CN107543873B - 一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法，本发明涉及代谢标记物的鉴定方法。本发明是要解决临床冠心病心阳虚证的诊断仍不具备足够敏感性造成方剂体内成分与疗效关系难以有效揭示的问题，而提出的一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法。该方法是通过步骤一、利用UPLC‑G2‑Si‑HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物；步骤二、利用G2‑Si‑HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描确定内源性代谢物结构；步骤三、鉴定冠心病心阳虚证受试者血液代谢生物标记物等步骤实现的。本发明应用于代谢标记物的鉴定领域。

Description

一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法

技术领域

本发明涉及代谢标记物的鉴定方法，特别一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病,CHD)是临床常见的心血管疾病之一，该病的发病率逐年增高，被称为“人类健康的第一杀手”。冠心病病因病机可简要归纳为心阳不足、痰瘀内生。因心阳不足，运血无力则血行瘀滞致瘀阻心脉；心阳虚弱则阴寒邪气上乘阳位；阴邪最易痹阻胸阳而致冠心病的发生。曹洪欣等通过对118例冠心病病人的临床观察，心阳虚证共62例,占52.54％，说明心阳虚证是冠心病的重要病理基础。心阳具有温煦、推动等作用，既是保证心脏本身发挥其生理功能的必要条件，又是心主血脉功能的主要动力。心阳不足，无以温煦、运行津液，无力推动血行，寒邪趁虚侵袭，凝滞气机，收引血脉，致心脉拘缩挛急而突发剧痛。近年来,诸多学者运用现代技术手段和方法对冠心病心阳虚证的病理机制、治疗和预防等方面进行了广泛的研究,取得了一定进展；但关于临床冠心病心阳虚证的诊断仍不具备足够敏感性。

然而，由于证候缺乏客观的诊断标准，致使方剂疗效难以正确评价，最终造成方剂体内成分与疗效关系难以有效揭示。代谢组学是解决此问题最有效的技术之一，它既能够以代谢轮廓宏观诊断证候，以代谢指纹准确把握证候变化，又能以生物标记物的含量变化微观精准地表征证候各阶段的生物学特征，并以此反映方剂的治疗效应。

发明内容

本发明的目的是为了解决临床冠心病心阳虚证的诊断仍不具备足够敏感性造成方剂体内成分与疗效关系难以有效揭示的问题，而提出的一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法。

上述的发明目的是通过以下技术方案实现的：

步骤一、利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物；

步骤二、利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

步骤三、鉴定冠心病心阳虚证受试者血液代谢生物标记物；

步骤三一、将内源性代谢物进行监督型OPLS-DA分析，分析得到正、负离子模式下的血液样本OPLS-DA模型二维得分Scores plot；根据得分Scores plot分析血液样本数据；

步骤三二、使用PCA，OPLS-DA获得潜在的生物标记物，根据分析的血液样本数据从OPLS-DA模型的S-plot列表中获得潜在生物标记物的各离子质量数；

步骤三三、根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物；

其中，所述38个生物标记物具体为尼古丁亚胺、25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、全-反-七异戊烯-二磷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、溶血卵磷脂、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、亚油酸、尿酸、D-乳酸、胞嘧啶核苷、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯甲酸、癸二酸、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺、11,12-环氧二十碳三烯酸、溶血卵磷脂、花生四烯酸、泛醌、非对称性二甲基精氨酸、尿苷/尿嘧啶核苷、吡咯烷酮羧酸、苯乙酰胺、a-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺。

发明效果

本发明以非治疗为目的利用代谢组学策略进行基于冠心病心阳虚证的代谢生物标记物进行研究。即利用代谢组学技术分析表征冠心病心阳虚证的代谢轮廓、代谢指纹、代谢生物标记物。发现特异性强、敏感度高的代谢生物标记物。该工作可为中医理论和临床经验的方剂组分创新药物设计提供科学依据。

本发明利用超高效液相色谱-高分辨率质谱(UPLC-HDMS)结合模式识别方法的代谢组学技术探索冠心病心阳虚证的代谢标记物。使得冠心病心阳虚证的诊断将不再完全依靠问卷量表进行主观判断，大大提高确定冠心病心阳虚证代谢标记物的准确性。

建立血清样品的最适制备方法，优化UPLC-G2-Si-HDMS分析方法学参数。利用UPLC-G2-Si-HDMS代谢组学技术，对健康受试者和冠心病心阳虚证受试者的血液代谢组进行模式识别分析。结果发现健康受试者和冠心病心阳虚证受试者的人体代谢网络存在明显差异。经模式识别分析(PCA和OPLS-DA)，鉴定了38个冠心病心阳虚证的潜在生物标记物，分别是尼古丁亚胺、25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、全-反-七异戊烯-二磷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、溶血卵磷脂、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、亚油酸、尿酸、D-乳酸、胞嘧啶核苷、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯甲酸、二酸、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺、11,12-环氧二十碳三烯酸、溶血卵磷脂、花生四烯酸、泛醌、非对称性二甲基精氨酸、尿苷/尿嘧啶核苷、吡咯烷酮羧酸、苯乙酰胺、a-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺。

运用诊断性试验受试者工作特征曲线(ROC)分析，进一步确定与冠心病心阳虚证相关性较高差异代谢物，主要是胞嘧啶核苷、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、癸二酸、溶血卵磷脂LysoPC(15:0)、苯乙酰胺。采用本发明发现的诊断代谢标记物，仅通过取血就能实现，微创，减轻患者痛苦，花费低，诊断快速、便捷，提高了工作效率具有良好的推广价值。

附图说明

图1(a)为实施例提出的正离子模式下的基于UPLC-G2-Si-HDMS的冠心病心阳虚证血液样品的主成分分析图；其中，1中的点为健康志愿者，2中的点为冠心病心阳虚证患者；

图1(b)为实施例提出的负离子模式下的基于UPLC-G2-Si-HDMS的冠心病心阳虚证血液样品的主成分分析图；其中，1中的点为健康志愿者，2中的点为冠心病心阳虚证患者；

图2(a)为具体实施方式一提出的正离子模式下S-plot和VIP值结合图的基于UPLC-G2-Si-HDMS的冠心病心阳虚证血液样品的主成分分析图(框内为VIP>1.5的离子)

图2(b)为具体实施方式一提出的负离子模式下S-plot和VIP值结合图的基于UPLC-G2-Si-HDMS的冠心病心阳虚证血液样品的主成分分析图(框内为VIP>1.5的离子)；

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法，具体是按照以下步骤制备的：

步骤一、利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物；

步骤二、利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

步骤三、鉴定冠心病心阳虚证受试者血液代谢生物标记物；

步骤三一、首先对正、负离子扫描模式的血液代谢轮廓进行非监督型PCA分析，分析冠心病心阳虚证代谢谱轨迹变化情况；为确定对聚类分群起关键作用的内源性代谢产物，将内源性代谢物进行监督型OPLS-DA分析，分析得到正、负离子模式下的血液样本OPLS-DA模型二维(2D)得分Scores plot见图1(a)；根据得分Scores plot分析血液样本数据；

步骤三二、正负离子扫描模式下的loading plot和S-Plot和VIP值的组合图见图2(a)和(b)，从图中能直观地观察两组样本的数据差异。查找到对聚类分组起关键作用的内源性代谢产物即潜在的生物标记物；查找VIP值较大，载荷图中距离原点越远，对聚类分组的贡献较大的离子即为差异代谢物，可能成为潜在的生物标记物；使用PCA，OPLS-DA获得潜在的生物标记物，为了进一步筛选变量，我们选择VIP(变量投影重要性值，Variablemportance in the Project)值大于1.5的离子，即图中红框内的变量作为冠心病心阳虚证的潜在生物标记物；对于潜在生物标记物的表征及鉴定，需要一系列的鉴定过程；根据分析的血液样本数据从OPLS-DA模型的S-plot列表中获得潜在生物标记物的各离子质量数；

步骤三三、根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息(表2)进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物；

其中，所述38个生物标记物具体为尼古丁亚胺、25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、全-反-七异戊烯-二磷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、溶血卵磷脂、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、亚油酸、尿酸、D-乳酸、胞嘧啶核苷、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯甲酸、癸二酸、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺、11,12-环氧二十碳三烯酸、溶血卵磷脂、花生四烯酸、泛醌、非对称性二甲基精氨酸、尿苷/尿嘧啶核苷、吡咯烷酮羧酸、苯乙酰胺、a-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺；具体信息见表2；

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物具体过程为：

血液样品的制备方法，由于血液中内源性蛋白的存在容易引起柱系统的衰退，因此血液样品制备的目的主要是扣除血清蛋白的干扰，使得内源性代谢产物尽量多的保留，便于揭示血液代谢组的真实情况；参考以往研究，有机溶剂萃取法是血浆代谢组学的最适样品制备方法，此法具有操作简便且选择性广的优势；经比较分析，确定本研究血清样品的制备方法：血液样品的制备方法，由于血液中内源性蛋白的存在容易引起柱系统的衰退，因此血液样品制备的目的主要是扣除血清蛋白的干扰，使得内源性代谢产物尽量多的保留，便于揭示血液代谢组的真实情况；参考以往研究，有机溶剂萃取法是血浆代谢组学的最适样品制备方法，此法具有操作简便且选择性广的优势；将n组健康受试者和冠心病心阳虚证受试者的血清样品中的每个样品取200μl合并，涡旋混匀，标记为血清QC(质控)样品，分装冻存；取室温解冻的血清QC样品200μl，加甲醇800μl，涡旋混匀30s，振荡15min，13000rpm在4℃离心15min，取上清液在45℃氮气流下吹干，残渣以200μl甲醇溶解，超声处理1min，涡旋混匀30s后，13000rpm在4℃离心15min，取上清液过0.22μm微型滤膜后，进样1μl供UPLC分析即UPLC-G2-Si-HDMS方法；确定内源性代谢物。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述UPLC分析色谱条件：色谱仪：Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪(沃特世科技有限公司，美国)；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 Column(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm)(Waters集团公司,美国)；流动相：流动相A质量百分比为0.1％甲酸乙腈，流动相B质量百分比为0.1％甲酸水；柱温预设：50℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.5ml/min；进样量：1μl；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；梯度洗脱程序见表1。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构具体过程为：

(1)、利用G2-Si-HDMS方法对内源性代谢物正、负离子模式全扫描，得到健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组个体血液样本的内含三维信息的(Rt_m/z_intensity)质谱代谢轮廓图；

(2)、利用Markerlynx4.1软件获取血液样本代谢轮廓的质谱信息；其中，质谱信息包括保留时间、质核比和峰面积归一化值；

(3)、利用EZinfo软件将质谱信息进行非监督型PCA(主成分分析)分析和监督型OPLS-DA(偏最小二乘判别分析)分析，获得目标统计图或统计表；

(4)、采用SPSS17.0软件进行统计分析，将健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组间数据比较采用T检验，寻找两组间的差异代谢物，进而选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述质谱条件正离子扫描模式：脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3000V；扫描范围：m/z 50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统(沃特世科技有限公司，美国)进行在线亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin，[M+H]+＝556.2771)质量校正。

其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述质谱条件负离子扫描模式具体为：毛细管电压：2500V；脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；扫描范围：m/z 50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统(沃特世科技有限公司，美国)进行在线亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin，[M-H]^-＝554.2771)质量校正。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三三中根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物具体过程为：

1)根据内源性代谢物结构确定在质量碎片(mass fragment)下在5ppm内获得内源性代谢物结构分子式，通过多数据库的检索；

2)对潜在的生物标记物离子进行二级数据扫描，获得二级质谱信息；

3)通过内源性代谢物结构分子式、二级质谱信息及二级质谱信息中的潜在的生物标记物离子裂解方式进行匹配，或结合文献报道，鉴定或表征得到各潜在生物标记物；

4)将所有鉴定或表征后的各潜在生物标记物均进行独立样本t检验，筛选具有显著性差异的变量；通过以上方法，在正、负离子模式下共鉴别了38个生物标记物。

其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：

本实施例一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法，具体是按照以下步骤制备的：

基于血液代谢组学的冠心病心阳虚证代谢标记物研究

步骤一、录入健康受试者和冠心病心阳虚证受试者和采集生物样品；

整个研究过程中，健康受试者的客观录入和生物样品的有效采集至关重要。步骤一工作将对这一过程进行优化，以保证健康受试者的有效录入和生物样品的客观采集且具代表性。

1受试者信息

1.1受试者纳入标准

病例来源：

选择自2014年2月到2015年3月，于北京中医药大学东直门医院、石家庄市中医院、郑州市中医院以及中国中医科学院中医门诊部采集的心阳虚证患者共426例，同时纳入来自中医科学院中医门诊部体检中心及黑龙江中医院大学附属第一医院的健康受试者545例。所有患者均符合相应的中西医诊断标准、病理纳入标准以及排除标准。

诊断标准：

参照《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》GB/T16751.2—1997制定：

冠心病心阳虚证：

主症：心悸怔忡，心胸憋闷而喘。

兼症：畏冷肢凉，面色恍白，或下肢浮肿，唇舌色暗，苔白，脉弱或结代。

纳入标准:

(1)年龄在≥35岁和≤80岁之间；

(2)符合心阳虚证诊断；

(3)知情同意并签署了知情同意书。

注：受试者者在实验前一周必须禁烟、禁酒、禁食含有奶酪和防腐剂的食物，禁饮果汁，禁食咖啡、茶、巧克力、可乐等含有咖啡因的食物或饮料。

排除标准：

(1)恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、结核、艾滋病以及慢性活动性肝炎、神经肌肉疾病、内分泌疾病。

(2)有肝、脑、肾和造血系统等严重原发性疾病者；

2生物样品的采集

2.1受试者血液样品的采集

在各个临床研究单位收集符合纳入标准的病例入组，入组当天由临床观察人员采集病史，并填写临床观察表。鉴于血液的固有属性，外源性物质的摄入对血液的干扰较小，所有受试者采集血液10-20ml一次。

2.2受试者血液样品的预处理

上述血液采集标号后立即送往医院检验中心离心移取血清并分装于1ml离心管中冷冻密封保存。并冷冻运输到黑龙江中医药大学血清药物化学重点实验室以备下一步处理。

3小结

整个研究过程中，健康受试者的客观录入和生物样品的有效采集至关重要。本部分工作将对这一过程进行优化，以保证健康受试者的有效录入和生物样品的客观采集且具代表性。

步骤一、利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物；

血液样品的制备方法，由于血液中内源性蛋白的存在容易引起柱系统的衰退，因此血液样品制备的目的主要是扣除血清蛋白的干扰，使得内源性代谢产物尽量多的保留，便于揭示血液代谢组的真实情况；参考以往研究，有机溶剂萃取法是血浆代谢组学的最适样品制备方法，此法具有操作简便且选择性广的优势；经比较分析，确定本研究血清样品的制备方法：血液样品的制备方法，由于血液中内源性蛋白的存在容易引起柱系统的衰退，因此血液样品制备的目的主要是扣除血清蛋白的干扰，使得内源性代谢产物尽量多的保留，便于揭示血液代谢组的真实情况；参考以往研究，有机溶剂萃取法是血浆代谢组学的最适样品制备方法，此法具有操作简便且选择性广的优势；随机取健康受试者和冠心病心阳虚证受试者100例，共100个血清样品，将n组健康受试者和冠心病心阳虚证受试者的血清样品中的每个样品取200μl合并，涡旋混匀，标记为血清QC(质控)样品，分装冻存；取室温解冻的血清QC样品200μl，加甲醇800μl，涡旋混匀30s，振荡15min，13000rpm在4℃离心15min，取上清液在45℃氮气流下吹干，残渣以200μl甲醇溶解，超声处理1min，涡旋混匀30s后，13000rpm在4℃离心15min，取上清液过0.22μm微型滤膜后，进样1μl供UPLC分析即UPLC-G2-Si-HDMS方法；确定内源性代谢物。

所述UPLC分析色谱条件：色谱仪：Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪(沃特世科技有限公司，美国)；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18Column(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm)(Waters集团公司,美国)；流动相：流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；柱温预设：50℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.5ml/min；进样量：1μl；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；

梯度洗脱程序见表1：

表1超高效液相梯度洗脱条件

。

步骤二、利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

(1)、利用G2-Si-HDMS方法对内源性代谢物正、负离子模式全扫描，得到健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组个体血液样本的内含三维信息的(Rt_m/z_intensity)质谱代谢轮廓图；

(2)、利用Markerlynx4.1软件获取血液样本代谢轮廓的质谱信息；其中，质谱信息包括保留时间、质核比和峰面积归一化值；

(3)、利用EZinfo软件将质谱信息进行非监督型PCA(主成分分析)分析和监督型OPLS-DA(偏最小二乘判别分析)分析，获得目标统计图或统计表；

(4)、采用SPSS17.0软件进行统计分析，将健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组间数据比较采用T检验，寻找两组间的差异代谢物，进而选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构。

步骤三、鉴定冠心病心阳虚证受试者血液代谢生物标记物；

步骤三一、首先对正、负离子扫描模式的血液代谢轮廓进行非监督型PCA分析，分析冠心病心阳虚证代谢谱轨迹变化情况；为确定对聚类分群起关键作用的内源性代谢产物，将内源性代谢物进行监督型OPLS-DA分析，分析得到正、负离子模式下的血液样本OPLS-DA模型二维(2D)得分Scores plot见图1(a)和(b)；根据得分Scores plot分析血液样本数据；

步骤三二、正负离子扫描模式下的loading plot和S-Plot和VIP值的组合图见图2(a)和(b)，从图中能直观地观察两组样本的数据差异。查找到对聚类分组起关键作用的内源性代谢产物即潜在的生物标记物；查找VIP值较大，载荷图中距离原点越远，对聚类分组的贡献较大的离子即为差异代谢物，可能成为潜在的生物标记物；使用PCA，OPLS-DA获得潜在的生物标记物，为了进一步筛选变量，我们选择VIP(变量投影重要性值，Variablemportance in the Project)值大于1.5的离子，即图中红框内的变量作为冠心病心阳虚证的潜在生物标记物；对于潜在生物标记物的表征及鉴定，需要一系列的鉴定过程；根据分析的血液样本数据从OPLS-DA模型的S-plot列表中获得潜在生物标记物的各离子质量数；

所述质谱条件正离子扫描模式：脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3000V；扫描范围：m/z 50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统(沃特世科技有限公司，美国)进行在线亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin，[M+H]+＝556.2771)质量校正。

所述质谱条件负离子扫描模式具体为：毛细管电压：2500V；脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；扫描范围：m/z 50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统(沃特世科技有限公司，美国)进行在线亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin，[M-H]^-＝554.2771)质量校正。

步骤三三、根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息(表2)进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物；

1)根据内源性代谢物结构确定在质量碎片(mass fragment)下在5ppm内获得内源性代谢物结构分子式，通过多数据库的检索；

2)对潜在的生物标记物离子进行二级数据扫描，获得二级质谱信息；

3)通过内源性代谢物结构分子式、二级质谱信息及二级质谱信息中的潜在的生物标记物离子裂解方式进行匹配，或结合文献报道，鉴定或表征得到各潜在生物标记物；

4)将所有鉴定或表征后的各潜在生物标记物均进行独立样本t检验，筛选具有显著性差异的变量；通过以上方法，在正、负离子模式下共鉴别了38个生物标记物。

其中，所述38个生物标记物具体为尼古丁亚胺、25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、全-反-七异戊烯-二磷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、溶血卵磷脂、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、亚油酸、尿酸、D-乳酸、胞嘧啶核苷、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯甲酸、癸二酸、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺、11,12-环氧二十碳三烯酸、溶血卵磷脂、花生四烯酸、泛醌、非对称性二甲基精氨酸、尿苷/尿嘧啶核苷、吡咯烷酮羧酸、苯乙酰胺、a-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺；具体信息见表2；

表2在正、负离子模式下冠心病心阳虚证相关的生物标记物的结构鉴定表征信息表

↑与健康受试者相比，冠心病心阳虚证受试者血液中代谢物含量极显著升高p<0.01；

↓与健康受试者相比，冠心病心阳虚证受试者血液中代谢物含量极显著降低p<0.01；

表3.冠心病心阳虚证代谢生物标记物诊断效果.

2.3冠心病心阳虚证代谢生物标记物诊断效果

采用诊断性试验受试者工作特征曲线(ROC)分析进一步确定与冠心病心阳虚证相关性较高的几个差异代谢物(表3)，主要是胞嘧啶核苷、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、癸二酸、溶血卵磷脂LysoPC(15:0)、苯乙酰胺。可为冠心病心阳虚证早期诊断及预防提供技术支持，具有良好的临床使用和推广价值。

小结

本部分实验初步鉴定出了38个冠心病心阳虚证血液代谢组学的潜在生物标记物，与健康受试者组相比，冠心病心阳虚证受试者组中：25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺含量明显下降，有极显著性差异(P<0.01)；尼古丁亚胺、全-反-七异戊烯-二磷酸、溶血卵磷脂LysoPC(O-18:0)、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、胞嘧啶核苷、血酸、D-乳酸、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、4-对羟基苯甲酸、癸二酸、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、11,12-环氧二十碳三烯酸、花生四烯酸、亚油酸、溶血卵磷脂、LysoPC(15:0)含量明显上升，有极显著性差异(P<0.01)。

采用ROC曲线分析进一步确定与冠心病心阳虚证相关性较高差异代谢物，主要是胞嘧啶核苷、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、癸二酸、溶血卵磷脂LysoPC(15:0)、苯乙酰胺。采用本发明发现的诊断代谢标记物、便捷，提高了工作效率。

样品制备方法和代谢产物轮廓的定性与定量分析方法也是影响代谢组学研究的关键环节。有效的样品制备方法力求简便、高效排除无效干扰且能让内源性代谢产物最大限度检出。理想的代谢轮廓表征方法要求高通量、高灵敏和高分辨。一方面，限于代谢组学研究的样本量较大，只有高通量分析条件下才能保证生物样品在稳定周期内被有效测定；另一方面，要求开发的分析方法对内源性代谢产物能够高灵敏和高分辨检出，有效摒弃离子抑制效应，保证辨识信息的最大化暴露；还要求开发的分析方法具有良好的区分性和重现性。只有这样的样品分析方法和UPLC-G2-Si-HDMS方法才能保证后续代谢轮廓模式识别的有效性和客观性，真正揭示机体代谢轮廓的变化规律和变化本质；

1实验材料

1.1仪器

Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪(沃特世科技有限公司，美国)；

Waters SYNAPT G2-Si HDMS质谱仪(沃特世科技有限公司，美国)；

Progenesis QI软件(沃特世科技有限公司，美国)；

MassLynx V4.1工作站(沃特世科技有限公司，美国)；

ST-16R型高速低温离心机(赛默飞世尔科技有限公司，美国)；

VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司，中国)；

PB1501-N型电子分析天枰(梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司，中国)；

KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；

Thermo Scientific Finnpipette F3单道移液器(赛默飞世尔科技有限公司，美国)(规格100-1000μL)；

Thermo Scientific Finnpipette F3单道移液器(赛默飞世尔科技有限公司，美国)(规格20-200μL)。

1.2药品与试剂

亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin)(SIGMA技术有限公司，美国)；

乙腈，色谱级(Merck技术有限公司，德国)；

甲醇，色谱级(Merck技术有限公司，德国)；

甲酸，色谱级(科密欧化学试剂有限公司，中国)；

蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料公司，中国)。

本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，本领域技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法，其特征在于，该方法具体是按照以下步骤进行的：

步骤一、利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物；

步骤二、利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

步骤三、鉴定冠心病心阳虚证受试者血液代谢生物标记物；

步骤三一、将内源性代谢物进行监督型OPLS-DA分析，分析得到正、负离子模式下的血液样本OPLS-DA模型二维得分Scores plot；根据得分Scores plot分析血液样本数据；

步骤三二、使用PCA，OPLS-DA获得潜在的生物标记物，根据分析的血液样本数据从OPLS-DA模型的S-plot列表中获得潜在生物标记物的各离子质量数；

步骤三三、根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物；

其中，所述38个生物标记物具体为尼古丁亚胺、25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、全-反-七异戊烯-二磷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、溶血卵磷脂、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、亚油酸、尿酸、D-乳酸、胞嘧啶核苷、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯甲酸、癸二酸、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺、11,12-环氧二十碳三烯酸、溶血卵磷脂、花生四烯酸、泛醌、非对称性二甲基精氨酸、尿苷/尿嘧啶核苷、吡咯烷酮羧酸、苯乙酰胺、a-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺；

步骤一中利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物具体过程为：

将n组健康受试者和冠心病心阳虚证受试者的血清样品中的每个样品取200μl合并，涡旋混匀，标记为血清QC样品，分装冻存；取室温解冻的血清QC样品200μl，加甲醇800μl，涡旋混匀30s，振荡15min，13000rpm在4℃离心15min，取上清液在45℃氮气流下吹干，残渣以200μl甲醇溶解，超声处理1min，涡旋混匀30s后，13000rpm在4℃离心15min，取上清液过0.22μm微型滤膜后，进样1μl供UPLC分析确定内源性代谢物；

所述UPLC分析色谱条件：色谱仪：WatersAcquityTM UPLC液相色谱仪；色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18 Column；流动相：流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；柱温预设：50℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.5ml/min；进样量：1μl；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；

梯度洗脱程序为：

步骤二中利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构具体过程为：

(1)、利用G2-Si-HDMS方法对内源性代谢物正、负离子模式全扫描，得到健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组个体血液样本的内含三维信息的质谱代谢轮廓图；

(2)、利用Markerlynx4.1软件获取血液样本代谢轮廓的质谱信息；其中，质谱信息包括保留时间、质核比和峰面积归一化值；

(3)、利用EZinfo软件将质谱信息进行非监督型PCA分析和监督型OPLS-DA分析，获得目标统计图或统计表；

(4)、采用SPSS17.0软件进行统计分析，将健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组间数据比较采用T检验，寻找两组间的差异代谢物，进而选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

所述质谱条件正离子扫描模式：脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3000V；扫描范围：m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽质量校正；

所述质谱条件负离子扫描模式具体为：毛细管电压：2500V；脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；扫描范围：m/z 50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽质量校正；

步骤三三中根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物具体过程为：

1)根据内源性代谢物结构确定在质量碎片下在5ppm内获得内源性代谢物结构分子式；

2)对潜在的生物标记物离子进行二级数据扫描，获得二级质谱信息；

3)通过内源性代谢物结构分子式、二级质谱信息及二级质谱信息中的潜在的生物标记物离子裂解方式进行匹配，鉴定或表征得到各潜在生物标记物；

4)将所有鉴定或表征后的各潜在生物标记物均进行独立样本t检验，鉴别了38个生物标记物。

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