PL205066B1 - Zastosowanie tlenku węgla do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie tlenku węgla do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej. Wynalazek ten dotyczy leczenia zapalenia wątroby.

Gazowy tlenek węgla jest toksyczny w wysokich stężeniach. Jednak obecnie jest uważany za ważną cząsteczkę sygnałową (Verma i wsp. Science 259:381-384, 1993). Sugerowano także, że tlenek węgla działa jako cząsteczka przekaźnikowa dla neuronów w mózgu (Id.) i jako modulator neuro-wewnątrzwydzielniczy w podwzgórzu (Pozzoli i wsp., Endocrinology 735:2314-2317, 1994). Tak jak tlenek azotu (NO), tlenek węgla jest czynnikiem zwiotczającym mięśnie gładkie (Utz i wsp., Biochem Pharmacol. 47:195-201, 1991; Christodoulides i wsp., Circulation 97:2306-9, 1995) i hamuje agregację płytek krwi (Mansouri i wsp., Thromb Haemost. 48:286-8, 1982). Wykazano, że wdychanie niskich poziomów tlenku węgla (CO) posiada w niektórych modelach właściwości przeciwzapalne.

Zapalenie wątroby jest chorobą charakteryzującą się stanem zapalnym wątroby. Zapalenie może się charakteryzować rozproszoną lub niejednorodną martwicą dotykającą gronka wątrobowe. Czynniki wywołujące zapalenie wątroby obejmują, przykładowo, wirusy, np. specyficzne wirusy zapalenia wątroby, wirusy typu A, B, C, D, E i G; alkohol oraz niektóre leki (np., izoniazyd, metylodopa, acetaminofen, amiodaron i nitrofurantoina) (patrz The Merck Manual of Diagnosis i Therapy, wyd. 17, część 4, rozdz. 42).

Niniejszy wynalazek opiera się częściowo na ujawnieniu, że podawanie CO może chronić przed rozwojem zapalenia wątroby. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie tlenku węgla do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania zapaleniu wątroby u pacjenta.

Niniejszym opisano także sposób leczenia, zapobiegania i zmniejszania ryzyka zapalenia wątroby u pacjenta. Sposób obejmuje identyfikację pacjenta chorego na zapalenie wątroby lub z ryzykiem zapalenia wątroby (np., pacjenta zdiagnozowanego z zapaleniem wątroby lub z ryzykiem zapalenia wątroby) i podanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej otrzymanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmującej taką ilość tlenku węgla, która jest skuteczna w leczeniu zapalenia wątroby u pacjenta.

Kompozycję farmaceutyczną można podawać pacjentowi dowolnym znanym w dziedzinie sposobem podawania gazów i/lub płynów, np. przez inhalację, wdmuchiwanie, infuzję, wstrzyknięcie i/lub spożycie. Zatem kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być korzystnie w postaci gazowej lub ciekłej. Kompozycja farmaceutyczna może być podawana pacjentowi przez inhalację lub doustnie. Kompozycja farmaceutyczna może być także podawana bezpośrednio do jamy brzusznej pacjenta. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku moż e być przeznaczona do podawania przez przyrząd do pozaustrojowej wymiany gazów przez błonę lub sztuczne płuco.

Pacjent może być zwierzęciem, człowiekiem lub zwierzęciem innym niż człowiek. Przykładowo, pacjentem może być ssak, np. ludzie, inne naczelne, świnie, gryzonie takie jak myszy i szczury, króliki, świnki morskie, chomiki, krowy, konie, koty, psy, owce i kozy. Zapalenie wątroby może być wynikiem lub osoba może być obarczona ryzykiem zapalenia wątroby ze względu na dowolny z wielu czynników, takich jak np. zakażenia, np. zakażenia wirusowe, np. zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu A, B, C, D E i/lub G; picie alkoholu (np., alkoholizm); stosowanie leków (np. jednego lub większej liczby leków tu opisanych, np. acetaminofenu, środków znieczulających, leków przeciwgruźliczych, czynników przeciwgrzybiczych, leków przeciwcukrzycowych, czynników neuroleptycznych i leków stosowanych do leczenia zakażenia HIV i AIDS); stany autoimmunizacyjne (np. autoimmunizacyjne zapalenie wątroby) i/lub procedury chirurgiczne. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być stosowana u pacjenta, który jest zakażony wirusem wybranym z grupy składającej się z wirusa zapalenia wątroby typu A; wirusa zapalenia wątroby typu B; wirusa zapalenia wątroby typu C; wirusa zapalenia wątroby typu D; wirusa zapalenia wątroby typu E i wirusa zapalenia wątroby typu G. W innej korzystnej postaci wykonania pacjent może być alkoholikiem.

Sposób leczenia opisany niniejszym obejmuje dalej stosowanie u pacjenta co najmniej jednej z nastę pują cych terapii: indukowanie u pacjenta HO-1 lub ferrytyny; ekspresja u pacjenta zrekombinowanych HO-1 lub ferrytyny; i podawanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej obejmującej HO-1, bilirubinę, biliwerdynę, ferrytynę lub apoferrytynę, żelazo, desferoksyaminę lub dekstran żelaza. CO i którykolwiek z wymienionych powyż ej czynników mogą być stosowane do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zapaleniu wątroby.

PL 205 066 B1

Kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być wykorzystywana do leczenia, kiedy zapalenie wątroby jest wywołane przez czynnik inny niż zabieg chirurgiczny lub endotoksyna. Możliwe jest też leczenie zapalenia wątroby wywołanego przez czynnik innych niż szok septyczny i/lub zapalenie układowe.

Opisany niniejszym sposób leczenia lub zapobiegania zapaleniu wątroby u pacjenta obejmuje identyfikację pacjenta chorego na zapalenie wątroby lub z ryzykiem zapalenia wątroby (np. pacjenta zdiagnozowanego z zapaleniem wątroby lub z ryzykiem zapalenia wątroby), dostarczenie naczynia zawierającego gaz obejmujący gazowy tlenek węgla pod zwiększonym ciśnieniem, uwolnienie gazu będącego pod zwiększonym ciśnieniem z naczynia w celu utworzenia atmosfery obejmującej gazowy tlenek węgla, wystawienie pacjenta na działanie atmosfery, przy czym ilość tlenku węgla w atmosferze jest wystarczająca do leczenia zapalenia wątroby u pacjenta.

Niniejszym ujawniono także sposób przeprowadzania operacji brzusznej, np. transplantacji wątroby u pacjenta, przy czym zapalenie wątroby jest ryzykiem operacji brzusznej, który obejmuje identyfikację pacjenta wymagającego operacji brzusznej; przeprowadzenie operacji brzusznej u pacjenta oraz, przed, w czasie lub po tym etapie podanie pacjentowi inhalacji z takiej ilości gazowego tlenku węgla, która jest wystarczająca do zmniejszenia ryzyka zapalenia wątroby u pacjenta.

Możliwe jest także leczenie zapalenia wątroby u pacjenta chorego na zapalenie wątroby lub z ryzykiem zapalenia wą troby nie wywoł anym operacją chirurgiczną i/lub endotoksyną , np. zapalenia wątroby wywołanego jakimkolwiek czynnikiem tu opisanym innym niż operacja chirurgiczna i/lub endotoksyna. Sposób obejmuje identyfikację pacjenta chorego na zapalenie wątroby lub z ryzykiem zapalenia wątroby nie wywołanym operacją chirurgiczną i/lub endotoksyną i podawanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej obejmującej skuteczną ilość tlenku węgla do leczenia zapalenia wątroby u pacjenta.

Kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być stosowana, kiedy zapalenie wątroby jest wywołane ekspozycją na czynnik hepatotoksyczny, na przykład lek hepatotoksyczny. Taki lek hepatotoksyczny może być wybrany z grupy składającej się z izoniazydu, metylodopy, acetaminofenu, amiodaronu i nitrofurantoiny.

Niniejszym opisano zatem sposób podawania pacjentowi leku wywołującego zapalenie wątroby (tzn. leku hepatotoksycznego, np. isoniazydu, metylodopy, acetaminofenu, amiodaronu, lub nitrofurantoiny), który obejmuje podawanie pacjentowi leku oraz podawanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej obejmującej tlenek węgla w ilości skutecznej do leczenia zapalenia wątroby u pacjenta przed, podczas i/lub po podaniu leku.

Korzystnie gazowy CO jest obecny w kompozycji farmaceutycznej otrzymanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku w stężeniu co najmniej 0,025%, co najmniej 0,05%, co najmniej 0,10%, co najmniej 1,0%, lub co najmniej 2,0%.

Kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest stosowana do leczenia lub zapobiegania zapaleniu wątroby związanym z ostrą niewydolnością wątroby.

O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie zastosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie jak rozumiane przez zwykłego specjalistę w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek. Stosowne metody i materiały opisano poniżej, chociaż w praktyce lub do testowania niniejszego wynalazku można zastosować podobne lub ekwiwalentne metody i materiały do tych tu opisanych. W przypadku zaistnienia sporu, wiążący będzie niniejszy opis wraz z definicjami. Materiały, metody oraz przykłady są tylko ilustracją i nie zostały przedstawione w celu ograniczenia.

Szczegóły jednego lub większej liczby wykonań według wynalazku przedstawiono w opisie poniżej. Inne cechy, przedmioty i korzyści niniejszego wynalazku będą oczywiste na podstawie opisu i zastrzeż e ń .

Krótki opis rysunków

Fig. 1 jest wykresem słupkowym pokazującym, że indukcja HO-1 chroni mysie hepatocyty przed śmiercią komórkową indukowaną TNF-a/D-gal. CoPP=protoporfiryna kobaltowa; ALT=surowicza aminotransferaza alaninowa; TNF=czynnik martwicy nowotworu alfa. Wyniki są średnią ± SD (odchylenie standardowe) 6-8 myszy/grupę *p<0,005.

Fig. 2 jest wykresem słupkowym pokazującym, że egzogenny CO chroni hepatocyty przed śmiercią komórkową indukowaną TNF-α w sposób niezależny od szlaku cGMP/p38 i zależny od aktywacji NF-κΒ. CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; TNF=czynnik martwicy nowotworu alfa; BAY=BAY 11-7082 (hamuje aktywację NF-kB) kB=kBa (zapobiega aktywacji NF-kB); ODQ=1H-[1, 2,4]oksadiazolo[4,3-a]chinoksalin-1-on (selektywny inhibitor cyklazy guanylowej); Lac-Z=pIEP-Lac-Z

PL 205 066 B1 (kontrola adenowirusowa). Przedstawione wyniki są średnią ± SD trzech powtórzeń w studzienkach z czterech niezależ nych doś wiadczeń (*p<0,01).

Fig. 3 jest wykresem słupkowym pokazującym, że egzogenny CO chroni ludzkie hepatocyty przed śmiercią komórkową indukowaną TNF-a/aktynomycyną-D (AktD). CO=tlenek węgla; pow. =powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/AktD. Wyniki są średnią ± SD trzech powtórzeń w studzienkach z 3 niezależnych doświadczeń.

*p<0,05.

Fig. 4 jest wykresem słupkowym pokazującym, że egzogenny CO wpływa na podniesienie aktywacji NF-kB w hepatocytach. CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; BAY=BAY 11-7082; CM=mieszanina cytokin (TNF-α (500 U/ml), IL-1 β (100 U/ml) i IFN-δ (100 U/ml)). Przedstawione wyniki są średnią ± SE (błąd standardowy) trzech powtórzeń z trzech niezależnych doświadczeń. *p<0,001 względem powietrza.

Fig. 5 jest zdjęciem przedstawiającym żel poliakryloamidowy, który pokazuje, że egzogenny CO indukuje wzrost przemieszczania NF-kB w jądrze i wiązanie z DNA, mierzone w elektroforetycznym teście zmiany ruchliwości (EMSA, ang. electrophoretic mobility shift assay). FP=wolna próbka (brak białka jądrowego, a zatem brak wiązania DNA); całkowity=prążki NFkB bez dodatkowej zmiany wywołanej przeciwciałem.

Fig. 6A-6C są fotomikrografiami hepatocytów pierwotnych immunobarwionych w celu wykrycia lokalizacji p65 w jądrze, które pokazują, że egzogenny CO powoduje wzrost aktywacji NF-kB w hepatocytach. Fig. 6A: hepatocyty poddane działaniu powietrza. Fig. 6B: hepatocyty poddane działaniu mieszaniny cytokin (TNF-α (500 U/ml), IL-1 β (100 U/ml) , i IFN-δ (100 U/ml)). Fig. 6C: hepatocyty poddane działaniu CO. Obrazy są reprezentatywne dla 6 różnych pól. Słupek odpowiada 10 μm.

Fig. 7 jest wykresem słupkowym pokazującym, że ochrona hepatocytów indukowana egzogennym CO wymaga ekspresji iNOS zależnej od NF-kB. CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; BAY=BAY 11-7082; CM=mieszanina cytokin. Przedstawione wyniki są średnią ± SE trzech powtórzeń z czterech niezależnych doświadczeń. *p<0,001 względem komórek traktowanych powietrzem i powietrzem/BAY.

Fig. 8 przedstawia Western blot pokazujący, że wyrażanie białka iNOS w hepatocytach jest znacząco podniesione po ekspozycji na TNF-α w obecności CO, w porównaniu z ekspozycją tylko na TNF -α. iNOS=indukowalna syntaza tlenku azotu; CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/AktD; e-aktyna=białko kontrolne. Immunoblot reprezentuje 3 niezależne doświadczenia.

Fig. 9 jest wykresem słupkowym pokazującym, że hepatocyty myszy z brakiem aktywności iNOS (inos¹) nie są chronione przez CO przed śmiercią komórkową indukowaną TNFa. CO=tlenek węgla; pow. =powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/AktD; inos^-- = myszy z nokautem iNOS; L-NIO = L-N5-(1-iminoetylo)-ornityna-2HCl. Przedstawione wyniki są średnią ± SE trzech powtórzeń w studzienkach z czterech niezależnych doświadczeń. *p<0,01 względem komórek bez TNF/AktD i traktowanych CO/TNF/AktD.

Fig. 10 jest wykresem słupkowym pokazującym, że egzogennie podawany CO zapobiega uszkodzeniu wątroby indukowanemu TNF-a/D-Gal u myszy. ALT=surowicza aminotransferaza alaninowa; CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe. Wyniki przedstawiają średnią ± SD dla 18-20 myszy. *p<0,001 względem traktowania powietrzem.

Fig. 11A-11H są fotomikrografiami próbek wątroby pokazującymi, że egzogennie podawany CO zapobiega uszkodzeniu wątroby indukowanemu TNF-a/D-Gal u myszy. Fig. 11A i 11B: próbki wątroby z myszy wystawionych na działanie, odpowiednio, powietrza pokojowego i CO, barwione hematoksyliną i eozyną (H&E).

Fig. 11C i 11D: próbki wątroby z myszy traktowanych TNF-a/D-Gal i wystawionych na działanie, odpowiednio, powietrza pokojowego i CO, barwione H&E. Fig. 11E i 11F: próbki wątroby z myszy traktowanych TNF-a/D-Gal i wystawionych na działanie, odpowiednio, powietrza pokojowego i CO, barwione w celu wykrycia aktywowanej kaspazy-3. Fig. 11G i 11H: próbki wątroby z myszy traktowanych TNF-a/D-Gal i wystawionych na działanie, odpowiednio, powietrza pokojowego i CO, barwione przy zastosowaniu znakowania końca przerwy dUTP za pośrednictwem terminalnej transferazy dezoksynukleotydylowej (TUNEL, ang. terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling). Obrazy reprezentują sekcje z 15-20 sekcji/wątrobę od 3-4 indywidualnych myszy/grupę. Słupek odpowiada 20 μm.

Fig. 12 przedstawia Western blot pokazujący, że wątroby myszy wystawionych na działanie TNF-a/D-Gal i poddanych inhalacji z CO wykazują podniesione poziomy białka iNOS. Typu dzikiePL 205 066 B1 go=myszy typu dzikiego; iNOS^-/- =myszy z niedoborem iNOS; CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/D-Gal; e-aktyna=białko kontrolne.

Fig. 13A-13D są fotomikrografiami próbek wątroby pokazującymi, że wątroby myszy eksponowanych na TNF-a/D-Gal i poddanych inhalacji z CO wykazują podniesione poziomy białka iNOS.

Fig. 13A: próbka wątroby z myszy wystawionej na działanie powietrza. Fig. 13B: próbka wątroby z myszy wystawionej na działanie CO. Fig. 13C: próbka wątroby z myszy wystawionej na działanie TNF-a/D-Gal i powietrza pokojowego. Fig. 13D: próbka wątroby z myszy wystawionej na działanie TNF-a/D-Gal i CO. Obrazy reprezentują 6 oddzielnych zwierząt i 6-10 różnych sekcji/próbkę wątroby. Słupek odpowiada 20 μm.

Fig. 14 jest wykresem słupkowym pokazującym, że CO nie chroni przed uszkodzeniem wątroby w nieobecności działania/wyrażania iNOS. L-NIL=dihydrochlorek L-N6-(1-iminoetylo)-lizyny (selektywny inhibitor iNOS); CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/D-Gal. Wyniki są średnią ± SD dla 6-8 zwierząt/grupę. *p<0,01 względem kontroli CO/TNF-a/D-gal i powietrze i CO.

Fig. 15 przedstawia Western blot pokazujący, że wątroby myszy traktowanych CO wykazują podniesione wytwarzanie HO-1 w obecności i w nieobecności TNF-a/D-Gal. CO=tlenek węgla; pow. =powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/D-Gal; e-aktyna=białko kontrolne. Blot reprezentuje 2 niezależne doświadczenia.

Fig. 16 przedstawia Western blot pokazujący, że wątroby myszy traktowanych CO nie wykazują podniesionej ekspresji HO-1 w obecności lub w nieobecności TNF-a/D-Gal, jeśli iNOS jest hamowana przy zastosowaniu L-NIL. CO=tlenek węgla; pow. =powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/D-Gal; e-aktyna=białko kontrolne; L-NIL=dihydrochlorek L-N6-(1-iminoetylo)-lizyny (selektywny inhibitor iNOS). Blot reprezentuje 2 niezależne doświadczenia.

Fig. 17 jest wykresem słupkowym pokazującym, że HO-1 indukowane CO chroni przed indukowanym TNF-a uszkodzeniem wątroby u myszy. ALT=surowicza aminotransferaza alaninowa; pow.=powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/D-Gal; Sn=protoporfiryna cynowa (inhibitor HO-1); VP=VPYRRO (donor tlenku azotu). Wyniki są wyrażone jako średnia ± SD dla 8-10 myszy/grupę. *p< 0,05 względem myszy traktowanych CO/TNF/D-gal.

Fig. 18 jest wykresem słupkowym pokazującym, że indukcja HO-1 chroni przed uszkodzeniem wątroby indukowanym przez TNF-a niezależnie od aktywności iNOS. ALT=surowicza aminotransferaza alaninowa; pow.=powietrze pokojowe; TNF=TNF-a/D-Gal; L-NIL=dihydrochlorek L-N6-(1-iminoetylo)lizyny (selektywny inhibitor iNOS); CoPP=protoporfiryna kobaltowa (induktor HO-1); iNOS^-/- =myszy z niedoborem iNOS. Wyniki są średnią ± SD dla 6-8 myszy/grupę. *p<0,001 względem pow./TNF i L-NIL/TNF.

Fig. 19 jest wykresem słupkowym pokazującym, że wytwarzanie HO-1 jest wymagane do indukowanej CO ochrony mysich hepatocytów przed śmiercią komórkową indukowaną TNF-a/AktD. Typu dzikiego (czarne słupki)=hepatocyty izolowane z myszy C57BL/6J typu dzikiego; hmox-1^-/- (białe słupki)=hepatocyty izolowane z myszy pozbawionych HO-1; CO=tlenek węgla; pow.=powietrze pokojowe; TNF -a=TNF-a/AktD. *p<0,01 względem komórek nie traktowanych TNF-a/AktD i względem komórek traktowanych TNF-a/AktD, które również traktowano CO.

Fig. 20 jest wykresem słupkowym pokazującym, że ekspresja HO-1 jest wymagana do indukowanej NO ochrony mysich hepatocytów przed śmiercią komórkową indukowaną TNF-a/AktD. Typu dzikiego (czarne słupki)=hepatocyty izolowane z myszy C57BL/6J typu dzikiego; hmox-1^-/- (białe słupki)=hepatocyty izolowane z myszy bez HO-1; SNAP=s-nitrozo-N-acetylo-penicyloamina (donor NO); pow.=powietrze pokojowe; TNF-a=TNF-a/AktD. *p<0,01 względem komórek nietraktowanych TNF-a/AktD i względem komórek traktowanych TNF-a/AktD, które traktowano również NO.

Fig. 21 jest wykresem słupkowym pokazującym, że myszy eksponowane na CO były chronione przed uszkodzeniem wątroby indukowanym acetaminofenem. ALT=surowicza aminotransferaza alaninowa; pow.=powietrze pokojowe; APAP=acetaminofen. Wyniki są średnią ±SD dla 4-8 myszy/grupę.

Szczegółowy opis

Termin „tlenek węgla (lub „CO) w zastosowanym tu znaczeniu opisuje cząsteczkowy tlenek węgla w stanie gazowym, sprężonym do postaci ciekłej lub rozpuszczony w roztworze wodnym. Terminy „kompozycja tlenku węgla i „kompozycja farmaceutyczna obejmująca tlenek węgla są stosowane w opisie do opisu gazowej lub ciekłej kompozycji zawierającej tlenek węgla, którą można podać pacjentowi i/lub do narządu, np. wątroby. Praktykujący specjalista będzie wiedział, która postać kompozycji farmaceutycznej, np. gazowa, ciekła lub obie postacie gazowa i ciekła, jest korzystna w konkretnym zastosowaniu.

PL 205 066 B1

W zastosowanym tu znaczeniu terminy „skuteczna ilość i „skuteczna do leczenia odnoszą się do ilości lub stężenia tlenku węgla wykorzystywanego przez okres czasu (łącznie z podawaniem w przypadkach ostrym lub podawaniem przewlekł ym i podawaniem okresowym lub cią g ł ym), która jest skuteczna w kontekście podawania do wywołania zamierzonego efektu lub rezultatu fizjologicznego. Skuteczne ilości tlenku węgla obejmują, przykładowo, ilości, które zapobiegają zapaleniu wątroby, zmniejszają ryzyko zapalenia wątroby, zmniejszają objawy zapalenia wątroby lub polepszają wyniki innej terapii zapalenia wątroby.

Dla gazów, skuteczne ilości tlenku węgla zazwyczaj mieszczą się w zakresie od około 0,0000001% do około 0,3% wagowo, np. 0,0001% do około 0,25% wagowo, korzystnie co najmniej około 0,001%, np. co najmniej 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% lub 0,24% wagowo tlenku węgla. Korzystne zakresy obejmują, np. 0,001% do około 0,24%, około 0,005% do około 0,22%, około 0,005% do około 0,05%, około 0,010% do około 0,20%, około 0,02% do około 0,15%, około 0,025% do około 0,10% lub około 0,03% do około 0,08% lub około 0,04% do około 0,06%. Dla ciekłych roztworów CO, skuteczne ilości tlenku węgla zazwyczaj mieszczą się w zakresie od około 0,0001 do około 0, 0044 g CO/100 g cieczy, np. co najmniej 0,0001, 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040 lub 0,0042 g CO/100 g wodnego roztworu. Korzystne zakresy obejmują, np. około 0,0010 do około 0,0030 g CO/100 g cieczy, około 0,0015 do około 0,0026 g CO/100 g cieczy lub około 0,0018 do około 0,0024 g CO/100 g cieczy. Praktykujący specjalista będzie wiedział, że można stosować ilości spoza tych zakresów w zależności od zastosowania.

Określenie „pacjent jest stosowane w opisie do opisu zwierzęcia, człowieka lub nie będącego człowiekiem zwierzęcia, któremu dostarczane jest leczenie. Niniejszy wynalazek rozpatruje zastosowania weterynaryjne. Termin obejmuje, lecz nie ogranicza się do ssaków, np. ludzi, innych naczelnych, świń, gryzoni, takich jak myszy i szczury, króliki, chomiki, krów, koni, kotów, psów, owiec i kóz. W zastosowanym tu znaczeniu termin „leczyć (leczenie) jest uż yty do opisania opó ź nienia początku, zahamowania lub złagodzenia skutków stanu pacjenta, np. zapalenia wątroby.

Określenie „zapalenie wątroby jest terminem znanym w dziedzinie i stosowanym w odniesieniu do choroby pacjentów charakteryzującej się po części stanem zapalnym wątroby. Czynniki wywołujące zapalenie wątroby obejmują, przykładowo, zakażenia, np. zakażenia specyficznymi wirusami zapalenia wątroby, np. wirusami zapalenia wątroby typu A, B, C, D, E i G lub czynniki hepatotoksyczne np. leki toksyczne wobec wątroby (np. izoniazyd, metylodopa, acetaminofen, amiodaron i nitrofurantoina) oraz toksyny (np. endotoksyna lub toksyny środowiskowe). Zapalenie wątroby może wystąpić po operacji u pacjentów z przeszczepem wątroby. Dalsze przykłady leków i toksyn, które mogą wywoł ywać zapalenie wątroby (tzn. czynników hepatotoksycznych) są opisane w Feldman: Sleisenger & Fordtran's Gastrointestinal i Liver Disease, wyd. 7, rozdz. 17 (Liver Disease Caused by Drugs, Anesthetics, and Toxins). Przykłady takie obejmują lecz nie ograniczają się do metylodopy i fenytoiny, barbituranów, np. fenobarbitalu; sulfonamidów (np. w lekach skojarzonych, takich jak kotrimoksazol (sulfametoksazol i trimetoprim); sulfasalazyny; salicylanów;

disulfiramu; czynników blokujących receptory β-adrenergiczne np. acebutololu, labetalolu i metoprololu; blokerów kanałów wapniowych np. nifedypiny, werapamilu i diltiazemu; syntetycznych retinoidów np. etretynianu; leków będących supresorami kwasu żołądkowego np. oksmetydyny, ebrotydyny, kimetydyny, ranitydyny, omeprazolu i famotydyny; antagonistów receptora leukotrienowego np. zafirlukastu; leków przeciwgruźliczych np. rifampicyny i pirazynamidu; środów przeciwgrzybiczych np. ketokonazolu, terbinafinu, flukonazolu i itrakonazolu; leków przeciwcukrzycowych np. tiazolidynodionów, np. troglitazonu i rozyglitazonu; leków stosowanych w zaburzeniach neurologicznych np. czynników neuroleptycznych, przeciwdepresyjnych (np. fluoksetyny, paroksetyny, wenlafaksyny, trazodonu, tolkaponu i nefazodonu), nasennych (np. alpidemu, zolpidemu, i bentazepamu) i innych leków np. takryny, dantrolenu, riluzolu, tizanidyny i alweryny; niesteroidowych leków przeciwzapalnych np. bromfenaku; inhibitorów COX-2; octanu cyproteronu; leflunomidu; środków antywirusowych np. fialurydyny, didanozyny, zalcytabiny, stawudyny, lamiwudyny, zydowudyny, abakawiru; leków przeciwnowotworowych np. tamoksifenu i metotreksatu; środków odurzających np. kokainy, fencyklidyny i 5-metoksy-3,4-metylenodioksymetamfetaminy; L-asparaginazy; amodiachiny; hykantonu; środków znieczulających np. halotanu, enfluranu i izofluranu; witamin np. witaminy A oraz toksyn pokarmowych i/lub środowiskowych np. alkaloidów pirolizydynowych, toksyny z Amanita phalloides lub innych toksycznych grzybów, aflatoksyny,

PL 205 066 B1 arszeniku, mieszaniny Bordeaux (sole miedzi i tlenek wapnia), monomeru chlorku winylowego; czterochlorku węgla, berylu, dimetyloformamidu, dimetylonitrozaminy, metylenodianiliny, fosforu, chlorodekonu (Kepon), 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo p-dioksyny (TCDD), tetrachloroetany, tetrachloroetylenu, 2,4,5-trinitrotoluenu, 1,1,1-trichloroetanu, toluenu i ksylenu oraz znanych „leków ziołowych np. efedryny i eugenolu.

Objawy zapalenia wątroby mogą obejmować zmęczenie, brak apetytu, bóle żołądka i/lub żółtaczkę (żółte zabarwienie skóry i/lub oczu). Dokładniejszy opis zapalenia wątroby dostarczono, przykładowo, w The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, wyd. 17, cz. 4, rozdz. 42, cz. 4, rozdz. 44 i cz. 4, rozdz. 40.

Praktykujący specjalista doceni, że pacjent może być zdiagnozowany przez lekarza jako chory na zapalenie wątroby dowolną metodą znaną w dziedzinie, np. przy zastosowaniu testów krwi określających poziomy surowiczej aminotransferazy alaninowej (ALT), fosfatazy alkalicznej (AP) lub poziomy bilirubiny.

Osobnicy podejrzewani o ryzyko rozwoju zapalenia wątroby mogą czerpać korzyść dzięki wynalazkowi, przede wszystkim dlatego, że leczenie profilaktyczne można zacząć przed oznakami zapalenia wątroby. Osobnicy „z ryzykiem obejmują np. pacjentów zakażonych wirusami zapalenia wątroby lub osobników cierpiących na jakiekolwiek objawy lub posiadających opisane tu czynniki ryzyka (np. pacjenci wystawieni na działanie czynników hepatotoksycznych). Praktykujący specjalista wie, że przez badanie lekarskie można ustalić czy pacjent jest zagrożony ryzykiem zapalenia wątroby.

Ilości CO skuteczne do leczenia zapalenia wątroby można podawać pacjentowi w dniu kiedy pacjentowi postawiona jest diagnoza zapalenia wątroby lub stwierdzone są objawy towarzyszące zapaleniu wątroby lub kiedy jest on wystawiony na dowolny czynnik ryzyka związany ze zwiększonym prawdopodobieństwem rozwinięcia zapalenia wątroby (np. takim, że pacjent był niedawno, jest lub będzie wystawiony na działanie czynnika hepatotoksycznego np. leku toksycznego dla wątroby takiego jak acetaminofen). Pacjenci mogą wdychać CO przez inhalację w stężeniach w zakresie od 10 ppm do 1000 ppm, np. około 100 ppm do około 800 ppm, około 150 ppm do około 600 ppm, lub około 200 ppm do około 500 ppm. Korzystne stężenia obejmują np. około 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm lub około 1000 ppm. CO można podawać pacjentowi w sposób przerywany lub ciągły. CO można podawać przez około 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 lub 20 dni lub dłużej niż 20 dni, np. 1, 2, 3, 5 lub 6 miesięcy lub dopóki pacjent nie wykazuje dłużej objawów zapalenia wątroby lub dopóki pacjent nie zostanie zdiagnozowany jako nie obarczony ryzykiem zapalenia wątroby. Danego dnia, CO można podawać przez cały dzień w sposób ciągły lub w sposób przerywany, np. przez pojedyncze zacią gnię cie CO w cią gu dnia (przy zastosowaniu wysokiego stężenia) lub do 23 godz. dziennie np. do 20, 15, 12, 10, 6, 3 lub 2 godz. w ciągu dnia lub do 1 godz. w cią gu dnia.

Jeśli pacjent musi przyjmować lek hepatotoksyczny (np. przepisany przez lekarza), pacjentowi może być podawany CO (np. w gazowej kompozycji CO) przed, podczas i/lub po podaniu leku. Przykładowo, CO można podawać pacjentowi, w sposób przerywany lub ciągły, począwszy od 0 do 20 dnia przed podaniem leku (a kiedy podawane są wielokrotne dawki, to przed każdą pojedynczą dawką), np. rozpoczynając co najmniej około 30 min., np. około 1, 2, 3, 5, 7 lub 10 godz. lub około 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 lub 20 dni, lub więcej niż 20 dni przed podaniem. Alternatywnie lub dodatkowo, CO można podawać pacjentowi równocześnie z podawaniem leku. Alternatywnie lub dodatkowo, CO można podawać pacjentowi po podaniu leku, np. rozpoczynając natychmiast po podaniu i kontynuując w sposób przerywany lub ciągły przez około 1, 2, 3, 5, 7 lub 10 godz., lub około 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 lub 60 dni, w sposób czasowo nieograniczony, lub dopóki lekarz nie stwierdzi, że podawanie CO nie jest dłużej konieczne (np. kiedy lek hepatotoksyczny jest usunięty z organizmu lub nie może dłużej niszczyć wątroby).

Wytwarzanie kompozycji gazowych

Kompozycja tlenku węgla może być gazową kompozycją tlenku węgla. Gaz sprężony lub pod zwiększonym ciśnieniem można uzyskać z dowolnego dostępnego na rynku źródła i w dowolnym typie naczynia odpowiedniego do przechowywania sprężonego gazu. Przykładowo, gazy sprężone lub pod zwiększonym ciśnieniem można uzyskać z dowolnego źródła, które dostarcza sprężone gazy takie jak tlen, do użytku medycznego. W zastosowanym tu znaczeniu termin „medyczna jakość gazu odnosi się do gazu stosowanego do podania pacjentom określonym powyżej. Gaz pod zwiększonym ciśnieniem obejmujący CO może być dostarczony tak, że wszystkie gazy z pożądanej kompozycji końcowej (np. CO, He, NO, CO2, O2, N2) znajdują się w tym samym naczyniu, z wyjątkiem tego, że NO i O2 nie

PL 205 066 B1 mogą być przechowywane razem. Ewentualnie, sposoby tu opisane mogą być wykonywane przy zastosowaniu wielu naczyń zawierających poszczególne gazy. Przykładowo, może być dostarczone pojedyncze naczynie, które zawiera tlenek węgla, w obecności lub nieobecności innych gazów, zawartości którego mogą być ewentualnie mieszane z powietrzem pokojowym lub z zawartością innych naczyń, np. naczyń zawierających tlen, azot, dwutlenek węgla, sprężone powietrze lub dowolny inny stosowny gaz lub ich mieszaninę.

Kompozycje gazowe podawane pacjentowi zazwyczaj zawierają 0% do około 79% wagowo azotu, około 21% do około 100% wagowo tlenu i około 0,0000001% do około 0,3% wagowo (odpowiadającym do około 1 ppb lub 0,001 ppm do około 3000 ppm) tlenku węgla. Korzystnie, ilość azotu w kompozycji gazowej wynosi około 79% wagowo, ilość tlenu wynosi około 21% wagowo i ilość tlenku węgla wynosi około 0,0001% do około 0,25% wagowo, korzystnie co najmniej około 0,001%, np. co najmniej około 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% lub 0,24% wagowo. Korzystne zakresy tlenku węgla obejmują około 0,005% do około 0,24%, około 0,01% do około 0,22%, około 0,015% do około 0,20%, około 0,08% do około 0,20% i około 0,025% do około 0,1% wagowo. Należy zwrócić uwagę, że gazowe kompozycje tlenku węgla o stężeniu tlenku węgla wyższym niż 0,3% (takim jak 1% lub większe) mogą być podawane przez krótkie okresy czasu (np. jeden lub kilka wdechów), w zależności od zastosowania.

Gazowa kompozycja tlenku węgla może być stosowana do stworzenia atmosfery, która obejmuje gazowy tlenek węgla. Atmosferę obejmującą odpowiednie poziomy gazowego tlenku węgla można stworzyć, przykładowo, przez dostarczenie naczynia zawierającego gaz pod zwiększonym ciśnieniem obejmujący gazowy tlenek węgla i uwolnienie gazu pod ciśnieniem z naczynia do komory lub przestrzeni w celu stworzenia atmosfery, która obejmuje gazowy tlenek węgla w komorze lub przestrzeni. Alternatywnie, gazy można uwalniać do aparatów, które są zakończone maską do oddychania lub rurką do oddychania, tworząc w ten sposób atmosferę obejmującą gazowy tlenek węgla w masce do oddychania lub rurce do oddychania, co zapewnia, że pacjent jest jedyną osobą w pokoju wystawioną na działanie znaczących poziomów tlenku węgla.

Poziomy tlenku węgla w atmosferze można mierzyć lub monitorować przy użyciu dowolnych metod znanych w dziedzinie. Metody takie obejmują detekcję elektrochemiczną, chromatografię gazową, zliczanie radioizotopowe, absorpcję w podczerwieni, kolorymetrię i metody elektrochemiczne oparte na membranach selektywnych (patrz, np. Sunderman i wsp., Clin. Chem. 2 8:2026-2032, 1982; Ingi i wsp., Neuron 16:835-842, 1996). Poziomy milionowych części tlenku węgla można wykrywać za pomocą np. chromatografii gazowej i zliczenia radioizotopowego. Ponadto, w dziedzinie wiadomo, że poziomy tlenku węgla w zakresie sub-ppm można mierzyć w tkance biologicznej za pomocą czujników gazowych w średniej podczerwieni (patrz, np. Morimoto i wsp., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280:H482-H488, 2001). Czujniki tlenku węgla i urządzenia do detekcji gazu są szeroko dostępne z wielu dostępnych na rynku źródeł.

Wytwarzanie kompozycji ciekłych

Kompozycja tlenku węgla może także być ciekłą kompozycją tlenku węgla. Ciecz można przekształcić w kompozycję tlenku węgla dowolną metodą znaną w dziedzinie powodując rozpuszczenie gazów w płynach. Przykładowo, ciecz można umieścić w tak zwanym „inkubatorze CO2 i wystawić na działanie ciągłego przepływu tlenku węgla, korzystnie zrównoważonego dwutlenkiem węgla, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia tlenku węgla w cieczy. W innym przykładzie, gazowy tlenek węgla można wprowadzić w postaci „bąbelków bezpośrednio do cieczy, tak aby osiągnąć pożądane stężenie tlenku węgla w płynie. Ilość tlenku węgla, którą można rozpuścić w danym roztworze wodnym wzrasta wraz z obniżaniem temperatury. W jeszcze innym przykładzie, odpowiednią ciecz można przepuścić przez rurkę pozwalającą na dyfuzję gazu, przy czym rurka jest poprowadzona przez atmosferę obejmującą tlenek węgla (np. z wykorzystaniem urządzenia takiego jak pozaustrojowy natleniacz błonowy). Tlenek węgla dyfunduje do płynu tworząc ciekłą kompozycję tlenku węgla.

Prawdopodobnie temperatura takiej kompozycji ciekłej przeznaczonej do wprowadzenia do żywego zwierzęcia będzie wynosić dokładnie lub około 37°C w momencie podawania jej zwierzęciu.

Ciecz może być dowolną cieczą znaną specjalistom w dziedzinie stosowną do podania pacjentom (patrz, przykładowo, Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Zazwyczaj, ciecz będzie roztworem wodnym. Przykłady roztworów obejmują roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS), Celsior™, Perfadex™, roztwór Collinsa, roztwór cytrynianowy i roztwór University of Wisconsin (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford

PL 205 066 B1

University Press (1994)). Cieczą może być roztwór Ringera, np. mleczanowy roztwór Ringera lub dowolna inna ciecz, którą można podać pacjentowi przez infuzję. W innym wykonaniu, ciecz obejmuje krew, np. krew całkowitą.

Dowolny odpowiedni płyn może być nasycony do zadanego stężenia tlenku węgla przez dyfuzory gazowe. Alternatywnie, można zastosować wcześniej przygotowane roztwory poddane kontroli jakości co do określonego poziomu tlenku węgla. Ścisłą kontrolę dawki można osiągnąć przez pomiary z zastosowaniem przepuszczalnych dla gazu i nieprzepuszczalnych dla cieczy błon połączonych z analizatorem tlenku wę gla. Roztwory moż na nasycić do pożądanych skutecznych stęże ń i utrzymywać na tych poziomach.

Leczenie pacjentów kompozycjami tlenku węgla

Pacjenta można leczyć kompozycją tlenku węgla dowolną znaną w dziedzinie metodą podawania pacjentom gazów i/lub cieczy. Kompozycje tlenku węgla można podawać pacjentom, u których zdiagnozowano zapalenie wątroby lub zaklasyfikowanych do grupy ryzyka. Możliwe jest układowe podawanie pacjentom ciekłych lub gazowych kompozycji tlenku węgla (np. przez inhalację i/lub spożycie) oraz miejscowe podawanie kompozycji do wątroby pacjenta (np. przez wprowadzenie do jamy brzusznej).

Układowe dostarczanie tlenku węgla

Gazowe kompozycje tlenku węgla można dostarczać pacjentowi układowo, np. pacjentowi, u którego zdiagnozowano zapalenie wą troby lub zaklasyfikowanego do grupy ryzyka. Gazowe kompozycje tlenku węgla są podawane zazwyczaj przez inhalację przez usta lub przeznosowo do płuc, gdzie tlenek węgla jest z łatwością absorbowany przez przepływającą krew pacjenta. Stężenie aktywnego związku (CO) wykorzystywane w terapeutycznej kompozycji gazowej będzie zależne od absorpcji, rozmieszczenia, poziomów inaktywacji i wydalania (zazwyczaj przez oddychanie) tlenku węgla, jak również od innych czynników znanych specjalistom w dziedzinie. Powinno być ponadto zrozumiałe, że dla dowolnego określonego osobnika specyficzne tryby podawania powinny być dostosowywane w czasie zgodnie z indywidualną potrzebą i profesjonalną opinią osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, i że zakresy stężenia ustalone tu są wyłącznie przykładowe i nie mają na celu ograniczenia zakresu i stosowania kompozycji otrzymanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku. Leczenie można monitorować i dawkowanie CO można dostosować w celu zapewnienia optymalnego leczenia pacjenta. Możliwe jest ostre, półostre i przewlekłe podawanie tlenku węgla, w zależności od np. ciężkości lub utrzymywania się zapalenia wątroby u pacjenta. Tlenek węgla można podawać pacjentowi przez czas (w tym nieokreślony) wystarczający do leczenia stanu i wywarcia zamierzonego efektu farmakologicznego lub biologicznego.

Poniżej przedstawiono przykłady niektórych metod i urządzeń, które można wykorzystać do podawania pacjentom gazowych kompozycji tlenku węgla.

Wentylatory

Medycznej jakości tlenek węgla (różne stężenia) można nabyć jako mieszaninę z powietrzem lub innym gazem zawierającym tlen w standardowym zbiorniku ze sprężonym gazem (np. 21% O2, 79% N2). Jest ona niereaktywna a stężenia, które są wymagane dla celów niniejszego wynalazku znajdują się poniżej zakresu łatwopalnego (10% w powietrzu). W warunkach szpitalnych, gaz będzie prawdopodobnie dostarczany do łóżka pacjenta, gdzie będzie mieszany z tlenem lub powietrzem otoczenia w mieszalniku w celu osiągnięcia pożądanego stężenia w ppm (części na milion). Pacjent będzie wdychać mieszaninę gazu przez wentylator, którego szybkość przepływu będzie ustawiona w zależ noś ci od komfortu i potrzeb pacjenta, ocenianych na podstawie wykresu pł ucnego (tzn. czę stości oddechów, objętości oddechowych etc). W systemie dostawczym, w celu ochrony pacjenta przed zbędnym otrzymywaniem wyższych niż pożądane ilości tlenku węgla, można zaprojektować mechanizm(y) zabezpieczające w razie uszkodzenia. Poziom tlenku węgla pacjenta można monitorować oznaczając poziom (1) karboksyhemoglobiny (COHb) mierzony we krwi żylnej oraz (2) wydychanego tlenku węgla odbieranego z bocznego wyjścia wentylatora. Wystawienie na działanie tlenku węgla może być dostosowywane w oparciu o stan zdrowia pacjenta i markery. Jeśli to konieczne, tlenek węgla można usunąć z pacjenta przez przestawienie inhalacji na 100% O2. Tlenek węgla nie jest metabolizowany; zatem, cokolwiek jest wdychane będzie w końcu wydychane z wyjątkiem niewielkiego procenta, który jest przekształcany w CO2. Tlenek węgla można także mieszać z dowolnym poziomem O2, aby uzyskać efekt terapeutycznego dostarczenia tlenku węgla bez konsekwencji w postaci stanów niedotlenienia.

PL 205 066 B1

Maska na twarz i namiot

Mieszanina gazowa zawierająca tlenek węgla jest wytwarzana jak powyżej w celu umożliwienia pacjentowi biernej inhalacji przy użyciu maski na twarz lub namiotu. Wdychane stężenie można zmieniać i można usuwać przez proste przestawienie na 100% O2. Monitorowanie poziomów tlenku węgla powinno odbywać się w lub w pobliżu maski lub namiotu za pomocą mechanizmu zabezpieczającego w razie uszkodzenia, który bę dzie zapobiegać przed wdychaniem zbyt wysokiego stężenia tlenku węgla.

Przenośny inhalator

Sprężony tlenek węgla można załadować do przenośnych urządzeń inhalacyjnych i podawać w dawce dozowanej, przykładowo, co pozwala na przerywane leczenie biorcy, który nie przebywa w warunkach szpitalnych. Do pojemników można załadować róż ne stężenia tlenku węgla. Urządzenie może być tak proste, jak mały zbiornik (np. poniżej 5 kg) zawierający stosownie rozcieńczony CO, z zaworem otwierają co-zamykają cym i rurką przez którą pacjent zacią ga CO, zgodnie ze standardowym trybem pobierania lub zgodnie z potrzebą.

Dożylne sztuczne płuco

Do dostarczania tlenku węgla można zastosować sztuczne płuco (cewnik do wymiany gazowej we krwi) zaprojektowane do dostarczania O2 i usuwania CO2. Cewnik, po implantacji, mieści się w jednej z większych żył i moż e dostarczać tlenek wę gla w danym stężeniu dla celów układowego dostarczania lub w określonym miejscu. Dostarczanie może być miejscowym dostarczeniem wysokiego stężenia tlenku węgla przez krótki okres czasu w miejscu procedury, np. w pobliżu wątroby (takie stężenie będzie szybko rozcieńczone w strumieniu krwi) lub względnie długą ekspozycją na niższe stężenia tlenku węgla (patrz, np. Hattler i wsp., Artif. Organs 18(11): 806-812 (1994) oraz Golob i wsp., ASAIO J., 47(5) :432-437 (2001)).

Komora normobaryczna

W pewnych przykładach, mogłoby być pożądane wystawienie na działanie tlenku węgla całego pacjenta. Pacjent znajdowałby się w hermetycznej komorze, która byłaby wypełniona tlenkiem węgla (na poziomie, który nie narazi pacjenta na niebezpieczeństwo lub na poziomie pozwalającym na dopuszczalne ryzyko bez ryzyka wystawienia na działanie osoby postronnej). Po zakończeniu ekspozycji, komora mogłaby być spłukiwana powietrzem (np. 21% O2, 79% N2) i za pomocą analizatorów tlenku węgla byłyby analizowane próbki w celu zapewnienia, że pacjent nie opuści systemu do eksponowania zanim nie zostanie usunięty tlenek węgla.

Układowe dostarczanie ciekłych kompozycji CO

Wodne roztwory obejmujące tlenek węgla mogą być przygotowane do układowego podawania pacjentowi, np. do podawania doustnego i/lub przez infuzję pacjentowi, np. dożylną, dotętniczą, dootrzewnową, i/lub podskórną. Przykładowo, ciekłe kompozycje CO, takie jak roztwór Ringera nasycony CO, można podawać pacjentowi, choremu lub z ryzykiem zapalenia wątroby, na drodze infuzji. Alternatywnie lub dodatkowo, pacjentowi można podawać na drodze infuzji całkowitą (lub częściową) krew częściowo lub całkowicie nasyconą CO.

Niniejszy wynalazek także rozważa wykorzystanie czynników zdolnych do dostarczania dawek gazowych kompozycji CO lub ciekłych kompozycji CO (np. gumy uwalniające CO, kremy, maści, pastylki lub plastry).

Miejscowe leczenie narządów tlenkiem węgla

Alternatywnie lub dodatkowo, kompozycje tlenku węgla można podawać bezpośrednio do wątroby, np. do całej wątroby lub do dowolnej jej części. Gazową kompozycję można bezpośrednio podawać do wątroby pacjenta dowolną znaną w dziedzinie metodą wdmuchiwania pacjentowi gazów. Przykładowo, gazy, np. dwutlenek węgla, są często wdmuchiwane do jamy brzusznej pacjentów w celu polepszenia badania podczas procedur laparoskopowych (patrz, np. Oxford Textbook of Surgery, Morris i Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Praktykujący specjalista będzie wiedział, że podobne procedury można by zastosować do podawania kompozycji tlenku węgla bezpośrednio do wątroby pacjenta.

Wodne kompozycje tlenku węgla można także podawać miejscowo do wątroby pacjenta. Wodne postacie kompozycji można podawać pacjentowi dowolną znaną w dziedzinie metodą podawania płynów. Tak jak kompozycje gazowe, kompozycje wodne można podawać bezpośrednio do wątroby. Przykładowo, ciecze, np. roztwory soli fizjologicznej zawierające rozpuszczony CO, można wstrzykiwać do jamy ciała pacjenta podczas procedur laparoskopowych. Praktykujący specjalista będzie wiedział, że podobne procedury można by zastosować do podawania ciekłych kompozycji tlenku węgla

PL 205 066 B1 bezpośrednio do wątroby pacjenta. Ponadto, można przeprowadzić ekspozycję in situ przez przepłukanie wątroby lub jej części ciekłą kompozycją tlenku węgla (patrz Oxford Textbook of Surgery, wyd. Morris i Malt, Oxford University Press (1994)).

Zastosowanie wobec zapalenia wątroby hemoksygenazy-1, innych związków i innych sposobów leczenia

W połączeniu z podawaniem CO może mieć miejsce także indukcja lub ekspresja hemeoksygenazy-1 (HO-1). Przykładowo, HO-1 można indukować u pacjenta cierpiącego lub z ryzykiem zapalenia wątroby. W zastosowanym tu znaczeniu termin „indukować (indukowany) oznacza wywołanie zwiększenia wytwarzania białka, np. HO-1, w izolowanych komórkach lub komórkach tkanki, narządu lub zwierzęcia przy zastosowaniu własnego endogennego genu komórkowego (np. niezrekombinowanego), który koduje białko.

HO-1 można indukować u pacjenta za pomocą dowolnej metody znanej w dziedzinie. Przykładowo, wytwarzanie HO-1 można indukować heminą, protoporfiryną żelazową lub protoporfiryną kobaltową. Silnymi induktorami ekspresji HO-1 są także różne czynniki niezawierające żelaza, w tym metale ciężkie, cytokiny, hormony, NO, COCl2, endotoksyna i szok cieplny (Choi i wsp., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997 oraz Tenhunen i wsp., J. Lab. Clin. Med. 75:410-421, 1970). HO-1 jest takż e silnie indukowana przez róż ne czynniki wywołujące stres oksydacyjny, włączając nadtlenek wodoru, „wymiatacze glutationu, promieniowanie UV, endotoksynę i nadmiar tlenu we krwi lub tkance (Choi i wsp., Am. J. Respir. Celi Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997 oraz Keyse i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:99-103, 1989). „Kompozycja farmaceutyczna obejmująca induktor HO-1 oznacza kompozycję farmaceutyczną zawierającą dowolny czynnik zdolny do indukcji HO-1 u pacjenta, np. dowolny czynnik opisany powyżej, np. NO, heminę, protoporfirynę żelazową i/lub protoporfirynę kobaltową.

Ekspresję HO-1 w komórce można podnieść przez przeniesienie genu. W zastosowanym tu znaczeniu termin „ekspresja (wyrażanie) oznacza wywołanie zwiększonego wytwarzania białka, np. HO-1 lub ferrytyny, w wyizolowanych komórkach lub komórkach tkanki, narządu lub zwierzęcia przy zastosowaniu genu podanego egzogennie (np. genu zrekombinowanego). HO-1 lub ferrytyna jest korzystnie z tego samego gatunku (np. człowiek, mysz, szczur, etc.) jak biorca, w celu zminimalizowania reakcji odpornościowej. Ekspresja mogłaby być kierowana przez promotor konstytutywny (np. promotory cytomegalowirusa) lub promotor tkankowo-specyficzny (np. promotor mlecznej serwatki dla komórek ssaczych lub promotor albuminy dla komórek wątroby). Odpowiedni wektor do terapii genowej (np. retrowirus, adenowirus, wirus towarzyszący adenowirusom (AAV), poksywirus (np. ospy), wirus ludzkiego niedoboru odporności (HIV), wirus MVM (ang. minute virus of mice), wirus zapalenia wątroby typu B, wirus grypy, wirus Herpes Simplex 1 i lentiwirus) kodujący HO-1 lub ferrytynę byłby podawany pacjentowi choremu na zapalenie wątroby lub z ryzykiem zapalenia wątroby przez usta, przez wdychanie, lub przez wstrzyknięcie do wątroby. Podobnie można podawać wektory plazmidowe kodujące HO-1 lub apoferrytynę, np. jako nagi DNA, w liposomach lub w mikrocząstkach.

Ponadto, egzogenne białko HO-1 można bezpośrednio podawać pacjentowi za pomocą dowolnej metody znanej w dziedzinie. Egzogenne HO-1 może być podawane bezpośrednio jako dodatkowe lub alternatywne wobec indukcji lub ekspresji HO-1 u pacjenta, jak opisano powyżej. Białko HO-1 można podawać pacjentowi, przykładowo, w liposomach i/lub jako białko fuzyjne, np. jako białko fuzyjne z TAT (patrz, np. Becker-Hapak i wsp., Methods 24:247-256, 2001).

Alternatywnie lub dodatkowo, pacjentowi można podawać dowolne produkty metabolizmu HO-1, np. bilirubinę, biliwerdynę, żelazo i/lub ferrytynę w połączeniu z CO w celu zapobiegania lub leczenia zapalenia wątroby. Ponadto pacjentowi można podawać cząsteczki wiążące żelazo inne od ferrytyny, np. desferoksaminę (DFO), dekstran żelaza i/lub apoferrytynę. Co więcej enzymy (np. reduktaza biliwerdyny), które katalizują rozkład dowolnego z tych produktów mogą być hamowane w celu stworzenia/wzmocnienia pożądanego efektu. Każdy z powyższych czynników można podawać np. doustnie, dożylnie, dootrzewnowo lub bezpośrednio do wątroby.

Związki, które uwalniają CO do ciała po ich podaniu (np. związki uwalniające CO, np. podlegające fotoaktywacji związki uwalniające CO), np. dekakarbonylodimangan, dimer trikarbonylodichlororutenu (II) i chlorek metylenowy (np. w dawce pomiędzy 400 do 600 mg/kg, np. około 500 mg/kg) można także stosować w sposobach tu opisanych, jak również karboksyhemoglobinę i substytuty hemoglobiny będące donorami CO.

PL 205 066 B1

Powyższe związki można podawać pacjentowi dowolną drogą, np. doustnie, dootrzewnowo, dożylnie lub dotętniczo. Dowolny z powyższych związków można podawać pacjentowi miejscowo i/lub układowo i w kombinacji.

Kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być wykorzystywana do leczenia/zapobiegania zapaleniu wątroby w kombinacji z dowolnymi znanymi metodami lub związkami do leczenia zapalenia wątroby, np. przerwaniem lub zredukowaniem podawania leków wywołujących zapalenie wątroby; podawaniem pacjentowi kortykosteroidów i/lub α-interferon u lub innych czynników antywirusowych i/lub przeprowadzeniem na pacjencie zabiegu chirurgicznego, np. przeszczepu wątroby.

Wynalazek jest w części zilustrowany następującymi przykładami.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Tlenek węgla hamuje uszkodzenie wątroby

Zwierzęta

W doświadczeniach in vitro stosowano samce C57BL/6J (Charles Rivers Laboratories, Bar Harbor, ME), myszy inos^-/- w wieku 8-12 tyg. i młode typu dzikiego (hodowane/utrzymywane w University of Pittsburgh).

Modele ostrego uszkodzenia wątroby

Grupom myszy podawano TNF-a/D-gal (odpowiednio 0,3 μg/8mg/mysz, i.p.). W zależności od warunków doświadczalnych niektóre myszy otrzymywały CO (250 ppm), selektywny donor NO, 1-(pirolidyn-1-ylo)diazen-1-ium-1,2-dioleinian O2-winylu (V-PYRRO; 10 mg/kg podskórnie [b.c.), Alexis Biochem., San Diego, CA) lub protoporfirynę kobaltową (CoPP, 5 mg/kg, dootrzewnowo (i.p.), Frontier Scientific, Logan, UT). Dodatkowo, tam gdzie zaznaczono podawano selektywny inhibitor iNOS, dihydrochlorek L-N6-(1-iminoetylo)-lizyny (L-NIL; 5 mg/kg, i.p., Alexis Biochemicals) lub inhibitor HO-1, protoporfirynę cynową (SnPP; 50 μmol/kg, i.p., Frontier Scientific). Wówczas gdy zaznaczono podawano acetaminofen (Sigma Chem. Co.; St Louis, MO) (500 mg/kg, i.p.).

Hodowla hepatocytów

Pierwotne hepatocyty mysie zbierano z C57BL/6J, mkk3^-/-, inos^-/- (kolonia hodowli domowej), lub myszy hmox-1^-/-, jak opisano w Kim i wsp. (J. Biol. Chem. 272: 1402-1411 (1997)). Hepatocyty wykorzystywano 1-3 dni po zebraniu.

Indukcja śmierci/apoptozy hepatocytów

Komórki poddawano działaniu TNF-a (10 ng/ml) i aktynomycyny-D (Act-D; 200 ng/ml, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) w celu zaindukowania śmierci. Wykazano, że działanie TNF-a/ActD indukuje śmierć komórek, w szczególności apoptozę, pierwotnych hepatocytów (patrz, np. Kim i wsp. (J.Biol.Chem. 272: 1402-1411 (1997)). Hepatocyty traktowano CO, donorem NO, s-nitrozo-N-acetylo-penicyloaminą (SNAP; 250-750 μM) i/lub dodatkowymi czynnikami farmakologicznymi. Dwanaście godz. po traktowaniu TNF-a/ActD, komórki płukano i barwiono fioletem krystalicznym w celu określenia żywotności jak opisano wcześniej (Id.). Tam gdzie wskazano, podawano selektywny inhibitor iNOS in vitro, L-N5-(1-iminoetylo)-ornitynę-2HCl (LNIO;1-2 mM; Calbiochem, San Diego, CA).

Przenoszenie genów/plazmidy

W niektórych doświadczeniach, przeprowadzano przeniesienie genu superrepresora kBa (Hellerbrand i wsp., Hepatology 27:1285-1295 (1998)) lub β-galaktozydazy przy zastosowaniu wektorów adenowirusowych (10 pfu/cell) 12 godz. przed podaniem TNF-a/ActD. Aktywację NF-kB oceniano przy zastosowaniu testu z lucyferazą reporterową, jak opisano w Chow i wsp. (J. Biol. Chem. 274: 1068910692 (1999)). Pokrótce, hepatocyty poddawano współtransfekcji z konstruktami reporterowymi NFkB (lucyferazą pGL3-kappae, 100 ng/studzienkę oraz pIEP-Lac-z 0,5 μg/studzienkę) przy zastosowaniu Lipofectin™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), zgodnie z zaleceniem producenta. Ocenę ekspresji iNOS prowadzono przy zastosowaniu testu z reporterową lucyferazą, jak opisano w Lowenstein i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9730-9734 (1993)). W skrócie, hepatocyty poddawano współtransfekcji konstruktami reporterowymi promotora iNOS (pXP2; 1 ^g/studzienkę) i pIEP-LacZ (0,5 μg/studzienkę) jak opisano powyżej.

Test z reporterową lucyferazą

Hepatocyty transfekowano plazmidami jak opisano powyżej i traktowano różnymi bodźcami 24 godz. po transfekcji. Aktywność lucyferazy (zapisywaną w postaci jednostek arbitralnych; A.U.) badano 6 godz. po rozpoczęciu traktowania, przy zastosowaniu zestawu do testu z lucyferazą (Promega, Madison, WI) i luminometra Berthold. Wyniki korygowano według wydajności transfekcji i stężenia białka.

PL 205 066 B1

Test zmiany ruchliwości elektroforetycznej

Po traktowaniu jądra poddawano ekstrakcji z hepatocytów. Sekwencję najwyższej zgodności dla NF-kB dwuniciowego DNA (GGGGACTTTCCC (SEKW. NR ID.: 1)); Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) wyznakowano ^-³²P]-ATP i inkubowano z 5 mg całkowitego białka jądrowego. Niektóre inkubacje prowadzono w obecności przeciwciał skierowanych przeciwko p65/RelA lub p50 (Santa Cruz Biotech) w celu oceny super-przesunięcia. Test zmiany ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) przeprowadzono jak opisano w Taylor i wsp. (J. Biol. Chem. 273: 15148-15156 (1998)).

Analiza immunoblotu

Analizę typu Western blot prowadzono na pierwotnych hepatocytach w hodowli lub z homogenatów wątroby z przeciwciałami wobec iNOS (Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky; 1:1000), HO-1 (Calbiochem; 1:2000) lub β-aktyny (Sigma Chemical; 1:5000). 30 μg białka w doświadczeniach z hodowlą komórkową lub 100 μg białka z homogenatów wątroby na studzienkę nanoszono dla celów SDS-PAGE.

Histologia/Immunohistochemia

Wątroby do badań histologicznych i immunohistochemicznych utrwalano w 2% paraformaldehydzie i następnie szybko zamrażano w ciekłym azocie. Następnie wątroby cięto na skrawki (grubości 7 mikronów) i barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E). Skrawki barwiono także dla celów TUNEL i aktywowanej kaspazy-3 przy zastosowaniu zestawów według zaleceń producenta (Promega). Skrawki do badań immunocytochemicznych iNOS blokowano 5% surowicą kozią zawierającą 0,2% wołową albuminą surowiczą. Następnie skrawki inkubowano przez 1 godz. w temp. pokojowej z przeciwciałem anty-iNOS (Transduction Laboratories; 1:300), następnie płukano i poddawano działaniu sondy z drugorzędowego przeciwciała skoniugowanego z Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Jądra barwiono barwnikiem Hoechst. Obrazy wykonywano przy zastosowaniu mikroskopu Olympus Provus. Hepatocyty w hodowli wysiewano na pokryte żelatyną szkiełka nakrywkowe, poddawano bodźcom jak wskazano, a następnie utrwalano 2% paraformaldehydem zawierającym 0,1% Triton X-100. Blokowanie i barwienie było podobne jak to dla skrawków wątroby z wyjątkiem tego, że wykorzystano przeciwciało anty-p65/RelA (Santa Cruz Biotechnology; 1:350).

Ekspozycja na CO

Zwierzęta wystawiono na działanie CO w stężeniu 250 ppm. Po krotce, 1% CO w powietrzu zmieszano z powietrzem (21% tlenu) w cylindrze do mieszania ze stali nierdzewnej, a następnie skierowano do 3,70 ft³ szklanej komory ekspozycyjnej z szybkością przepływu 12 L/min. Do ciągłego pomiaru poziomów CO zastosowano analizator CO (Interscan, Chatsworth, CA). Stężenia CO utrzymywano przez cały czas na poziomie 250 ppm. Myszy umieszczano w komorze ekspozycyjnej zgodnie z wymaganiami.

HO-1 chroni przed urazem wątroby

Badano czy HO-1 chroni przed ostrą niewydolnością wątroby. Wyniki przedstawiono na Fig. 1. Samcom myszy C57BL/6J podawano protoporfirynę kobaltową (5 mg/kg, i.p.). Dwadzieścia cztery godz. później myszom podawano TNF-a/D-gal (odpowiednio 0,3 μg/8mg/mysz, i.p.). Osiem godz. po podaniu TNF-a/D-gal u myszy mierzono poziomy surowiczej aminotransferazy alaninowej (ALT). Na podstawie pomiarów surowiczej ALT ustalono, że indukcja HO-1 zapobiega urazowi wątroby.

Egzogenny CO chroni hepatocyty

Badano czy egzogenny CO chroni hepatocyty przed śmiercią komórkową in vitro. Wyniki przedstawiono na Fig. 2 i 3. W celu uzyskania wyników prezentowanych na Fig. 2, mysie hepatocyty inkubowano wstępnie z CO (250 ppm) przez 1 godzinę (standardowy czas wstępnego traktowania dla wszystkich doświadczeń) przed dodaniem TNF-a/Act-D (10 ng/200 ng/ml odpowiednio). Komórki utrzymywano w CO przez czas trwania doświadczenia. Dwanaście godzin później, oceniano żywotność komórek jak opisano w Kim i wsp. (J. Biol. Chem. 272: 1402-1411 (1997)). Doświadczenia na adenowirusach wymagały inkubacji hepatocytów przez noc z 10 pfu/komórkę adenowirusa przed dodaniem TNF-a/ActD, a następnie zbadania żywotności przy zastosowaniu fioletu krystalicznego. W modelu tym badano także rolę cząsteczek sygnałowych - cyklazy guanylowej i p38 MAPK. Dla oceny roli cGMP i potwierdzenia roli NF-kB, hepatocyty traktowano oddzielnie rozpuszczalnym inhibitorem cyklazy guanylowej (sGC), 1H-[1,2,4]oksadiazolo[4,3-a]chinoksalin-1-onem (ODQ; Calbiochem; 2-10 μM) lub inhibitorem NF-kB, BAY 11-7082 (10 μM). Komórki traktowano inhibitorami przez 1 godzinę poprzedzającą 1 godzinne wstępne traktowanie CO. Następnie dodawano TNF-a/ActD i 12 godzin później testowano żywotność komórek. Aktywacja NF-kB była istotna dla ochrony wywo14

PL 205 066 B1 ływanej przez CO, podczas gdy cGMP nie był wymagany. Poddanie działaniu CO prowadziło do znacząco mniejszej śmierci komórek (*p<0,01) niż bez CO.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 3, pierwotne hepatocyty ludzkie uzyskane z wycięcia wątroby dawcy traktowano CO i TNF-a/ActD jak opisano powyżej.

Wystawienie pierwotnych hepatocytów mysich, szczurzych i ludzkich na działanie CO hamowało apoptozę indukowaną TNF-α. Hamowanie apoptozy hepatocytów było niezależne od wytwarzania cGMP, ponieważ selektywny inhibitor cyklazy guanylowej ODQ nie odwracał ochrony nadawanej przez CO (Fig. 2). Dodatkowo, traktowanie CO hamowało śmierć komórek zarówno w obecności selektywnego inhibitora aktywacji p38 MAPK, SB203580 (3-30 μM, Calbiochem) jak i w hepatocytach myszy mkk3^-/-, działająca nadrzędnie kinaza dominująca dla p38 (wyników nie przedstawione). Zatem, wpływy CO były niezależne od drogi cGMP/p38 MAPK. W doświadczeniach tych hepatocyty traktowano wstępnie CO przez jedną godzinę przed podaniem do podłoża TNF-a/ActD. Jeśli traktowanie CO rozpoczynano po dodaniu TNF-α obserwowano mniejszą ochronę (wyników nie przedstawiono).

Rola NF-kB w ochronie dostarczanej przez CO

Badano czy ochrona hepatocytów indukowana przez CO zależy od NF-kB. Fig. 4, 5 i 6A-6C prezentują wyniki ilustrujące, że CO indukował wzrost przemieszczenia NF-kB w jądrze i wiązania DNA w mysich hepatocytach, co odpowiednio mierzono testem aktywności NF-kB z reporterową lucyferazą, EMSA, i immunobarwieniem badającym przemieszczenie RelA/p65 w jądrze.

W celu uzyskania wyników prezentowanych na Fig. 4, oceniano aktywność NF-kB przy zastosowaniu testu z lucyferazą reporterową jak opisano w Chow i wsp. (J.Biol. Chem. 274: 10689-10692 (1999)). Po krotce, 24 godz. przed dodaniem BAY 11-7082 (10 μM) lub nośnika, hepatocyty współtransfekwano konstruktami reporterowmi NF-kB i pIEP-Lac-z. Komórki inkubowano przez 1 godzinę przed podaniem CO (250 ppm). Aktywność lucyferazy (raportowaną w postaci arbitralnych jednostek; A.U.) badano 6 godzin po ekspozycji na CO lub mieszaninę cytokin (CM) złożoną z TNF-a (500 U/ml), IL-1 β (100 U/ml) i IFN-δ (100 U/ml), którą stosowano jako kontrolę pozytywną aktywacji NF-kB. Wyniki korygowano według wydajności transfekcji i stężenia białka.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 5, oceniano wiązanie NF-kB DNA przy zastosowaniu EMSA w hepatocytach traktowanych CO (250 ppm). Notowano zależny od czasu wzrost wiązania NF-kB (całkowitego) z maksimum ekspresji w ciągu jednej godziny (ścieżki 1, 4, 7). Następnie ekstrakty poddawano analizie superprzesunięcia w celu zidentyfikowania różnych dimerów NF-kB przy zastosowaniu przeciwciał skierowanych przeciwko p50 (ścieżki 2, 5, 8) i p65 (ścieżki 3, 6, 9).

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 6A-6C, pierwotne hepatocyty poddawano immunobarwieniu w celu zlokalizowania p65 w jądrze po wystawieniu przez 1 godz. na działanie CO (250 ppm). Obrazy przedstawiają przemieszczenie NF-kB w jądrze (strzałki wskazujące zielone jądra pokazują przemieszczenie NF-kB) w komórkach traktowanych zarówno CM (stosowanej jako kontrola pozytywna) jak i CO względem braku lokalizacji w komórkach traktowanych powietrzem (strzałki pokazujące niebieskie jądra).

Aktywność w teście NF-kB z lucyferazą reporterową osiągnęła maksimum w ciągu jednej godziny po umieszczeniu komórek w atmosferze z CO. Mieszaninę cytokin (CM) włączono do traktowanych grup jako pozytywny sygnał, jak również jako standard maksymalnej aktywności reportera dzięki któremu oceniano efekty CO. Uzyskanie wydajnej transfekcji pierwotnych hepatocytów jest trudne, lecz aktywność reportera była znacząca (*p<0,001 względem kontroli). Wyniki te w połączeniu z pozytywnym immunobarwieniem i wynikami EMSA potwierdzają obserwację, że CO indukuje średni wzrost NF-kB, który sam w sobie może częściowo prowadzić do selektywnej ekspresji genu. W celu oceny czy aktywność NF-kB jest potrzebna do ochrony za pośrednictwem CO, wykorzystano przeniesienie genu kBa za pomocą adenowirusa w celu uniemożliwienia przemieszczenia NF-kB oraz BAY 11-7082 (1-10 mM, Calbiochem) do zahamowania aktywacji NF-kB. Ochronne efekty CO były zniesione przez zahamowanie aktywności NF-kB.

Rola ekspresji iNOS zależnej od NF-kB w ochronie dostarczanej przez CO

Badano czy ochrona hepatocytów za pośrednictwem CO wymaga ekspresji iNOS i wytworzenia NO. Wyniki przedstawiono na Fig. 7, 8, i 9.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 7, oceniono ekspresję iNOS przy zastosowaniu testu z reporterową lucyferazą jak opisano w Lowenstein i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9730-9734 (1993)). W skrócie, 24 godziny przed ekspozycją na BAY 11-7082 (10 μM) lub nośnik hepatocyty współtransfekowano konstruktem reporterowego promotora iNOS i pIEP-LacZ. Komórki inkubowano z BAY 1 godzinę przed wystawieniem na działanie CO (250 ppm). Aktywność lucyferazy

PL 205 066 B1 (zapisywaną w postaci arbitralnych jednostek; A.U.) określano jak powyżej. Mieszaninę cytokinin (CM; patrz powyżej) stosowano jako kontrolę pozytywną do indukcji ekspresji iNOS i wyniki korygowano według wydajności transformacji i stężenia białka.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 8, określano ekspresję białka iNOS przy zastosowaniu technik immunoblottingu. Po krotce, ekstrakty komórkowe z hepatocytów poddawano działaniu TNF-a/ActD przez 6-8 godzin w obecności i nieobecności CO (250 ppm). Komórki kontrolne otrzymywały powietrze lub sam CO. Na Fig. 8 odnotowano, że TNF-a indukuje minimalnie ekspresję iNOS, podczas gdy komórki te podawane działaniu TNF-a w obecności CO wykazują znacząco większą indukcję białka iNOS.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 9, hepatocyty mysie izolowano z myszy inos^-/- lub typu dzikiego C57BL/6J, które następnie poddawano wstępnemu działaniu L-NIO (1 mM) przez 1 godzinę, w celu zahamowania iNOS przed podaniem CO. Te eksponowane na CO grupy otrzymywały jednogodzinne wstępne traktowanie przed dodaniem TNF-a/ActD, a następnie były z powrotem poddawane działaniu CO. CO nie dawał ochrony przed śmiercią komórek, co określono za pomocą wykluczenia fioletem krystalicznym 12 godzin później, w komórkach w których nie było ekspresji iNOS lub została ona zahamowana.

Wystawienie hepatocytów na działanie CO dawało wysoko znaczący wzrost aktywności w teście z reporterową lucyferazą dla iNOS (Fig. 7). Ponownie, zastosowano mieszaninę cytokin zarówno jako kontrolę pozytywną w transfekcjach o niskiej wydajności jak i jako standard za pomocą którego oceniano wpływy CO. Zgodnie z tym, że ekspresja iNOS zależy od NF-kB, w hepatocytach traktowanych BAY 11-7082 obserwowano zmniejszenie aktywności reporterowej (Fig. 7). Dodatkowo, ilość białka iNOS znacząco wzrastała w odpowiedzi na TNF-a w obecności CO w porównaniu z samym TNF -a (Fig. 8). Stosując hepatocyty z myszy znokautowanych względem iNOS (inos^-/-) i hepatocyty dzikiego typu traktowane selektywnym dla iNOS inhibitorem L-NIO (1 mM, Calbiochem), zgłaszający ustalili czy CO mogło chronić przed śmiercią indukowaną TNF-a przy braku aktywności iNOS. Hepatocyty bez aktywności iNOS nie były chronione przez CO przed śmiercią komórek indukowaną TNF-a podczas gdy hepatocyty dzikiego typu były chronione (Fig. 9). Razem wziąwszy wyniki te pokazują, że CO wymaga aktywacji NF-kB i ekspresji iNOS w celu ochrony hepatocytów przed śmiercią komórek in vitro.

Wdychane CO stanowi ochronę przeciwko niewydolności wątroby

Badano czy wdychanie CO chroni myszy przed uszkodzeniem wątroby w modelu TNF-a/D-gal piorunującej niewydolności wątroby. Wyniki przedstawiono na Fig. 10 i 11A-11H.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 10, myszy poddawano wstępnemu traktowaniu CO (250 ppm) przez jedną godzinę przed podaniem TNF-a/D-gal (odpowiednio 0,3 μg/8 mg/mysz; i.p.). Po otrzymaniu TNF-a/D-gal, myszy z powrotem przenoszono do komory do wystawiania na działanie CO i 6-8 godzin później analizowano ich surowicę pod kątem poziomów ALT. Bez ekspozycji na CO niewydolność wątroby pojawiała się w 6-8 godzin, kierowana głównie apoptozą hepatocytów jak w opisanym powyżej modelu in vitro. ALT w surowicach myszy traktowanych CO była 74% niższa niż u myszy poddanych działaniu powietrza.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 11A-11H, próbki wątroby pochodzące od myszy traktowanych TNF-a/D-gal w obecności i braku CO (250 ppm) przez 8 godzin krojono i barwiono hematoksyliną & eozyną (H&E), aktywowaną kaspazą 3 (na co wskazuje wzrost intensywności czerwieni) i TUNEL dla komórek pozytywnych (co rozgraniczono przez wzrost zielonego zabarwienia komórek; marker śmierci komórek). Jądra barwiły się na niebiesko. Jak oszacowano na podstawie barwienia H&E ekspozycja na CO znacząco redukowała uszkodzenie wątroby indukowane TNF-a/D-gal. Wątroby z myszy eksponowanych na CO także wykazywały mniej komórek pozytywnych wobec TUNEL, wykazywały słabsze barwienie aktywowaną kaspazą-3 i posiadały prawidłową architekturę. Myszy kontrolne eksponowane na powietrze, które otrzymały TNF-a/D-gal wykazywały znaczące zapalenie wątroby, obrzęk, krwotok i utratę architektury.

Wyniki omówione powyżej potwierdzono stosując zamiast TNF lipopolisacharydy (LPS, także określane jako endotoksyny). W tych potwierdzających badaniach, wynikiem podawania LPS/D-Gal był wzrost poziomów ALT w surowicy, z poziomu kontrolnego 20 +/- 5 IU/ml do >1000 IU/ml, w pomiarze przeprowadzonym po 8 godzinach od podania LPS/D-Gal. U myszy wstępnie traktowanych 250 ppm CO, wzrost ALT był zredukowany w >75%, do 250 +/- 75 IU/ml. Do dalszej charakterystyki efektów obserwowanych z CO w tym modelu, mierzono surowiczą interleukinę-6 i ustalono, że była zredukowana 65% u zwierząt wdychających CO w stosunku do kontroli wdychających powietrze (wy16

PL 205 066 B1 ników nie pokazano). Obraz histopatologiczny tkanek wątroby pochodzących od tych myszy był podobny do pokazanego gdy stosowano TNF/D-Gal. Myszy nie traktowane i traktowane CO (bez LPS/DGal) nie miały objawów uszkodzenia, podczas gdy te traktowane powietrzem i LPS/D-Gal wykazywały znaczące uszkodzenie, w tym obrzęk, krwotok, infiltrację neutrofili i ogólne zniszczenie prawidłowej morfologii i architektury. Dla kontrastu, wątroby z myszy traktowanych CO i LPS/D-Gal były chronione w tym samym zakresie jak myszy traktowane CO i TNF/D-Gal. Obserwowano niewiele zmian w markerach zapalenia (obrzęk, krwotok, infiltracja neutrofili). Architektura była zachowana i wydawała się ogólnie podobna do tej u myszy nie traktowanych i traktowanych CO (bez LPS/D-Gal). Ogólnie, zastosowanie LPS/D-Gal do indukcji ostrego zapalenia wątroby odpowiadało i potwierdzało wyniki uzyskane przy traktowaniu TNF/D-Gal.

Rola iNOS w ochronie przed uszkodzeniem wątroby dostarczonej za pomocą CO

Przy zastosowaniu technik immunoblottingu i immunohisto-chemii badano czy w wątrobach myszy wystawionych na działanie CO po traktowaniu TNF-a/D-gal wzrastały poziomy wątrobowego białka iNOS. Ponadto, badano czy CO może chronić myszy inos^-/- lub myszy typu dzikiego traktowane selektywnym dla iNOS inhibitorem L-NIL (10 mg/kg, i.p; podawanym co 2 godz.) w celu określenia czy ekspresja iNOS posiada funkcjonalną rolę.

Wyniki dostarczono na Fig. 12, 13A-13D, i 14.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 12, samce myszy C57BL/6J traktowano powietrzem lub CO (250 ppm) na 1 godz. przed podaniem TNF-a/D-gal (odpowiednio 0,3 μg/8mg/mysz, i.p.). Sześć godzin później, wątroby zbierano w celu oceny ekspresji iNOS za pomocą immunoblottingu. Wyniki pokazują, że ekspresja iNOS wzrastała skromnie u myszy traktowanych powietrzem/ TNF-a/D-gal, a znacząco wzrastała u myszy traktowanych TNF-a/D-gal i CO. Zgodnie z oczekiwaniem, myszy inos'¹' nie wytwarzały białka iNOS.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 13A-13D, skrawki wątroby mysiej barwiono immunologicznie w celu uwidocznienia ekspresji iNOS. Skrawki wątroby uzyskiwano z myszy traktowanych TNF-a/D-gal w obecności lub bez CO oraz z kontroli eksponowanych na powietrze i CO, które nie otrzymały TNF-a/D-gal. Wątroby z myszy eksponowanych na CO i nie otrzymujących TNF-a/D-gal wykazywały skromny wzrost ekspresji iNOS. Chociaż, znacząco większy wzrost ekspresji (wykazany przez wzrost komórek barwiących się na zielono) obserwowano w wątrobach z myszy eksponowanych na CO i otrzymujących TNF-a/D-gal. Wydaje się, że wzrost ekspresji występuje wokół naczyń krwionośnych.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 14, wydajność ochrony indukowanej przez CO badano przy braku aktywności iNOS stosując myszy inos^-/- i myszy typu dzikiego, które traktowano L-NIL, selektywny inhibitorem iNOS (L-NIL; 5 mg/kg, i.p. podawane co 2 godz.). L-NIL podawano 2 godz. przed CO. Zwierzęta traktowane CO były następnie wstępnie traktowane (250 ppm) przez 1 godz. przed podaniem TNF-a/D-gal. Jak oceniono na podstawie poziomów surowiczej ALT i wyników histopatologicznych, CO nie jest w stanie chronić przed uszkodzeniem wątroby przy braku funkcjonowania/ekspresji iNOS (wyników nie pokazano).

Zatem, wydaje się, że ochronny efekt wdychanego CO w niewydolności wątroby indukowanej przez TNF-a zależy od aktywności iNOS.

Rola HO-1 w ochronie przed ostrą niewydolnością wątroby dostarczonej za pomocą CO

Badano czy CO i NO wywierają ochronę wobec ostrej niewydolności wątroby przez mechanizm zależny od HO-1. Wyniki przedstawiono na Fig. 15, 16, 17, i 18.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 15, przeprowadzono immunoblotting w celu zaobserwowania ekspresji HO-1 w wątrobie myszy, które otrzymały TNF-a/D-gal w obecności i przy braku CO (250 ppm). Myszy traktowane CO wykazywały znaczący wzrost ekspresji HO-1 zarówno w obecności jak i przy braku TNF-a/D-gal.

W celu określenia roli iNOS w ekspresji HO-1 indukowanej TNF-a/D-gal w wątrobie (wyniki prezentowane na Fig. 16), myszom podawano L-NIL (5 mg/kg, i.p.) 2 godziny przed wstępnym traktowaniem CO (250 ppm) i co 2 godziny po nim. Myszy kontrolne otrzymywały L-NIL i pozostawały w pokoju z powietrzem. Na Fig. 16 odnotowano, że CO podnosił ekspresję HO-1 u myszy traktowanych nośnikiem, lecz nie był w stanie indukować ekspresji, wówczas gdy zahamowana była iNOS. Traktowanie samym L-NIL miało minimalny wpływ na ekspresję HO-1.

W celu zbadania ochronnej roli HO-1 indukowanej CO (wyniki prezentowane na Fig. 17), myszom podawano SnPP (50 μmol/kg, s.c), selektywny inhibitor HO-1, na 5 godzin przed CO. Alternatywnie, myszom podawano VPYRRO (VP), donor NO (10 mg/kg, s.c). VP był selektywnie zaprojektoPL 205 066 B1 wany tak, aby dostarczał NO bezpośrednio do wątroby. Jedną godzinę po podaniu wstępnej dawki

VP, zwierzęta eksponowano na CO przez 1 godzinę przed podaniem TNF-a/D-gal (patrz powyżej). 6-8 godz. później określano poziomy surowiczej ALT. Odnotowano, że CO nie był zdolny do ochrony u zwierząt z zablokowaną aktywnością HO-1. VP, podawane 2 godziny przed, a następnie co 2 godziny potem, dostarczało ochronę przed uszkodzeniem, co ustalono 8 godzin później na podstawie pomiarów surowiczej ALT.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 18, myszy C57BL/6J typu dzikiego poddawano wstępnemu działaniu przez 24 godziny L-NIL w wodzie pitnej (4,5 mM) jak opisano w Stengert i wsp. (J. Exp. Med. 183: 1501-1514 (1996)). Myszom tym oraz myszom inos^-/- podawano CoPP. L-NIL znajdował się w wodzie podczas trwania całego doświadczenia. Myszy kontrolne i inos^-/- otrzymywały normalną wodę pitną. Dwadzieścia cztery godziny po podaniu CoPP, podawano TNF-a/D-gal i 6-8 godzin później określono poziomy surowiczej serum ALT. Na Fig. 18 odnotowano, że indukcja HO-1 nadaje protekcję niezależnie od obecności iNOS.

Immunoblot ekstraktów z wątroby myszy traktowanych CO w obecności lub przy braku TNF-a/D-gal pokazuje podniesienie regulacji HO-1 (Fig. 15). Dodanie inhibitora iNOS, L-NIL, powyższym grupom, który znosi ochronę (Fig. 17), zapobiega także podniesieniu regulacji HO-1 (Fig. 16). W celu ustalenia czy HO-1 jest kluczową dla ochrony hepatocytów wywoływanej CO zastosowano protoporfirynę cynową IX (SnPP, 50 μmol/kg, s.c., Frontier Scientific) jako selektywny inhibitor aktywności HO-1. W modelu tym SnPP znacząco zmniejsza ochronne efekty CO (Fig. 17). Podanie SnPP bez TNF-a/D-gal nie miało szkodliwych lub ochronnych efektów (wyników nie pokazano). Wyniki te sugerują, że podwyższenie regulacji HO-1 jest istotne dla ochronnych efektów CO.

W celu ustalenia czy podwyższenie regulacji HO-1 będzie także konieczne jeśli ochrona zostanie zainicjowana przez NO, myszy traktowano farmakologicznym donorem NO, V-PYRRO/NO. Czynnik ten jest metabolizowany w wątrobie, w wyniku czego hepatocyty uwalniają NO. V-PYRRO/NO dostarcza także ochrony po podaniu LPS/D-gal lub TNF-a/D-gal. Myszy randomizowano i traktowano TNF-a/D-gal z lub bez SnPP dla ocenienia roli HO-1. V-PYYRO/NO stanowił ochronę, co oszacowano na podstawie surowiczej ALT. Jednakże, SnPP znosił zdolność tego donora NO do ochrony przed uszkodzeniem wątroby (Fig. 17). Zatem, wydaje się, że ochrona hepatocytów zainicjowana przez CO lub NO jest przynajmniej częściowo zależna od HO-1.

Ponieważ wyniki te sugerują, że CO i NO wymagają aktywności HO-1 do ochrony przed śmiercią hepatocytów indukowaną TNF-a, badano czy ochrona za pośrednictwem HO-1 wymaga aktywności iNOS. Stosując myszy inos^-/-, indukowano HO-1 przez podanie CoPP. 24 godziny po tym wstrzykiwano TNF-a/D-gal, przy maksimum ekspresji HO-1, a uszkodzenie wątroby oceniano 6-8 godzin później. Wyniki pokazują, że indukcja HO-1 była zdolna do znaczącej ochrony przed uszkodzeniem wątroby niezależnie od aktywności iNOS z >50% redukcją surowiczej ALT (Fig. 18). Wyniki te potwierdzono przy zastosowaniu L-NIL. Myszy poddawano wstępnemu traktowaniu wodą pitną zawierającą L-NIL (4,5 mM) przez 24 godziny. Sposób ten skutecznie hamuje aktywność NOS. Myszy kontrolne otrzymywały normalną wodę. Następnie, podawano CoPP w celu zaindukowania ekspresji HO-1 i 24 godz. po tym myszy traktowano TNF-a/D-gal. Traktowanie samym L-NIL nie zmieniało ciężkości uszkodzenia indukowanego w tym modelu. Wszystkie zwierzęta, które otrzymały CoPP (z i bez L-NIL) były chronione przed uszkodzeniem wątroby (Fig. 18).

Badano czy ekspresja HO-1 jest wymagana dla indukowanej CO lub NO ochrony przed śmiercią komórkową hepatocytów indukowaną TNF-a/ActD. Wyniki pokazano na Fig. 19 i 20.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 19, mysie hepatocyty izolowano z myszy bez HO-1 (hmox-1^-/-) i młodych dzikiego typu (C57BL/6J), wstępnie traktowanych przez 1 godz. CO (250 ppm) i traktowanych TNF-a/ActD. Żywotność oceniano jak opisano powyżej. CO znacząco chronił hepatocyty dzikiego typu, lecz nie był zdolny do ochrony hepatocytów izolowanych z myszy hmox-1^-/-.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 20, mysie hepatocyty izolowano z myszy bez (hmox-1^-/-) i młodych dzikiego typu (C57BL/6J), wstępnie traktowanych donorem NO, SNAP (500 μM), a następnie traktowanych TNF-a/ActD 1 godz. później. Wykazano, że SNAP chroni hepatocyty w tym modelu. SNAP znacząco chronił przed śmiercią komórkową w hepatocytach dzikiego typu lecz nie nadawał znaczącej ochrony przed śmiercią komórkową w hepatocytach izolowanych z myszy _hmox-1 ^-/-.

Jak omówiono powyżej, komórki dzikiego typu traktowane powietrzem i hmox-1^-/- wystawione na działanie TNF-a/ActD przechodziły jak oczekiwano śmierć komórkową, podczas gdy komórki dzikiego typu traktowane CO lub NO były chronione w obecności TNF-a/ActD (Fig. 19 i 20). Ochrona

PL 205 066 B1 nadawana przez CO i NO była tracona w komórkach bez funkcjonalnej HO-1 (hmox-1^-/-). Zatem, wydaje się, że HO-1 może dostarczyć ochrony w tym modelu bez wymagania obecności iNOS, co sugeruje, że w tym modelu HO-1 lub jeden czy większa liczba jego katalitycznych produktów może, częściowo, wywierać efekty cyto-ochronne.

Wdychanie CO chroni przed zapaleniem wątroby indukowanym acetaminofenem

Badano czy wdychanie CO chroni przed zapaleniem wątroby indukowanym acetaminofenem (APAP). Wyniki przedstawiono na Fig. 21.

W celu uzyskania wyników przedstawionych na Fig. 21, samce myszy C57BL/6J wystawiono na działanie CO (250 ppm) przez 1 godzinę przed lub 4 godziny po podaniu APAP (500 mg/kg, i.p.). Następnie myszy utrzymywano w CO przez czas trwania doświadczenia. Poziomy surowiczej ALT ustalano 20 godz. po podaniu APAP. Myszy kontrolne otrzymały APAP i były utrzymywane w powietrzu. Protokół ten zaplanowano tak, aby zapalenie wątroby mogło się rozwinąć przez cztery godziny przed podaniem CO. CO znacząco zredukowało uszkodzenie wątroby co oceniono na podstawie surowiczej ALT (622 ± 44 względem 175 ± 137, p < 0,01 w porównaniu z kontrolami). Ochrona ta była podobna do tej obserwowanej w oddzielnej grupie zwierząt, które były wstępnie traktowane CO przed APAP. Wyniki te czynią zasadnym terapeutyczne zastosowanie CO w stosownej sytuacji klinicznej, w której leczenie zaczęto by po rozpoczęciu zapalenia wątroby.

Wyniki omawiane w tym przykładzie pokazują, że niskie stężenie CO może chronić przed piorunującym zapaleniem wątroby indukowanym TNF-a/D-gal i ilustrują unikatową i nie ujawnioną wcześniej zależność od zarówno HO-1 jak i iNOS indukowanej przez CO ochrony wątroby przed uszkodzeniem przez TNF-a/D-gal.

Bez wiązania z teorią, możliwe jest że ochrona za pośrednictwem CO działa przez aktywowanie NF-kB, który w obecności bodźców zapalnych prowadzi do podniesienia regulacji iNOS z wynikającą z tego produkcją NO. Dodatkowo do indukcji iNOS, mogą być indukowane inne geny antyapoptotyczne/ochronne zależne od NF-kB. Podczas 1 godziny wstępnego traktowania CO i przed traktowaniem komórek TNF-α, obecna była znacząca aktywacja NF-kB, która mogła być częścią aktywacji aparatu komórkowego omawianego powyżej. Aktywacja NF-kB przez CO może częściowo wynikać z łagodnego wzrostu wytwarzania reaktywnego tlenu pochodzącego z mitochondriów (wstępne obserwacje). Jedna godzina może być także czasem pozwalającym na ekspresję genów anty-apoptotycznych zależnych od NF-kB. Następny etap w takim hipotetycznym modelu może prowadzić do produkcji NO po podwyższeniu regulacji iNOS. NO prowadzi do podwyższenia regulacji HO-1, której aktywność nadaje efekty ochronne. Efekt ochronny HO-1 mógłby zależeć od usunięcia hemu lub jednego czy większej liczby jego trzech produktów: CO, biliwerdyny/bilirubiny lub żelaza/ferrytyny. Wiedząc, że egzogenny CO był podawany przez cały czas trwania doświadczeń, wydaje się nieprawdopodobne aby wytwarzany endogennie CO sam pośredniczył w ochronie przez HO-1. Jednakże, może być wymagana kombinacja CO z innymi produktami HO-1 lub też inne produkty działające indywidualnie.

W badaniach opisanych powyżej, CO podawano w stosownym klinicznie modelu zapalenia wątroby indukowanym acetaminofenem (APAP), który posiada przebieg w czasie podobny do rozwoju ostrego zapalenia wątroby u ludzi. Wyniki demonstrują, że ekspozycja na CO 4 godziny po podaniu APAP (500 mg/kg, i.p.) prowadzi do 62% redukcji uszkodzenia wątroby (Fig. 21). W tym indukowanym przez APAP modelu uszkodzenia wątroby, myszy wykazują sygnały zapalenia wątroby już po 2-4 godzinach od podania APAP i śmiertelność pojawia się w ciągu 24-48 godzin. Zatem, CO podawano po rozpoczęciu uszkodzenia wątroby. Zgodne z wynikami dla modelu APAP są wyniki dla mysiego modelem szoku krwotocznego, gdzie terapeutyczne rozpoczęcie wdychania CO podczas reanimacji po 2,5 godz. fazy szoku prowadzi do ochrony przed uszkodzeniem wątroby (>65% redukcji surowiczej ALT w 24 godz. p<0,01; n=6-10/grupę).

Podsumowując, wykorzystując model uszkodzenia wątroby kierowanego w szczególności przez apoptozę indukowaną TNF-a, wykazano: po pierwsze, że wdychany CO może chronić przed zapaleniem wątroby w tym modelu; po drugie, że ochrona przez CO wymaga wytworzenia drugiej cząsteczki gazowej, NO; po trzecie, że NO wywiera swoje korzystne efekty przynajmniej w części przez podwyższenie regulacji HO-1; i po czwarte, że podwyższenie regulacji HO-1 ma działanie ochronne bez konieczności aktywności iNOS/NO, tzn. bez konieczności kontynuacji cyklu.

P r z y k ł a d 2. Protokół leczenia zapalenia wątroby

Poniższy przykład ilustruje protokoły do zastosowania w leczeniu pacjentów zdiagnozowanych jako chorych na zapalenie wątroby. Przykład ilustruje także protokoły leczenia pacjentów przed, w czasie i/lub po operacjach chirurgicznych, np. chirurgicznym przeszczepie wątroby. Doświadczony

PL 205 066 B1 specjalista będzie wiedział, że dowolny opisany tu protokół można zaadaptować do indywidualnych potrzeb pacjenta i można zaadaptować do zastosowania w połączeniu z dowolnym innym leczeniem zapalenia wątroby.

Traktowanie pacjentów

Traktowanie pacjenta CO można rozpocząć w dniu zdiagnozowania u pacjenta zapalenia wątroby, przykładowo, zapalenia wątroby wywołanego zakażeniem wirusowym i/lub nadużyciem alkoholu. Pacjent może być zdiagnozowany przez lekarza stosującego dowolną znaną w dziedzinie metodę. Przykładowo, lekarz może postawić diagnozę na podstawie wyników uzyskanych z testów krwi, np. testów określających poziomy surowiczej ALT i testów określających czy pacjent jest zakażony określonym wirusem (np. dowolnym wirusem zapalenia wątroby). Ponadto, lekarz może zapoznać się z historią medyczną pacjenta i postawić taką diagnozę (np. przez zapoznanie się z tym czy pacjent jest alkoholikiem lub stosuje przewlekle leki). Pacjent może wdychać CO w stężeniu od około 250 do 500 ppm jedną godzinę dziennie. Leczenie to można kontynuować przez około 30 dni lub dopóki pacjent nie zostanie zdiagnozowany jako nie posiadający dłużej lub nie zagrożony ryzykiem zapalenia wątroby.

Procedury przeszczepu wątroby

Traktowanie dawcy wątroby

Przed pobraniem wątroby lub jej części, dawcy można podawać inhalację z tlenku węgla (250 ppm) przez jedną godzinę. Podawanie można stosować w różnych dawkach od 10 ppm do 1000 ppm w róż nych czasach od jednej godziny do sześ ciu godzin lub przez cał y czas od momentu kiedy podawanie dawcy ze śmiercią mózgu (zwłoki) staje się możliwe do czasu usunięcia narządu. Dla dawcy ludzkiego, podawanie powinno rozpocząć się najszybciej jak to możliwe po ustaleniu, że nastąpiła śmierć mózgu. W niektórych zastosowaniach, może być pożądane rozpoczęcie podawania przed śmiercią mózgu.

U zwierząt nie będących ludźmi (np. świnie), które mają być zastosowane jako dawcy przeszczepu heterologicznego, żyjącemu dawcy zwierzęcemu można podawać stosunkowo wysokie poziomy tlenku węgla przez inhalację, jeśli pożądane, tak długo, jak wytwarzana w ten sposób karboksyhemoglobina nie upośledza żywotności i funkcji narządu który ma być przeszczepiony. Przykładowo, można zastosować poziomy powyżej 500 ppm (np. 1000 ppm lub wyższe i do 10000 ppm, w szczególności przez krótkie okresy czasu).

Traktowanie wątroby in situ.

Przed pobraniem wątroby od dawcy, może być ona spłukana lub poddana perfuzji roztworem, np. buforem lub pożywką, kiedy jeszcze znajduje się w dawcy. Wątroba powinna być spłukiwana roztworem nasyconym tlenkiem węgla i utrzymywana w atmosferze tlenku węgla tak, że zawartość tlenku węgla pozostaje w nasyceniu. Spłukiwanie powinno trwać przez okres co najmniej 10 minut, np. 1 godzinę , kilka godzin lub dłużej. Idealnie, roztwór powinien dostarczać najwyższe stężenie tlenku węgla dopuszczalne dla komórek wątroby (lub jej fragmentu).

Traktowanie wątroby ex vivo

Wątrobę można zabezpieczyć w pożywce zawierającej tlenek węgla od czasu usunięcia z dawcy do czasu przeszczepu biorcy. Można to przeprowadzić przez utrzymywanie wątroby w poż ywce obejmują cej CO lub poddanie perfuzji z zastosowaniem takiej poż ywki. Ponieważ zachodzi to raczej ex vivo niż w zwierzęciu, można zastosować bardzo wysokie stężenia gazowego CO (np. 10000 ppm) dla utrzymania nasycenia pożywki CO.

Traktowanie wątroby biorcy

Traktowanie biorcy CO można zacząć w dniu przeszczepu co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem operacji. Alternatywnie, można je zacząć co najmniej 30 minut przed ponowną perfuzją narządu u biorcy. Może być ono kontynuowane przez co najmniej 30 minut, np. 1 godzinę. Dawki tlenku węgla pomiędzy 10 ppm i 3000 ppm można podawać w różnych okresach czasu, np. minutach lub godzinach i można podawać w dniu przeszczepu i w dniach po przeszczepie. Przykładowo, pacjent może przyjmować inhalację z tlenku węgla o stężeniu, np. 3000 ppm, przez trzy kolejne zatrzymania oddechu przez 10 sekund. Alternatywnie, niższe stężenie gazu można dostarczać w sposób przerywany lub ciągły, przez dłuższy okres czasu, z regularnym oddychaniem a nie z zatrzymaniem oddechu. Stężenia karboksyhemoglobiny można wykorzystać jako przewodnik do odpowiedniego podawania tlenku węgla pacjentowi. Zazwyczaj, traktowanie biorców nie powinno podnosić poziomów karboksyhemoglobiny powyżej tych uważanych za stanowiące dopuszczalne ryzyko u pacjenta, który potrzebuje przeszczepu.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie tlenku wę gla do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania zapaleniu wątroby u pacjenta.
2. 2. Zastosowanie wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e kompozycja jest w postaci gazowej.
3. 3. Zastosowanie wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e kompozycja farmaceutyczna jest w postaci ciekłej.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ż e pacjent jest zakażony wirusem wybranym z grupy składającej się z wirusa zapalenia wątroby typu A; wirusa zapalenia wątroby typu B; wirusa zapalenia wątroby typu C; wirusa zapalenia wątroby typu D; wirusa zapalenia wątroby typu E i wirusa zapalenia wą troby typu G.
5. 5. Zastosowanie wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e pacjent jest alkoholikiem.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ż e kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania przez sztuczne płuco lub przyrząd do pozaustrojowej wymiany gazów przez błonę.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ż e zapalenie wątroby jest wywołane ekspozycją na czynnik hepatotoksyczny.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zapalenie wątroby jest wywołane przez czynnik inny niż zabieg chirurgiczny lub endotoksyna.
9. 9. Zastosowanie wedł ug zastrz. 7, znamienne tym, ż e czynnik hepatotoksyczny jest lekiem hepatotoksycznym.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że lek hepatotoksyczny jest wybrany z grupy składającej się z izoniazydu, metylodopy, acetaminofenu, amiodaronu i nitrofurantoiny.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że gazowy tlenek węgla jest w kompozycji w stężeniu co najmniej 0,025%, co najmniej 0,05%, co najmniej 0,10%, co najmniej 1,0%, lub co najmniej 2,0%.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2 albo 11, znamienne tym, że zapalenie wątroby jest związane z ostrą niewydolnością wątroby.