CN108872459B - 一种通过lc-ms检测核酸表观遗传修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过LC‑MS检测核酸表观遗传修饰的方法,具体涉及一种检测核糖核酸(RNA)中甲基化修饰的核糖核苷酸的丰度的方法和一种检测脱氧核糖核酸(DNA)中甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的丰度的方法。包括如下步骤:(1)提取生物样本的核酸,进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;(2)采用液相色谱‑质谱联用仪对上机样本进行检测,获得丰度结果。本发明对于核酸表观遗传修饰的研究领域具有重大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过LC-MS检测核酸表观遗传修饰的方法,具体涉及一种检测核糖核酸(RNA)中甲基化修饰的核糖核苷酸的丰度的方法和一种检测脱氧核糖核酸(DNA)中甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的丰度的方法。
背景技术
表型(phenotype),又称性状,是指一个生物体(或细胞)可以观察到的性状或特征,是特定的基因型与环境相互作用的结果。包括个体形态、功能等各方面的表现,如身高、肤色、血型、酶活力、药物耐受力乃至性格等。经典遗传学(genetics)是指由于基因序列改变(如基因突变等)所引起的基因功能的变化,从而导致表型发生可遗传的改变。表观遗传学是指在不改变核DNA序列的前提下影响个体发育并且是可遗传的,其研究主要集中于DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等修饰。这些表观遗传学修饰相互作用以调节基因的表达,控制表型,是维持机体内环境稳定所必需的。
一直以来人们都认为基因组DNA决定着生物体的全部表型,但逐渐发现有些现象无法用经典遗传学理论解释,比如基因完全相同的同卵双生双胞胎在同样的环境中长大后,他们在性格、健康等方面会有较大的差异。这说明在DNA序列没有发生变化的情况下,生物体的一些表型却发生了改变。因此,英国科学家Waddington最早提出了表观遗传的概念,它是在研究与经典遗传学不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的一门前沿学科,是对经典遗传学的补充和进一步发展。现在人们认为,基因组含有两类遗传信息,一类是传统意义上的遗传信息,即基因组DNA序列所提供的遗传信息,另一类则是表观遗传学信息,即基因组DNA的修饰,它提供了何时、何地、以何种方式去应用DNA遗传信息的指令。生物体正常功能的维持是这两种信息相互作用的、保持平衡的结果,因此,表观遗传学是生命科学中一个普遍而又及其重要的研究领域,对基因的表达、调控、遗传有重要作用。
核酸的甲基化修饰包括DNA甲基化修饰和RNA甲基化修饰。DNA甲基化是在甲基转移酶的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体而发生的反应。DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象。通常发生在5′胞嘧啶位置上,具有调节基因表达和保护DNA该位点不受特定限制酶降解的作用。一般而言,甲基化模式有两种,一种是维持甲基化,指在细胞分裂过程中,根据亲本链上特异的甲基化位点,在新生链相应的位置进行甲基化修饰;二是从头甲基化,即催化未甲基化的CpG位点甲基化,分别由不同的DNA甲基化转移酶催化完成的。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。DNA中碱基的化学修饰近年来一直是生命科学领域研究的热点之一。其中,胞嘧啶第5位碳原子上的甲基化动态修饰研究得较为深入。早在上世纪中叶,科学家就发现DNA胞嘧啶可以被甲基化修饰,修饰之后的碱基称为5mC。后来,又陆续发现了发生在同一个碳原子上的其它修饰,并且这些修饰之间可以相互转化,调节基因表达的DNA甲基化修饰主要包括:5-甲基胞嘧啶(5mC)及其氧化衍生产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)、5-羧基胞嘧啶(5caC)、N6-甲基腺嘌呤(6mA)、N4-甲基胞嘧啶(4mC),这些共价修饰是在DNA复制过程中完成的,广泛存在于细菌与真核生物中。2015年,三个研究小组分别报道了三种不同真核系统中6mA的作用途径,为高等动植物6mA甲基化作用机理阐明带来了新契机。低等真核生物衣藻(Chlamydomonas)基因组甲基化分析表明6mA以较低的本底水平存在于全基因组中,结合RNA-seq揭示出了DNA水平的6mA修饰其能够激活基因转录。高通量6mA-CLIPexo结合精确到单个核苷酸水平的6mA-RE-seq分析发现6mA聚集在具有转录活性的基因转录起始位点(Transcriptionalstartsite,TSS)两侧,特别是CATG与GATC区域中的AT位点,占据了全基因组6mA分布范围的1/3。6mA特异性地位于基因TSS周围相邻两个核小体之间的连接DNA处,推测可能与核小体定位有关。核小体印记实验与高通量测序结果证明,核小体出现的概率与6mA周期性分布是呈正相关的。在转录起始阶段,核小体结构相对于化学共价修饰的甲基化更具空间上的灵活性,能够与甲基化作用协同调节染色体构象,促进有效的转录起始。5mC修饰虽然在其他真核生物中能够定位核小体,但衣藻基因组分析显示5mC分布范围与6mA并不相干,没有共定位于相似的区域,暗示两者的合成可能通过不同途径受到调节,且行使不同的功能。通过探讨在高等植物中的6mA分布规律与特点,发现其修饰位点特殊性,能够为解析其调控关键生物学功能的分子作用机制提供了新的观点。
在分子生物学的中心法则中,信息从DNA流向信使RNA(messenger RNA,mRNA),最后翻译成蛋白质。RNA在生物学系统中有着举足轻重的作用,它不仅将DNA的遗传信息传递给蛋白,也负责调控各种生物学过程。近年来,科学家们首次发现了一种可逆性的RNA甲基化-m6A。随后,研究人员陆续定位了哺乳动物转录组中的m6A,鉴定了这种动态修饰所需的“读”、“写”和“擦除”蛋白,解析了m6A在转录后调控中的一些功能。可逆的RNA甲基化与DNA、组蛋白的表观遗传学修饰存在许多共通之处。“读”、“写”和“擦除”蛋白能够不断雕琢RNA的甲基化组,进而对蛋白表达产生影响。由此看来,中心法则中的三大成员都存在着可逆性的化学修饰。DNA和组蛋白的表观遗传学修饰主要在转录水平上起作用。而可逆的RNA甲基化主要在转录后水平上调控基因表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过LC-MS检测核酸表观遗传修饰的方法。
本发明提供了一种通过LC-MS检测生物样本的核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的丰度的方法(方法Ⅰ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的RNA,进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的丰度;
质谱中,m/z参数设置为282.1-150.1,CID参数设置为16;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
本发明还保护一种通过LC-MS检测生物样本的核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的相对丰度的方法(方法Ⅱ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的RNA,进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的丰度和腺嘌呤核糖核苷酸的丰度;
检测N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为282.1-150.1,CID参数设置为16;检测腺嘌呤核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为268.1-136.1,CID参数设置为14;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;
(3)N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的丰度除以腺嘌呤核糖核苷酸的丰度,即为N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的相对丰度。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
本发明还保护一种通过LC-MS检测生物样本的脱氧核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度的方法(方法Ⅲ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度;
质谱中,m/z参数设置为266.1-150.1,CID参数设置为14;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0。
所述方法中,变性条件为95℃、5min。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
本发明还保护一种通过LC-MS检测生物样本的脱氧核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的相对丰度的方法(方法Ⅳ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度;
检测N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为266.1-150.1,CID参数设置为14;
检测腺嘌呤脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为252.1-136.1,CID参数设置为10;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;
(3)N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度除以腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度,即为N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的相对丰度。
所述方法中,变性条件为95℃、5min。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
本发明还保护一种通过LC-MS检测生物样本的脱氧核糖核酸中5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度的方法(方法Ⅴ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度;
质谱中,m/z参数设置为242-126,CID参数设置为8;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0。
所述方法中,变性条件为95℃、5min。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
本发明还保护一种通过LC-MS检测生物样本的脱氧核糖核酸中5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的相对丰度的方法(方法Ⅵ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度;
检测5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为242-126,CID参数设置为8;
检测胞嘧啶脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为228.2-112.1,CID参数设置为6;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;
(3)5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度除以胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度,即为5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的相对丰度。
所述方法中,变性条件为95℃、5min。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
本发明还保护一种通过LC-MS检测核糖核酸中甲基化修饰的核糖核苷酸的丰度的方法(方法Ⅶ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的RNA,进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得核糖核酸中甲基化修饰的核糖核苷酸的丰度;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
所述方法中,所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中设置质谱中的“m/z”参数和“CID”参数如下:
本发明还保护一种通过LC-MS检测核糖核酸中甲基化修饰的核糖核苷酸的相对丰度的方法(方法Ⅷ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的RNA,进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得核糖核酸中甲基化修饰的核糖核苷酸和相应的正常核糖核苷酸的丰度;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;
(3)甲基化修饰的核糖核苷酸的丰度除以相应的正常核糖核苷酸的丰度,即为甲基化修饰的核糖核苷酸的相对丰度。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
所述方法中,所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中设置质谱中的“m/z”参数和“CID”参数如下:
本发明还保护一种通过LC-MS检测脱氧核糖核酸中甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的丰度的方法(方法Ⅸ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的丰度;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0。
所述方法中,变性条件为95℃、5min。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
所述方法中,所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中设置质谱中的“m/z”参数和“CID”参数如下:
本发明还保护一种通过LC-MS检测脱氧核糖核酸中甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的相对丰度的方法(方法Ⅹ),包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸和相应的正常脱氧核糖核苷酸的丰度;
液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;
(3)甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的丰度除以相应的正常脱氧核糖核苷酸的丰度,即为甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸的相对丰度。
所述方法中,变性条件为95℃、5min。
所述方法中,单核苷酸制备的反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。所述方法中,单核苷酸制备的反应条件为37℃、5小时。
所述方法中,去磷酸化的方法为:完成单核苷酸制备后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。所述方法中,去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
所述方法中,纯化单核苷酸的方法为:完成去磷酸化后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
所述方法中,所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中设置质谱中的“m/z”参数和“CID”参数如下:
以上任一所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中:液相色谱的检测柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phase column(100×2.1mm,1.9μm);液相色谱的柱温为25℃;;液相色谱的流动相流速为0.3ml/min。
以上任一所述“采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测”中:在阳离子模式下运行;喷射流技术ESI源的参数设置:干燥器温度50℃,干燥器流量11L/min,雾化器压力20psi,鞘气温度300℃,鞘气流量12L/min,毛细管电压1800V。
以上任一所述液相色谱-质谱联用仪具体可为安捷伦1260液相色谱-G6400系列三级四极杆质谱联。
所述甲基化修饰的核糖核苷酸具体可为N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸(m6A)。所述甲基化修饰的核糖核苷酸具体可为N1-甲基腺嘌呤核糖核苷酸(m1A)。所述甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸具体可为N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(6mA)。所述甲基化修饰的脱氧核糖核苷酸具体可为5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(5mC)。
本发明提供的方法,优化了DNA打断时间、碰撞能量和洗脱过程,可以在更短的时间内更有效的实现甲基化修饰的核糖核苷酸,对于核酸表观遗传修饰的研究领域具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为实施例2的结果。
图2为实施例3的结果。
图3为实施例4的结果。
图4为实施例5的结果。
图5为实施例6的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实施例1、方法的建立
一、制备上机样本
1、制备核酸样本
核酸样本为DNA样本或RNA样本。
制备DNA样本的方法:提取DNA,然后95℃变性5min,得到DNA样本。
制备RNA样本的方法:提取RNA,得到RNA样本。
2、取步骤1得到的核酸样本,进行单核苷酸制备。
反应体系为300μl。反应体系中,核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mM、2,6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mM、核酸酶P1含量为1U、磷酸二酯酶Ⅰ含量为0.01U、乙酸钠浓度为0.1mM、ZnCl2浓度为0.0067mM,余量为水。
实施例中采用的具体腺苷脱氨酶抑制剂为EHMA hydrochloride,Sigma公司,货号E114。实施例中采用的具体抗氧化剂为去铁胺。实施例中采用的具体磷酸二酯酶Ⅰ为蛇毒磷酸二酯酶Ⅰ。
核酸样本为DNA样本时的反应条件:37℃、5小时。
核酸样本为RNA样本时的反应条件:37℃、3小时。
3、取步骤2的产物,进行去磷酸化。
完成步骤2后,在体系中加入10U碱性磷酸酶进行反应。
实施例中采用的具体碱性磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶(CIP),NEB公司,货号M0290S。
反应条件:37℃、1小时。
4、取步骤3的产物,纯化单核苷酸。
完成步骤3后,将体系加至10KD超滤管,13000rpm离心10min,收集滤液,即为上机样本。
二、上机检测
采用安捷伦1260液相色谱-G6400系列三级四极杆质谱联用仪对步骤一得到的上机样本进行检测。
按照表1设置质谱中的“m/z”参数和“CID”参数。
表1
目标检测对象 | “m/z”参数 | “CID”参数(优化后) | “CID”参数(优化前) |
6mA | 266.1-150.1 | 14 | 9 |
5mC | 242-126 | 8 | 9 |
dA | 252.1-136.1 | 10 | 9 |
dC | 228.2-112.1 | 6 | 5 |
dT | 243.1-127 | 8 | 7 |
dG | 268.1-152 | 14 | 7 |
m6A | 282.1-150.1 | 16 | 10 |
m1A | 282.1-150.1 | 16 | 10 |
rC | 244.1-112.1 | 8 | 10 |
rU | 245.1-113.1 | 8 | 10 |
rG | 284.1-152.1 | 15 | 8 |
rA | 268.1-136.1 | 14 | 8 |
表1中,dA代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸,dC代表胞嘧啶脱氧核糖核苷酸,dT代表胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸,dG代表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸;rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,rC代表胞嘧啶核糖核苷酸,rU代表尿嘧啶核糖核苷酸,rG代表鸟嘌呤核糖核苷酸。
液相色谱的检测柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phasecolumn(100×2.1mm,1.9μm)。液相色谱的柱温为25℃。液相色谱的洗脱过程见表2。液相色谱的流动相中,A相为乙腈,B相为0.1%(体积比)甲酸水溶液。液相色谱的流动相流速为0.3ml/min。
表2
以优化后洗脱过程中的第一个时间段为例,对表2进行示例性解释如下:第0-7min,A相占流动相的体积份数由0线性上升至1%。
在阳离子模式下运行。喷射流技术ESI源的参数设置:干燥器温度50℃,干燥器流量11L/min,雾化器压力20psi,鞘气温度300℃,鞘气流量12L/min,毛细管电压1800V。
实施例2、进行单核苷酸制备时反应时间的优化
生物样本为:粳稻品种日本晴萌发2周的幼苗的地上部分。
设置五个生物学重复,结果取平均值。
按照实施例1描述的方法对生物样本进行检测,核酸样本为DNA样本,目标检测对象分别为6mA和dA,“CID”参数为表1中的优化后参数,洗脱过程为表2中的优化前洗脱过程。6mA的相对丰度=峰型图中6mA相应的峰面积/峰型图中dA相应的峰面积。
与实施例1的差异仅在于步骤一的2中,反应时间分别设置为3小时、5小时或7小时。
反应时间设置为5小时时,目标检测对象为6mA时,输出的峰型图见图1。
目标检测对象相应的峰面积以及6mA的相对丰度见表3。
表3
6mA | dA | 6mA的相对丰度 | |
3h | 2477 | 2642645 | 0.000937 |
5h | 4387 | 3296741 | 0.001331 |
7h | 2333 | 2986319 | 0.000781 |
实施例3、进行CID参数的优化
生物样本为:粳稻品种日本晴萌发2周的幼苗的地上部分。
设置三个生物学重复,结果取平均值。
按照实施例1描述的方法对生物样本进行检测,核酸样本为DNA样本,目标检测对象为6mA,“CID”参数分别采用表1中的优化前参数和优化后参数,洗脱过程为表2中的优化后洗脱过程,。
采用6mA标准品按照目标检测对象为6mA的方法(采用优化后洗脱过程)进行检测,6mA标准品的峰值对应的保留时间为14.4min,如果样本中具有14.4±1min的峰值,可以判断该峰值对应的化合物为6mA。
采用优化前参数时输出的峰型图见图2A。采用优化后参数时输出的峰型图见图2B。图2中,横坐标为保留时间(min)。结果表明,采用优化前参数时杂峰多、目标峰弱,采用优化后参数时显示单一目标峰。
实施例4、效果体现
生物样本为:粳稻品种日本晴萌发2周的幼苗的地上部分。
按照三个生物学重复,结果取平均值。
按照实施例1描述的方法对生物样本进行检测,核酸样本为RNA样本,目标检测对象为m6A、m1A和rA,“CID”参数为表1中的优化后参数,洗脱过程分别采用表2中的优化前洗脱过程和优化后洗脱过程。
采用m6A标准品按照目标检测对象为m6A的方法(采用优化后洗脱过程)进行检测,m6A标准品的峰值对应的保留时间为14.1min,如果样本中具有14.1±1min的峰值,可以判断该峰值对应的化合物为m6A。采用m1A标准品按照目标检测对象为m1A的方法(采用优化后洗脱过程)进行检测,m1A标准品的峰值对应的保留时间为2.8min,如果样本中具有2.8±1min的峰值,可以判断该峰值对应的化合物为m1A。采用rA标准品按照目标检测对象为rA的方法(采用优化后洗脱过程)进行检测,rA标准品的峰值对应的保留时间为5.4min,如果样本中具有5.4±1min的峰值,可以判断该峰值对应的化合物为rA。
m6A的相对丰度=峰型图中m6A相应的峰面积/峰型图中rA相应的峰面积。
检测m6A和m1A输出的峰型图见图3。图3中,横坐标为保留时间(min)。图3A为优化后洗脱过程的结果,m6A的相对丰度为0.00319。图3B为优化前洗脱过程的结果,m6A的相对丰度为0.003162。结果表明,采用优化后洗脱过程可以有效区分m1A和m6A,出峰单一,并且比采用优化前洗脱过程时峰型更好。
实施例5、效果体现
生物样本为:粳稻品种日本晴萌发2周的幼苗的地上部分。
设置三个生物学重复,结果取平均值。
按照实施例1描述的方法对生物样本进行检测,核酸样本为DNA样本,目标检测对象为5mC和dC,“CID”参数为表1中的优化后参数,洗脱过程分别采用表2中的优化前洗脱过程和优化后洗脱过程。
采用5mC标准品按照目标检测对象为5mC的方法(采用优化后洗脱过程)进行检测,5mC标准品的峰值对应的保留时间为4.5min,如果样本中具有4.5±1min的峰值,可以判断该峰值对应的化合物为5mC。采用dC标准品按照目标检测对象为dC的方法(采用优化后洗脱过程)进行检测,dC标准品的峰值对应的保留时间为6.7min,如果样本中具有6.7±1min的峰值,可以判断该峰值对应的化合物为dC。
5mC的相对丰度=峰型图中5mC相应的峰面积/峰型图中dC相应的峰面积。
检测5mC输出的峰型图见图4。图4中,横坐标为保留时间(min)。图4A为优化后洗脱过程的结果,5mC的相对丰度为0.76628。图4B为优化前洗脱过程的结果,5mC的相对丰度为0.72556。
实施例6、效果体现
生物样本为:水稻9311、高粱、紫花苜蓿R108、豫谷一号、小麦中国春、玉米B73萌发3周的幼苗的地上部分。
设置三个生物学重复,结果取平均值。
按照实施例1描述的方法对生物样本进行检测,核酸样本为RNA样本,目标检测对象为m6A和rA,“CID”参数为表1中的优化后参数,洗脱过程采用表2中的优化后洗脱过程。
m6A的相对丰度=峰型图中m6A相应的峰面积/峰型图中rA相应的峰面积。
以水稻9311的m6A的相对丰度为1,计算其它植物的相对值,结果见图5。
Claims (3)
1.一种通过LC-MS检测生物样本的核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的相对丰度的方法,包括如下步骤:
(1)提取生物样本的RNA,进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的丰度和腺嘌呤核糖核苷酸的丰度;
检测N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为282.1-150.1,CID参数设置为16;检测腺嘌呤核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为268.1-136.1,CID参数设置为14;
液相色谱的检测柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phasecolumn,检测柱规格为100×2.1 mm,1.9μm;液相色谱的柱温为25℃;液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;液相色谱的流动相流速为0.3ml/min;
(3)N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的丰度除以腺嘌呤核糖核苷酸的丰度,即为N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的相对丰度。
2.一种通过LC-MS检测生物样本的脱氧核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的相对丰度的方法,包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度;
检测N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为266.1-150.1,CID参数设置为14;
检测腺嘌呤脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为252.1-136.1,CID参数设置为10;
液相色谱的检测柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phasecolumn,检测柱规格为100×2.1 mm,1.9μm;液相色谱的柱温为25℃;液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;液相色谱的流动相流速为0.3ml/min;
(3)N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度除以腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的丰度,即为N6-甲基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的相对丰度。
3.一种通过LC-MS检测生物样本的脱氧核糖核酸中5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的相对丰度的方法,包括如下步骤:
(1)提取生物样本的DNA,变性后进行单核苷酸制备,然后进行去磷酸化,然后纯化单核苷酸,得到上机样本;
(2)采用液相色谱-质谱联用仪对上机样本进行检测,获得脱氧核糖核酸中5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度;
检测5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为242-126,CID参数设置为8;
检测胞嘧啶脱氧核糖核苷酸时,质谱中,m/z参数设置为228.2-112.1,CID参数设置为6;
液相色谱的检测柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phasecolumn,检测柱规格为100×2.1 mm,1.9μm;液相色谱的柱温为25℃;液相色谱中,A相为乙腈,B相为0.1%甲酸水溶液;液相色谱中,洗脱过程如下:第0-7min,A相占流动相的体积比由0线性上升至1%;第7-10.5min,A相占流动相的体积比由1%线性上升至6%;第10.5-15min,A相占流动相的体积比由6%线性上升至100%;第15-20min,A相占流动相的体积份数由100%线性下降至0;液相色谱的流动相流速为0.3ml/min;
(3)5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度除以胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的丰度,即为5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的相对丰度。
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