CN102818867B

CN102818867B - 一种鉴别注射用核糖核酸ⅱ的方法

Info

Publication number: CN102818867B
Application number: CN201210295478.2A
Authority: CN
Inventors: 高其品; 徐多多; 高阳; 李秉安; 刁桂芳
Original assignee: JILIN AODONG YANJI CO Ltd
Current assignee: JILIN AODONG YANJI CO Ltd
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2032-08-17
Also published as: CN102818867A

Abstract

本发明公开了一种检测注射用核糖核酸Ⅱ的方法，包括如下步骤：将待测物质的核酸酶水解溶液进行高效液相色谱分析，采用的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ C₁₈色谱柱，流动相为甲酸溶液和乙腈溶液的混合物；若经上述分析后，确定所述待测物质含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质，则所述待测物质为或候选为注射用核糖核酸Ⅱ；反之，则所述待测物质不为或候选不为注射用核糖核酸Ⅱ。本发明利用高效液相色谱技术，建立了专属性强的“注射用核糖核酸Ⅱ”的质控方法，对于提高该药的科技含量、增加安全性、有效性、降低成本、扩大生产规模、提高市场占有率、向国际市场迈进具有重要意义。

Description

一种鉴别注射用核糖核酸Ⅱ的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测注射用核糖核酸Ⅱ的方法。

背景技术

“注射用核糖核酸Ⅱ”（BP素）是由吉林敖东药业集团延吉股份有限公司应用现代生物工程技术自主研发，在我国生物制药领域中具有独立知识产权的品种。2002年，经国家食品药品监督管理局专家审评，独家取得了“注射用核糖核酸II”的批准文号。该产品是应用现代生物工程技术，从健康牛胰脏中提取而成的免疫调节药，适用于胰腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤及其它癌症的辅助治疗，该药对乙型肝炎的辅助治疗也有较好的效果；亦可用于其他免疫机能低下引起的各种疾病。“注射用核糖核酸II”安全可靠，疗效确切，多种给药途径（静滴、肌注均可），深受广大医患的信赖，临床使用未发现明显的毒副作用和不良反应。

“注射用核糖核酸II”是由健康牛胰脏中提取的总核糖核酸，该注射液中总核糖核酸为80%，其中核糖核酸的种类、结构和其余成分尚在研究当中。该药品目前质量标准中的鉴别和含量测定均针对总核糖核酸，专属性不高。虽然该药品已占有一定的市场份额，有着较大的生产规模和较好的销售额，但是该药申报、审批时是按照生化药的要求完成，后国家统一将生化药转为化药或生物制品，因此该药的药效物质基础和质量控制方面，按照现行化药的要求，按照现代化、国际化的要求，按照确保用药安全有效的要求，还存在着一些不足及尚待提高改进的地方。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测或辅助检测注射用核糖核酸Ⅱ的方法。所述注射用核糖核酸Ⅱ的批准文号为国药准字H22020007、国药准字H20056530或国药准字H22020006。

本发明所提供的检测或辅助检测注射用核糖核酸Ⅱ的方法包括如下步骤：

（1）将待测物质的核酸酶水解溶液进行高效液相色谱分析；所述高效液相色谱分析中采用的色谱条件如下：美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18 5um，250×4.6mm，流动相为如下流动相A和流动相B，依次采用所述流动相A和所述流动相B进行洗脱；

流动相A：甲酸水溶液；

流动相B：体积比为80：20的甲酸水溶液与乙腈水溶液的混合溶液；

（2）按照如下方法确定所述待测物质是否为注射用核糖核酸Ⅱ：若步骤（1）高效液相色谱分析确定所述待测物质含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质，则所述待测物质为注射用核糖核酸Ⅱ或候选为注射用核糖核酸Ⅱ；若步骤（1）高效液相色谱分析确定所述待测物质不含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质，则所述待测物质不为注射用核糖核酸Ⅱ。

在本发明中，所述待测物质具体可为市售的名称为“注射用核糖核酸Ⅱ”的物质。

在上述方法中，步骤（1）所述流动相中，所述甲酸水溶液中甲酸的含量为每1000ml所述甲酸水溶液中含有1g所述甲酸；所述乙腈水溶液中乙腈的含量为每100ml所述乙腈水溶液中含有5g所述乙腈。

所述方法中，用所述流动相A洗脱10min后采用所述流动相B进行洗脱。

在上述方法中，步骤（1）中所述待测物质的核酸酶水解溶液的获得方法包括如下步骤：将所述待测物质与所述核酸酶按照质量比为5：1的比例溶解于水中，得到所述待测物质的核酸酶水解溶液。

在实际操作中，步骤（1）中所述待测物质的核酸酶水解溶液的获得方法还包括将所述待测物质与所述核酸酶按照质量比为5：1的比例溶解于水中后，进行60℃温育（如水浴）的步骤。其水解时间为1-3h，如1h。

所得所述待测物质的核酸酶水解溶液中所述待测物质的终浓度为2mg/ml（10mg/5ml）。

在上述方法中，步骤（1）中所述进行高效液相色谱分析的检测波长具体可为260nm，进样量具体可为5～20μl（如10μl），流速具体可为1ml/min。

在上述方法中，通过高效液相色谱分析所述待测物质中是否含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质的方法如下：

若经过高效液相色谱分析获得的色谱图，具有6个特征峰，且所述6个特征峰的相对保留时间在各自规定值±5%范围之内，则所述待测物质中含有或候选含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质，进而则所述待测物质为注射用核糖核酸Ⅱ或候选为注射用核糖核酸Ⅱ；反之，则所述待测物质中不含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质，进而则所述待测物质不为注射用核糖核酸Ⅱ；

所述6个特征峰的相对保留时间的所述规定值按照保留时间从小到达的顺序依次为0.450-0.497、0.592-0.654、0.844-0.933、1（将该峰设为参比峰）、2.550-2.818、2.909-3.215，具体如（0.462-0.479、0.621-0.628、0.878-0.892、1、2.638-2.713、2.978-3.106）其中，第1个特征峰对应胞嘧啶核苷酸，第2个特征峰对应尿嘧啶核苷酸，第4个特征峰对应鸟嘌呤核苷酸，第5个特征峰对应鸟嘌呤核苷，第6个特征峰对应腺嘌呤核苷。在本发明的一个实施例中，所述6个特征峰的相对保留时间的所述规定值按照保留时间从小到达的顺序依次具体为0.474、0.622、0.889、1.00、2.684、3.062。

在实际操作中，还可对所述待测物质进行液质联用分析，通过检测所述待测物质中各分离组分分子量进一步确定所述待测物质中是否含有胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质。

在上述方法中，进行色谱分析时，色谱柱的柱温可为25-35℃，由于接近室温的温度，可适当延长色谱柱填料寿命，故而在本发明的一个实施例中，选择25℃的柱温。

在上述方法中，理论板数按鸟嘌呤核苷酸峰（参比峰）计算应不低于20000。

进一步，上述方法还包括如下步骤：按照上述方法将所述待测物质进行高效液相色谱分析得到的待测物质色谱图，与相同条件下对注射用核糖核酸Ⅱ标准品进行高效液相色谱分析得到的标准品色谱图进行比对，若所述待测物质色谱图与所述标准品色谱图一致，则所述待测物质为注射用核糖核酸Ⅱ或候选为注射用核糖核酸Ⅱ，若所述待测物质色谱图与所述标准品色谱图不一致，则所述待测物质不为注射用核糖核酸Ⅱ。所述注射用核糖核酸Ⅱ标准品的批准文号为国药准字H22020007、国药准字H20056530或国药准字H22020006。

更进一步，上述方法还包括比较上述待测物质色谱图和所述标准品色谱图，确定两者的指纹图谱相似度的步骤。

所述指纹图谱相似度采用常规方法比较，具体可用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算得到。在本发明的一个实施例中，所用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》具体为中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）。若所得相似度大于0.9，则所述待测物质为注射用核糖核酸Ⅱ或候选为注射用核糖核酸Ⅱ，若所得相似度不大于0.9，则所述待测物质不为注射用核糖核酸Ⅱ或候选不为注射用核糖核酸Ⅱ。

本发明利用高效液相色谱技术，建立了专属性强的“注射用核糖核酸Ⅱ”的质量控制方法，对于提高“注射用核糖核酸Ⅱ”的科技含量、增加其安全性、有效性、降低成本、扩大生产规模、提高市场占有率、向国际市场迈进均具有积极的影响和意义。

附图说明

图1为供试品的色谱图。

图2为供试品的离子流图及质谱图。其中，A为总离子流图；B-1为质谱图正谱（保留时间3.7min）；B-2为质谱图负谱（保留时间3.7min）；C-1为质谱图正谱（保留时间5.1min）；C-2为质谱图负谱（保留时间5.1min）；D-1为质谱图正谱（保留时间7.8min）；D-2为质谱图负谱（保留时间22.8min）；E-1为质谱图正谱（保留时间7.8min）；E-2为质谱图负谱（保留时间22.8min）；F-1为质谱图正谱（保留时间27.1min）；F-2为质谱图负谱（保留时间27.1min）。

图3为水-乙腈（90：10）洗脱色谱图。

图4为1‰甲酸-乙腈（80：20）洗脱色谱图。

图5为1‰甲酸（100%）洗脱色谱图。

图6为流动相：0～10min，1‰甲酸-5%甲醇（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%甲醇（80：20）洗脱色谱图。

图7为流动相：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20）洗脱色谱图。

图8为流动相中添加乙酸、磷酸、甲酸洗脱色谱图。其中，A为流动相：0～10min，1‰乙酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰乙甲酸-5%乙腈（80：20）洗脱色谱图；B为流动相：0～10min，1‰磷酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰磷酸-5%乙腈（80：20）洗脱色谱图；C为流动相：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20）洗脱色谱图。

图9为采用不用色谱柱分离的色谱图。其中，A为柱1分离色谱图；B为柱2分离色谱图；C为柱3分离色谱图。

图10为不同柱温时液相色谱图。其中，A为柱温25℃时供试品液相色谱图；B为柱温30℃时供试品液相色谱图；C为柱温35℃时供试品液相色谱图。

图11为不同品牌HPLC分离的色谱图。其中，A为岛津LC-2010A高效液相色谱仪分离色谱图；B为Waters2487-600高效液相色谱仪分离色谱图；C为Agilent 1200 Series高效液相色谱仪分离色谱图。

图12为样品经不同方法水解的色谱图。其中，A为直接加水溶解水解样品的色谱图；B为酸水解样品的色谱图；C为酶水解样品的色谱图。

图13为酶溶液直接水解1h后的色谱图和不同酶水解的供试品色谱图。其中，A为酶溶液直接水解1h后的色谱图。B为T₂酶水解的供试品色谱图；C为核糖核酸酶A水解的供试品色谱图；D为核酸酶水解的供试品色谱图。

图14为不同加酶量水解的供试品色谱图。其中，A为2mg核酸酶水解的供试品色谱图；B为5mg核酸酶水解的供试品色谱图；C为10mg核酸酶水解的供试品色谱图；D为20mg核酸酶水解的供试品色谱图；E为50mg核酸酶水解的供试品色谱图。

图15为精密度试验结果。其中，A为精密度试验全谱相似度评价结果；B为精密度试验全谱校正后相似度评价结果；C为精密度试验相似度评价结果。S1-S6表示6次进样。

图16为重复性试验结果。其中，A为重复性试验全谱相似度评价结果；B为重复性试验全谱校正后相似度评价结果；C为重复性试验相似度评价结果。S1-S6表示6次进样。

图17为稳定性试验结果。其中，A为稳定性试验全谱相似度评价结果；B为稳定性试验全谱校正后相似度评价结果；C为稳定性试验相似度评价结果。S1-S6表示6个供试样品。

图18为10批供试品检测结果。其中，A为全谱相似度评价结果；B为全谱校正后相似度评价结果；C为相似度评价结果。S1-S10表示10个供试样品。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007）（吉林省敖东药业集团延吉股份有限公司），共10批。批号分别为，20090421、20090608、20091111、20100114、20100518、20101105、20110201、20110401、20110810、20111213。上述各批次药品均按照申报国药准字时递交的生产工艺进行生产，均符合申报国药准字时递交的药品各项参考指标。

美国Agilent 1200高效液相色谱仪；日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪；美国Waters600-2487高效液相色谱仪；美国Agilent 6320 LC-MS；蒸馏水机WP-VP-Ⅲ-40（四川沃特尔科技发展有限公司）

甲酸（天津市光复科技发展有限公司，分析级），乙酸（西陇化工股份有限公司，分析级），磷酸（天津市福晨化工厂，分析级）；甲醇、乙腈（J.T.Barker,色谱级）；核酸酶（南宁庞博生物工程有限公司）；液相用水（娃哈哈纯净水）。

胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷：sigma公司。产品目录号如下：胞嘧啶核苷酸C1131-500MG、尿嘧啶核苷酸U1752-1G、鸟嘌呤核苷酸G8377-1G、鸟嘌呤核苷G6752-1G、腺嘌呤核苷A9251-1G。

T2酶（M0044，Scienticfic Research Special）；核糖核酸A（R6513-10MG，sigma公司）；核酸酶（批号11113002，南宁庞博生物工程有限公司）。

实施例1、高效液相色谱检测注射用核糖核酸Ⅱ条件的优化

一、注射用核糖核酸Ⅱ特征图谱中共有峰的确认及共有色谱峰的指认

1、液相色谱法

（1）供试品溶液的制备

分别精密称取10批注射用核糖核酸Ⅱ粉末各10mg置于5ml量瓶中，加入核酸酶2mg，加水溶解并定容至刻度，60℃水浴水解1h，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得10批注射用核糖核酸Ⅱ的供试品溶液。

（2）对照品溶液的制备

分别精密称取胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷适量，分别加水制成每1ml含1mg的对照品溶液，即得。

（3）色谱条件

色谱柱：美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18（5um，250×4.6mm）；流速：1ml/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；流动相：洗脱时间为0～10min时，1‰甲酸（1g/1000ml）与5%（5g/100ml）乙腈的混合溶液（体积比100：0），洗脱时间为10～60min时，1‰甲酸与5%乙腈的混合溶液（体积比80：20）；进样量：10μL。

（4）测定方法

分别吸取上述制备的供试品溶液及对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，分别记录色谱图。

（5）结果

10批注射用核糖核酸Ⅱ经酶解后的供试品溶液，注入液相色谱仪后记录10个色谱图，确认6个共有峰，以峰面积最大的4号峰为参比峰。计算参比峰的理论板数为25344。见图1。从图1及对照品色谱图中色谱峰的保留时间看，供试品色谱图中共有6个色谱峰（其中5个特征峰与对照品色谱峰相匹配）按照保留时间从小到大的顺序依次为：第1个特征峰对应胞嘧啶核苷酸、第2个特征峰对应尿嘧啶核苷酸、第4个特征峰对应鸟嘌呤核苷酸、第5个特征峰对应鸟嘌呤核苷、第6个特征峰对应腺嘌呤核苷。

2、液相色谱-质谱联用法

通过对比液相色谱中色谱峰的保留时间，初步确定了供试品色谱中的5个色谱峰，但单纯凭保留时间的一致不能肯定以上色谱峰的信息，故本发明通过LC-MS研究来进一步确证。

（1）供试品溶液的制备：同步骤1（1）。

（2）色谱条件：同步骤1（3）。

（3）质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI)；自动正负二级离子化模式。扫描范围：50～1200Da；干燥气温度：350℃；干燥气流量：9.0L/min；雾化气压强：0.24MPa；毛细管电压：4kV。

（4）测定方法

吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，记录总离子流图及各个色谱峰的质谱图。

（5）结果

结果见图2和表1。可知，峰1、2、4、5、6分别与胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的分子量一致，故通过LC-MS实验本发明进一步确认图1中1、2、4、5、6号色谱峰分别为胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷，与步骤1中液相色谱法指认的结论一致。

表1供试品中色谱峰LC-MS分析结果

综上所述，通过10批供试品的色谱图，本发明确定了其中的6个峰为特征图谱的共有峰。通过液相色谱和液相色谱法-质谱联用两种方法，明确了供试品指纹图谱中6个共有峰的化学组成。

二、色谱条件的选择

色谱实验条件选择的目的是通过比较实验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征以及信息量足够的特征图谱，以满足特征图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。其中，特征图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。从以下六方面内容进行研究：

1、检测波长的选择

采用DAD检测器，参照步骤一1中色谱条件测定供试品溶液中各共有峰的最大吸收波长，确定260nm为检测波长。

2、流动相的选择

（1）供试品溶液的制备：同步骤一1（1）。

（2）色谱条件

色谱柱：美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18（5um，250×4.6mm）；柱温：25℃；流速：1ml/min；波长：260nm；进样量：10μL。

（3）流动相

注射用核糖核酸Ⅱ水解后得到的核苷及核苷酸类物质，极性较大，为了获得较好的分离效果，本发明考察了以下流动相，将供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

流动相1：水-乙腈（90：10），即水与乙腈按照体积比90：10的比例混合；

流动相2：1‰甲酸-乙腈（80：20），即1‰（1g/1000ml）甲酸水溶液与乙腈按照体积比80：20的比例混合；

流动相3：1‰甲酸（100%），即1‰（1g/1000ml）甲酸水溶液；

流动相4：0～10min，1‰甲酸-5%甲醇（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%甲醇（80：20），即洗脱时间为0～10min时，流动相为1‰（1g/1000ml）甲酸水溶液，洗脱时间为10～60min时，流动相为1‰（1g/1000ml）甲酸水溶液与5%（5g/100ml）甲醇水溶液按照体积比80：20的比例混合；

流动相5：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20），即洗脱时间为0～10min时，流动相为1‰（1g/1000ml）甲酸水溶液，洗脱时间为10～60min时，流动相为1‰（1g/1000ml）甲酸水溶液与5%（5g/100ml）乙腈水溶液按照体积比 80：20的比例混合；

流动相6：0～10min，1‰乙酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰乙酸-5%乙腈（80：20），即洗脱时间为0～10min时，流动相为1‰（1g/1000ml）乙酸水溶液，洗脱时间为10～60min时，流动相为1‰（1g/1000ml）乙酸水溶液与5%（5g/100ml）乙腈水溶液按照体积比80：20的比例混合；

流动相7：0～10min，1‰磷酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰磷酸-5%乙腈（80：20），即洗脱时间为0～10min时，流动相为1‰（1g/1000ml）磷酸水溶液，洗脱时间为10～60min时，流动相为1‰（1g/1000ml）磷酸水溶液与5%（5g/100ml）乙腈水溶液按照体积比80：20的比例混合。

（4）结果

流动相1：水-乙腈（90：10），色谱峰未达到分离，结果见图3。

流动相2：酸具有改善峰形及提高分离度的作用，选用流动相1‰甲酸-乙腈（80：20）洗脱，色谱峰未达到基线分离。结果见图4。

流动相3：1‰甲酸（100%），后两个色谱峰拖尾，峰形不好。结果见图5。

流动相4：采用0～10min1‰甲酸，10～60min添加一定比例的有机相以达到更好的分离效果。0～10min，1‰甲酸-5%甲醇（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%甲醇（80：20），结果见图6。

流动相5：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20），结果见图7。

比较图6和图7可知，流动相1‰甲酸-5%乙腈系统的分离度更好，故采用1‰甲酸-5%乙腈系统。

流动相5-7：流动相中添加剂（不同种类的酸）的影响也是十分显著的。因此，本发明比较流动相中不同种类的酸对色谱图的影响。结果见图8。由图可知，图8中C图的分离度及峰形较好，故采用甲酸作为流动相更好。

综上所述，确定本实验的流动相为0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20）。应用此流动相洗脱时，各个色谱峰出峰时间合理，各峰的分离度良好，峰形对称，柱效高。

3、色谱柱的选择

不同生产厂家色谱柱因选用的硅胶原料、键合条件、封尾情况等的差异，致使在性能上互有差异，因此，需要通过实验比较，选择合适的色谱柱。在本发明中，通过上述步骤2所确定的色谱条件洗脱的前10分钟流动相中没有有机相，因为普通的C₁₈色谱柱不能用纯水相作为流动相，否则会使填料塌陷，故本发明只能选择经过特殊处理的水相色谱柱。

本发明选择了三个厂家的水相色谱柱，如下：

柱1：美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18（5μm，250×4.6mm）；

柱2：日本资生堂CAPCELL PAK Aq C18(5μm,250×4.6mm)；

柱3：美国GRACE Prevail C18（5μm，250×4.6mm）。

供试品溶液的制备同步骤一1（1），将供试品溶液注入液相色谱仪，除色谱柱外的其他色谱条件同步骤一1（3），记录色谱图。

结果见图9。可明显看出，三种色谱柱的分离效果差异很大，应用Agilent ZORBAX SB-AQ C₁₈色谱柱分离时，各色谱峰分离完全，峰数最多，保留时间适中，峰形好。这说明在实验中如使用不同品牌的水相色谱柱，即使其它条件都一致，所得到的色谱图也有较大的差异，这可能是由于不同厂家的水相色谱柱在制作工艺上存在差异所致。为了使实验具有更好的重现性，需要固定特定厂家特定品牌的色谱柱。综合以上实验结果选择Agilent ZORBAX SB-AQ C₁₈作为本发明的色谱柱。

4、柱温的选择

柱温的选择与恒定是特征图谱技术稳定的影响因素之一。适宜的柱温不仅影响色谱峰的分离效果，而且柱温发生变化将导致色谱峰保留时间的迁移，技术参数的设置就失去了意义，因此，柱温必须限定。而且，在分离效果相同时，应尽可能选定低温，以延长色谱柱填料的寿命。

在本发明中分别设定柱温25℃、30℃、35℃。供试品溶液的制备同步骤一1（1），除柱温外的其他色谱条件同步骤一1（3），记录色谱图。

结果如图10所示，在各柱温下，峰分离效果差别不是很大，且柱压均正常。在分离效果一致时，应尽可能选定接近室温的温度，以延长色谱柱填料的寿命。综上，本实验确定柱温为25℃，接近室温并且对柱子损伤小。

5、进样量的选择

虽然进样量对图谱的结果影响不是很大，且加大进样量可以减弱流动相洗脱时基线漂移的程度，但是色谱柱的载样量是有限度的，如果进样量过大，造成色谱柱超载，可导致色谱峰宽增加或色谱峰尖钝化，还会影响色谱柱的寿命。因此，当洗脱时基线较为平稳时，进样量应尽量减少。

本发明分别考察了进样量为5μl，10μl，20μl。供试品溶液的制备同步骤一1（1），除进样量外的其他色谱条件同步骤一1（3），记录色谱图。

结果显示，以上三种进样量的色谱图在峰形，分离度等方面差异均不大，因此，本发明中进样量在5～20μl之间均可。

6、不同仪器的选择

本发明选择了三个厂家的液相色谱仪分别进行考察，分别为Waters600-2487、岛津LC-2010A、Agilent1200高效液相色谱仪。供试品溶液的制备同步骤一1（1），色谱条件同步骤一1（3），记录色谱图。

色谱图结果如图11所示，以峰面积最大的4号色谱峰（鸟嘌呤核苷酸）为参比峰（S），计算不同厂家仪器测定的相对保留时间（表2）和相对峰面积（表3）。结果表明，不同品牌HPLC测定的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均符合±5%限定要求。

表2不同仪器色谱峰的保留时间及相对保留时间

表3不同仪器色谱峰的相对峰面积

综上所述，本实验采用的色谱条件为美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18（5μm，250×4.6mm），流速：1ml/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；流动相：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20）。

三、供试品制备条件的优化

1、水解方法的考察

精密称取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20101105）粉末10mg置于5ml量瓶中，共三份，分别：a）加入水溶解至刻度；b）核酸酶2mg，加水溶解至刻度；c）加入1%盐酸水溶解至刻度。再将其60℃水浴下水解1h，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得三种供试品溶液。

色谱条件同步骤一1（3），将上述分别制得的三种供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果如图12所示。由图可知，直接加水溶解的样品未发生水解；酸水解后的样品色谱图中色谱峰多而杂乱，基线噪音大；酶水解后样品的色谱图清晰，各个色谱峰的分离度符合要求，基线平稳。因此，本发明选择酶水解的方法对样品进行水解，方法简单可行。

同时，为排除残留核酸酶对供试品的影响，本发明还考察了核酸酶的影响。将2mg酶加水直接定容至5ml，60℃水浴水解1h，采用与上相同色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图13。核酸酶在波长260nm处对酶水解的供试品色谱图没有影响。

2、不同种类酶水解供试品的考察

本发明考察了三种不同种类的酶对样品进行水解：T₂酶、核糖核酸A酶和核酸酶。

精密称取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20101105）粉末10mg置于5ml量瓶中，共三份，分别：a）T₂酶2mg，加水溶解至刻度；b）核酸酶2mg，加水溶解至刻度；c）核糖核酸A酶2mg，加水溶解至刻度。再将其60℃水浴下水解1h，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得三种供试品溶液。

结果见图13。由图可知，经T₂酶、核糖核酸A酶水解供试品的色谱图中的色谱峰较少，而核酸酶水解的供试品色谱图中的色谱峰峰多。因此，本发明选定以核酸酶水解供试品。

3、不同加酶量的考察

本发明分别考察5种加酶量，分别为2mg、5mg、10mg、20mg、50mg。即精密称取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20101105）粉末10mg置于5ml量瓶中，加入相应量的核酸酶，加水溶解至刻度，再将其60℃水浴下水解1h，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得五种供试品溶液。

色谱条件同步骤一1（3），将上述分别制得的五种供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果见图14。由图可知，酶量较大时，部分色谱峰分离度下降，且分离效果较差；酶量为2mg时各色谱峰分离度适中，且分离效果好。因此，本发明选定加酶量为2mg对样品进行进行水解。

4、水解时间的考察

样品加入核酸酶后分别水解1h、2h、3h。即精密称取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20101105）粉末10mg置于5ml量瓶中，核酸酶2mg，加水溶解至刻度，再将其60℃水浴下水解相应时间，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得三种供试品溶液。

色谱条件同步骤一1（3），将上述分别制得的三种供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，比较它们的峰面积变化。

结果表明，不同水解时间下，色谱图基本无变化，各共有峰的峰面积的变化很小，即水解1h后，样品水解已经稳定。因此，本发明选定水解时间为1h。

综合本实施例结果，得到高效液相色谱检测注射用核糖核酸Ⅱ的优化后条件如下：

A、色谱条件

色谱柱：美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18（5μm，250×4.6mm）；流速：1ml/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；流动相：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0），10～60min，1‰甲酸-5%乙腈（80：20）；进样量5-20μL。

B、供试品溶液的制备条件

将供试品注射用核糖核酸Ⅱ与核酸酶按照质量比为5：1（10mg注射用核糖核酸Ⅱ添加核酸酶2mg）的比例溶解于水中，60℃水浴下水解1h，冷却过滤后得到供试品的核酸酶水解溶液。

实施例2、高效液相色谱检测注射用核糖核酸Ⅱ的方法学的考察

在本实施例中，供试品溶液的制备、对照品溶液的制备以及色谱条件如下：

a）供试品溶液的制备

精密称取注射用核糖核酸Ⅱ粉末10mg置于5ml量瓶中，加入核酸酶2mg，加水溶解并定容至刻度，60℃水浴下水解1h，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得。

b）对照品溶液的制备

分别精密称取对照品适量，分别加水制成每1ml含1mg的对照品溶液，即得。

c）色谱条件

美国Agilent ZORBAX SB-Aq C18（5um，250×4.6mm），流速：1ml/min；波长：260nm；柱温：25℃；流动相：0～10min，1‰甲酸-5%乙腈（100：0）,10～60min1‰甲酸-5%乙腈（80：20）

一、精密度试验

取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20110201）10mg，按照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，以4号峰鸟嘌呤核苷酸为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，及它们的RSD。另外，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算精密度试验的相似度。

各共有峰的相对保留时间及相对峰面积结果如表4和表5所示，精密度实验中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版））软件计算精密度试验的相似度结果见图15，精密度试验相似度为0.9以上。以上结果表明仪器等整个检测系统的精密度良好。

表4注射用核糖核酸Ⅱ精密度试验结果（示保留时间和相对保留时间）

表5注射用核糖核酸Ⅱ精密度试验结果（示峰面积和相对峰面积）

二、重复性试验

取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20110201）10mg，共6份，分别按照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，以4号峰鸟嘌呤核苷酸为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，及它们的RSD。另外，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版））软件计算精密度试验的相似度。

各共有峰的相对保留时间及相对峰面积结果如表6和表7所示，6份供试品中相对保留时间及相对峰面积比值的RSD均小于5%。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算精密度试验的相似度结果见图16，重复性试验相似度为0.9以上。以上结果表明该方法的重现性良好。

表6注射用核糖核酸Ⅱ重复性试验结果（示保留时间和相对保留时间）

表7注射用核糖核酸Ⅱ重复性试验结果（示峰面积和相对峰面积）

三、稳定性试验

取注射用核糖核酸Ⅱ（国药准字H22020007，批号：20110201）10mg，共6份，分别按照上述供试品制备方法制备供试品溶液，6份供试品溶液分别在室温下保存0h、4h、8h、12h、16h、24h，之后分别按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，以4号峰鸟嘌呤核苷酸为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，及它们的RSD。另外，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版））软件计算精密度试验的相似度。

各共有峰的相对保留时间及相对峰面积结果如表8和表9所示，注射用核糖核酸Ⅱ供试品在24小时内通过HPLC分析结果稳定，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.3%；相对峰面积的RSD小于3%。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算精密度试验的相似度结果见图17，稳定性试验相似度为0.9以上。以上结果表明室温保存下24小时内注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液稳定性良好。

表8注射用核糖核酸Ⅱ稳定性试验结果（示保留时间和相对保留时间）

表9注射用核糖核酸Ⅱ稳定性试验结果（示峰面积和相对峰面积）

综合本实施例的结果，可见利用高效液相色谱检测注射用核糖核酸Ⅱ的方法具有较高的精密度、实验重复性好、稳定性强的特点。

实施例3、高效液相色谱检测注射用核糖核酸Ⅱ的应用

基于上述实施例1和实施例2，本实施例采用高效液相色谱检测10批注射用核糖核酸Ⅱ，以鸟嘌呤核苷酸为参照物（即峰4为参比峰，记作S），计算各共有峰的相对峰面积、相对保留时间。另外，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件（中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版））计算10批注射用核糖核酸Ⅱ的相似度。

其中，供试品溶液的制备、对照品溶液的制备以及色谱条件如下：

a）供试品溶液的制备

分别精密称取注射用核糖核酸Ⅱ（共10批）粉末10mg置于5ml量瓶中，加入核酸酶2mg，加水溶解并定容至刻度，60℃水浴下水解1h，放冷，用水补足至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得10份供试品溶液。

b）对照品溶液的制备

c）色谱条件

各共有峰的相对保留时间及相对峰面积结果如表10和表11所示，色谱峰的平均相对保留时间，0.474（峰1）、0.622（峰2）、0.889（峰3）、1.00（峰4/S）、2.684（峰5）、3.062（峰6）。所有十批供试品的共有峰均在相应色谱峰的平均相对保留时间的±5%范围内。色谱峰的平均相对峰面积0.398（峰1，占总峰面积10%-20%）、0.342（峰2，占总峰面积10%-20%）、0.549（峰3，占总峰面积10%-20%）、1.00（峰4/S，占总峰面积＞20%）、0.156（峰5，占总峰面积＜10%）、0.146（峰6占总峰面积＜10%）。所有十批供试品的共有峰的峰面积均在相应色谱峰的平均相对峰面积的范围内，即单峰面积占总峰面积（所述总峰面积为6个特征峰的面积与其它峰的面积之和）大于20%的共有峰（峰4，即S峰），其每批供试品共有峰的相对峰面积具体值与平均相对峰面积的差值在平均相对峰面积±20%的范围内，单峰面积占总峰面积大于10%小于20%的共有峰（峰1、2、3），其每批供试品共有峰的相对峰面积具体值与平均相对峰面积的差值小于平均相对峰面积±25%的范围内；单峰面积占总峰面积小于10%的共有峰（峰5、6），峰面积比值不作要求。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版））软件计算10批注射用核糖核酸Ⅱ的相似度结果见图18。

表10 10批注射用核糖核酸Ⅱ供试品结果（示保留时间和相对保留时间）

表11 10批注射用核糖核酸Ⅱ供试品结果（示峰面积和相对峰面积）

Claims

1.鉴别注射用核糖核酸Ⅱ的方法，包括如下步骤：

将待测物质的核酸酶水解溶液进行高效液相色谱分析；

所述高效液相色谱分析中采用的色谱条件如下：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ C₁₈色谱柱，流动相为如下流动相A和流动相B，依次采用所述流动相A和所述流动相B进行洗脱；

流动相A：甲酸水溶液；

所述流动相具体为：洗脱时间为0-10min时，1‰甲酸-5%乙腈的混合溶液，体积比100：0；洗脱时间为10～60min时，1‰甲酸与5%乙腈的混合溶液，体积比80：20；其中，1‰甲酸浓度为1g/1000ml，5%乙腈为5 g/100ml；

流速为1ml/min；检测波长为260nm；柱温为25℃；

注射用核糖核酸Ⅱ应在胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷5种物质的保留时间处出峰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述待测物质的核酸酶水解溶液的获得方法包括如下步骤：将所述待测物质与所述核酸酶按照质量比为5：1的比例溶解于水中，得到所述待测物质的核酸酶水解溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述待测物质的核酸酶水解溶液的获得方法还包括将所述待测物质与所述核酸酶按照质量比为5：1的比例溶解于水中后，进行60℃温育的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：进样量为5～20μl。