CN100526876C - 一种未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测定未甲基化CpG含量的方法，该方法采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，然后利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法对修饰和未修饰的DNA水解样品中5-甲基胞嘧啶含量做测定，并通过修饰和未修饰的DNA水解样品中5-甲基胞嘧啶检出量的差别而对CpG进行定量。

Description

一种未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测方法

本申请是申请日为2004年4月15日，申请号为200410033878.1，发明名称为“一种免疫佐剂和含有该佐剂的疫苗”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及核苷酸含量的检测方法，具体是涉及未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测。

背景技术

佐剂是疫苗中不可缺少的成分，在免疫佐剂方面，虽然铝佐剂的应用已接近80年，其安全性也经过了长期应用的检验，但由于其对细胞免疫作用不明显，尤其对细胞免疫为主的疫苗，如对高纯化的第二代重组疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微，因此人们一直致力于新型佐剂的研究。

CpG-DNA刺激天然免疫，促进抗原特异的体液和细胞免疫，作为疫苗的佐剂已有实验室研究的记载。CpG-DNA疫苗佐剂活性主要体现在以下几个方面：活化APC细胞，上调CD40、CD54、CD80、CD86和MHCII类分子等细胞分子的表达，增强抗原呈递能力；作为辅助刺激信号，协同TCR/BCR传入的抗原活化信号，活化抗原特异性的T细胞和B细胞；通过IFN-α/β、IL-12、IL-18等细胞因子诱生Th1类免疫应答；诱生较强的CTL反应。应答的抗体类型以IgG2a为主。但是目前的CpG-DNA研究都是针对人工合成的含CpG基序的寡核苷酸(ODN)，制备成本高，阻碍了临床应用的推广。

细菌提取物是CpG-DNA的另一个来源，但是至今没有关于来自细菌的CpG-DNA作为佐剂的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种来源于细菌提取物的CpG-DNA免疫佐剂，该佐剂本身具有免疫活性，与疫苗中的抗原在体内作用能诱导Th1型为主的免疫应答。

本发明同时提供该免疫佐剂作为治疗和预防用疫苗佐剂的用途和含有该佐剂的疫苗。

本发明的CpG-DNA佐剂是来自提取物细菌，尤其是富含CpG基序的卡介菌提取物。本发明以该卡介菌DNA(BCG-CpG-DNA)做为疫苗佐剂，证实了其诱导的免疫反应特点，以此研制出新型的免疫佐剂。

CpG-DNA是指含有未甲基化CpG二核苷酸基序的DNA，本发明得到的BCG-CpG-DNA是含有未甲基化CpG基序天然的CpG-DNA，它是从细菌中，优选是从卡介菌中提取的。

本发明提供的BCG-CpG-DNA，一个重要的特点就是来自天然产物，其CpG含量可以通过高效液相检测而获得，即，其中的有效成分含量是已知的。其通过以下方法获得：将菌种接种于适合分支杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；菌体经破碎后离心收集上清液；上清液经CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有机溶剂抽提收集无蛋白层，该无蛋白层再次抽提后的上清液用乙醇处理收集沉淀，对该沉淀进行后处理。得到的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量在15.75％-24.75％，优选是在21.5-23.5％，按照本发明具体提取方法得到的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量可以达到22.5％左右。

检测CpG含量可以通过反相-高效液相法(RP-HPLC)：采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)为5-甲基胞嘧啶(m⁵-dC)，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶(BAP)将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法(RP-HPLC)对修饰和未修饰的DNA水解样品中m⁵-dC检出量的差别而对CpG进行定量。

根据本发明的另一个方面，就是通过大量试验探索证实，该新型富含CpG基序佐剂本身具有免疫活性，作为佐剂诱导的是Th1型为主的免疫反应，机体产生抗体类型以IgG2a为主，因此该富含CpG基序佐剂能赋予疫苗既能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，在体内诱导Th1型为主的免疫反应的功能，从而发挥疫苗的预防作用及治疗作用。

本发明更提供了一种含有BCG-CpG-DNA作为免疫佐剂的疫苗。该疫苗可以是BCG-CpG-DNA与抗原混合制备的液体疫苗，也可以是BCG-CpG-DNA与抗原混合后制备的冻干疫苗。即，本发明的这种疫苗可以是BCG-CpG-DNA佐剂与抗原混合而成，也可以是BCG-CpG-DNA与目前的铝佐剂疫苗混合而成。

在本发明提供的疫苗中，该免疫佐剂BCG-CpG-DNA的含量为每单位剂量疫苗中10-250μg/人份，该用量与所用的抗原或疫苗有关。

附图说明

图1为BCG-CpG-DNA佐剂作用不同免疫时间的结果比较，图中：

1组--3μgHBsAg                    2组--3μgHBsAg+50μgBCG-CpG-DNA

3组--3μgHBsAg+100μgBCG-CpG-DNA   4组--1μgHBsAg+10μgBCG-CpG-DNA

5组--3μgHBsAg-Al                 6组--3μgHBsAg-Al+50μgBCG-CpG-DNA

7组--3μgHBsAg-Al+100μgBCG-CpG-DNA

图2为BCG-CpG-DNA抗-HbsIgG亚类分析结果；

图3为BCG-CpG-DNA对流脑多糖疫苗免疫结果的影响；

图4为添加BCG-CpG-DNA的流脑多糖抗体IgG2a分析结果；

图5为添加BCG-CpG-DNA的流脑多糖抗体IgG1分析结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解本发明的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。

一、BCG-CpG-DNA的制备

步骤一，菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所菌苗室提供)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基。37℃培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃下培养14-20天；

其中，

马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：

取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；

用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时；

用纯化水冲洗土豆斜面块；

用苏通培养基冲洗斜面块；

取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；

将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；

10磅20分钟灭菌。

改良的液体苏通培养基配方及制备：

天冬素(AR)：4g

柠檬酸(AR)：2g

K₂HPO_4·3H₂O(AR)：0.5g

MgSO_4·7H₂O(AR)：0.5g

柠檬酸铁铵(CP)：0.05g

甘油(药用)：60ml

蒸馏水：940ml

以NH_3·H₂O调节pH 7.2-7.4之间，

然后加1％(W/V)硫酸锌1ml，10磅20分钟灭菌。

步骤二、菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重；

步骤三、菌体破碎：将收集的菌体以去离子蒸馏水按1g/ml混匀，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次；

步骤四、BCG-CpG-DNA的制备：将破碎的菌体悬液以超纯水稀释到200mg/ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、12000rpm/min离心，15min×2次，收集上清，在上清液中加入5MNaCl、5％(w/v)CTAB/0.3MNaCl，2000rpm/min、10min离心留沉淀，将沉淀溶于1M的NaCl溶液中，加入相同体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提至无蛋白层，氯仿:异戊醇(24:1)抽提，在收集的上清中加入2倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀，再以70％乙醇洗涤3次，空气中风干后，溶解于TE缓冲液(Tris-ClpH 8.0)中，去离子水、TE缓冲液透析，0.45μm无菌滤器过滤，即为BCG-CpG-DNA佐剂，于-20℃保存。

二、提取物中CpG有效成分的检测

1、甲基化修饰反应

甲基化修饰反应严格按照供应商提供的方法进行，即DNA用SssI甲基化酶在合适的NEBuffer中处理，37℃加入S-腺苷蛋氨酸(SAM)，每4小时补充SAM，24小时后酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提2次，氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次，分别用乙醚，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，空气中风干，溶解于TE缓冲液中。

2、甲基化修饰程度的检测

DNA原液和甲基化酶处理过的DNA用限制性内切酶Hpa II处理1小时，1％琼脂糖凝胶电泳60分钟，EB染色。

3、酶水解反应

利用核酸酶P1(Nuclease P1)、细菌碱性磷酸酶(BAP)(Sigma)水解DNA。

取50μl DNA溶液(500μg/ml溶于TE缓冲液中，pH8.0)至1.5ml离心管中，沸水10分钟变性后置冰水5分钟灭活，样品加100μl 30mM乙酸钠，pH5.3。

5μl 20mM硫酸锌以及10μl nuclease P1(1mg/ml 200units permg in30mM乙酸钠，pH5.3)于37℃水浴2小时，加20μl 0.5M Tris-cl调pH 8.5，再加入10μl细菌碱性磷酸酶(BAP)(10.8mgprot./ml 43.7units/mgprot.)37℃水浴2小时，-20℃保存备用。

4、RP-HPLC

HPLC系统：waters 600高效液相色谱仪，717plus自动进样器，2487双光道紫外检测器，Millennium³²色谱工作站；

HPLC条件：

色谱柱：25-cm Supelcosil LC-18-DB C₁₈反相柱(Supelco，U.S.A)；

流动相：缓冲液A(2.5％ v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH 4.0)22.5分钟；

        缓冲液B(8.0％ v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄KH₂PO₁，pH 4.0)30分钟；

洗脱液：70％甲醇-水10分钟；

流速：1ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：254nm，280nm双波长同时检测。

5、数据处理

由于双链DNA特殊碱基互补配对原则，理论上dC/dG＝1 dT/dA＝1，因此对dC/dG、dT/dA的摩尔比的检测能够反应检测的准确性。以已知量的各种脱氧核苷为标准，以8Br-Guo为内标，对所水解的BCG-CpG-DNA中的各种脱氧核苷进行摩尔定量后分别计算dC/dG、dT/dA的摩尔比，及GC的摩尔百分含量，将各种脱氧核苷的摩尔量和其相应脱氧单核苷酸的分子量的积累加计算出核酸的质量；根据m⁵-dC的摩尔量和CpG分子量乘积，计算出CpG的质量，二者相比，即可得到CpG质量百分含量。

结果示例：

表1 未甲基化BCG-CpG-DNA检测结果

表2 甲基化BCG-CpG-DNA检测结果

三、BCG-CpG-DNA的药理学研究

通过体外实验及体内实验，对BCG-CpG-DNA的药理学作用机制进行了研究，结果表明，BCG-CpG-DNA体外能刺激B细胞产生IgM，促进抗原呈递细胞(APC)产生IL-12，能显著性的增强ConA对IFN-γ的诱生能力；体内能够增强T、B淋巴细胞的增殖作用，提高动物体内T细胞各亚群的含量，而CD4+/CD8+比例仍保持正常，能增强小鼠NK细胞的杀伤能力，增强体内Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ的产生，对免疫功能低下小鼠模型有促进免疫功能恢复作用，对猪血清致敏的小鼠过敏性模型有明显的脱敏作用。

因此本发明提供的新型免疫佐剂BCG-CpG-DNA，本身有免疫活性作用，做为佐剂诱导的是Th1型为主的免疫反应，机体产生的抗体类型以IgG2a为主。说明该新型富含CpG基序佐剂赋予疫苗既能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，发挥疫苗的预防作用及治疗作用。

四、药效学研究

本发明的意义尤其在于将来自卡介菌提取物的BCG-CpG-DNA作为佐剂用于疫苗中，该佐剂可以单独与抗原作用，也可以与铝佐剂联合作用。

1、乙型肝炎BCG-CpG-DNA疫苗：

1.1 将BCG-CpG-DNA、病毒表面抗原或乙肝疫苗(铝佐剂)溶液按一定的配比混匀，得到以BCG-CpG-DNA为佐剂的乙肝疫苗。

1.2 上述所得的乙肝疫苗冰浴30min，皮下免疫动物。

1.3 BCG-CpG-DNA用于佐剂作用的药效学实验结果：

(1)不同佐剂与抗原剂量免疫效果比较

在不同剂量(1μg、3μg)的HBsAg和HBs铝疫苗(HBsAg-Al)中混合不同剂量(10μg、100μg、500μg)的BCG-CpG-DNA，总体积为200μl，头背部皮下免疫BALB/c小鼠，免疫4周后采血，用定量I¹²⁵-HBsAg放免法检测抗-HBs总抗体水平，结果见表3、4。

由表3可见，1μg HbsAg与不同剂量的BCG-CpG-DNA共同免疫后，抗体水平均提高，其中和10μgDNA免疫结果抗体水平接近1μg HBsAg-Al的2倍；3μg HBsAg和100μgDNA共同免疫的抗体水平是3μg HBsAg-Al的2倍，并和3μg HbsAg+10μgDNA的免疫效果有显著性差异(*P<0.05)。

表3 HBsAg与不同剂量BCG-CpG-DNA共同免疫效果(X±SD)(mIU/ml)

注：表中的“Ag”是指“HBsAg”。

由表4可见，1μg HBsAg-Al和不同剂量的BCG-CpG-DNA共同免疫后，抗体水平均提高，其中和100μgDNA共同作用的效果最高；3μg HBsAg-Al和不同剂量的BCG-CpG-DNA共同免疫后，抗体水平也均提高，其中和100μgDNA共同作用的效果和3μg HBsAg-Al的效果有显著性差异(*P<0.05)

表4 HBsAg-Al与不同剂量BCG-CpG-DNA共同免疫效果(X±SD)(mIU/ml)

2、BCG-CpG-DNA佐剂作用的远期效力学结果：

1)在不同剂量(1μg、3μg)的HBs抗原和HBs疫苗中混合不同剂量(10μg、50μg、100μg)的BCG-CpG-DNA，总体积为200μl，头背部皮下免疫BALB/c小鼠，3周时加强一次，分别在4周、10周时采血，用定量I¹²⁵-HBsAg放免法检测血清中抗-HBs总抗体水平。结果见图1。

由图1可见，4周时，加BCG-CpG-DNA的HBs抗原组的抗体水平(2、3、4组)均高于单纯抗原组(1组)，且均达到相同剂量的HBs疫苗(HBsAg-Al)组的水平(2、3组与5组比较)；10周时，各组的的抗体水平都提高，其中加BCG-CpG-DNA的HBsAg组的抗体水平(2、3、组)和单纯抗原组(1组)有显著性差异(P<0.05)；比相同抗原剂量的铝佐剂疫苗组(5组)略高，二者之间无显著性差异(P>0.05)。当BCG-CpG-DNA添加到HBs-Al疫苗中共同免疫动物(6、7组)，在4、10周，其抗体滴度均高于单纯HBs-Al疫苗组(5组)。另外，结果显示，无论在HBs抗原还是在HBs-Al疫苗中添加BCG-CpG-DNA，50μg和100μg的效果几乎没有差别(见2、3组和6、7组)。

2)抗-HBsIgG亚类分析

取免疫10周小鼠血清，一定的稀释度(一般可以是1:500)，ELISA方法测定IgG亚类，结果见图2。由图1可知，当50μg和100μg的BCG-CpG-DNA和3μg的HBs抗原共同免疫，免疫效果达到并高于3μg的HBs-AL疫苗的作用，但二者无显著性差异，同样在HBs-AL疫苗中添加BCG-CpG-DNA，也可增强免疫作用。而由图2可见，添加BCG-CpG-DNA的HBs抗原组产生的IgG2a的水平与单纯抗原组及HBs-AL疫苗组都有显著性差别(***P<0.01，*P<<0.01，)，并且100μgBCG-CpG-DNA组IgG2a的水平高于50μgBCG-CpG-DNA组，而且添加100μgBCG-CpG-DNA的HBs-AL疫苗组IgG2a的水平也高于HBs-AL疫苗组，IgG1的水平无差别。但添加BCG-CpG-DNA的HBs抗原组的lgG1水平明显低于单纯抗原组和HBs-AL疫苗组，其中添加100μgBCG-CpG-DNA的HBs抗原组的IgG1水平和这两个对照组有显著性差异(**P<0.05)。

综上所述的效力学结果表明，添加BCG-CpG-DNA后，小鼠产生的抗HBs抗体水平均提高，达到并超过同剂量的铝疫苗的免疫效果；当在铝疫苗中添加BCG-CpG-DNA后，则表现为明显的协同作用，并有显著性差异。同时发现BCG-CpG-DNA有很好的安全性，因为当BCG-CpG-DNA的剂量达到500μg时，动物无逆毛、腹泻、或其他中毒现象等任何异常。但是BCG-CpG-DNA的佐剂作用并不是随剂量的增加而增强的，这可能和抗原的配比有一定的关系。从效力学结果来看BCG-CpG-DNA诱导的抗体强度，在4W和10W，以BCG-CpG-DNA为佐剂的实验组，均高于单纯抗原组，在10W时，有显著性差异。同时都达到也超过相同抗原剂量的铝疫苗实验组的抗体水平。而抗体亚型的实验结果也显示，和铝佐剂相比，BCG-CpG-DNA诱导产生的IgG2a的水平显著性增高，同时IgG1的水平显著性低；BCG-CpG-DNA和铝佐剂二者共同作用的结果是，IgG2a的水平增高了，IgG1的水平无差别。这说明BCG-CpG-DNA能诱导机体产生以IgG2a为主的Th1型免疫反应，也能协同铝佐剂共同作用，并部分逆转铝佐剂诱导的以IgG1为主的Th2型免疫反应。

3、流脑多糖BCG-CpG-DNA免疫疫苗

3.1不同免疫时间结果的比较

BCG-CpG DNA对流脑多糖疫苗不同免疫时间结果见图3。由图3可见，免疫2针，添加BCG-CpG DNA的流脑多糖疫苗组的抗体水平并不比单纯疫苗组高；但免疫3针后，添加BCG-CpG DNA的流脑多糖疫苗组的抗体水平普遍高于单纯疫苗组，说明BCG-CpG DNA能增强流脑多糖疫苗的抗体水平，但10μg和100μgBCG-CpG-DNA作用并无很大差异。

3.2BCG-CpG DNA对流脑多糖抗体亚型的影响

取免疫3针后小鼠血清，经一定的稀释度(1:100)，用ELISA方法测定IgG亚类，结果见图4、5。图4为流脑多糖抗体IgG2a分析结果，图5为流脑多糖抗体IgG1分析结果。

由图4可见，添加BCG-CpG DNA的流脑多糖组的IgG2a的水平均高于单纯抗原组，其中添加10、100μgBCG-CpG-DNA两组的IgG2a水平和单纯抗原组有显著性差异(P<0.01)，而且100μgBCG-CpG-DNA组的IgG2a水平高于其他的剂量组。

由图5可见添加不同剂量BCG-CpG DNA的流脑多糖各组的IgG1的水平和单纯抗原组并无差别(P>0.05)。

所以，把BCG-CpG DNA添加到流脑多糖疫苗中，结果显示：和单纯流脑多糖疫苗的免疫效果相比，BCG-CpG DNA能够增强流脑多糖的免疫效果，抗体水平增高，但无显著性差异。在免疫两针的情况下，增强效果不明显，但三针后的增强效果较明显。说明BCG-CpG DNA的佐剂效果和量有关系，但不是随剂量增加而增强的，而是和配比的抗原量有关系。同时对流脑多糖抗体亚型进行检测的结果显示，以BCG-CpGDNA为佐剂的流脑多糖组产生的IgG2a水平均高于单纯流脑多糖组，并有显著性差异，而产生的IgG1水平，两组之间并无显著性差异。BCG-CpG DNA诱导多糖抗原产生Th1型保护性抗体IgG2a水平明显高于对照组，总的抗体水平无显著性差异。

五、肌肉注射BCG-CpG DNA对小鼠安全评价

1、实验材料

BCG-CpG DNA：50μg/100μl

实验动物：BALB/c小鼠(SPF)，8-10W，雌性

2、实验方法

1)将小鼠随机分成4组：正常对照组、免疫22天组、免疫28天组、免疫40天组，每组3-4只小鼠。

2)给药方法：实验组将BCG-CpG DNA从小鼠后腿肌肉注射50μg/100μl，隔日一次。正常对照组不予任何处理。

3)分别在免疫后的22天、28天、40天后，称小鼠体重后，处死小鼠，取肝、脾称重，计算肝重指数及脾重指数，并和正常对照组比较，结果见表5。

表5 肌肉注射BCG-CpG DNA对小鼠安全评价实验结果

各BCG-C pGDNA实验组体重、肝重、脾重、肝指、脾指和正常对照组比较均无统计学上差异(P>0.05)。

结论：BCG-CpGDNA对小鼠有较好的安全性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1、一种测定未甲基化CpG二核苷酸含量的方法，包括下述步骤，采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶dC为5-甲基胞嘧啶m⁵-dC，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法对修饰和未修饰的DNA水解样品中m⁵-dC含量做测定，并通过修饰和未修饰的DNA水解样品中m⁵-dC检出量的差别而对CpG进行定量，其特征在于，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶水解DNA时，取50μl DNA溶液至1.5ml离心管中，沸水10分钟变性后置冰水5分钟灭活，加入30mM pH5.3的乙酸钠100μl，再加入5μl 20mM硫酸锌以及2units的核酸酶P1于37℃水浴2小时，之后加20μl 0.5M Tris-C1调pH至8.5，再加入4.7196units的细菌碱性磷酸酶于37℃水浴2小时，-20℃保存备用；其中DNA溶液为500μg/ml溶于pH8.0的TE缓冲液。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用反相-高效液相法测定DNA水解样品中m⁵-dC含量时的条件为：色谱柱为25cm Supelcosil LC-18-DB C₁₈反相柱；流动相为缓冲液A和缓冲液B，其中缓冲液A为2.5％v/v甲醇，0.05MKH₂PO₄，pH4.0，缓冲液B为8.0％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH4.0；洗脱液为70％甲醇-水；流速为1ml/min；柱温为35℃。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：

1)用SssI甲基化酶修饰CpG时是在合适的NEBuffer中处理DNA，37℃加入S-腺苷蛋氨酸，每4小时补充S-腺苷蛋氨酸，24小时后用25:24:1的酚:氯仿:异戊醇抽提2次，再用24:1的氯仿:异戊醇抽提2次，再分别用乙醚，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，空气中风干，溶解于TE缓冲液中；

2)检测甲基化修饰程度时，DNA原液和甲基化酶处理过的DNA用限制性内切酶Hpa II处理1小时后，用1％琼脂糖凝胶电泳60分钟，EB染色；

3)利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶水解DNA时，取50μl DNA溶液至1.5ml离心管中，沸水10分钟变性后置冰水5分钟灭活，加入30mM pH5.3的乙酸钠100μl，再加入5μl20mM硫酸锌以及2units的核酸酶P1于37℃水浴2小时，之后加20μl 0.5M Tris-C1调pH至8.5，再加入4.7196units的细菌碱性磷酸酶于37℃水浴2小时，-20℃保存备用；其中DNA溶液为500μg/ml溶于pH8.0的TE缓冲液；

4)利用反相-高效液相法测定DNA水解样品中m⁵-dC含量时的条件为：采用waters 600高效液相色谱仪；色谱柱为25cm Supelcosil LC-18-DB C₁₈反相柱；流动相为缓冲液A 22.5分钟和缓冲液B30分钟，其中缓冲液A为2.5％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH4.0，缓冲液B为8.0％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH4.0；洗脱液为70％甲醇-水10分钟；流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为254nm，280nm，双波长同时检测。

4、如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所检测的DNA为BCG-CpG-DNA。

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