CN114264741A - 一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法，采用以下步骤：（1）分别检测样品和至少3批猪肝素标准品中全硫酸化三糖和ΔIA（ΔUA2S‑GlcNAc6S）的含量；（2）计算全硫酸化三糖含量和ΔIA含量的比值及猪肝素标准品中该比值的标准偏差（SD）；当样品中全硫酸化三糖含量和ΔIA含量的比值超过猪肝素标准品中该比值的最大值＋3SD时，判定样品中掺有反刍类动物肝素；（3）所用检测方法为亲水相互作用液相色谱质谱联用技术或多反应监测技术。该方法是基于肝素本身的物种来源差异的直接鉴定方法，区别于现有PCR等间接鉴定方法的不稳定性，具有特异性强等优点，可应用于肝素原料筛选、肝素制剂检测等领域。

Description

一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法
技术领域
本发明涉及肝素的鉴别领域，具体涉及一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法。
背景技术
肝素（Heparin）是糖胺聚糖家族中的异质性的高负电荷的线性多糖，主要存在于哺乳动物的肥大细胞中，由己糖醛酸（HexA）和D-葡萄糖胺（GlcN）通过1-4糖苷键连接形成的重复二糖单元构成，在糖醛酸残基上可能发生2-O-硫酸基取代，在葡萄糖胺残基上可能发生N-乙酰基取代、N-硫酸基取代、6-O-硫酸基取代和3-O-硫酸基取代。肝素自1935年首次进入临床应用，直到现在已有80多年的历史，一直被用作临床抗凝血药物，广泛用于血栓性疾病的预防和治疗。目前，国际市场对肝素原料药的需求十分强劲并保持高速增长趋势。
目前FDA唯一批准的肝素来源是猪粘膜。绵羊肝素和牛肝素正在进行临床前研究，由于牛和羊等反当动物携带致病性朊蛋白可能导致人类患新型克雅氏症，因此猪来源肝素就成为了确保肝素安全性的一条关键要求，但是由于肝素的单一动物来源，其种群规模、产量水平和价格受到疾病爆发的影响，很容易遭受掺假、污染以及与来自其他反刍类动物肝素混合。在利益驱使下，不法商家将牛、羊来源肝素掺假到猪来源肝素中，这扰乱了肝素市场的秩序，阻碍了肝素产业的健康发展，给消费者的健康带来了严重的隐患。目前肝素市场无专属性强、灵敏度高的方法来鉴定不同来源的肝素，需要开发分析方法来有效地识别肝素的来源，从而进行产品质量和生产过程的控制。
目前反刍类动物肝素掺假的检测方法有荧光定量 PCR 法、免疫学检测方法、主成分分析法。其中基于聚合酶链式反应（PCR）的DNA检测技术可检测肝素样品中有无其他反刍类动物的残留DNA，是一种间接的肝素物种来源鉴定方法。在粗品肝素在生产过程中会残余一些核酸，因此利用残余核酸片段（如线粒体基因、多拷贝核基因、短片段穿插的核重复元件等）的 qPCR 分析可以确定粗品肝素的动物来源。但是由于肝素在制备的过程中需要经过多次提取与纯化，当中的DNA会受到严重的破坏和去除，当肝素钠粗品经过高锰酸钾、过氧化氢等氧化脱色和核酸酶处理等步骤精制而成的肝素钠原料药时，其中的核酸被进一步破坏，使其中残留的DNA难以被有效的检测。同时，研究表明肝素多糖对于扩增酶有抑制作用，容易造成假阴性，必须经过肝素酶完全降解处理才可行。同时PCR检测技术涉及DNA提取等过程操作复杂。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明开发了一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法。所述鉴别方法是针对不同来源肝素糖链本身差异的直接测定，是基于不同物种肝素糖链的结构差异而开发的方法，不会因为工艺导致差异的消失，并且检测步骤更加简便、更易操作。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法，采用以下步骤：
（1）分别检测样品和至少三批猪肝素标准品中全硫酸化三糖（英文表述trisaccharide(4S)，结构式 ΔUA2S-GlcNS6S- HexA2S）和ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）的含量；
（2）计算全硫酸化三糖含量和ΔIA含量的比值，并计算猪肝素标准品中该比值的标准偏差（SD）；当样品中全硫酸化三糖含量和ΔIA含量的比值超过猪肝素标准品中该比值的最大值＋3SD时，判定样品中掺有反刍类动物肝素。
优选地，步骤（1）所述的检测样品中全硫酸化三糖和ΔIA 的含量均采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术或多反应监测技术。
优选地，所述采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术的操作为：
（1）对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶（各0.4 mIU/μL，等体积混合）进行完全酶解；
（2）使用亲水相互作用液相色谱质谱联用（HILIC-MS）对步骤（1）酶解产物中的全硫酸化三糖和ΔIA进行相对定量分析，其中全硫酸化三糖的检测离子形式为[M-2H]2-，质荷比为415.4729，和/或[M-3H+Na]2-，质荷比为426.4639；ΔIA的检测离子形式为[M-H]-，质荷比为268.5，和/或[M-3H+Na]2-，质荷比为279.5。
（3）色谱及质谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna 3 μm HILIC 200Å (150 ×2.0mm)；流动相：A相：5 mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5 mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15mL/min；进样量：20 μL；洗脱梯度：0-5 min，95% B；5-6 min，90% B；6-25 min，90-84% B；25-27 min，84-50% B；27-31 min，50-50% B；31-32 min，50-95% B；32-40 min，95-95% B。质谱参数：仪器：Q Exactive plus；鞘流气（Sheath gas）：40；辅助气（Aux gas）：10；喷针电压（Spray voltage：3.8 kV；毛细传输管温度（Capillary temperature）：275℃；S-lens：50；m/z：150-800；采集时间：40 min。
优选地，所述多反应监测（MRM）技术操作可以分为HILIC-MRM法或C18-MRM法。
优选地，所述HILIC-MRM法的操作步骤为：
①对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
②使用多反应监测技术对步骤①产物中全硫酸化三糖及ΔIA进行相对定量分析，其中全硫酸化三糖的MRM定量方法中母离子质荷比为415.5，z=-2，子离子质荷比为157.0；ΔIA的MRM定量方法中母离子质荷比为268.5，z=-2，子离子质荷比为300.0；
③色谱及质谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna 3μm HILIC 200Å (150 ×2.0mm)；流动相：A相：5 mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5 mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15mL/min；进样量：10 μL；0-5 min，95% B；5-12 min，95-50% B；12-15 min，50%B；15-20 min，95% B；质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15 min；HILIC-MRM通道参数：
# 名称 结构 理论分子量 母离子 电荷数 子离子
1 ΔIA ΔUA2S-G1cNAc6S 539.0251 268.5 -2 300
2 trisaccharide(4S) ΔUA2S-GlcNS6S-HexA2S 832.9602 415.5 -2 157.0
优选地，所述C18-MRM法的操作步骤为:
①对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
②对步骤①完全酶解后的样品进行2-氨基吖啶酮溶液（AMAC）标记，氰基硼氢化钠还原，分离取上清后保存于-20 ℃备用；
③使用多反应监测技术对步骤②AMAC标记的完全酶解产物中的全硫酸化三糖及ΔIA进行相对定量分析，全硫酸化三糖AMAC衍生的定量方法中母离子质荷比为512.5，z=-2，子离子质荷比为432.6；ΔIA的AMAC衍生的定量方法中选择质荷比为732.1，z=-2，子离子质荷比为652.1；
④所述C18-MRM法色谱条件：色谱柱：Kinetex 2.6μm EVO C18 100Å (150 × 2.1mm)；流动相A相：50 mmol/L 醋酸铵水溶液；B相：甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL；柱温：45 ℃；洗脱梯度：0-2 min，5% B；2-4 min，26% B；4-8 min，40% B；8-10 min，100%B；10-15 min，5% B；质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15 min；
所述C18-MRM法质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15min； C18-MRM通道参数：
# 名称 结构 理论分子量 母离子 电荷数 子离子
1 ΔIA-AMAC ΔUA2S-G1cNAc6S-AMAC 733.1095 732.1022 -1 652.1454
2 trisaccharide(4S) ΔUA2S-GlcNS6S-HexA2S-AMAC 1027.0446 512.5150 -2 432.5366
进一步地，步骤②所述2-氨基吖啶酮溶液（AMAC）标记采用的方法为：（1）称取一定量的2-氨基吖啶酮溶液（AMAC），溶于二甲基亚砜和冰醋酸的混合液中（二甲基亚砜和冰醋酸的体积比为17:3），至终浓度为0.1 moL/L；（2）向已经完全干燥的完全酶解样品中加入5μL 0.1 moL/L AMAC，室温反应15 min，加入5 μL 1 moL/L NaBH3CN水溶液，45 ℃，1 h，反应结束后高速离心3 min后取上清9 μL放入进样瓶中。
亲水相互作用液相色谱质谱联用（HILIC-MS）和多反应监测（MRM）技术两种检测方法可以根据检测需要选择任意一种或者两种，两种方法均可获得全硫酸化三糖及ΔIA含量，区别在于使用的仪器、色谱柱、检测方法的差异。
本发明的有益效果：
1、与PCR方法相比，本发明中的方法是基于猪、牛、羊肝素糖链结构的差异而建立的分析方法，区别于现有PCR中基于DNA残留，或者免疫学检测方法基于蛋白质残留的间接鉴定方法，本发明中的全硫酸化三糖与ΔIA比值的差异不能通过分离纯化、增加工艺等方法除去，避免了人为破坏的可能，使得结果更加可靠。
2、与现有的核磁与PCR结合的方法相比，本发明中的质谱检测方法对样品检测的需求量少，检测时间短，数据分析方法简便，检测灵敏度高。
3、本发明中提供了两套样品检测方法，使用目前常用的高分辨质谱及三重四极杆质谱，使得该分析方法可广泛应用于科研院所、企业、检测机构等。
4、该检测方法具有特异性，可应用于肝素原料的筛选，肝素粗品、精制品的鉴定，肝素制剂的检测等，具有良好的市场应用价值。
附图说明
图1 为HILIC-MS分析图；A：HILIC-MS分析ΔIA（[M-2H]2-）的高分辨质谱图；B：全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）（[M-2H]2-）高分辨质谱图；C：ΔIA（[M-3H+Na]2-）的高分辨质谱图；D：全硫酸化三糖（[M-3H+Na]2-）高分辨质谱图；
图2为全硫酸化三糖trisaccharide(4S)和ΔIA的提取离子流图（EIC）；
图3为HILIC-MS数据处理结果，羊、猪和牛来源肝素完全酶解后全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）和ΔIA含量比值，其中黑色横线max_Porcine+3SD表示6批猪肝素标准品全硫酸化三糖/ΔIA的最大值加上3SD；
图4为猪肝素标准品混有不同比例羊来源肝素完全酶解后HILIC-MS分析全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）和ΔIA的比值结果，其中Ovine_mix表示将6批羊来源肝素等比例混合，Porcine_mix表示将6批猪肝素标准品等比例混合；50%表示在猪肝素标准品中混有50%的羊来源肝素，以此类推；
图5为ΔIA和全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）二级质谱图，其中ΔIA的碎片离子300.0和全硫酸化三糖的碎片离子157.0用于HILIC-MRM方法的建立；
图6为HILIC-MRM数据处理结果，羊、猪和牛来源肝素完全酶解后全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）和ΔIA含量比值，其中max_Porcine+3SD表示6批猪肝素标准品中trisaccharide(4S)/ΔIA的最大值加上3SD；
图7为猪肝素标准品混有不同比例羊来源肝素完全酶解后HILIC-MRM分析全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）和ΔIA的比值结果，其中Ovine_mix表示将6批羊来源肝素等比例混合，Porcine_mix表示将6批猪肝素标准品等比例混合；50%表示在猪肝素标准品中混有50%的羊来源肝素，以此类推；
图8为ΔIA和全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）经AMAC标记后的二级质谱图，其中ΔIA-AMAC的碎片离子651.9和全硫酸化三糖-AMAC的碎片离子472.5用于MRM方法的建立；
图9 为C18-MRM数据处理结果，羊、猪和牛来源肝素完全酶解后全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）和ΔIA含量比值，其中max_Porcine+3SD表示6批猪肝素标准品中trisaccharide(4S)/ΔIA的最大值加上3SD；
图10 为猪肝素标准品混有不同比例羊来源肝素完全酶解后C18-MRM分析全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）和ΔIA的比值结果，其中Ovine_mix表示将6批羊来源肝素等比例混合，Porcine_mix表示将6批猪肝素标准品等比例混合；50%表示在猪肝素标准品中混有50%的羊来源肝素，以此类推。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
本发明采用的仪器设备、化学试剂及实验步骤。具体如下：
1、仪器
（1）高效液相质谱仪
（2）高分辨质谱仪
（3）三重四极杆质谱仪
2、试剂
试剂 规格
肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 阿斯雷尔、贝奥康泰等市售肝素酶
乙酸铵 优级纯(GR) / Ultra Pure
乙腈、H<sub>2</sub>O 分析纯（AR）/色谱纯（LC）
AMAC 分析纯（AR）/色谱纯（LC）
DMSO 分析纯（AR）/色谱纯（LC）
乙酸 分析纯（AR）/色谱纯（LC）
NaBH<sub>3</sub>CN 分析纯（AR）/色谱纯（LC）
3、实验操作
3.1 亲水相互作用液相色谱质谱联用（HILIC-MS）检测方法
3.1.1 肝素样品的处理步骤
完全酶解：样品与猪肝素标准品分别用水溶解至20 μg/μL，各取2.5 μL，加入8.75μL醋酸钠/醋酸钙缓冲液（10 mg 牛血清白蛋白和32 mg醋酸钙溶于60 mL水中，加入580 μL冰醋酸，混匀后用2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH到7.0，用水定容至100 mL）和12.5 μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液（其中肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ均是0.4 mIU/μL，用醋酸钠/醋酸钙缓冲液溶解）。在25 ℃孵育36小时后再加入12.5 μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液继续孵育。总孵育时间达到72小时后，100 ℃水浴加热10 min以灭活肝素酶，12000 r/min离心10 min后取上清，冻干。
3.1.2 HILIC-MS的检测条件如下：
使用HILIC -MS分析前，用80%流动相B溶解，进样量20 μg。
色谱柱：Phenomenex Luna 3 μm HILIC 200Å (150 ×2.0 mm)；流动相：A相：5mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5 mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15 mL/min；进样量：20μL；洗脱梯度：0-5 min，95% B；5-6 min，90% B；6-25 min，90-84% B；25-27 min，84-50% B；27-31 min，50-50% B；31-32 min，50-95% B；32-40 min，95-95% B。
质谱参数：仪器：Q Exactive plus；Sheath gas：40；Aux gas：10；Spray voltage：3.8 kV；Capillary tmp.：275 ℃ ；S-lens：50；m/z：150-800；采集时间：40 min。
3.2 多反应监测技术（MRM）检测方法
3.2.1肝素样品的处理步骤
所述多反应监测（MRM）技术操作可以分为HILIC-MRM法或C18-MRM法。
HILIC-MRM样品处理：完全酶解：样品与猪肝素标准品分别用水溶解至20 μg/μL，各取2.5 μL，加入8.75 μL醋酸钠/醋酸钙缓冲液（10 mg 牛血清白蛋白和32 mg醋酸钙溶于60 mL水中，加入580 μL冰醋酸，混匀后用2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH到7.0，用水定容至100 mL）和12.5 μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液（其中肝素酶ⅠI、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ均是0.4mIU/μL，用醋酸钠/醋酸钙缓冲液溶解）。在25 ℃孵育36小时后再加入12.5 μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液继续孵育。总孵育时间达到72小时后，100 ℃水浴加热10 min以灭活肝素酶，12000 r/min离心10 min后取上清，冻干。
C18-MRM样品处理：样品完全酶解冻干后，进行AMAC标记。称取一定量的2-氨基吖啶酮溶液（AMAC），溶于二甲基亚砜和冰醋酸的混合液中（混合液中二甲基亚砜和冰醋酸的体积比为17:3），至终浓度为0.1 moL/L。向已经完全干燥的完全酶解样品中加入5 μL 0.1moL/L AMAC，室温反应15 min，加入5 μL 1 moL/L NaBH3CN水溶液，45 ℃，1 h。反应结束后高速离心3 min后取上清9 μL放入进样瓶中。
3.2.2多反应监测（MRM）技术检测条件：
（1）、HILIC-MRM检测条件：
使用HILIC-MRM分析前，用80%流动相B溶解，进样量5 μg。
色谱柱：Phenomenex Luna 3μm HILIC 200Å (150 ×2.0 mm)；流动相：A相：5mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5 mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15 mL/min；进样量：10μL；0-5 min，95% B；5-12 min，95-50% B；12-15 min，50%B；15-20min，95% B。
质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15 min；
表1为HILIC-MRM通道参数：
# 名称 结构 理论分子量 母离子 电荷数 子离子
1 ΔIA ΔUA2S-G1cNAc6S 539.0251 268.5 -2 300
2 trisaccharide(4S) ΔUA2S-GlcNS6S-HexA2S 832.9602 415.5 -2 157.0
（2）、C18-MRM
样品进样量5 μg。
色谱柱：Kinetex 2.6 μm EVO C18 100Å (150 × 2.1 mm)；流动相A相：50 mmol/L 醋酸铵水溶液；B相：甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL；柱温：45 ℃；洗脱梯度：0-2 min，5% B；2-4 min，26% B；4-8 min，40% B；8-10 min，100%B；10-15 min，5% B；
质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15 min；
表2为 C18-MRM通道参数：
# 名称 结构 理论分子量 母离子 电荷数 子离子
1 ΔIA-AMAC ΔUA2S-G1cNAc6S-AMAC 733.1095 732.1022 -1 652.1454
2 trisaccharide(4S) ΔUA2S-GlcNS6S-HexA2S-AMAC 1027.0446 512.5150 -2 432.5366
4. 验证试验
采用本发明方法对6批猪肝素标准品、6批羊来源肝素和3批牛来源肝素分别进行全硫酸化三糖及ΔIA的相对定量及比值分析。
（一）亲水相互作用液相色谱质谱联用（HILIC-MS）方法的检测结果及分析
图1是采用本发明所述的HILIC-MS方法分析全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）及ΔIA的高分辨质谱图及结构图，图中分别给出了ΔIA（[M-2H]2-和[M-3H+Na]2-）、全硫酸化三糖（[M-2H]2-）和 [M-3H+Na]2-）的高分辨质谱图。通过对给定的目标m/z进行积分，可以获得其提取离子流（EIC）图，以此获得全硫酸化三糖和ΔIA的含量。实施例中的EIC图谱及出峰时间见图2，在相同的进样量时，猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量明显低于牛、羊来源的肝素。
采用HILIC-MS方法获得的6个批次猪肝素标准品、6个批次羊肝素和3个批次牛肝素中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值，并进行了物种间差异的比较，结果见图3。猪肝素标准品完全酶解后全硫酸化三糖/ΔIA远远小于羊和牛来源肝素，因此可以用来区分猪和牛、羊来源肝素。以六个批次的猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值最大值＋3SD作为判定条件时（黑色横线max_Porcine+3SD为定量线），牛、羊肝素的该比值明显超过标准，可以判定样品为或者含有反刍类动物肝素。
更进一步地，我们将猪肝素标准品混有不同比例羊来源肝素，HILIC-MS分析全硫酸化三糖和ΔIA的比值结果（见图4）。图4中Ovine_mix表示将6批羊来源肝素等比例混合，Porcine_mix表示将6批猪肝素标准品等比例混合；50%表示在混合后的猪肝素标准品中混有50%的混合后的羊来源肝素，以此类推。以六个批次的猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值的最大值＋3SD作为判定条件（黑色横线max_Porcine+3SD为定量线），当猪肝素中掺入15%以上羊肝素时，可以判定猪肝素中掺有羊来源肝素。
（二）MRM方法的检测结果及分析
（1）、HILIC-MRM检测结果
使用HILIC-MRM方法对全硫酸化三糖和ΔIA的含量及其比值进行定量分析。图5为ΔIA和全硫酸化三糖的二级质谱图，其中ΔIA的碎片离子300.0和全硫酸化三糖的碎片离子157.0用于HILIC-MRM方法的建立。
图6为从HILIC-MRM数据处理结果，计算了HILIC-MRM方法获得的6个批次猪肝素标准品、6个批次羊肝素和3个批次中牛肝素中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值，并进行了物种间差异的比较。以六个批次的猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值的最大值＋3SD作为判定条件时（黑色横线max_Porcine+3SD为定量线），牛、羊肝素的该比值明显超过标准，可以判定样品为或者含有反刍类动物肝素。
图7为猪肝素标准品混有不同比例羊来源肝素完全酶解后HILIC-MRM分析全硫酸化三糖和ΔIA的比值结果，其中Ovine_mix表示将6批羊来源肝素等比例混合，Porcine_mix表示将6批猪肝素标准品等比例混合；50%表示在混合后的猪肝素标准品中混有50%的混合后的羊来源肝素，以此类推；以三个批次的猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值最大值＋3SD作为判定条件（黑色横线max_Porcine+3SD为定量线），当猪肝素中掺入15%以上羊肝素时，可以判定猪肝素中掺有羊来源肝素。
（2）、C18-MRM检测结果
使用C18-MRM方法对全硫酸化三糖和ΔIA的含量及其比值进行定量分析。图8为ΔIA和全硫酸化三糖经AMAC标记后的二级质谱图，其中ΔIA-AMAC的碎片离子651.9和全硫酸化三糖-AMAC的碎片离子472.5用于MRM方法的建立，通过MRM的质谱结果可以获得全硫酸化三糖和ΔIA的含量。
图9为从C18-MRM数据处理结果，计算了HILIC-MS方法获得的6个批次猪肝素标准品、6个批次羊肝素和3个批次中牛肝素中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值，并进行了物种间差异的比较。以六个批次的猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值的最大值＋3SD作为判定条件时（黑色横线max_Porcine+3SD为定量线），牛、羊肝素的该比值明显超过标准，可以判定样品为或者含有反刍类动物肝素。
图10为猪肝素标准品混有不同比例羊来源肝素完全酶解后C18-MRM分析全硫酸化三糖和ΔIA的比值结果，其中Ovine_mix表示将6批羊来源肝素等比例混合，Porcine_mix表示将6批猪肝素标准品等比例混合；50%表示在混合后的猪肝素标准品中混有50%的混合后的羊来源肝素，以此类推；以六个批次的猪肝素标准品中全硫酸化三糖含量/ΔIA含量的比值的最大值＋3SD作为判定条件（黑色横线max_Porcine+3SD为定量线），当猪肝素中掺入15%以上羊肝素时，可以判定猪肝素中掺有羊来源肝素。

Claims (10)

1.一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）分别检测样品和至少3批猪肝素标准品中全硫酸化三糖和ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）的含量；
（2）计算全硫酸化三糖含量和ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）含量的比值，并计算猪肝素标准品中该比值的标准偏差（SD）；当样品中全硫酸化三糖含量和ΔIA含量的比值超过猪肝素标准品中该比值的最大值＋3SD时，判定样品中掺有反刍类动物肝素。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，步骤（1）所述的检测样品中全硫酸化三糖和ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）的含量均采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术或多反应监测技术进行检测。
3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术的操作条件为：
（1）对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
（2）使用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术对步骤（1）酶解产物中的全硫酸化三糖和ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）进行相对定量分析，其中全硫酸化三糖的检测离子形式为[M-2H]2-和/或[M-3H+Na]2-；ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）的检测离子形式为[M-H]-，和/或[M-3H+Na]2-。
4.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述全硫酸化三糖离子[M-2H]2-的质荷比为415.4729，离子[M-3H+Na]2-的质荷比为426.4639；ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）离子[M-H]-的质荷比为268.5，离子[M-3H+Na]2-的质荷比为279.5。
5.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述亲水相互作用液相色谱质谱联用技术的色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Luna 3 μm HILIC 200Å (150 ×2.0 mm)；流动相：A相：5 mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5 mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15 mL/min；进样量：20 μL；洗脱梯度：0-5 min，95% B；5-6 min，90% B；6-25 min，90-84% B；25-27min，84-50% B；27-31 min，50-50% B；31-32 min，50-95% B；32-40 min，95-95% B；质谱参数：仪器：Q Exactive plus；鞘流气：40；辅助气：10；喷针电压：3.8 kV；毛细传输管温度:275 ℃ ；S-lens：50；m/z：150-800；采集时间：40 min。
6.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述多反应监测技术操作可以分为HILIC-MRM法或C18-MRM法。
7.根据权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，所述HILIC-MRM法的操作步骤为：
①对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
②使用HILIC-MRM对步骤①产物中全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）及ΔIA（ΔUA2S-GlcNAc6S）进行相对定量分析，其中全硫酸化三糖（trisaccharide(4S) ）的MRM定量方法中母离子质荷比为415.5，z=-2，子离子质荷比为157.0；ΔIA的MRM定量方法中母离子质荷比为268.5，z=-2，子离子质荷比为300.0。
8.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于，所述HILIC-MRM的色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Luna 3 μm HILIC 200Å (150 ×2.0 mm)；流动相：A相：5 mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5 mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15 mL/min；进样量：10 μL；0-5 min，95%B；5-12 min，95-50% B；12-15 min，50%B；15-20min，95% B；
所述HILIC-MRM的质谱条件为：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15min；HILIC-MRM通道参数：
Figure 946362DEST_PATH_IMAGE002
。
9.根据权利要求6所述的鉴别方法，其特征在于，所述C18-MRM法的操作步骤为:
①对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
②对步骤①完全酶解后的样品进行2-氨基吖啶酮溶液（AMAC）标记，氰基硼氢化钠还原，离心取上清后保存于-20 ℃备用；
③使用多C18-MRM对步骤②AMAC标记的完全酶解产物中的全硫酸化三糖及ΔIA进行相对定量分析，全硫酸化三糖AMAC衍生的定量方法中母离子质荷比为512.5，z=-2，子离子质荷比为432.6；ΔIA的AMAC衍生的定量方法中选择质荷比为732.1，z=-2，子离子质荷比为652.1。
10.根据权利要求9所述的鉴别方法，其特征在于，所述C18-MRM法的色谱条件为：色谱柱：Kinetex 2.6 μm EVO C18 100Å (150 × 2.1 mm)；流动相A相：50 mmol/L 醋酸铵水溶液；B相：甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL；柱温：45 ℃；洗脱梯度：0-2 min，5% B；2-4 min，26% B；4-8 min，40% B；8-10 min，100%B；10-15 min，5% B；
所述C18-MRM法的质谱条件为：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15min；质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15 min；C18-MRM通道参数：
名称 结构 理论分子量 母离子 电荷数 子离子 1 ΔIA-AMAC ΔUA2S-G1cNAc6S-AMAC 733.1095 732.1022 -1 652.1454 2 trisaccharide(4S) ΔUA2S-GlcNS6S-HexA2S-AMAC 1027.0446 512.5150 -2 432.5366
。
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