CN106370753B

CN106370753B - 冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法

Info

Publication number: CN106370753B
Application number: CN201610949785.6A
Authority: CN
Inventors: 张爱华; 王喜军; 赵琪琪; 刘畅; 安娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: CN106370753A

Abstract

冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，本发明涉及尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。本发明为了解决现有检测冠心病的方法效率低、费用高以及不能早发现、早治疗的问题。本发明步骤为：一：尿液样品的采集及预处理；二：尿液样品的制备；三：进行UPLC分离；四：将UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；五：进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；六：对39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到19个代谢通路；七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。本发明应用于代谢标记物鉴定领域。

Description

冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法

技术领域

本发明涉及尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。

背景技术

冠心病以极高的致死率及致残率成为影响人类健康的主要疾病之一，占所有致命性事件的40％。并且每年全世界范围内因心血管疾病死亡的人数逐年增高。据统计，发达国家心血管病死亡人数将从2000年的500万至2030年将增至6000万。在我国随着经济飞速发展，人民生活水平极大改善，居民生活方式改变，心血管疾病的发病率与死亡率也逐年增高。根据《中国心血管病报告2013》调查结果显示，中国城乡居民心血管病患病率呈上升趋势,死亡率居高不下，全国每年约有350万人死于心血管病。因此，对以冠心病为首的心血管疾病的早期筛查、系统诊治及相关基础研究成为目前我国面临的重大公共卫生问题。

多年来人们研究发现冠心病是多种因素作用于不同环节所致的一种复杂疾病。除了早期发现的年龄、性别、血脂异常、肥胖、高血压、糖尿病、不良生活方式等传统危险因素，遗传因素也是导致冠心病发病的主要因素。存在冠心病、糖尿病、高血压、血脂异常家族史的人群冠心病发病率明显增加。近年来已克隆出与冠心病危险因素相关的易感或突变基因200种以上。

发明内容

本发明是为了解决现有检测冠心病的方法效率低、费用高以及不能早发现、早治疗的问题，而提出的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。

冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法按以下步骤实现：

步骤一：尿液样品的采集及预处理；

步骤二：尿液样品的制备；

步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；

步骤四：将步骤三中UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；

步骤五：根据步骤四进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；

步骤六：对步骤五得到的39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到20个代谢通路；

步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。

发明效果：

本发明建立尿液样品的最适制备方法，优化UPLC-G2-Si-HDMS分析方法学参数。利用已开发UPLC-G2-Si-HDMS代谢组学技术，对400例健康受试者和375例冠心病受试者尿液代谢组进行模式识别分析。结果发现400例健康人和375例冠心病患者经代谢组学模式识别方法得到很好的区分。通过VIP进一步筛选差异代谢物，并进行了定性分析，鉴定了39个冠心病的潜在生物标记物，分别是半乳糖酸，肌酐，二甲基-L-精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2-糠酸，磷酸二乙酯，尿刊酸，L-乙酰，UDP-4脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖，尿酸，柠檬酸，二磷酸鸟苷，7-甲基腺嘌呤，衣康酸，O型磷酸-4-羟基-L-苏氨酸，N1甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺，1-甲基鸟嘌呤，7-氨基甲基-7-卡巴鸟嘌呤，5-磺基水杨酸，多巴胺-4-硫酸，6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸，高香草酸硫酸，乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸，L-谷氨酰胺，间甲酚，多巴醌，吲哚乙酸，壳二糖，壬二酸，对甲苯乙基，L-肉碱辛，21羟基5B-孕3,11,20三酮，11-氧代雄甾酮葡糖苷酸，2-苯基葡糖苷酸，辅酶-1，醇酮葡萄糖醛酸，芥子醇，单乙基己基邻苯二甲酸，这些尿液生物标记物主要与冠心病的19个代谢通路密切相关，主要包括半乳糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸及脯氨酸代谢、组氨酸代谢、氨基糖及核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等。采用ROC曲线分析进一步考察确定与冠心病相关性较高的代谢生物标记物，发现肌酐、尿酸、柠檬酸、7-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸、L-谷氨酰胺、2-苯基葡萄糖醛酸具有良好的诊断效力。采用本发明发现的尿液代谢标记物，仅通过采集尿液就能实现，无创，花费低，诊断快速、便捷，提高了工作效率，有利于冠心病的早发现、早治疗，具有良好的临床诊断潜力和推广价值。

附图说明

图1为基于UPLC G2-Si HDMS的冠心病受试者尿液样品的正离子模式下PCA得分图(3D)；

图2为基于UPLC G2-Si HDMS的冠心病受试者尿液样品的负离子模式下PCA得分图(3D)；

图3为冠心病受试者尿液样品的正离子模式下VIP得分图；

图4为冠心病受试者尿液样品的负离子模式下VIP得分图；

图5为冠心病尿液标记物经MetPA分析的代谢通路图。

具体实施方式

具体实施方式一：冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法包括以下步骤：

步骤一：尿液样品的采集及预处理；

步骤二：尿液样品的制备；

步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述步骤一中尿液样品的采集及预处理的具体过程为：

每天收集受试者首次空腹晨尿和夜间睡前最后一次尿液，连续收集3天；尿液于12000～13000rpm，4℃离心8～10min，取上清液，置-20℃冰箱中保存备用；样品冻藏前从每个样品中移取1ml分装，其余整体冷冻密封保存。

其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述步骤二中尿液样品的制备的具体过程为：

取室温解冻的尿液在12000～13000rpm，4℃条件下离心8～10min，取上清液，加入蒸馏水稀释，振荡1min，经0.22μm滤膜过滤。

其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述步骤三中UPLC条件为：

色谱柱：Waters Acquity^TM UPLC HSS T3，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为0.1％甲酸乙腈，B为0.1％甲酸水(质量百分含量为0.1％甲酸溶液)；色谱柱温度为40℃；样品仓温度为4℃；流速为0.5ml/min；进样体积为2μl。

其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述步骤四中进行正负离子扫描分析的质谱条件为：

正离子扫描模式：

锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为1000L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸-脑啡肽溶液；

负离子扫描模式：

锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为800L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸-脑啡肽溶液。

其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述步骤五中39个潜在尿液生物标记物具体为：

采用SPSS17.0进行统计分析，共鉴定了39个潜在尿液生物标记物，包括半乳糖酸，肌酐，二甲基-L-精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2-糠酸，磷酸二乙酯，尿刊酸，L-乙酰，UDP-4脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖，尿酸，柠檬酸，二磷酸鸟苷，7-甲基腺嘌呤，衣康酸，O型磷酸-4-羟基-L-苏氨酸，N1甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺，1-甲基鸟嘌呤，7-氨基甲基-7-卡巴鸟嘌呤，5-磺基水杨酸，多巴胺-4-硫酸，6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸，高香草酸硫酸，乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸，L-谷氨酰胺，间甲酚，多巴醌，吲哚乙酸，壳二糖，壬二酸，对甲苯乙基，L-肉碱辛，21羟基5B-孕3,11,20三酮，11-氧代雄甾酮葡糖苷酸，2-苯基葡糖苷酸，辅酶-1，醇酮葡萄糖醛酸，芥子醇，单乙基己基邻苯二甲酸。

其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：所述步骤六中得到20个代谢通路具体为：

将鉴定得到的39个冠心病尿液潜在生物标记物进行MetPA分析，20个代谢通路，包括半乳糖代谢，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，酪氨酸代谢，组氨酸代谢，柠檬酸循环(TCA循环)，嘧啶代谢，维生素B6代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，类固醇激素生物合成，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢，嘌呤代谢，戊糖和葡糖醛酸互变，精氨酸和脯氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，色氨酸代谢，氮代谢，烟碱和烟酰胺代谢，氨酰-tRNA生物合成。

其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：所述步骤七中确定与冠心病相关的生物标记物具体为：肌酐、尿酸、柠檬酸、7-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸、L-谷氨酰胺、2-苯基葡萄糖醛酸。

其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

实施例一：

一受试者信息

1病例来源

选择自2014年2月到2015年3月，于北京中医药大学东直门医院、石家庄市中医院、郑州市中医院以及中国中医科学院中医门诊部采集的冠心病患者共375例，同时纳入来自中医科学院中医门诊部体检中心及黑龙江中医院大学附属第一医院的健康受试者400例。所有患者均符合相应的西医诊断标准、病理纳入标准以及排除标准。

2受试者尿液样品的采集及预处理

在各个临床研究单位收集符合纳入标准的病例入组，入组当天由临床观察人员采集病史，并填写临床观察表，并于次日起，每天收集首次空腹晨尿和夜间睡前最后一次尿液(日尿)，连续收集3天。尿液于PVC管中(10ml)，13000r/min，4℃离心10min，取上清液，置-20℃冰箱中保存备用。且样品冻藏前从每个样品移取1ml分装，供首次样品分析用，其余整体冷冻密封保存。

二UPLC-G2-Si-HDMS分析方法

1实验仪器

Waters Acquity^TM UPLC液相色谱仪(沃特世科技有限公司，美国)；

Waters SYNAPT G2-Si HDMS质谱仪(沃特世科技有限公司，美国)；

Thermo Scientific Sorvall ST16R通用台式离心机；

VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司，中国)；

KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；

Thermo Scientific Finnpipette F3单道移液器(赛默飞世尔科技有限公司，美国)(规格20-200μl，100-1000μl)；

0.22μm微型滤膜(Millipore集团公司，美国)；

Masslynx V4.1工作站(沃特世科技有限公司，美国)；

Progenesis QI软件(沃特世科技有限公司，美国)；

2药品与试剂

甲醇、乙腈(Merck技术有限公司，德国)；

甲酸(科密欧化学试剂有限公司，中国)；

亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin)(SIGMA技术有限公司，美国)；

蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料公司，中国)；

3尿液样品的制备

取室温解冻的尿液在13000rpm，4℃条件下离心10min，取300μl上清液，加入900μl蒸馏水稀释，振荡1min，经0.22μm滤膜过滤后，进样2μl供UPLC分析。

4色谱条件

色谱柱：Waters Acquity^TM UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相A：0.1％甲酸乙腈，B：0.1％甲酸水；梯度洗脱程序(表1)；色谱柱温度40℃；样品仓温度：4℃；流速：0.5ml/min；进样体积：2μl；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析。

表1超高效液相梯度洗脱条件

A：0.1％甲酸乙腈；B.0.1％甲酸水；

A：Acetonitrile(0.1％formic acid)；B:Water(0.1％formic acid。

5质谱条件

5.1正离子扫描模式：

锥孔电压：20v；毛细管电压：3kv；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔反吹气流量：50L/h；扫描范围：m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；锁定质量溶液：采用美国Waters集团公司独家专利Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽(Leueine-enkephalin，[M+H]⁺＝556.2771)质量校正；工作站：MassLynxV4.1工作站。

5.2负离子扫描模式：

锥孔电压：20v；毛细管电压：3kv；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：50L/h；扫描范围：m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；锁定质量溶液：采用美国Waters集团公司独家专利Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽(Leueine-enkephalin，[M-H]^-＝554.2771)质量校正；工作站：MassLynxV4.1工作站。

三冠心病的尿液代谢轮廓及生物标记物分析

1冠心病受试者尿液代谢生物标记物的鉴定

将健康受试者以及冠心病受试者的尿液样品按照本章第二节项下的相应方法制备后，利用第二节项下已建立的分析方法对上述尿液样品进行正、负离子模式全扫描，得到健康受试者组和冠心病受试者组个体样本的内含三维信息的质谱代谢数据。

将尿液样品代谢轮廓利用Progenesis QI软件进行质谱信息(保留时间_质核比_峰面积归一化值)获取，为了找到对代谢轮廓变化起关键性作用的内源性代谢物，进一步对冠心病受试者组尿液代谢轮廓数据进行配对偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)分析，分析后所得正、负离子模式下尿液样本OPLS-DA模型三维(3D)得分图Scores plot(见图1和图2)，从图中能直观地观察两组样本的数据差异。在VIP散点图中(见图3和图4)，离子碎片呈V型排列，底部离子(VIP值小)，对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献率小；顶端离子(VIP值大)，对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献率大。查找VIP图中VIP值较大，载荷图中距离远点越远，对聚类分组的贡献较大的离子即为差异代谢物，可能成为潜在的生物标记物。

为进一步筛选变量，选择VIP值大于1的离子，即图中红框内的变量作为冠心病尿液的潜在生物标记物。同时对各组所获得计量资料信息数据采用SPSS17.0进行统计分析，各组间比较采用T检验，比较两组间差别是否具有统计学意义，基于P值小于0.05作为筛查条件，作为潜在生物标记物集合。

通过OPLS-DA分析，在列表中获得各离子保留时间_质核比一致的数据，利用G2-Si-HD MS/MS的方法测定标记物的精确信息，然后在Mass fragment下在5ppm内获得可能的化合物分子式，通过分子式及分子量在多个数据库进行检索，如chemspider、人类代谢组学数据库、METLIN及KEGG等免费数据库。然后，结合获得的二级质谱信息，通过碎片信息及其可能的裂解方式进行匹配，或结合文献报道，鉴定或表征各潜在生物标记物。

通过以上方法，在正、负离子模式下共鉴定了39个潜在尿液生物标记物，包括半乳糖酸，肌酐，二甲基-L-精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2-糠酸，磷酸二乙酯，尿刊酸，L-乙酰，UDP-4脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖，尿酸，柠檬酸，二磷酸鸟苷，7-甲基腺嘌呤，衣康酸，O型磷酸-4-羟基-L-苏氨酸，N1甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺，1-甲基鸟嘌呤，7-氨基甲基-7-卡巴鸟嘌呤，5-磺基水杨酸，多巴胺-4-硫酸，6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸，高香草酸硫酸，乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸，L-谷氨酰胺，间甲酚，多巴醌，吲哚乙酸，壳二糖，壬二酸，对甲苯乙基，L-肉碱辛，21羟基5B-孕3,11,20三酮，11-氧代雄甾酮葡糖苷酸，2-苯基葡糖苷酸，辅酶-1，醇酮葡萄糖醛酸，芥子醇，单乙基己基邻苯二甲酸。具体信息见表1。

3冠心病尿液潜在生物标记物相关代谢通路分析

将鉴定得到的39个冠心病尿液潜在生物标记物进行MetPA分析，得到与冠心病密切相关的20个代谢通路，主要包括半乳糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸及脯氨酸代谢、组氨酸代谢、氨基糖及核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等。具体数据结果见图5。结果表明，冠心病受试者体内机体内的内源性生物标记物在整个代谢轨迹中产生了强烈的扰动，并影响了多个代谢途径。

1 Galactose metabolism半乳糖代谢、2 D-Glutamine and D-glutamatemetabolism D-谷氨酰胺及D-谷氨酸代谢、3 Purine metabolism嘌呤代谢、4 Pyrimidinemetabolism嘧啶代谢、5 Citrate cycle(TCA cycle)三羧酸循环、6 Alanine,aspartateand glutamate metabolism丙氨酸，天冬氨酸及谷氨酸代谢、7 Tyrosine metabolism酪氨酸代谢、8 Arginine and proline metabolism精氨酸及脯氨酸代谢、9 Tryptophanmetabolism色氨酸代谢(-Log(p)大于1的代谢通路)；

表3.冠心病尿液代谢生物标记物诊断效果.

2.3 ROC曲线(SPSS 17.0软件)

本研究寻找冠心病疾病诊断的尿液生物标记物，ROC曲线(receiver operatingcharacteristic curve)是衡量一个代谢物或一组代谢物作为分类器其性能高低的重要工具。ROC曲线最重要的属性是曲线下面积(Area under the curve,AUC)。采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关性较高的生物标记物(表3)，主要是肌酐、尿酸、柠檬酸、7-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸、L-谷氨酰胺、2-苯基葡萄糖醛酸(AUC>0.9)。可为冠心病早期诊断及预防提供技术支持，有利于冠心病的早发现、早治疗，具有良好的临床使用和推广价值。

Claims

1.冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述鉴定及分析方法包括以下步骤：

步骤一：尿液样品的采集及预处理；

步骤二：尿液样品的制备；

步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；

步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物；

所述步骤一中尿液样品的采集及预处理的具体过程为：

每天收集受试者首次空腹晨尿和夜间睡前最后一次尿液，连续收集3天；尿液于12000～13000rpm，4℃离心8～10min，取上清液，置-20℃冰箱中保存；样品冻藏前从每个样品中移取1ml分装，其余整体冷冻密封保存；

所述步骤二中尿液样品的制备的具体过程为：

取解冻的尿液在12000～13000rpm，4℃条件下离心8～10min，取上清液，加入蒸馏水稀释，振荡1min，经0.22μm滤膜过滤；

所述步骤三中UPLC条件为：

色谱柱：Waters Acquity^TM UPLC HSS T3，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为0.1％甲酸-乙腈，B为0.1％甲酸-水；色谱柱温度为40℃；样品仓温度为4℃；流速为0.40mL/min～0.60mL/min；

所述步骤四中进行正负离子扫描分析的质谱条件为：

正离子扫描模式：

负离子扫描模式：

锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为800L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸-脑啡肽溶液；

所述步骤五中39个潜在尿液生物标记物具体为：

采用SPSS17.0进行统计分析，共鉴定了39个潜在尿液生物标记物，包括半乳糖酸，肌酐，二甲基-L-精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2-糠酸，磷酸二乙酯，尿刊酸，L-乙酰，UDP-4脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖，尿酸，柠檬酸，二磷酸鸟苷，7-甲基腺嘌呤，衣康酸，O型磷酸-4-羟基-L-苏氨酸，N1甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺，1-甲基鸟嘌呤，7-氨基甲基-7-卡巴鸟嘌呤，5-磺基水杨酸，多巴胺-4-硫酸，6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸，高香草酸硫酸，乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸，L-谷氨酰胺，间甲酚，多巴醌，吲哚乙酸，壳二糖，壬二酸，对甲苯乙基，L-肉碱辛，21羟基5B-孕3,11,20三酮，11-氧代雄甾酮葡糖苷酸，2-苯基葡糖苷酸，辅酶-1，醇酮葡萄糖醛酸，芥子醇，单乙基己基邻苯二甲酸；

所述步骤六中得到20个代谢通路具体为：

将鉴定得到的39个冠心病尿液潜在生物标记物进行MetPA分析，20个代谢通路，包括半乳糖代谢，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，酪氨酸代谢，组氨酸代谢，柠檬酸循环，嘧啶代谢，维生素B6代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，类固醇激素生物合成，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢，嘌呤代谢，戊糖和葡糖醛酸互变，精氨酸和脯氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，色氨酸代谢，氮代谢，烟碱和烟酰胺代谢，氨酰-tRNA生物合成。

2.根据权利要求1所述的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述步骤七中确定与冠心病相关的生物标记物具体为：肌酐、尿酸、柠檬酸、7-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸、L-谷氨酰胺、2-苯基葡萄糖醛酸。