CN113533561A - 一种注射用核糖核酸ⅱ重均分子量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法，本发明以葡聚糖为标准对照品，建立了对注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量专属性强的检测方法。对于提高“注射用核糖核酸Ⅱ”的科技含量、增加其安全性、有效性、降低成本、扩大生产规模、提高市场占有率、向国际市场迈进均具有积极的影响和意义。进一步地，本发明通过优化液相色谱分析的条件，进一步提高了对“注射用核糖核酸Ⅱ”的重均分子量的准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法。
背景技术
“注射用核糖核酸Ⅱ”(BP素)是由吉林敖东药业集团延吉股份有限公司应用现代生物工程技术自主研发，在我国生物制药领域中具有独立知识产权的品种。2002年，经国家食品药品监督管理局专家审评，独家取得了“注射用核糖核酸II”的批准文号。该产品是应用现代生物工程技术，从健康牛胰脏中提取而成的免疫调节药，适用于胰腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤及其它癌症的辅助治疗，该药对乙型肝炎的辅助治疗也有较好的效果；亦可用于其他免疫机能低下引起的各种疾病。“注射用核糖核酸II”安全可靠，疗效确切，多种给药途径(静滴、肌注均可)，深受广大医患的信赖，临床使用未发现明显的毒副作用和不良反应。
“注射用核糖核酸II”是由健康牛胰脏中提取的总核糖核酸，该注射液中总核糖核酸为80％，其中核糖核酸的种类、结构和其余成分尚在研究当中。该药品目前质量标准中的鉴别和含量测定均针对总核糖核酸，专属性不高。虽然该药品已占有一定的市场份额，有着较大的生产规模和较好的销售额。但是该药申报、审批是按照生化药的要求完成后，国家统一将生化药转为化药或生物制品。因此，该药的药效物质基础和质量控制方面，按照现行化药的要求，按照现代化、国际化的要求，按照确保用药安全有效的要求，还存在着一些不足及尚待提高改进的地方。
然而，在开发注射用核糖核酸Ⅱ的过程中，注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量并没有现成的检测和分析方法，这种现状使得该药物没有统一的标准，极大的阻碍了该药物的应用和推广。因此，建立一套有效、稳定的重均分子量检测方法是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法。本发明提供的检测方法精密度高、重复性和稳定性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法，包括以下步骤：
将注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，得到注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息；
将所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息代入葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线，获得所述注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量。
优选地，所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液包括注射用核糖核酸Ⅱ供试品和溶剂；所述溶剂为质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液。
优选地，所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液的浓度为1～5mg/mL。
优选地，所述液相色谱分析的参数包括：
色谱柱：凝胶色谱柱；
流动相：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液；
流速：0.3～0.7mL/min；
柱温：25～40℃；
进样量：5～15μL；
检测器：示差折光检测器；
工作站：GPC专用软件工作站，理论板数≥3000。
优选地，所述凝胶色谱柱为OHpak SB802-HQ，8mm×300mm。
优选地，所述液相色谱分析的参数包括：
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
进样量：10μL；
检测器：示差折光检测器。
优选地，所述葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线由包括以下步骤的方法获取：
将多个重均分子量不同的葡聚糖标准品和溶剂混合，得到重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液；
对所述重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液进行液相色谱分析，得到重均分量不同的葡聚糖标准品的色谱信息；
将葡聚糖标准品的重均分子量的对数值和色谱信息进行拟合，得到所述葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线。
优选地，所述葡聚糖标准品的重均分子量包括180、342、1000、5000和12000。
优选地，所述重均分子量为180的葡聚糖标准品为葡萄糖；重均分子量为342的葡聚糖标准品为蔗糖；重均分子量为1000的葡聚糖标准品为Dextran T 1000；重均分子量为5000的葡聚糖标准品为Dextran T 5000；重均分子量为12000的葡聚糖标准品为DextranT12000。
本发明提供了一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法，包括以下步骤：将注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，得到注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息；将所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息代入葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线，获得所述注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量。
本发明以葡聚糖为标准对照品，建立了对注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量专属性强的检测方法。对于提高“注射用核糖核酸Ⅱ”的科技含量、增加其安全性、有效性、降低成本、扩大生产规模、提高市场占有率、向国际市场迈进均具有积极的影响和意义。
进一步地，本发明通过优化液相色谱分析的条件，进一步提高了对“注射用核糖核酸Ⅱ”的重均分子量的准确检测。
附图说明
图1为实施例1中以超纯水为流动相对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图2为实施例1中以0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液为流动相对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图3为实施例1中以质量浓度为0.2％的氯化钠溶液为流动相对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图4为实施例1中以质量浓度为1.2％的氯化钠溶液为流动相对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图5为实施例1中以质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液为流动相对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图6为实施例2中色谱柱为OHpak SB804-HQ对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图7为实施例2中色谱柱为OHpak SB803-HQ对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图8为实施例2中色谱柱为OHpak SB802.5-HQ对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图9为实施例2中色谱柱为STR-100对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图10为实施例2中色谱柱为TSK G2500PWXL对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图11为实施例2中色谱柱为OHpak SB802-HQ对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图12为实施例3中柱温为25℃对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图13为实施例3中柱温为30℃对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图14为实施例3中柱温为35℃对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析所得色谱图；
图15为实施例4所得标准曲线图；
图16～21为实施例5中精密度试验所得色谱图；
图22～27为实施例6中稳定性试验所得色谱图；
图28～33为实施例7中重复性试验所得色谱图；
图34～43为实施例8所得10个批次标准品溶液所得色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法，包括以下步骤：
将注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，得到注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息；
将所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息代入葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线，获得所述注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量。
在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
本发明将注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，得到注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息。
在本发明中，所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液优选包括注射用核糖核酸Ⅱ供试品和溶剂。在本发明中，所述溶剂优选为质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液。在本发明中，所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液的浓度优选为1～5mg/mL，进一步优选为5mg/mL。
在本发明中，所述液相色谱分析的参数优选包括：
色谱柱：凝胶色谱柱，进一步优选为OHpak SB802-HQ，8mm×300mm；
流动相：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液；
流速：0.3～0.7mL/min，进一步优选为0.5mL/min；
柱温：25～40℃，进一步优选为35℃；
进样量：5～15μL，进一步优选为10μL；
检测器：示差折光检测器；
工作站：GPC专用软件工作站，理论板数≥3000。
得到注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息后，本发明将所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息代入葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线，获得所述注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量。
在本发明中，所述葡聚糖标准品分子量-色谱信息的标准曲线优选由包括以下步骤的方法获取：
将多个重均分子量不同的葡聚糖标准品和溶剂混合，得到重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液；
对所述重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液进行液相色谱分析，得到重均分量不同的葡聚糖标准品的色谱信息；
将葡聚糖标准品的重均分子量的对数值和色谱信息进行拟合，得到所述葡聚糖标准品分子量-色谱信息的标准曲线。
本发明将多个重均分子量不同的葡聚糖标准品和溶剂混合，得到重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液。
在本发明中，所述葡聚糖标准品的重均分子量优选包括180、342、1000、5000和12000。在本发明中，所述重均分子量为180的葡聚糖标准品优选为葡萄糖；重均分子量为342的葡聚糖标准品优选为蔗糖；重均分子量为1000的葡聚糖标准品优选为Dextran T1000；重均分子量为5000的葡聚糖标准品优选为DextranT 5000；重均分子量为12000的葡聚糖标准品优选为Dextran T 12000。在本发明中，所述溶剂优选为质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液。
在本发明中，所述液相色谱分析的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
得到重均分量不同的葡聚糖标准品的色谱信息后，本发明将葡聚糖标准品的重均分子量的对数值和色谱信息进行拟合，得到所述葡聚糖标准品分子量-色谱信息的标准曲线。
本发明对所述拟合的方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的拟合手段即可。
本发明对所述代入的方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的代入方式即可。
下面结合实施例对本发明提供的注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例所用样品、仪器和试剂来源如下：
样品：注射用核糖核酸Ⅱ(生产批号：国药准字H22020007，吉林省敖东药业集团延吉股份有限公司)，共10批；批号分别为：20090421、20090608、20091111、20100114、20100518、20101105、20110201、20110401、20110810、20111213)。
仪器与试剂：日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪；超纯水机WP-VP-Ⅲ-40(四川沃特尔科技发展有限公司)；硫酸钠(北京化工厂，分析级)；Dextran葡聚糖标准品、葡萄糖标准品和蔗糖标准品(Sigma公司)。
供试品溶液的制备：分别取10个批次的注射用核糖核酸Ⅱ适量，加质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液制成浓度为5mg/mL的供试品溶液。
对照品溶液的制备：取葡萄糖、蔗糖、DextranT 1000、DextranT 5000、DextranT12000标准品适量，精密称定，分别加质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液制成浓度为5mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
实施例1
流动相的优化
色谱条件：示差折光检测器；柱温：35℃；流速：0.5mL/min；色谱柱：OHpak SB802-HQ(8mm×300mm)；进样量：10μL。
流动相1：超纯水；
流动相2：0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液；
流动相3：质量浓度为0.2％的氯化钠溶液；
流动相4：质量浓度为1.2％的氯化钠溶液；
流动相5：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液。
采用不同流动相的色谱条件对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，结果如图1～5所示。从图1～5可以看出：流动相1～4峰形拖尾(如图1～4)，分离度低；流动相5峰形对称，分离度高(如图5)。故选用质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液作为重均分子量测定的流动相。
实施例2
色谱柱的优化
色谱条件：示差折光检测器；柱温：35℃；流速：0.5mL/min；流动相：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液；进样量：10μL。
色谱柱：
色谱柱1：OHpak SB804-HQ；
色谱柱2：OHpak SB803-HQ；
色谱柱3：OHpak SB802.5-HQ；
色谱柱4：STR-100；
色谱柱5：TSK G2500PWXL；
色谱柱6：OHpak SB802-HQ。
采用不同色谱柱的色谱条件对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，结果如图6～11所示。从图6～11可以看出：色谱柱1～5峰形拖尾(如图6～10)，分离度低；色谱柱6峰形对称，分离度高(如图11)。故选用OHpak SB802-HQ凝胶色谱柱进行分子量分布的测定。
实施例3
柱温的优化
色谱条件：示差折光检测器；流速：0.5mL/min；流动相：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液；色谱柱：OHpak SB802-HQ；进样量：10μL。
柱温
柱温1：25℃；
柱温2：30℃；
柱温3：35℃。
采用不同柱温的色谱条件对注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，结果如图12～14所示。从图12～14可以看出：柱温为25℃、30℃时，基线下移(如图12～13)；柱温为35℃时基线平稳(如图14)。因此，选择35℃柱温进行测定。
实施例4
标准曲线测定
色谱条件：示差折光检测器；流速：0.5mL/min；流动相：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液；色谱柱：OHpak SB802-HQ；进样量：10μL，柱温：35℃。
将各对照品溶液进行液相色谱分析，记录洗脱峰的保留时间，由GPC专用软件绘制标准曲线，以对照品的重均分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程；结果如图15所示。从图15可以看出：所得回归方程线性良好。
实施例5
精密度试验
取批次为20110201的供试品溶液10μL，按实施例4中的色谱条件进行液相色谱分析，连续进样6次，所得色谱图如图16～21所示，计算重均分子量，计算RSD，结果如表1所示。
表1精密度试验考察结果
从表1可以看出：重均分子量RSD为1.13％，本发明提供的检测方法精密度良好。
实施例6
稳定性试验
取批次为20110201的供试品溶液10μL，分别在室温下保存0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h后，按实施例4中的色谱条件进行液相色谱分析，所得色谱图如图22～27所示，计录重均分子量，计算RSD，结果如表2所示。
表2稳定性试验考察结果
从表2可以看出：重均分子量RSD为2.42％，本发明提供的检测方法在12内的稳定性良好。
实施例7
重复性试验
取6份批次为201102的注射用核糖核酸Ⅱ适量，加质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液制成浓度为5mg/mL的供试品溶液；分别取10μL所得供试品溶液按实施例4中的色谱条件进行液相色谱分析，所得色谱图如图28～33所示，计录重均分子量，计算RSD，结果如表3所示。
表3重复性试验考察结果
从表3可以看出：重均分子量RSD为1.64％，本发明提供的检测方法重复性良好。
实施例8
按照实施例4的色谱条件对各供试品溶液进行液相色谱分析，所得色谱图如图34～43所示，计算重均分子量，如表4所示。
表4不同批次的供试品的重均分子量测试结果
从表4可以看出：所测注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量在800～1000。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种注射用核糖核酸Ⅱ重均分子量的检测方法，包括以下步骤：
将注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液进行液相色谱分析，得到注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息；
将所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品的色谱信息代入葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线，获得所述注射用核糖核酸Ⅱ的重均分子量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液包括注射用核糖核酸Ⅱ供试品和溶剂；所述溶剂为质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述注射用核糖核酸Ⅱ供试品溶液的浓度为1～5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱分析的参数包括：
色谱柱：凝胶色谱柱；
流动相：质量浓度为0.7％的硫酸钠溶液；
流速：0.3～0.7mL/min；
柱温：25～40℃；
进样量：5～15μL；
检测器：示差折光检测器；
工作站：GPC专用软件工作站，理论板数≥3000。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为OHpak SB802-HQ，8mm×300mm。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱分析的参数包括：
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
进样量：10μL；
检测器：示差折光检测器。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线由包括以下步骤的方法获取：
将多个重均分子量不同的葡聚糖标准品和溶剂混合，得到重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液；
对所述重均分子量不同的葡聚糖标准品溶液进行液相色谱分析，得到重均分量不同的葡聚糖标准品的色谱信息；
将葡聚糖标准品的重均分子量的对数值和色谱信息进行拟合，得到所述葡聚糖标准品重均分子量-色谱信息的标准曲线。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述葡聚糖标准品的重均分子量包括180、342、1000、5000和12000。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述重均分子量为180的葡聚糖标准品为葡萄糖；重均分子量为342的葡聚糖标准品为蔗糖；重均分子量为1000的葡聚糖标准品为Dextran T 1000；重均分子量为5000的葡聚糖标准品为Dextran T 5000；重均分子量为12000的葡聚糖标准品为Dextran T 12000。
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