proliferación de SMC en la presencia (¦; CO 250 ppm) o ausencia (?; aire) de CO durante 6 días. El SMC fue suero estimulado al tercer día del experimento. La proliferación incrementó en SMC tratado con CO después de que se interrumpió la exposición a CO en el día 6. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes, llevado cada uno por triplicado (* P<0.01 versus aire). La figura 8, es una gráfica de barras que ilustra que el CO bloquea la proliferación de SMC de ratones tipo natural (wt) y p53"y~ pero no de ratones p21"'". La figura presenta los resultados de un ensayo de incorporación [3H]timidina utilizado para evaluar la proliferación celular (conteos por minuto; cpm) en SMCs de ratón tipo natural (wt), p21_ ", y p53' expuestos a aire (barras grises) o a CO (250 ppm; barras negras) durante 24 horas. Los resultados mostrados son la desviación promedio ¿estándar (n = 3; *P<0.05 versus aire). Las figuras 9A-9G ilustran que el CO suprime él desarrollo de lesiones vasculares asociadas con lesión por cable en ratones tipo natural (C57/B16/S129) y p21-/-. Las figuras 9A-9D son fotomicrográficas (magnificación de 20x) de arterias carótidas teñidas en forma inmunocitoquímica 14 días después de la reacción con cables. Los ratones fueron expuestos a aire ambiental (figuras 9A y 9C) o a CO (1 hora; 250 ppm; figuras 9B y 9D) antes de la lesión con cables. Todos los animales fueron expuestos a aire ambiental después de la lesión. Dos semanas después de la lesión con cables, las muestras fueron teñidas con hemotoxina y eosina (H&E). Se muestran, muestras de ratones tipo natural (figuras 9A y 9B) y p21-/- (figuras 9C y 9D). Las figuras 9E, 9F, y 9G son gráficas de barras que ¡lustran las áreas relativas promedio (desviación estándar + (n=4 * P<0.001 versus control)) que corresponden a las regiones íntima y media, así como a las proporciones íntima: media, procedentes de fotomicrográficas mostradas en las figuras 9A-9D. El CO suprime la proliferación SMC in vitro Se utilizó un sistema in vitro para evaluar el crecimiento SMC en la presencia o ausencia de CO, para delinear el mecanismo a través del cual el CO inhibió la hiperplasia íntima. El SMC inhibido de suero proliferó al momento de la nueva adición de suero al medio de cultivo (figura 7B), el SMC de control no expuesto a suero exhibió una mínima proliferación durante 5 días de experimento. La expresión de un adenovirus recombinante HO-1 o la exposición a CO suprime la proliferación de SMC (figuras 4A y 4B). En un sistema similar, la "depuración" de CO mediante hemoglobina suprimió el efecto anti-proliferativo de HO-1, lo que sugiere que CO generado mediante HO-1 cuenta probablemente para el efecto antiproliferativo de HO-1. El análisis del ciclo celular reveló que el SMC tratado con CO se acumuló en la fase G0/G1 (figura 7A). El SMC de ratones que careció de HO-1 (ho-V'') se proliferó en forma significativamente más rápida cuando se expuso a suero, que cuando lo hizo al SMC procedente de ratones naturales (figura 4C), lo que indica que la expresión HO-1 endógena en SMC expuesta a suero, suprimió la proliferación de células de músculo liso. El CO inhibió en forma significativa la proliferación de SMC de ratones ho-1' ', lo que sugiere que el CO toma en cuenta en gran medida la acción antiproliferativa de HO-1. La inhibición de proliferación SMC, no se asoció con la muerte celular tal como se evaluó mediante análisis de exclusión de azul tripano y yoduro de propidio. Los efectos antiproliferativos de CO fueron reversibles, conforme la finalización de exposición a CO permitió que el SMC comenzara a proliferarse nuevamente (figura 7B). El efecto anti-proliferativo ¡n vitro de CO depende de P21Cip1. El SMC expuesto a CO activó la expresión de proteína p21Cip1 (figura 4D), en forma similar al SMC que sobre-expresó HO-1. Este efecto fue transitorio ya que la expresión de p21Cip que incrementó significativamente durante 4 horas, fue mínima a las 16 horas y regresó a niveles básales a las 24 horas después de la exposición a CO (figura 4D). La proliferación de SMC de ratones con deficiencia de p21Cip1 (p21~/m) no fue suprimida mediante CO (figura 4E), lo que indica que se requiere la expresión de p21Cip1 para el efecto antiproliferativo de CO. A pesar del papel establecido de p53 en la regulación de la expresión de p21Cip1, CO indujo a la expresión de p21Cip1 e inhibió la proliferación de SMC derivado de p53"'" o de ratones tipo natural hasta un grado similar (figura 4E y figura 8). Por lo tanto, el efecto antiproliferativo de CO in vitro depende de la expresión de p21Cip1, la cual no involucra p53. Involucramiento de p21Cip1 en el efecto anti-proliferativo in vivo de CO Se expresó p21Cip1 después de la lesión de la pared vascular, funcionando de igual manera para regular la proliferación de SMC del desarrollo de hiperplasia íntima. Se investigó el papel de la expresión de p21Cip endógeno en el desarrollo de hiperplasia íntima después de la lesión arterial en ratones. La hiperplasia íntima fue tres veces más pronunciada en ratones p21~f~ tratados con aire que en ratones tipo natural (n=4; 314 + 41.8%, p<0.001), lo que muestra que la expresión endógena de p21Cip1 juega un papel importante en el control del grado de hiperplasia íntima después de lesión arterial en ratones (figura 4F). En contraste, una hora de tratamiento previo de CO (250 ppm) suprimió la hiperplasia íntima tanto en ratones tipo natural (C57/S129) como en ?2G? (C57/S129) en un 80.9 + 7.2% (n=4, p<0.001) y 86.2 + 14% (n=4, p<0.001), respectivamente, versus controles tratados con aire (figura 4F; figuras 9A-9G). Por lo tanto, en este modelo de ratón in vivo, el CO suprime la hiperplasia íntima a través de un mecanismo que no depende de la expresión de p21Cip . El efecto antiproliferativo de CO requiere la activación de ciclasa de guanilato y la generación de cGMP y se ejerce a través de la activación de p38 MAPK. Las figuras 5A a 5G ilustran que el CO bloquea la proliferación del SMC a través de la generación de cGMP y la activación de p38 MAPK. La figura 5A es una gráfica de barras que ilustra el contenido cGMP promedio (desviación estándar +_ (n = 3)) en SMC de ratón expuesto a aire o a CO (250 ppm durante 8 ó 16 horas). La figura 5B es una gráfica de barras que ilustra los resultados de un ensayo de incorporación de [3H]timidina utilizado para evaluar la proliferación celular (conteos por minuto; cpm) en SMC de ratón expuesto a CO (250 ppm) en la presencia o ausencia del inhibidor de ciciasa de guanilato ODQ. Los resultados mostrados son la desviación promedio + estándar (n = 3; * P<0.05 versus aire y CO/ODQ). La figura 5C es una ilustración de un manchado Western de SMC de ratón p21Cip1 expuesto a 8Br-cGMP análogo de cGMP. Las membranas fueron probadas subsecuentemente para ß-actina para asegurar una carga igual. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. La figura 5D es una gráfica de barras que ilustra la incorporación de [3H]timidina de SMC aislado de ratones tipo natural (wt) con deficiencia de p21Cip1 (?21" ') en la presencia y ausencia del 8Br-cGMP análogo de cGMP. Los resultados mostrados son la desviación promedio +. estándar (n=4; * P<0.05 versus aire y 8BrcGMP). La figura 5E es una ilustración compuesta de un manchado Western de p38 MAPK fosforilado (p-p38), ATF-2 (p-ATF-2), JNK (p-JNK) y ERK (p-ERK) de SMC expuesto a CO (250 ppm). Las membranas fueron probadas en forma subsecuente con un anticuerpo contra p38 MAPK, ATF-2, JNK y ERK total para asegurar una carga igual. Los manchados son representativos de 6 experimentos independientes. La figura 5F es una gráfica de barras que ilustra la incorporación de [3H]timidina en SMC de ratón expuesto a CO (250 ppm) en la presencia o ausencia de SB203580 inhibidor de p38 MAPK. Los resultados mostrados son la desviación promedio +. estándar de 4 experimentos independientes (p<0.005; versus aire y células tratadas con CO/SB). La figura 5G es una ilustración compuesta de un manchado Western de p21cip1 de SMC de ratón expuesto a CO (250 ppm) en la presencia y ausencia de SB203580 inhibidor p38 MAPK ó DMSO, utilizado como vehículo. La misma membrana fue probada con un anticuerpo contra ß-actina para asegurar una carga igual. Los resultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes. Las figuras 6A-6B ilustran que el CO activa p38 MAPK a través de un mecanismo que requiere la generación de cGMP. La figura 6A es una ilustración compuesta de un manchado Western de p38 MAPK fosforilado procedente de SMC de ratón expuesto al 8BrcGMP análogo de cGMP. Las membranas se probaron subsecuentemente con un anticuerpo contra p38 total para asegurar una carga igual. El manchado compuesto mostrado en la figura 6A, es representativo de 3 experimentos independientes. La figura 6B, es una gráfica de barras que ilustra la incorporación de [3H]timidina en SMC de ratón expuesto a CO (250 ppm) en la presencia o ausencia del 8-BrcGMP análogo de cGMP. Los resultados mostrados en la desviación promedio +_ estándar de 4 experimentos independientes. La figura 10 es una gráfica de barras que ilustra que el CO no suprime a proliferación en SMC de ratones p27~A. La gráfica de barras presenta los resultados de un ensayo de incorporación de [3H]timidina para evaluar la incorporación celular (conteos por minuto; cpm) en SMC derivado de ratones p21~ ~ tratados con CO (250 ppm) en la presencia o ausencia del SB203580 inhibidor en p38 MAPK (SB). La exposición de SMC a CO, incrementó los niveles de cGMP (figura 5A). La capacidad de CO para suprimir la proliferación de SMC y para activar la expresión de p21Cip1 se dañó bajo la inhibición de la actividad de ciclasa de guanilato mediantel H(1 ,2,4) oxadiazoI(4,3-a)quinoxalin-1 - (ODQ) (figura 5B). La sal de sodio de monofosfato 3'-5'-cíclica de 8-bromoguanosina análoga cGMP no degradable (8-Br-cGMP), suprimió la proliferación de SMC (figura 5D) e incrementó la expresión de p21Cip1 en comparación con CO (figura 5C). La supresión de la proliferación mediante 8-Br-cGMP fue dañada en SMC derivados de ratones p21' ' (figura 5D). Por lo tanto parece que el efecto antiproliferativo de CO se transmite a través de la activación de ciclasa de guanilato, la acumulación de cG P y la expresión/activación de p21Cip1. La activación de cinasas dependientes de cGMP (PKG y ß) parece necesitarse para que CO suprima la proliferación de SMC ya que un inhibidor de PKG eliminó el efecto antiproliferativo de CO. Se investigó si el efecto antiproliferativo de CO en SMC, involucró la activación de la trayectoria de transducción de señal p38 MAPK. El CO activó el MAPK p 38 en SMC (figura 5E) como lo hizo en células endoteliales y monocitos/macrófagos. La fosforilación/activación de p38 MAPK alcanzó su pico 4 horas después de la exposición a CO y regresó a niveles básales posteriormente (figura 5E). La exposición de SMC a CO también estuvo asociada con la activación de ATF-2, un factor de transcripción activado en forma más frecuente a través de la trayectoria de transducción de señal p38 MAPK (figura 5E). La inhibición de la activación de p38 MAPK mediante SB203580 de imidazol de piridinilo, un inhibidor selectivo de las isoformas p38 y ß, bloqueó la capacidad de CO para activar la expresión de p21cip (figura 5G) y suprimió el efecto antiproliferativo de CO (figura 5F). Además, el CO no inhibió la proliferación en células aisladas de ratones con deficiencia de cinasa 3 de cinasa de proteína activada por mitogén {mkks '), la cinasa de corriente ascendente que activa p38a y ?38ß. SB203580 no moduló los efectos de CO en la proliferación de SMC procedentes de ratones p21~'~ (figura 10). Estos datos indican que es importante la activación de p38 MAPK para la activación de p21Cip y la inhibición de la proliferación de SMC mediante CO. El CO no moduló la activación de cinasas moduladas extra-celular 1 y 2 (ERK-1 y -2) (figura 5E), lo que indica que esta trayectoria de transmisión de señal se involucró en el efecto antiproliferativo de CO. El CO indujo la activación de cinasas activadas por jun 1 y 2 (JNK-1 y -2) (figura 5E). Debido a que CO induce la generación de cGMP (figura 5A) y la activación de p38 MAPK en SMC, se investigó la inter-relación entre estas dos trayectorias de transduccion de señal. Se eliminó la activación de p38 MAPK mediante CO, cuando se bloqueó la generación de cGMP mediante ODQ. La exposición de SMC a p38 MAPK activado por 8-bromo-cGMP (figura 6A) y el efecto antiproliferativo de 8Br-cGMP se eliminó en presencia de SB203580 (figura 6B). En forma consistente con estos descubrimientos, se suprimió la capacidad de 8Br-cGMP para activar la expresión de p21Cip mediante SB203580. El efecto antiproliferativo de CO no requiere la expresión de sintasas de óxido nítrico. Las figuras 11A y 11B ilustran que NO no está involucrado con el efecto antiproliferativo de CO. La figura 11A es una gráfica de barras que ilustra la incorporación de [3H]timidina en SMC de ratón aislado de ratones tipo natural (wt) y con deficiencia de enos"7" e /nos"7" en la presencia y ausencia de CO (250 ppm). Los resultados mostrados son la desviación promedio + estándar (n = 6-8, * P<0.001 versus wt). La figura 11B es una gráfica de barras que ilustra las áreas íntimas y medias promedio de arterias carótidas procedentes de ratas Sprague-Dowley expuestas a aire ambiental (barras blancas) ó NO (barras negras; 1 hora; 250 ppm) antes de la lesión con balón de la arteria carótida. Todos los animales fueron expuestos a aire ambiental después de la lesión. En dos semanas posteriores a la lesión, se eliminaron las arterias carótidas, se seccionaron y tiñeron con hematoxilina y eusina (H&E). Se calcularon las áreas que corresponden a las regiones íntimas y medias. Los resultados son la desviación promedio +_ estándar de 40 secciones representativas tomadas de 3 ratas por grupo de tratamiento.

El SMC expuesto a CO (250 ó 10,000 ppm) durante diversas cantidades de tiempo, no mostró inducción de cualquier isoforma NOS mediante manchado Western. El SMC de ratón con eficiencia de la isoforma constitutiva/endotelial de sintasa de óxido nítrico (eNOS/NOS-3; nos-3''') o la isoforma inducible (¡NOS/NOS-2; nos-2'''J mostró una captación de timidina significativamente mayor, cuando se expuso a suero en comparación con SMC derivado de ratones tipo natural (figura 11 A). La exposición a CO inhibe en forma significativa la proliferación de SMC derivado de ratones tipo natural, nos-2~'~ ó nos-3~'~ (inhibición de 51+_12.9% y 51+_25% y 54 + 11%, respectivamente; p<0.001 versus controles tratados con aire) (figura 11A). Estos datos indican que el efecto antiproliferativo de CO puede ocurrir en ausencia de ¡NOS ó eNOS. En forma similar, bajo condiciones similares a las que se utilizaron para CO (250 ppm; una hora de tratamiento previo) NO, no moduló el engrosamiento de la túnica íntima disparado por la lesión de balón. El NO administrado a 500 ppm fue letal. El CO no inhibió la expresión del Inhibidor de activador de plasminogén tipo I (PAI-1) en SMC. Las figuras 12A, 12B, y 12C ilustran que CO incrementa los niveles de expresión de proteína PAI-1. La figura 12A, es una ilustración compuesta de un análisis de manchado Western para PAI-1 en SMC tratado con y sin CO (250 ppm) durante 24 ó 48 horas. Los Usados celulares completos procedentes de homogenados de hígado de rata tratados con y sin endotoxina (LPS) fueron utilizados como controles. Se utilizó -actina para ensayar la carga de proteína. La figura 12B es una ilustración compuesta de un análisis de manchado Western de PAI-1 en aortas no transplantadas (control), transplantadas (Alo.+Aire), y transplantadas tratadas con CO (AIo.+ CO) después e 56 días. La figura 12C es un gel de poliacrilamida teñido con azul Commassie utilizado para crear el manchado Western de la figura 12B e ilustra que se carga la misma cantidad de proteína en cada columna. El CO suprime la expresión de PAI-1 en M0, la cual es la clave para el efecto protector de CO en la prevención de lesión de reperfusión por isquemia de pulmón en ratones. La exposición de SMC a suero no altera la expresión de PAI-1 mediante manchado Western (figura 12A). El tratamiento de CO incrementó ligeramente la proteína de PAI-1, ¡o que sugiere que el efecto antiproliferativo de CO no involucra la desactivación de PAI-1. En forma similar, la expresión de la proteína PAI-1 en aortas alogenéicas transplantadas bajo tratamiento de CO, fue similar a la de aortas alogenéicas transplantadas en ausencia de CO tal como se probó mediante inmunohistología y manchado Western (figura 12B). Esto sugiere que la capacidad de CO para modular la lesión vascular asociada con rechazo de injerto crónico, puede no estar ligada directamente a la expresión de PAI-1. El CO se genera en forma fisiológica en la mayor parte de tipos celulares a través del catabolismo de heme mediante enzimas de la familia de oxigenasa heme. La expresión de la enzima inducible, HO-1, es una respuesta protectora a la lesión que limita los efectos perjudiciales asociados con reacciones inflamatorias. Los efectos protectores de HO-1 son de rango amplio, e incluyen la inhibición del desarrollo de aterogenesis e hiperplasia íntima, y en muchos casos pueden ser mimetizados mediante CO. Los estudios de la presente invención demuestran que CO posee propiedades vasoprotectoras directas. La exposición continua a una baja concentración de CO (250 ppm), suprime el desarrollo de hiperplasia íntima e infiltración de injerto mediante leucocitos activados (figuras 1A-1I y 2A-2C), asociados con arterieesclerosis de transplante (figuras 1A-11). La exposición a CO (250 ppm) durante solo una hora antes de la lesión, suprime la hiperplasia íntima asociada con lesión de angioplastía de arteria carótida en ratas (figuras 3A-3G). La relevancia fisiológica del efecto antiproliferativo é'e HO-1 en SMC, descrito originalmente en células epiteliales pulmonares, está soportada por la observación de que SMC procedente de ratones con deficiencia de HO-1 prolifera más rápido in vitro e in vivo que el SMC tipo natural. Los datos de la presente invención demuestran que el CO suprime la proliferación de SMC en una forma similar a HO-1. La generación de cGMP y la expresión de p21Cip1 son esenciales para los efectos de CO, y están inter-relacionados. La capacidad de CO para activar la expresión p21Cip1 y suprimir la proliferación de SMC, depende de la activación de ciclasa de guanilato (figuras 5A-5G). CO activa p21Cip1 (figuras 4A-4F) y el efecto antiproliferativo de CO depende de la expresión de p21Cip ya que este efecto se eliminó en SMC p21Cip1 (figuras 6A-6B). La capacidad de 8-Br-cGMP para suprimir la proliferación de SMC, fue dañada en SMC derivado de ratones con deficiencia de p21Cip (figuras 5A-5G), lo que sugiere que cGMP suprime la proliferación SMC in vitro a través de la activación de p21c,p'i. La contribución individual de cGMP y P38 MAPK para los efectos de CO parece ser el tipo celular específico. Los datos de la presente invención demuestran que el efecto antiproliferativo de CO en SMC depende de ambas trayectorias de transducción de señal (figuras 5A-5G). El CO requiere de cGMP para la activación de p38 MAPK, la cual es necesaria para que CO active p21c,p1 y suprima la proliferación de cGMP. Esto sugiere que CO, al igual que NO, activa p38 MAPK a través de cGMP y la activación de cGMP dependiente de cinasas de proteína, es consistente con la observación de que la inhibición de PKG a y/o ß, suprime el efecto antiproliferativo de CO. Los datos e la presente invención sugieren que el efecto antiproliferativo de CO es distinto y puede actuar en forma independiente a NO. Se debe observar que el enlace entre cGMP, p38 MAPK y p21Cip1 no ha sido reportado en células expuestas a HO-1 o CO. SMC expresa p21Cip al momento de la lesión vascular y la expresión p21Cip1 transmitida por adenovirus recombinante SMC suprime la hiperplasia intima seguida de lesión vascular. Los datos de la presente invención muestran que la expresión fisiológica de p21Clp1 está involucrada en hiperplasia intima: después de lesión arterial, hiperplasia intima en ratones p21" 1~ es tres veces mayor a los controles tipo natural (figura 4F), lo que soporta fuertemente la noción de que la inducción de CO de la expresión p21Cip1 en SMC (figura 5D) contribuye a suprimir la hiperplasia intima seguida de la lesión vascular. Se utilizaron ratones p21'1' para evaluar el papel de la expresión p21Cip1 en la capacidad de CO para suprimir la hiperplasia intima seguida de lesión arterial, ratones p21'1". Una hora de tratamiento previo con CO fue suficiente para suprimir por más del 80% el desarrollo de hiperplasia intima en ratones p21"1' o ratones tipo natural, en comparación con sus controles tratados con aires respectivos (figura 4F). Una interpretación de estos datos, es que la capacidad de CO para suprimir la proliferación neointima in vivo, actúa en forma independiente a p21Cip1 en SMC. En ratones, en contraste con ratas, existe un proceso inflamatorio/trombótico significativo que conduce presumiblemente a la proliferación intima. Debido a los potentes efectos anti-inflamatorios de CO, parece que es posible que CO suprima la hiperplasia intima en ratones inhibiendo la inflamación, un proceso que es casi independiente de p21Cip1.

Debido a la supresión conocida de PAI-1 mediante CO en monocitos-macrófagos y a la importancia de PAI-1 en la patogénesis de hiperplasia intima después de lesión vascular en algunos estudios, se investigó si ocurre una supresión similar de PAI-1 en el sistema de la presente invención. No se observó disminución en el nivel de la expresión de la proteína PAI-1 a los 56 días posteriores al transplante (figura 12B). Ejemplo 2. Protocolos para el Tratamiento de Pacientes Durante Angioplastia y Procedimientos de Transplante.

Los siguientes ejemplos, ilustran los protocolos para tratar pacientes durante procedimientos de angioplastia y para tratar a un donante, órgano y/o receptor con monóxido de carbono durante un procedimiento de transplante. Cualquiera de uno o más de los siguientes procedimientos pueden utilizarse en un procedimiento de transplante determinado. Angioplastia. Se puede administrar CO en forma sistémica o local a un paciente antes de, durante y/o después de que se lleva a cabo un procedimiento de angioplastia en el paciente. El tratamiento puede administrarse en dosis que varían de 10 ppm a 1000 ppm (por ejemplo, desde aproximadamente 100 ppm hasta aproximadamente 800 ppm, desde aproximadamente 150 ppm hasta aproximadamente 600 ppm (por ejemplo, aproximadamente 150 ppm), o desde aproximadamente 200 ppm hasta aproximadamente 500 ppm) (por ejemplo, desde aproximadamente 250 ppm o aproximadamente 500 ppm)). Por ejemplo, el CO puede administrarse al paciente, en forma intermitente o continua, comenzando de los 0 a 20 días antes de que se lleve a cabo el procedimiento, por ejemplo, iniciando al menos aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 5, 7, ó 10 horas, o aproximadamente 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, ó 20 días, o más de 20 días antes del procedimiento. Como en alternativa o en adición, el CO puede ser administrado al paciente durante el procedimiento, por ejemplo, a través de un instrumento utilizado para llevar a cabo la angioplastia y/o mediante inhalación. Como alternativa o en adición, el CO puede ser administrado al paciente después del procedimiento, por ejemplo, iniciando inmediatamente después del termino del procedimiento, y continuando durante aproximadamente 1, 2, 3, 5, 7, ó 10 horas, o aproximadamente 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50, ó 60 días, o en forma indefinida, después del termino del procedimiento.

Transplante Tratamiento de un Donante. Antes de recolectar un órgano o tejido, el donante debe ser tratado con monóxido de carbono inalado (250 ppm) durante una hora. El tratamiento puede administrarse en dosis que varían de 10 ppm a 1000 ppm durante tiempos que varían de una hora a seis horas, o durante todo el período a partir del momento en el que es posible tratar un donante de muerte cerebral (cadáver) hasta el momento en el que se elimina el órgano. El tratamiento debe iniciar tan pronto como sea posible después de la declaración de la muerte cerebral. En algunas aplicaciones, puede ser posible comenzar el tratamiento antes de la muerte cerebral. Para animales no humanos (por ejemplo, cerdos) que serán utilizados como donantes de xeno-transplante, el animal vivo puede ser tratado con niveles relativamente altos de monóxido de carbono inhalado, según se necesite, siempre que la carboxihemoglobina producida de este modo no comprometa la viabilidad y función del órgano que será transplantado. Por ejemplo, se podrían utilizar niveles mayores a 500 ppm (por ejemplo, 1000 ppm o mayor y hasta 10,000 ppm, particularmente durante tiempos breves). Tratamiento del órgano in situ. Antes de que se recolecte un órgano de un donante, se puede enjuagar con una solución, por ejemplo, un amortiguador o medio, sin glóbulos rojos, aunque aun esté en el donante. Se intenta enjuagar el órgano con una solución saturada con monóxido de carbono y mantenerlo en una atmósfera de monóxido de carbono de modo que el contenido de monóxido de carbono permanezca en saturación. El enjuague puede tener lugar durante un período de tiempo de al menos 10 minutos, por ejemplo, 1 hora, varias horas o más. La solución debe administrar idealmente la concentración más alta posible de monóxido de carbono a la vasculatura del órgano. Tratamiento de un Órgano o Tejido. El órgano o tejido puede ser conservado en un medio que incluya monóxido de carbono a partir del momento en el que se eliminó del donante y hasta el momento en el qué sea transplantado al receptor. Esto se puede llevar a cabo manteniendo el órgano o tejido en el medio que comprende CO, o perfuslonándolo con un medio. Ya que esto ocurre, ex vivo en el lugar de en el animal, se pueden utilizar concentraciones muy altas de gas CO (por ejemplo, 10,000 ppm) para mantener el medio saturado con CO. Tratamiento de un Receptor. El receptor puede ser tratado con monóxido de carbono. El tratamiento puede comenzar en cualquier día antes del procedimiento de transplante, por ejemplo, en el día del procedimiento de transplante al menos una hora antes de que comience la cirugía. Como alternativa, podría comenzar al menos 30 minutos antes de la re-perfusión del órgano en el receptor. Puede continuar durante al menos 30 minutos, por ejemplo, 1 hora. Las dosis de monóxido de carbono entre 10 ppm y 3000 ppm pueden ser administradas durante diversos tiempos, por ejemplo, minutos u horas, y puede administrarse el mismo día y en los días posteriores al transplante. Por ejemplo, un receptor puede inhalar una concentración de monóxido de carbono, por ejemplo, a 3000 ppm, durante tres contenciones de respiración consecutivas de 10 segundos. Como alternativa, el receptor puede inhalar, es decir 200 ppm durante un tiempo prolongado, tal como 20 días. Se pueden utilizar concentraciones de carboximoglobina como una guía para la administración adecuada de monóxido de carbono a un paciente. Normalmente, los tratamientos para receptores no deben elevar los niveles de carboximoglobina arriba de los que se consideran que imponen un riesgo aceptable para un paciente que necesita de un transplante. Se ha descrito un número de modalidades de la presente invención. Sin embargo, quedará entendido que se pueden realizar diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Por consiguiente, otras modalidades están dentro del alcance de las reivindicaciones que se encuentran a continuación.

Claims (49)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para llevar a cabo angioplastia en un paciente, en donde el método comprende: (a) realizar una angioplastia en el paciente; y (b) antes, durante o después de (a), administrar al paciente una composición farmacéutica que comprenda una cantidad de monóxido de carbono efectiva para tratar hiperplasia intima en el paciente.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende angioplastia de balón.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende angioplastia láser.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende atreroctomía direccional.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende atreroctomía de rotación.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende atreroctomía de extracción.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende procedimiento de colocación de stent.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por que la angioplastia comprende angioplastia de balón y un procedimiento de colocación de stent.
9. 9. Un método para tratar restenosis en un paciente, en donde el método comprende: (a) proporcionar un envase que contenga gas presurizado que comprende gas de monoxido de carbono; (b) identificar a un paciente que padece o que está en riesgo de restenosis; (c) liberar el gas presurizado del envase, para formar una atmósfera que comprende gas de monoxido de carbono; y (d) exponer al paciente a la atmósfera, donde la cantidad de monoxido de carbono en la atmósfera es suficiente para tratar restenosis en el paciente.
10. 10. Un envase que comprende gas de monoxido de carbono comprimido de grado médico, caracterizado porque el envase contiene una etiqueta que indica que el gas puede utilizarse para reducir restenosis en un paciente.
11. 11. El envase de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado por que el gas de monoxido de carbono está en una mezcla con un gas que contiene oxigeno.
12. 12. El envase de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado por que el gas de monoxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de ai menos aproximadamente el 0.025%.
13. 13. El envase de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 0.05%.
14. 14. El envase de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 0.10%.
15. 15. El envase de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado por que caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos 1.0%.
16. 16. El envase de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en una mezcla en una concentración de al menos 2.0%.
17. 17. Un envase que comprende gas de monóxido de carbono comprimido de grado médico, caracterizado porque el envase contiene una etiqueta que indica que el gas puede utilizarse para reducir la arteriosclerosis en un paciente.
18. 18. El envase de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente el 0.025%.
19. 19. El envase de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente el 0.05%.
20. 20. El envase de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente el 0.10%.
21. 21. El envase de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente el 1.0%.
22. 22. El envase de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos aproximadamente el 2.0%.
23. 23. Un envase que comprende gas de monóxido de carbono comprimido de grado médico, caracterizado porque el envase contiene una etiqueta que indica que el gas puede utilizarse junto con un procedimiento de angioplastia en un paciente.
24. 24. El envase de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 0.025%.
25. 25. El envase de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 0.05%.
26. 26. El envase de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 0.10%.
27. 27. El envase de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 1.0%.
28. 28. El envase de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado por que el gas de monóxido de carbono está presente en la mezcla en una concentración de al menos el 2.0%.
29. 29. Un método para tratar restenosis en un paciente, en donde el método comprende: (a) identificar a un paciente que padece de o que está en riesgo de restenosis; y (b) administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono efectiva para tratar restenosis en el paciente.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado por que la restenosis resulta de angioplastia de balón .
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado por que la restenosis resulta de angioplastia láser.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado por que la restenosis resulta de atreroctomía direccional.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado por que la restenosis resulta de atreroctomía de rotación.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado por que la restenosis resulta de atreroctomía de extracción.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado por que la restenosis resulta de un procedimiento de colocación de stent.
36. 36. Un método para tratar hiperplasia intima en un paciente, en donde el método comprende: (a) identificar a un paciente que padece de o que está en riesgo de hiperplasia intima que no resulta de un procedimiento de transplante; y (b) administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad de monóxido de carbono efectiva para tratar hiperplasia intima en el paciente.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado por que la hiperplasia intima resulta de angioplastia de balón.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado por que la hiperplasia intima resulta de angioplastia láser.
39. 39. El método ,de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado por que la hiperplasia intima resulta de atreroctomía de dirección.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado por que la hiperplasia intima resulta de atreroctomía de rotación.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado por que la hiperplasia intima resulta de atreroctomía de extracción.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado por que la hiperplasia intima resulta de un procedimiento de colocación de stent.
43. 43. Un método para llevar a cabo angioplastia en un paciente, en donde el método comprende: (a) proporcionar un aparato de angioplastia con la capacidad de administrar monóxido de carbono a un paciente; (b) colocar el aparato en un bazo sanguíneo que necesita de angioplastia. (c) llevar a cabo la angioplastia utilizando el aparato; y (d) antes, durante o después de (c), utilizar el aparato para administrar monóxido de carbono al bazo sanguíneo en una cantidad suficiente para tratar hiperplasia intima.
44. 44. Un equipo que comprende: (a) un aparato de angioplastia; (b) un envase que contiene una composición de monóxido de carbono.
45. 45. El equipo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado por que el aparato de angioplastia tiene la capacidad de administrar monóxido de carbono a un paciente.
46. 46. El equipo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado por que comprende además: (c) instrucciones para utilizar la composición de monóxido de carbono en un método para llevar a cabo angioplastia en un paciente.
47. 47. El equipo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado por que la composición de monóxido de carbono es una composición líquida.
48. 48. El equipo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado por que la composición de monóxido de carbono es una composición gaseosa.
49. 49. Un aparato de angioplastia que comprende: un elemento inflable que comprende una pluralidad de aperturas; y un depósito que comprende gas de monóxido de carbono y que está conectado al elemento inflable, mediante lo cual se proporciona el gas al elemento inflable durante el inflado del mismo. R E S U M E N La presente invención se refiere a un método para tratar pacientes que padecen de, o que están en riesgo de hiperplasia intima y/o arteriosclerosis. El tratamiento incluye administrar al paciente una composición farmacéutica que incluye monóxido de carbono.