CN115792044B - 一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及低分子肝素的原料来源鉴别领域，具体涉及一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法。分别检测样品和猪依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖和还原端ΔIVS（REΔIVS）的含量；当样品中单硫酸化三糖含量/REΔIVS含量的比值超过猪依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖含量/REΔIVS含量的比值的最大值+3SD时，判定样品中掺有羊依诺肝素钠。本发明针对于猪羊两种来源的依诺肝素钠糖链还原端本身差异的直接测定，是基于猪羊肝素经化学降解过后的依诺肝素钠糖链结构差异而开发的方法，检测步骤简单，用时少。
Description
技术领域
本发明涉及低分子肝素的原料来源鉴别领域，具体涉及一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法。
背景技术
肝素是由己糖醛酸(Hexuronic acid,HexA)和葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)通过1-4糖苷键连接的二糖重复单元组成的高硫酸化线性异质多糖。在肝素的结构组成中，HexA主要包括β-D-葡萄糖醛酸(Glucuronic acid,GlcA)和α-L-艾杜糖醛酸(Iduronic acid,IdoA)且C2位置可能发生硫酸化。GlcN的氨基位置可发生乙酰化和硫酸化修饰，C3和C6位置可发生硫酸化修饰，因此形成了肝素糖链复杂不均一的线性结构。低分子肝素(Lowmolecular heparins,LMWHs)作为肝素经过化学降解或酶法降解的产物具有生物利用度高、半衰期长及副作用小的优点，兼具应用广、效果好特性的抗凝血药物，也被用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。目前，医药行业对抗凝血类药物需求越来越大，这也将成为肝素类药物市场面临的巨大挑战。
目前，FDA唯一批准的肝素来源是猪黏膜肝素。由于20世纪90年代欧洲出现的牛海绵状脑病以及对朊病毒污染的担忧降低了全世界牛(疯牛病)和羊(羊痒症)肝素的生产和使用。因此，对猪肠肝素的需求增加，导致肝素原料药的短缺和成本增加。当前仍存在一些监管方面的担忧，即所有肝素原料药可能并非仅来源于猪肠。肝素原料药的种属来源决定了LMWHs药物的来源。目前LMWHs市场上无专属性强、灵敏度高的方法鉴定不同物种来源的依诺肝素钠，因此需要开发新的分析方法来有效识别依诺肝素钠的来源，从而进行产品质量的控制。
目前反刍类动物LMWHs掺假的检测方法有聚合酶式反应(PCR)法、核磁共振波谱法、液质联用(LC-MS)法和化学计量学分析法等。PCR作为一种分子生物学技术可以在生物体外开展DNA的复制工作，并且可以将少数、微量的DNA进行很大程度地扩增。由于肝素物种来源的特异性，利用PCR法检测在粗肝素生产过程中残留的核酸以及评估这种物质的来源。然而，当该过程去除DNA时，这种方法将不再适用，需要选择使用其他分析技术来评估其它动物来源的污染。同时，研究表明肝素多糖对于扩增酶有抑制作用，容易造成假阴性。PCR检测技术还会出现阴性、假阳性以及在实验过程中极易被污染等一系列问题。前期肝素原料残留的DNA被破坏或去除，经化学降解或酶解后产生的依诺肝素钠质量就更加不可靠。利用核磁共振波谱法可以看到不同物种来源依诺肝素钠的结构组成及取代模式，但这种方法在分析多种动物来源的混合依诺肝素钠方面特异性不强，需要借助化学计量学方法才能提高依诺肝素钠混合物的检测能力。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明开发了一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法。所述鉴别方法在依诺肝素钠的还原端进行2-氨基吖啶酮(AMAC)标记，针对于猪羊两种来源的依诺肝素钠糖链还原端本身差异的直接测定，是基于猪羊肝素经化学降解过后的依诺肝素钠糖链结构差异而开发的方法，检测步骤简单，用时少。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，采用以下步骤：
(1)分别检测样品和至少3批猪依诺钠标准品中单硫酸化三糖和还原端ΔIVS(REΔIVS)的含量；
(2)计算单硫酸化三糖含量/REΔIVS含量的比值，并计算猪依诺肝素钠标准品中该比值的标准偏差(SD)；当样品中单硫酸化三糖含量/REΔIVS含量的比值超过猪依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖含量/REΔIVS含量的比值的最大值+3SD时，判定样品中掺有羊依诺肝素钠。
进一步地，步骤(1)所述的检测样品中单硫酸化三糖和REΔIVS含量均采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术或多反应监测技术。
进一步地，所述采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术的操作为：
(1)对检测样品进行AMAC标记(依诺糖链还原端会被AMAC标记)，NaBH3CN还原，用预冷的乙醇萃取后弃去上清转干；
(2)对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
(3)使用亲水相互作用色谱质谱联用对步骤①和②酶解产物中单硫酸化三糖-AMAC和REΔIVS-AMAC进行定量分析，其中单硫酸化三糖-AMAC的检测离子形式为[M-2H]2-和/或[M-3H+Na]2-；REΔIVS-AMAC的检测离子形式为[M-H]-和/或[M-2H+Na]-。
进一步地，步骤(1)所述预冷的乙醇温度为-20℃；所述离子[M-2H]2-的质荷比为413.60，离子[M-3H+Na]2-的质荷比为424.58；所述离子[M-H]-质荷比为610.10，所述离子[M-2H+Na]-的质荷比为632.12。
进一步地，所述亲水相互作用色谱质谱联用技术的色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Luna 3μm HILIC
(150′2.0mm)；流动相：A相：5mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5mmol/L醋酸铵，98％乙腈溶液；流速：0.15mL/min；进样量：32μL；洗脱梯度：0-10min，95％B；10-11min，95-90％B；11-30min，90-84％B；30-32min，84-50％B；32-36min，50-50％B；36-37min，50-95％B；37-40min，95-95％B；
质谱参数：仪器：LTQ-Orbitrap velos pro ETD；鞘气：40；辅助气：10；喷雾电压：3.8Kv；毛细管温度：275℃；透镜(％)：50；扫描范围m/z：150-800；采集时间：40min。
进一步地，所述多反应监测技术为C18-MRM法，其中所述C18-MRM法的操作步骤为：
①对检测样品进行AMAC标记，NaBH3CN还原，用预冷的乙醇萃取后弃去上清转干；
②对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
③使用多反应监测技术对步骤①和②产物中单硫酸化三糖和REΔIVS进行定量分析；所述单硫酸化三糖的AMAC衍生的MRM定量方法中母离子质荷比为413.60，z＝-2，子离子质荷比为221.00；REΔIVS的AMAC衍生的MRM定量方法中母离子质荷比为610.10，z＝-1，子离子质荷比为354.10。
进一步地，所述C18-MRM法的色谱条件为：色谱柱：Kinetex 2.6μm EVO C18
(150′2.1mm)：流动相A相：50mmol/L醋酸铵水溶液；B相：甲醇溶液；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；柱温：45℃；洗脱梯度：0-2min，5％B；2-4min，26％B；4-8min，40％B；8-10min，100％B；10-15min，5％B；
质谱条件：喷雾电压：-3.7kV；喷雾气流速：30arb；采集时间：15min；
表C18-MRM通道参数：
本发明的有益效果：
1.与PCR方法相比，本发明中的方法是基于猪、羊依诺肝素钠糖链结构的差异而建立的而分析方法，区别于现有PCR中基于DNA残留，或者核磁共振波谱法，本发明中单硫酸化三糖与REΔIVS比值的差异不能通过分离纯化、增加工艺等方法除去，避免了人为破坏的可能，使得结果更加可靠。
2.与现有的核磁与化学计量学结合的方法相比，本发明中质谱检测方法对样品检测需求的量少，灵敏度高，耗时低，操作简便，数据处理简单快速。
3.本发明中提供的样品检测方法，使用目前常用的高分辨质谱以及三重四级杆质谱，使得该分析方法可广泛用于高校、科研院所、企业及检测机构等等。
4.该检测方法具有特异性，可用于低分子肝素-依诺肝素钠作为产品原料的筛选，依诺肝素钠注射液的检测等，具有良好的应用前景和极具潜力的市场价值。
附图说明
图1为HILIC-MS分析图；A:HILIC-MS分析REΔIVS-AMAC([M-H]-)的高分辨质谱图；B:单硫酸化三糖-AMAC-([M-2H]2-)的高分辨质谱图；C:REΔIVS-AMAC([M-2H+Na]-)的高分辨质谱图；D:单硫酸化三糖-AMAC([M-3H+Na]2-)的高分辨质谱图；
图2为HILIC-MS数据处理结果，羊、猪来源依诺肝素钠标记酶解后单硫酸化三糖和REΔIVS含量比值，其中黑色横线max_Porcine enoxaparin+3SD表示4批猪来源依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖/REΔIVS的最大值加上3SD；
图3为猪来源依诺肝素钠混有不同比例羊来源依诺肝素钠完全酶解后HILIC-MS分析单硫酸化三糖-和REΔIVS的比值结果，其中OE_mix(Ovine enoxaparin_mix)表示将4批羊来源依诺肝素钠等比例混合，PE_mix(Porcine enoxaparin_mix)表示将4批猪来源依诺肝素钠等比例混合；50％表示在猪来源依诺肝素钠中混有50％的羊来源依诺肝素钠，以此类推；
图4为REΔIVS-AMAC和单硫酸化三糖-AMAC二级质谱图，其中REΔIVS-AMAC的碎片离子354.10和单硫酸化三糖-AMAC的碎片离子221.00用于C18-MRM方法的建立；
图5为C18-MRM数据处理结果，羊和猪来源依诺肝素钠标记酶解后单硫酸化三糖和REΔIVS含量比值，其中黑色横线max_PE+3SD表示4批猪来源依诺肝素钠中单硫酸化三糖/REΔIVS的最大值加上3SD；
图6为猪来源依诺肝素钠混有不同比例羊来源依诺肝素钠完全酶解后C18-MRM分析单硫酸化三糖和REΔIVS的比值结果，其中OE_mix表示将4批羊来源依诺肝素钠等比例混合，PE_mix表示将4批猪来源依诺肝素钠等比例混合；50％表示在猪来源依诺肝素钠中混有50％的羊来源依诺肝素钠，以此类推。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
本发明采用的仪器设备、化学试剂及实验步骤。具体如下：
1.仪器
(1)高效液相色谱质谱仪
(2)高分辨质谱仪
(3)三重四级杆质谱仪
2.试剂
| 试剂 | 规格 |
| 肝素酶I、II、Ⅲ | 阿斯雷尔市售肝素酶 |
| 乙酸铵 | 优级纯(GR)/Ultra Pure |
| <![CDATA[乙腈、H<sub>2</sub>O]]> | 分析纯(GR)/色谱纯(LC) |
| AMAC | 分析纯(GR)/色谱纯(LC) |
| DMSO | 分析纯(GR)/色谱纯(LC) |
| 乙酸 | 分析纯(GR)/色谱纯(LC) |
| <![CDATA[NaBH<sub>3</sub>CN]]> | 分析纯(GR)/色谱纯(LC) |
| 乙醇 | 分析纯(GR)/色谱纯(LC) |
3.实验操作
3.1亲水相互作用液相色谱质谱联用(HILIC-MS)检测方法
3.1.1依诺肝素钠样品处理步骤
完全酶解：样品与猪依诺肝素钠标准品分别用水溶解成20μg/μL，各取2.5μL，转干。称取一定量的2-氨基吖啶酮溶液(AMAC)，溶于二甲基亚砜和冰醋酸的混合液中(17∶3，v/v)，至终浓度为0.1moL/L。向已经完全干燥的样品中加入5μL0.1moL/L AMAC，室温反应15min，加入5μL1moL/L NaBH3CN水溶液，45℃，1h。反应结束后，乙醇要在-20℃预冷，然后在冰上萃取，10μL体系加125μL乙醇，萃取15min后，10000rpm超速离心5min后弃去上清，转干。样品与猪依诺肝素钠标准品分别用2.5μL水复溶，加入8.75μL醋酸钠/醋酸钙缓冲液(10mg牛血清白蛋白和32mg醋酸钙溶于60mL水中，加入580μL冰醋酸，混匀后用2moL/L氢氧化钠溶液调节pH到7.0，用水定容至100mL)和12.5μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液(其中肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ均是0.4mIU/μL，用醋酸钠/醋酸钙缓冲液溶解)。在37℃孵育24h后再加入12.5μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液继续孵育。总孵育时间达到48h后，100℃水浴加热10min以灭活肝素酶，12000r/min离心10min后取上清，冻干。
3.1.2 HILIC-MS的检测条件如下：
使用HILIC-MS分析前，用80％流动相B溶解，进样量32μL。
色谱柱：Phenomenex Luna 3μm HILIC
(150′2.0mm)；流动相：A相：5mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5mmol/L醋酸铵，98％乙腈溶液；流速：0.15mL/min；进样量：32μL；洗脱梯度：0-10min，95％B；10-11min，95-90％B；11-30min，90-84％B；30-32min，84-50％B；32-36min，50-50％B；36-37min，50-95％B；37-40min，95-95％B。
质谱参数：仪器：仪器：LTQ-Orbitrap velos pro ETD；鞘气：40；辅助气：10；喷雾电压：3.8Kv；毛细管温度：275℃；透镜(％)：50；扫描范围m/z：150-800；采集时间：40min。
3.2多反应监测技术(MRM)检测方法
3.2.1依诺肝素钠样品的处理步骤
C18-MRM样品处理：完全酶解：样品与猪依诺肝素钠标准品分别用水溶解成20μg/μL，各取2.5μL，转干。称取一定量的2-氨基吖啶酮溶液(AMAC)，溶于二甲基亚砜和冰醋酸的混合液中(17:3，v/v)，至终浓度为0.1moL/L。向已经完全干燥的样品中加入5μL 0.1moL/LAMAC，室温反应15min，加入5μL1moL/L NaBH3CN水溶液，45℃，1h。反应结束后，乙醇要在-20℃预冷，然后在冰上萃取，10μL体系加125μL乙醇，萃取15min后，10000rpm超速离心5min后弃去上清，转干。样品与对照品分别用2.5μL水复溶，加入8.75μL醋酸钠/醋酸钙缓冲液(10mg牛血清白蛋白和32mg醋酸钙溶于60mL水中，加入580μL冰醋酸，混匀后用2moL/L氢氧化钠溶液调节pH到7.0，用水定容至100mL)和12.5μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液(其中肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ均是各0.4mIU/μL，用醋酸钠/醋酸钙缓冲液溶解)。在37℃孵育24小时后再加入12.5μL肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液继续孵育。总孵育时间达到48小时后，100℃水浴加热10min以灭活肝素酶，12000r/min离心10min后取上清，冻干。
3.2.2C18-MRM的检测条件如下：
使用C18-MRM分析前，用10μL水溶解后放入进样瓶中。
色谱柱：Kinetex 2.6μm EVO C18
(150×2.1mm)：流动相A相：50mmol/L醋酸铵水溶液；B相：甲醇溶液；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；柱温：45℃；洗脱梯度：0-2min，5％B；2-4min，26％B；4-8min，40％B；8-10min，100％B；10-15min，5％B；
质谱条件：喷雾电压：-3.7kV；喷雾气流速：30arb；采集时间：15min；
表C18-MRM通道参数：
4.验证实验
采用本发明方法对4批猪来源依诺肝素钠以及4批羊来源肝素钠分别进行单硫酸化三糖-AMAC及REΔIVS-AMAC的定量及比值分析。
(一)HILIC-MS方法的检测结果及分析
图1是HILIC-MS方法分析单硫酸化三糖-AMAC和REΔIVS-AMAC的高分辨质谱图及结构图，图1A和图1C分别为REΔIVS-AMAC([M-H]-和[M-2H+Na]-)的高分辨质谱图，图1B和图1D分别为单硫酸化三糖-AMAC([M-2H]2-和[M-3H+Na]2-)的高分辨质谱图。通过对给定的目标m/z进行积分，可以获得其提取离子流(EIC)图，以此获得单硫酸化三糖-AMAC和REΔIVS-AMAC的含量；
其中图1A的结构式为
图1B的结构式为
图1C的结构式为
图1D的结构式为
实施例中，计算了HILIC-MS方法获得的4个批次的猪依诺肝素钠、4个批次的羊依诺肝素钠中单硫酸化三糖/REΔIVS含量的比值，并进行了物种间差异的比较，结果见图2。猪依诺肝素钠完全酶解后单硫酸化三糖/REΔIVS含量的比值+3SD作为判定条件时(黑色横线max_PE+3SD为定量线)，羊依诺肝素钠的该比值明显高于标准，可以判定样品为或者含有羊依诺肝素钠。
更进一步地，我们将猪依诺肝素钠混有不同比例的羊依诺肝素钠，HILIC-MS分析单硫酸化三糖和REΔIVS的比值结果(见图3)。图3中OE_mix表示将4批羊来源依诺肝素钠等比例混合，PE_mix表示将4批猪来源依诺肝素钠等比例混合；50％表示在猪依诺肝素中混有50％羊依诺肝素钠，以此类推。以猪依诺肝素钠中单硫酸化三糖/REΔIVS含量的比值+3SD作为判定条件(黑色横线max_PE+3SD为定量线)，当猪依诺肝素钠中混有20％以上羊依诺肝素钠时，可以判定猪依诺肝素钠中混有羊依诺肝素钠。
(二)MRM方法的检测结果及分析
使用C18-MRM方法对单硫酸化三糖和REΔIVS进行定量及比值分析，图4为REΔIVS-AMAC和单硫酸化三糖-AMAC的二级质谱图，其中REΔIVS-AMAC的碎片离子和单硫酸化三糖-AMAC的碎片离子用于MRM方法的建立，通过MRM的质谱结果对样品中单硫酸化三糖和REΔIVS进行定量。
其中图4A的结构式为
图4B的结构式为
图5为MRM数据处理结果，计算了HILIC-MS方法获得并计算4个批次猪依诺肝素钠、4个批次羊依诺肝素钠单硫酸化三糖/REΔIVS的比值，并进行了物种间差异比较。以猪依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖含量/REΔIVS含量的比值+3SD作为判定条件时(黑色横线max_PE+3SD为定量线)，羊依诺肝素钠该比值明显超过标准，可以判定样品为或者含有羊依诺肝素钠。
图6为猪来源依诺肝素钠混有不同比例羊来源依诺肝素钠完全酶解后MRM分析单硫酸化三糖和REΔIVS的比值结果，其中OE_mix表示将4批羊依诺肝素钠等比例混合，PE_mix表示将4批猪来源依诺肝素钠等比例混合；50％表示在猪依诺肝素中混有50％羊依诺肝素钠，以此类推。以猪依诺肝素钠中单硫酸化三糖/REΔIVS含量的比值+3SD作为判定条件(黑色横线max_PE+3SD为定量线)，当猪依诺肝素钠中混有20％以上羊依诺肝素钠时，可以判定猪依诺肝素钠中混有羊依诺肝素钠。
Claims (7)
1.一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）检测样品和猪依诺肝素钠标准品进行AMAC标记，分别检测样品和至少3批猪依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖-AMAC和RE ΔIVS-AMAC的含量；
（2）计算单硫酸化三糖-AMAC含量/ RE ΔIVS-AMAC含量的比值，并计算猪依诺肝素钠标准品中该比值的标准偏差SD；当样品中单硫酸化三糖-AMAC含量/ RE ΔIVS-AMAC含量的比值超过猪依诺肝素钠标准品中单硫酸化三糖-AMAC含量/ RE ΔIVS-AMAC含量的比值的最大值+3SD时，判定样品掺有羊依诺肝素钠。
2.根据权利要求1所述的利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，步骤（1）所述的检测样品中单硫酸化三糖-AMAC和RE ΔIVS-AMAC含量均采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术或多反应监测技术。
3.根据权利要求2所述的利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，所述采用亲水相互作用液相色谱质谱联用技术的操作为：
①对检测样品进行AMAC标记，NaBH3CN还原，用预冷的乙醇萃取后弃去上清转干；
②对样品使用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ混合酶进行完全酶解；
③使用亲水相互作用色谱质谱联用对步骤①和②酶解产物中单硫酸化三糖-AMAC和REΔIVS-AMAC进行定量分析，其中单硫酸化三糖-AMAC的检测离子形式为[M-2H]2-和/或[M-3H+Na]2-；RE ΔIVS-AMAC的检测离子形式为[M-H]-和/或[M-2H+Na]-。
4.根据权利要求3所述的利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，步骤（1）所述预冷的乙醇温度为-20℃；所述离子[M-2H]2-的质荷比为413.60，离子[M-3H+Na]2-的质荷比为424.58；所述离子[M-H]-质荷比为610.10，所述离子[M-2H+Na]-的质荷比为632.12。
5.根据权利要求3所述的利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，所述亲水相互作用色谱质谱联用技术的色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Luna 3μm HILIC 200Å；流动相：A相：5 mmol/L醋酸铵水溶液；B相：5mmol/L醋酸铵，98%乙腈溶液；流速：0.15 mL/min；进样量：32 µL；洗脱梯度：0-10 min，95%B；10-11 min，95-90% B；11-30 min，90-84% B；30-32 min，84-50% B；32-36 min，50-50%B；36-37 min，50-95% B；37-40 min，95-95% B；
质谱参数：仪器：LTQ-Orbitrap velos pro ETD；鞘气：40；辅助气：10；喷雾电压：3.8Kv；毛细管温度：275℃；透镜：50%；扫描范围 m/z：150-800；采集时间：40 min。
6.根据权利要求2所述的利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，所述多反应监测技术为C18-MRM法，其中所述C18-MRM法的操作步骤为：
①对检测样品进行AMAC标记，NaBH3CN还原，用预冷的乙醇萃取后弃去上清转干；
②对样品使用肝素酶 Ⅰ、肝素酶 Ⅱ和肝素酶 Ⅲ 混合酶进行完全酶解；
③使用多反应监测技术对步骤①和②产物中单硫酸化三糖-AMAC和RE ΔIVS-AMAC进行定量分析；所述单硫酸化三糖的AMAC衍生的MRM定量方法中母离子质荷比为413.60，z=-2，子离子质荷比为221.00；RE ΔIVS的AMAC衍生的MRM定量方法中母离子质荷比为610.10，z=-1，子离子质荷比为354.10。
7. 根据权利要求6所述的利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法，其特征在于，所述C18-MRM法的色谱条件为：色谱柱：Kinetex 2.6μm EVO C18 100Å ：流动相A相：50 mmol/L醋酸铵水溶液；B相：甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：1 µL；柱温：45℃；洗脱梯度：0-2 min，5% B；2-4 min，26% B；4-8 min，40% B；8-10min，100% B；10-15 min，5% B；
质谱条件：喷雾电压：-3.7 kV；喷雾气流速：30 arb；采集时间：15 min；
所述RE ΔIVS-AMAC的结构为∆UA-GlcNS –AMAC，理论分子量为611.14；RE ΔIVS-AMAC的C18-MRM通道参数为：母离子为610.10，电荷数为-1，子离子为354.10；
所述单硫酸化三糖 (1S,0Ac)-AMAC的结构为ΔUA-GlcNAc-HexA2S-AMAC，理论分子量为829.18；单硫酸化三糖 (1S,0Ac)-AMAC的C18-MRM通道参数为：母离子为413.60，电荷数为-2，子离子为221.00。
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